WO2006030722A1 - 神経特異的遺伝子発現に必須なアミノ酸配列 - Google Patents

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WO2006030722A1
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rest
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Yoshifumi Nishimura
Mitsuru Nomura
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Yokohama City University
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to peptides and complexes comprising amino acid sequences essential for neuron-specific gene expression.
  • NRSE / RE1 neural restrictive silencer element / repressor element 1
  • NRSE / RE1 nerve restrictive silencer element / repressor element 1
  • the neuron-selective silencer binding factor NRSF / REST has been identified as a transcriptional repressor that binds to NRSE / RE1 and suppresses the expression of nerve-specific genes in non-neuronal cells.
  • Non-patent Document 1 The N-terminal transcriptional repression domain of NRSF / REST recruits HDAC via the corepressor mSin3, and the C-terminal domain recruits HDAC via CoREST, thereby degrading the chromatin structure. It was suggested that transcription is suppressed by activation (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Naruse Y et al .: Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999) Disclosure of the Invention
  • N-terminus of NRSF / REST can interact with the PAH1 domain of mSin3B. Although it has been clarified by the laboratory of the inventors of the present invention, it is important to determine which residue at the N-terminus is necessary for suppressing transcription.
  • the present invention aims to identify the interaction region of NRSF / REST with mSin3B, and to clarify the recognition mechanism at the atomic level by structural analysis of the complex using NMR. .
  • the present inventors have found that by creating several interactions candidate region NRSF / REST, and ⁇ Ka ⁇ to PAH1 aqueous solution of each 15 N labeled MSin3B, measuring the 'H- ⁇ N HSQC The area required for interaction was roughly determined. Subsequently, the region necessary for interaction with mSin3B was identified from the results of assignment of NOE between protein and protein by the NMR filter method. The present invention has been completed based on these findings.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a peptide having 8 to 50 amino acid residues is provided.
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 are independently hydrophobic amino acid residues having high strength, X 1 , X
  • X 3 are each independently any amino acid residue other than Pro, and A 1 and A 2 are each independently Ala or Val)
  • a peptide having 8 to 50 amino acid residues is provided.
  • Prophylaxis of neurological disease and Z comprising measuring whether a test substance affects the interaction between the peptide according to any one of (1) to (16) and the PAH1 domain of Sin3 Alternatively, a method for screening a substance effective for treatment.
  • the “silencer” refers to a cis-element for suppressing gene transcription.
  • the silencer works regardless of the position, distance, and direction of the gene itself, as does the transcriptional ability. Transcription is suppressed when the silencer binding factor binds to the silencer.
  • NRSE / RE1 is revealed for the first time in the nervous system It is a silencer involved in cell-specific expression control.
  • mSin3 is one of the mammalian-derived scaffold proteins involved in the transcriptional control mechanism. Sin3 is widely expressed without tissue specificity and is highly conserved from yeast to humans. It has four PAH (paired amphipathic helix) domains and HDAC interaction domains, such as transcription factors, corepressors, and methyli ⁇ CpG binding proteins (Xie AY et al .: J Virol, 76 , 11809-11818 (2002)) 0 PAH1 domain is the most N-terminal domain among the four PAH domains, and is known to interact with transcriptional corepressor N-CoR etc.
  • PAH paired amphipathic helix domains
  • HDAC interaction domains such as transcription factors, corepressors, and methyli ⁇ CpG binding proteins
  • N-CoR nuclear receptor co-repressor
  • the 15 N HSQCJ refers to a spectrum shown a correlation of 1 H and 15 N covalently linked ' ⁇ - 5 ⁇
  • N HSQC is the most fundamental spectrum for determining the three-dimensional structure of stable-isotopically labeled proteins and discussing motility. It is an effective tool for interaction analysis, and has recently been used for screening drug candidates in drug discovery.
  • the dynamics of the main chain can be determined from the observation results, and it can be judged whether the force is a random region with high mobility in the protein or a region that forms a certain structure. State with NOE It is evaluated using the peak intensity ratio in a non-existing state, and the value becomes smaller depending on the magnitude of internal motion.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • Trp or W Tryptophan
  • His or H Histidine Asp or D: Aspartic acid
  • nucleotide sequence is described in the 5′-terminal ⁇ 3′-terminal direction, and the amino acid sequence is described in the N-terminal ⁇ C-terminal direction.
  • NRSF / REST nerve-selective silencer binding factor NRSF / REST does not work in nerve cells, and by suppressing the expression of nerve-specific genes in non-neuronal cells, it guarantees the expression of nerve-specific genes in nerve cells.
  • Figure 1 This transcriptional repression mechanism involves the interaction between NRSF / REST and the corepressor mSin3.
  • This invention identified the amino acid sequence required for interaction with mSin3 in NRSF / REST.
  • Down's syndrome is a genetic difference between the fetal tissue that died of force dawn syndrome and normal fetal nerve tissue caused by a trisomy mutation in chromosome 21.
  • NRSF / REST except protein is controlled by transcription factors was expressed normally (Bru S et al .: Lancet, 359, 310-315 (2002)) 0
  • Alzheimer's disease has been observed to vary in the expression of SCG10 in the brain, which is a disease caused by the accumulation of ⁇ -amyloid and neurofibrillary tangles and the loss of neurons (Okazaki T et al.). al .: Neurobiol Aging, 16, 883-894 (1995)).
  • medulloblastoma is the most malignant childhood brain tumor, NRSF / REST expression levels are very high in medulloblastoma cells.
  • Recombinant protein REST-VP16 that antagonizes NRSF / REST and activates the target gene of NRSF / REST induces apoptosis by promoting neuronal gene expression and further activating the caspase cascade .
  • REST-VP 16 has the potential to be a therapeutic (Lawinger P et al .: Nature Med., 7, 826-831 (2000)).
  • Huntington's disease is a progressive neurodegenerative disease with the main symptoms of choreography, dementia, and personality changes. Affected force It is thought that abnormal huntingtin molecular force aggregates with repeating structures of glutamine residues form neuronal degeneration by forming aggregates. Wild-type huntingtin binds to NRSF / REST in the cytoplasm and controls the binding of NRSF / REST to NRSE / RE1. On the other hand, in Huntington's disease, this control is lost, and neuronal genes are not fully expressed (Zuccato C et al .: Nature Genetics, 35, 76-83 (200 3)).
  • NRSF / REST plays a central role in nerve cell-specific transcriptional control, it may be involved in other neurological diseases.
  • FIG. 1 is a model diagram of nerve-specific gene expression in nerve cells and inhibition of nerve-specific gene expression in non-neuronal cells.
  • Figure 4 structure information and fH of mSin3B PAH1 in the complex ⁇ - 15 N NOE.
  • the first invention of the present application is the following amino acid sequence:
  • a peptide having 8 to 50 amino acid residues is provided.
  • the peptide of the first invention of the present application has 8 to 50 amino acid residues, preferably 10 to 40, more preferably 15 to 30.
  • the peptide of the first invention of the present application may further contain Gin on the N-terminal side of the sequence (I) and / or Leu on the C-terminal side.
  • it may further contain Ala-Pro-Gin on the N-terminal side of the sequence (I) and / or Leu-Thr on the C-terminal side.
  • the peptide of the first invention of the present application is preferably one capable of binding to the PAH1 domain of Sin3.
  • Sin3 include those derived from eukaryotes (eg, yeast, Drosophila, etc.) mammals (eg, humans, rats, mice, etc.) and amphibians (eg, Xenopus, etc.). it can.
  • the PAH1 domain of Sin3 is a 31-98 residue region of mouse-derived mSin3B (Spronk CA et al .: Nat. Struct. Biol, 7, 1100-1104 (2000)), 38-105 residues of human-derived Sin3B. Region of the group (Spronk CA et al .: Nat. Struct.
  • the peptide of the first invention may be capable of binding to any of these. Even if the Sin3 PAH1 domain is a naturally occurring peptide with a sequence ability, other sequences (for example, artificial sequences added to facilitate purification when producing peptides in the large-scale expression system of Escherichia coli) are used. (For example, Gly-Ser-His-Met) may be attached.
  • Sequence (I) is a consensus sequence found in the interaction region of NRSF / REST that can bind to the PAH1 domain of mSin3. For example, sequence (I) is found in the region of residues 46-53 of human NRSF / REST.
  • the peptide of the first invention of the present application has the same amino acid sequence as a specific region of the neuroselective silencer binding factor NRSF / REST (for example, a region containing an amino acid residue that interacts with the PAH1 domain of Sin3). It may consist of.
  • the peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, and 5 are identical to the amino acid sequences of the 43-83 residue, 39-55 residue, and 38-57 residue regions of human NRSF / REST, respectively. Amino acid sequence power.
  • the peptide of the first invention of the present application may have a basic amino acid residue added to the C-terminal side. Thereby, the solubility of a peptide can be improved. Furthermore, an amino acid residue having an aromatic ring may be added. This makes it possible to quantify the concentration by UV.
  • a basic amino acid residue (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) is added to the C-terminal side of a specific region (42-56 residue region) of the nerve selective silencer binding factor NRSF / REST,
  • An example of the amino acid sequence of a peptide attached with an amino acid residue (Trp) having an aromatic ring is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the second invention of the present application is the following amino acid sequence:
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 are each independently hydrophobic amino acid residues, and X 1 , X 2 and X 3 are each independently any amino acid residue other than Pro, A 1 and A 2 are each independently Ala or Val)
  • a peptide having 8 to 50 amino acid residues is provided.
  • the “bulky hydrophobic amino acid residues” of ⁇ 1 and ⁇ 2 include Leu, Ile, Val, Met, Phe, Trp
  • Tyr can be exemplified. Of these, Leu and lie are preferred.
  • amino acid residues of X 1 , X 2 and X 3 include Ala, Met, Leu, Val, Ile, Phe, Trp, Glu, Asp
  • the peptide of the second invention of the present application is preferably one capable of binding to the PAH1 domain of Sin3.
  • Sin3 include those derived from eukaryotes (eg, yeast, Drosophila, etc.) mammals (eg, humans, rats, mice, etc.) and amphibians (eg, Xenopus, etc.). it can.
  • the PAH1 domain of Sin3 the mouse-derived mSin3B 31 ⁇ 98-residue region (Spronk CA et al .: Nat. Struct. Biol, 7, 1100-1104 (2000)), human-derived Sin3B 38-105 residue region (Spronk CA et al .: Nat.
  • Sequence (II) is a consensus sequence found in the interaction region of NRSF / REST and the interaction region of N-CoR that can bind to the PAH1 domain of mSin3.
  • sequence ( ⁇ ) is found in the region of residues 46-53 of human NRSF / REST and the region of residues 1837-1844 of human N-CoR.
  • the peptide of the second invention of the present application may have a basic amino acid residue added to the C-terminal side. Thereby, the solubility of a peptide can be improved. Furthermore, an amino acid residue having an aromatic ring may be added. This makes it possible to quantify the concentration by UV.
  • a basic amino acid residue (Lys-Lys-Lys-Lys) is added to the C-terminal side of a specific region (42-56 residue region) of the nerve selective silencer binding factor NRSF / REST,
  • An example of the amino acid sequence of a peptide attached with an amino acid residue (Trp) having an aromatic ring is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the peptide of the second invention of the present application is a specific region of the neuronal selective silencer binding factor NRSF / REST or transcriptional corepressor N-CoR (for example, a region containing an amino acid residue that interacts with the PAH1 domain of Sin3) Etc.) and the same amino acid sequence ability.
  • the peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3, 4 and 5 are identical to the amino acid sequences of the 43-83, 39-55 and 38-57 residue regions of human NR SF / REST, respectively.
  • amino acid alignment ability of the peptide having the amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 10 has the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the 1834-1847 residue region of the human transcription corepressor N-CoR. Consists of columns.
  • the peptides of the first invention and the second invention of the present application can be produced by known methods.
  • it can be produced using a commercially available peptide synthesizer, or can be produced by a conventional gene recombination technique.
  • amino acids constituting the peptides of the first and second inventions of the present application may be any of D-form, L-form, and DL-form, but since naturally occurring amino acids are L-form, L body is preferred.
  • the peptides of the first and second inventions of the present application can be used for the development of a neurological disease drug targeting the site of interaction with Sin3 of NRSF / REST.
  • a neurological disease drug targeting the site of interaction with Sin3 of NRSF / REST For example, abnormal expression of genes targeted by NRSF / REST and NRSF / REST is observed in various neurodegenerative diseases, but it is used for screening drug candidate compounds that control the expression of these genes. be able to.
  • the third invention of the present application provides a complex formed by the peptide of the first or second invention of the present application and the PAH1 domain of Sin3.
  • the PAH1 domain of Sin3 can be produced by a conventional genetic recombination technique.
  • the base sequence of the PAH1 domain of mouse-derived mSin3B is a sequence consisting of the 7th to 246th bases of SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of the PAH1 domain of mSin3B derived from mouse is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the complex of the third invention of the present application can be produced by adding the peptide of the first or second invention of the present invention to a PAH1 domain aqueous solution of Si n3 at room temperature.
  • the molar ratio between the peptide of the first invention or the second invention of the present application and the PAH1 domain of Sin3 may be about 1: 1.
  • the PAH1 domain aqueous solution concentration of Sin3 is good to be 0.1 mM-2 mM. Complex formation can be confirmed by NMR.
  • the complex of the third invention of the present application can be used for the development of a neurological disease drug targeting an interaction site with Sin3 of NRSF / REST.
  • a neurological disease drug targeting an interaction site with Sin3 of NRSF / REST for example, in various neurodegenerative diseases! /, Abnormal expression of genes targeted by NRSF / REST and NRSF / REST However, it can be used for screening drug candidate compounds that control the expression of these genes.
  • the fourth invention of the present application includes the prevention and prevention of neurological diseases, comprising measuring whether the test substance affects the interaction between the peptide of the first or second invention of the present application and the PAH1 domain of Sin3. Methods for screening for Z or therapeutically effective substances are provided.
  • the test substance may be any substance such as protein, peptide, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, low molecular weight compound, nucleic acid (DNA, RNA, oligonucleotide, mononucleotide, etc.).
  • a method of observing the shape of the complex using an atomic force microscope, the three-dimensional structure of the peptide of the first invention or the second invention of the present application, and the stable binding mode with the test substance of any structure to the three-dimensional structure of the PAH1 domain of Sin3 It is possible to use a technique such as a docking study that simulates a computer.
  • a technique such as a docking study that simulates a computer.
  • test substance is effective in preventing and / or treating neurological diseases.
  • the test substance may neither strengthen nor weaken the interaction between the peptide of the first invention of the present application or the second invention and the PAH1 domain of Sin3.
  • neurological diseases include diseases in which NRSF / REST is involved, and specific examples include neurodegenerative diseases such as Down's syndrome, Arnno's disease, Huntington's disease, and medulloblastoma.
  • the fifth invention of the present application provides a method for detecting a neurological disease using the peptide of the first or second invention of the present application or an antibody thereto.
  • a neurological disorder can be detected by examining the expression of Sin3 or PAH1 domain of Sin3 in a biopsy sample collected from a subject using the peptide of the first invention or the second invention of the present application.
  • a neurological disease can be detected by examining the expression of NRSF / REST in a biopsy sample from which the subject's ability was also collected using an antibody against the peptide of the first invention or the second invention of the present application.
  • Subject force Biopsy samples to be collected include nerve tissue, tissues other than nerves, amniotic fluid, blood, and cerebrospinal fluid.
  • Nerve-selective silencer binding factor NRSF / REST is a transcriptional regulator that binds to NRSE / RE1, which plays a central role in neuronal cell-specific gene transcription control.
  • NRSF / REST abnormal expression of genes targeted by NRSF / REST and NRSF / REST is observed (see above).
  • the antibody used may be an antibody that specifically recognizes the protein to be measured.
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. These antibodies can be produced by a known method.
  • the antibody When measured by Western plotting, the antibody is secondarily detected using 125 1-labeled protein A, peroxidase-conjugated IgG, or the like.
  • the antibody In the case of measuring by immunohistochemical analysis, the antibody may be labeled with a fluorescent dye, ferritin, enzyme or the like.
  • the antibody By ELISA
  • the antibody should be labeled with an enzyme such as peroxidase or galactosidase.
  • NRSF / REST in the cerebrospinal fluid if the expression level of NRSF / REST in the cerebrospinal fluid is high, it may be determined as medulloblastoma. Moreover, if the expression level of NRSF / REST in the nerve cell nucleus is high, there is a suspicion of neurological diseases such as fever and nintington disease.
  • NRSF / REST and mSin3B cDNA were obtained by RT-PCR based on published sequence data (Naruse Y et al .: Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999)). ). The obtained cDNA was subcloned into TA cloning vector manufactured by Invitrogen Corporation. Next, insert the NRSF / REST (aa43-83) fragment into the BamH EcoRI site of GST fusion protein expression vector (pGEX-2T) manufactured by Amersham Biosciences Co., Ltd. Novagen).
  • a fragment of mSin3B PAH1 domain (aa28-107) was inserted into the Ndel-BamHI site of the Novagen His-tagged protein expression vector (pET-28a), and transformed into E. coli BL21 (DE3) strain.
  • the cells were cultured in a liquid medium at 37 ° C., and expression induction was performed with isopropy ⁇ ⁇ -D-thiogalactopyranosi de manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. After collection and cell disruption, the target supernatant was obtained by subjecting the disrupted supernatant in sequence to affinity chromatography, cleaving GST and His tags with thrombin, and gel filtration chromatography.
  • SEQ ID NO: 14 shows the DNA sequence of the NRSF / REST (a.a.43-83) fragment inserted into the BamHI-EcoRI site of pGEX-2T.
  • the sequence consisting of the first to sixth bases of SEQ ID NO: 14 (GGATCC) is the BamHI site
  • the sequence consisting of the seventh to 129th bases is the DNA sequence of NRSF / RE ST (aa43-83)
  • the sequence consisting of the 131st to 136th bases is an EcoRI site.
  • the amino acid sequence of NRSF / REST (a.a.43-83) is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the DNA sequence of the fragment of the PAH1 domain (a.a.28-107) of mSin3B inserted into the Ndel-BamHI site of pET-28a is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the sequence consisting of the first to sixth bases (CATATG) of SEQ ID NO: 15 is the Ndel site, and the sequence consisting of the seventh to 246th bases is the DNA sequence of the mSi3B PAH1 domain (aa28-107).
  • the 250th to 255th basic sequence (GGATCC) is a BamHI site.
  • the amino acid sequence of the PAH1 domain (a.a.28-107) of mSin3B is shown in SEQ ID NO: 16.
  • NRSF / REST (aa39-55), NRSF / REST (aa64-80), NRSF / REST (aa38-57), NRSF / REST (aa68-83), NRSF / REST (aa42-56) and N-CoR (aa1829-1847) was synthesized and purified by a conventional peptide synthesis method.
  • Voyager-DE manufactured by Applied Laboratories, Inc. or a mass spectrometer BIFLEX or AutoFLEX manufactured by Bull Tsukichi's Dart-Tas Co., Ltd. was used.
  • NRSF / REST (aa39-55), NRSF / REST (aa64-80), NRSF / REST (aa38-57), NRSF / REST (aa68-83), NRSF / REST (aa42-56) and
  • the molecular weights of N—CoR (aa1829-1847) were 1739, 1937, 2053, 1790, 2182, and 1835 in this order, and confirmation was performed using the corresponding m / z.
  • NRSF / REST (aa39-55), NRSF / REST (aa64-80), NRSF / REST (aa38-57), NRSF / REST (aa68-83), NRSF / REST (aa42- 56) and N-CoR (aa1829-1847) are shown in SEQ ID NOs: 4, 6, 5, 7, 8, and 17, respectively.
  • NRSF / REST interaction candidate regions (aa43-83, 39-55, 38-57, 64-80, 68-83) S and ⁇ Ka ⁇ to N labeled PAHl aqueous MSin3B, Ri by measuring the ⁇ - 15 ⁇ HSQC, was determined region required for interaction.
  • pressurized example by changing phosphate buffer in concentration (pH 6.6) with 15 N mark t identified been mSin3B NRSF / REST to PAHl domain (aa42-56), a 1H-15 N HSQC The change in signal was observed.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence obtained by adding KKKK and W to the C-terminus of NRSF / REST (a.a.42-56).
  • Figure 4 shows the spin-spin coupling constant 3 J, 1 H-NOE between adjacent residues and the middle, chemistry
  • the PAH1 domain consists of four ⁇ -helix cars, From NOE, it was shown that there is a low V, region of mobility on the C-terminal side.
  • N-CoR in molar ratios of 1: 0, 1: 0.2, 1: 0.4, 1: 0.6, 1: 0.8, 1: 1, 1: against the PAH1 domain of O.lmM 15 N-labeled mSin3B 2 and 1: 3 were measured so that 1 H- 15 N HSQC was measured, and a part of the superposition spectrum was shown in Fig. 5.
  • concentration of N-CoR changes, the signal position shifts, indicating a fast exchange process with respect to the NMR time scale.
  • SID that binds to PAH2 domain (Sin3- Table 2 shows the consensus sequence for interaction domain. ⁇ is bulky hydrophobic residue, X is proline Represents any residue outside. Both the SID that binds to the PAH1 domain and the SID that binds to the PAH2 domain also have a characteristic hydrophobic amino acid force and are similar. However, in the SID sequence that binds to the PAH2 domain of mSin3B, there is a difference that the second ⁇ is A / V when it is a PAH1 domain, and there is no ⁇ on the C-terminal side of the PAH1 domain. .
  • NRSF / REST (aa43-56), N-CoR (aa1834- 1847), SID3 Madl (aa6-21) that binds to mSin3B PAH1, SID a) that binds to mSin3B PAH2, and mSin3A PAH2
  • SID b) to be bound are shown in SEQ ID NO: 9, 10, 2, 11, 12, and 13, respectively.
  • the PAH1 domain has been shown to be composed of four a-helix forces, and the PAH2 domain has also been shown to be composed of four alpha helices (van Ingen H et al. : Biochemistry, 43, 46-54 (2004), Swanson KA et al .: Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 738-746 (2004)) o
  • the homology of the amino acid sequences of PAH1 and 2 is also very high It was shown that the flexible loop between helices 2 and 3 in the PAH2 domain does not connect to the PAH1 domain and that there is a fixed loop region at the C-terminus of the PAH1 domain.
  • each of the PAH domains of mSin3 has different selectivity !, different affinity, and various interaction variations, thereby allowing various DNA-binding transcriptional regulators and coliforms. It can be combined with a presser to suppress transcription depending on the situation.
  • the PAH1 domain of mSin3B is composed of four a helices. And a fixed loop region not present in the PAH2 domain at the C-terminus.
  • the peptide and complex of the present invention can be used for the development of a neurological disease drug targeting the site of interaction with Sin3 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence necessary for interaction with mSin3 in NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 2 shows a common amino acid sequence necessary for interaction with mSin3 in NRSF / REST and N-CoR.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of residues 43-83 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of residues 39-55 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of residues 38-57 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of residues 64-80 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of residues 68-83 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 8 has Lys-Lys- Lys-Lys and Trp attached to the C-terminal side of residues 42-56 of NRSF / REST The added amino acid sequence is shown.
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of residues 43-56 of NRSF / REST.
  • SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of 1834-1847 residues of N-CoR.
  • SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of residues 6-21 of Madl.
  • SEQ ID NO: 12 shows the consensus sequence of SID that binds to the PAH2 domain of mSin3B.
  • SEQ ID NO: 13 represents the consensus sequence of SID that binds to the PAH2 domain of mSin3A.
  • SEQ ID NO: 14 shows the DNA sequence of the fragment of NRSF / REST (a.a.43-83) inserted into the BamHI-EcoRI site of pGEX-2T.
  • SEQ ID NO: 15 shows the DNA sequence of the fragment of the PAH1 domain (a. A.28-107) of mSin3B inserted into the Ndel-BamHI site of pET-28a.
  • SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of the PAH1 domain (a.a.28-107) of mSin3B.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of 1829-1847 residues of N-CoR.

Abstract

　NRSF/RESTのmSin3Bとの相互作用領域を特定した。下記のアミノ酸配列： Leu-Ile-Met-Leu-Ala-Asn-Val-Ala　　(I) を含む、アミノ酸残基数８～５０個のペプチド。

Description

明 細 書
神経特異的遺伝子発現に必須なアミノ酸配列
技術分野
[0001] 本発明は、神経特異的遺伝子発現に必須なアミノ酸配列を含むペプチド及び複合 体に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子は、適切な時期に適切な場所において、適切な量だけ発現することによつ て、生体内で正常な細胞、組織そして器官が形成され、正しい機能が発揮されること になる。 例えば、神経の遺伝子は、神経細胞において正しく発現されなければなら ず、非神経細胞では発現が起こってはならない。 NRSE/RE1 (neural restrictive silen cer element/ repressor element 1)は 21塩基対からなり、神経特異的遺伝子の近傍 に存在し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャネル、神経突起伸長関連分子など、 約 30種類以上の遺伝子の神経細胞特異的な転写制御の中核を担って 、るサイレン サーである。神経細胞では働かず、非神経細胞で神経特異的遺伝子の発現を抑え ることで、神経細胞における神経特異的な遺伝子の発現を保障している。また、神経 特異的遺伝子の発現制御に関与するだけでなぐ神経細胞の最終分化にも関与し ていると考えられている。この NRSE/RE1に結合し、非神経細胞での神経特異的遺伝 子の発現を抑える転写抑制因子として同定されたものが、神経選択的サイレンサー 結合因子 NRSF/RESTである。
[0003] 鳴瀬らによって、 NRSF/RESTの N末端側転写抑制ドメインは、コリプレッサー mSin3 を介して HDACをリクルートし、また C末端側のドメインでは CoRESTを介して HDACを リクルートし、クロマチン構造を不活性ィ匕することで、転写を抑制することが示唆され た (非特許文献 1)。
[0004] 非特許文献 1 :Naruse Y et al.： Proc.Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 現在までに NRSF/RESTの N末端は、 mSin3Bの PAH1ドメインと相互作用することが 本発明者らの研究室によって明ら力となっているが、具体的に N末端のどの残基が転 写抑制に必要なのか分力つて ヽな 、。
[0006] そこで、本発明は、 NRSF/RESTの mSin3Bとの相互作用領域を特定し、さらに NMR を用いた複合体の構造解析によって、原子レベルでの認識機構を明らかにすること を目的とする。
[0007] また、同じく mSin3Bとの相互作用が知られている転写コリプレッサー N- CoRを用い た実験や、構造既知ながん抑制因子 Madlと mSin3の PAH2ドメインの複合体との構造 比較から、転写抑制に関する新たな知見を得ることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 NRSF/RESTの相互作用候補領域を数種作成し，各々 15N標識され た mSin3Bの PAH1水溶液に添カ卩し、 'H-^N HSQCを測定することにより、相互作用に 必要な領域をおおまかに求めた。その後， NMRフィルタ一法によるタンパク質一タン パク質間の NOEの帰属結果から、 mSin3Bとの相互作用に必要な領域を特定した。本 発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
[0009] 本発明の要旨は以下の通りである。
[0010] (1) 下記のアミノ酸配列：
Leu- lie- Met- Leu- Ala- Asn-Va卜 Ala (配列番号 1) (I)
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチド。
[0011] (2) 配列 (I)の N末端側に Gin及び Z又は C末端側に Leuをさらに含む、（1)記載のぺ プチド。
[0012] (3) 配列 (I)の N末端側に Ala-Pro- Gin及び/又は C末端側に Leu-Thrをさらに含む 、（1)記載のペプチド。
[0013] (4) Sin3の PAH1ドメインと結合することができる、（1)〜（3)のいずれかに記載のぺ プチド。
[0014] (5) 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTの特定の領域と同一のアミノ酸 配列からなる、（1)〜（4)のいずれかに記載のペプチド。
[0015] (6) 配列番号 3、 4又は 5のいずれかのアミノ酸配列力 なる、（5)記載のペプチド。
[0016] (7) C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、（1)〜（6)のいずれかに記載のぺ プチド。
[0017] (8) さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、（7)記載のペプチド。
[0018] (9) 配列番号 8のアミノ酸配列力もなる、（8)記載のペプチド。
[0019] (10) 下記のアミノ酸配列：
Φ -X -X2- Φ 2-A -X3-A2-Ala (配列番号 2) (II)
(配列 (II)中、 Φ 1及び Φ2はそれぞれ独立に力さ高い疎水性アミノ酸残基であり、 X1、 X
2及び X3はそれぞれ独立に Pro以外の任意のアミノ酸残基であり、 A1及び A2はそれぞ れ独立に Ala又は Valである）
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチド。
[0020] (11) Sin3の PAH1ドメインと結合することができる、（10)記載のペプチド。
[0021] (12) 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/REST又は転写コリプレッサー N- Co
Rの特定の領域と同一のアミノ酸配列力もなる、（10)又は（11)に記載のペプチド。
[0022] (13) 配列番号 3、 4、 5又は 10のアミノ酸配列からなる、（12)記載のペプチド。
[0023] (14) C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、（10)〜（13)のいずれかに記載 のペプチド。
[0024] (15) さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、（14)記載のペプチド。
[0025] (16) 配列番号 8のアミノ酸配列力もなる、（15)記載のペプチド。
[0026] (17) (1)〜（16)のいずれかに記載のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとが形成する 複合体。
(18) 被験物質が、（1)〜（16)のいずれかに記載のペプチドと Sin3の PAH1ドメイン との相互作用に影響を与える力否かを測定することを含む、神経疾患の予防及び Z 又は治療に効果がある物質をスクリーニングする方法。
(19) (1)〜（16)のいずれかに記載のペプチド又はそれに対する抗体を利用して、 神経疾患を検出する方法。
[0027] 本明細書において、「サイレンサー」とは、遺伝子の転写を抑制するためのシスエレ メントをいう。サイレンサーは、転写活性ィ匕能をもつェンノヽンサ一と同様に、遺伝子本 体との位置、距離、そして方向に無関係に働く。サイレンサーにサイレンサー結合因 子が結合することによって、転写が抑制される。 NRSE/RE1は、神経系で初めて明ら かにされた細胞特異的発現制御に関わるサイレンサーである。
[0028] 「mSin3」とは、転写制御機構に関わる哺乳動物由来のスカフォールドタンパク質の 一つである。 Sin3は組織特異性がなぐ広く発現し、酵母からヒトまで高度に保存され ている。転写因子やコリプレッサー、メチルイ匕 CpG結合タンパク質といった、相互作用 の相手が異なる 4つの PAH (paired amphipathic helix)ドメインと HDAC相互作用ドメイ ンを有している（Xie AY et al.： J Virol, 76, 11809-11818 (2002)) 0 PAH1ドメインは、 4つの PAHドメインのうち最も N末端側にあるドメインで、転写コリプレッサー N- CoR等 と相互作用することが知られている（Heinzel T et al.： Nature, 387, 43-48 (1997), All and L et al.： Nature, 387, 49-55 (1997)) 0本明細書において、「Sin3(又は mSin3)の PAH1ドメイン」という時には、天然由来の配列からなるペプチドのみならず、それに他 の配列 (例えば、大腸菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にする ために付加する人工配列（例えば、 Gly-Ser-His-Metなど）が付カ卩したものも含まれる ものとする。 mSin3には、 mSin3Aと mSin3Bの 2つのアイソフォームがある（Heinzel T et al.： Nature, 387, 43—48 (1997)) 0
[0029] 「N- CoR」 (nuclear receptor co- repressor)とは、約 270kDaの転写コリプレッサーを いう。リガンドと結合していない状態の核内ホルモンレセプターは、 N- CoRを介して、 mSin3や HDACと複合体を形成し、転写を抑制している。相同性の高い関連因子に S MRTがある。
[0030] 卩1!"!- 15N HSQCJとは、共有結合した1 Hと15 Nの相関を示したスペクトルをいう。 'Η- 5^
HSQCにより、 Proと N末端を除いた主鎖アミドの NH (および一部の側鎖の NH)を観 測することができる。 15N HSQCは、安定同位体標識されたタンパク質の立体構 造決定や運動性の議論等を行う際、最も基本となるスペクトルである。相互作用解析 にも有効な手段となり、近年創薬における薬物候補ィ匕合物のスクリーニングにも利用 されている。
[0031] 後述の実施例においては、 {1H}-15Nの NOEを測定している力 {1H}-15Nの NOEの 強度変化は、タンパク質内部の15 N-1Hベクトルの運動を反映している。観測結果から 主鎖のダイナミクスが分り、タンパク質中で運動性の高いランダムな領域なの力、それ ともある一定の構造を形成した領域なのかを判断することができる。 NOEのある状態 とない状態のピーク強度比を用いて評価し、内部運動の大きさに応じてその値は小さ くなる。
[0032]
Figure imgf000007_0001
、て、塩基及びアミノ酸を略語で表示する場合、 IUPAC-I
UB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略語あるいは当分野における慣 用略語に基づいて記載する。その例を以下に記載する。
[0033] DNA:デォキシリボ核酸
A：アデニン
T:チミン
G:グァニン
C:シトシン
Ala又は A：ァラニン
Val又は V：パリン
Leu又は L:ロイシン
lie又は I：イソロイシン
Pro又は P:プロリン
Phe又は F：フエニノレアラニン
Trp又は W:トリプトファン
Met又は M:メチォニン
Gly又は G:グリシン
Ser又は S:セリン
Thr又は T:トレオニン
Cys又は C:システィン
Gin又は Q:グルタミン
Asn又は N:ァスパラギン
Tyr又は Y:チロシン
Lys又は K:リシン
Arg又は R:ァノレギニン
His又は H:ヒスチジン Asp又は D :ァスパラギン酸
Glu又は E:グルタミン酸
特に断りのない限り、塩基配列は 5'末端→3 '末端の方向で記載し、アミノ酸配列は N末端→C末端の方向で記載する。
発明の効果
[0034] 本発明により、神経の遺伝子発現に関わるタンパク質—タンパク質相互作用に必 要なアミノ酸配列が見出された。神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTは、 神経細胞では働かず、非神経細胞で神経特異的遺伝子の発現を抑えることで、逆 に神経細胞における神経特異的な遺伝子の発現を保障している（図 1)。この転写抑 制機構には， NRSF/RESTとコリプレッサー mSin3との相互作用が関与している。本発 明は， NRSF/RESTの中で mSin3との相互作用に必要なアミノ酸配列を特定した。
[0035] ダウン症、アルッノ、イマ一病、ハンチントン病と!/、つた神経変性疾患ゃ髄芽腫に、 N RSF/RESTや NRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が関与している。
[0036] ダウン症は、第 21染色体力 ¾本になったトリソミ一変異により生ずる病気である力 ダ ゥン症で死亡した胎児と正常な胎児の神経組織で、遺伝子の違!、を調べたところ、 神経突起伸長関連分子 SCG10をはじめ、 NRSF/RESTのターゲット遺伝子の発現が 大きく低下していた。一方、 NRSF/REST以外の転写因子で制御されているタンパク 質は正常に発現していた（Bahn S et al.： Lancet, 359, 310-315 (2002)) 0
[0037] アルツハイマー病は、 βアミロイドおよび神経原繊維変化の蓄積と、神経細胞の脱 落により生ずる病気である力 アルッノヽイマ一病脳において、 SCG10の発現に変動 が見られた（Okazaki T et al.： Neurobiol Aging, 16, 883-894 (1995))。
[0038] 髄芽腫は最も悪性の小児の脳腫瘍であるが、髄芽腫細胞中では、 NRSF/RESTの 発現レベルが非常に高い。 NRSF/RESTに拮抗し、 NRSF/RESTのターゲット遺伝子を 活性ィ匕する組み換えタンパク質 REST-VP16は、神経の遺伝子の発現を促進し、さら にカスパーゼカスケードを活性ィ匕することにより、アポトーシスを誘導する。 REST-VP 16は治療薬になる可能性を秘めている（Lawinger P et al.： Nature Med., 7, 826-831 (2000))。
[0039] ハンチントン病は、舞踏運動，痴呆，性格変化を主症状とした進行性の神経変性疾 患である力 グルタミン残基の繰り返し構造を持つ異常なハンチンチン分子力 凝集 体を形成することによって、神経細胞の変性をもたらすと考えられている。野生型の ハンチンチンは細胞質中で NRSF/RESTと結合し、 NRSF/RESTの NRSE/RE1への結 合を制御している。一方、ハンチントン病では、このコントロールが失われ、神経の遺 伝子の発現が十分に起こらない（Zuccato C et al.： Nature Genetics, 35, 76-83 (200 3)) o
[0040] NRSF/RESTは、神経細胞特異的な転写制御の中核を担って 、るため、上記以外 の神経性疾患にも関わっている可能性がある。
[0041] 神経変性疾患にはまだ根本的な治療法が存在しな!、。治療法の確立して!/、る髄芽 腫においても、腫瘍摘出手術後に^ | および全脊髄への放射線照射とともに化学 療法を行なうため、患者に対する負担が大きい。
[0042] ダウン症、アルッノ、イマ一病、ハンチントン病と!/、つた神経変性疾患ゃ髄芽腫には
、現在のところ NRSF/RESTの mSin3との相互作用部位をターゲットにした薬物はな!/ヽ ため、新規な作用機序の薬物開発が期待できる。
[0043] アルッノ、イマ一病は、主原因と考えられている βアミロイドの生成を抑えたり、除去 したりする薬の開発が行われている力 NRSF/RESTをターゲットにした薬剤を開発し た場合、それらとは異なる作用機序で働くと考えられる、新たな治療法開発の可能性 がある。髄芽腫では、 NRSF/RESTの mSin3との相互作用部位をターゲットにした薬剤 を開発することで、腫瘍摘出手術以外に治療法の選択肢が広がる可能性がある。 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願 (特願 2004-267770号） の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0044] [図 1]神経細胞での神経特異的遺伝子の発現と非神経細胞での神経特異的遺伝子 の発現抑制のモデル図。
[図 2]15N— mSin3B PAH 1単体と NRSF/REST
38-57、 NRSF/REST
43-83、 NRSF/REST お
39-55 よび NRSF/REST 存在下での1 H- 15N HSQC
42-56 。
[図 3]NRSF/REST を添カ卩した時の mSin3B PAH1の化学シフト変化。左から mSin3B
42-56
PAH1:NRSF/REST=1:0、 1:0.5、 1:1、 1:2。 [図 4]複合体中の mSin3B PAH1の構造情報と fH}- 15N NOE。
[図 5]N-CoRの滴定実験の重ね合わせのスペクトル。
発明を実施するための最良の形態
[0045] 以下、本発明をより詳細に説明する。
[0046] 本願の第 1発明は、下記のアミノ酸配列：
Leu- lie- Met- Leu- Ala- Asn-Va卜 Ala (配列番号 1) (I)
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチドを提供する。
[0047] 本願の第 1発明のペプチドのアミノ酸残基数は、 8〜50個であるが、好ましくは 10 〜40個であり、より好ましくは 15〜30個である。
[0048] 本願の第 1発明のペプチドにお 、て、配列 (I)の N末端側に Gin及び/又は C末端側 に Leuをさらに含んでもょ ヽ。あるいは、配列 (I)の N末端側に Ala-Pro- Gin及び/又は C末端側に Leu-Thrをさらに含んでもょ 、。
[0049] 本願の第 1発明のペプチドは、 Sin3の PAH1ドメインと結合することができるものであ るとよい。 Sin3としては、真核生物（例えば、酵母、ショウジヨウバエなど）哺乳動物（例 えば、ヒト、ラット、マウスなど）、両生類 (例えば、アフリカッメガエルなど）に由来する ものを例示することができる。 Sin3の PAH1ドメインとしては、マウス由来 mSin3Bの 31〜 98残基の領域（Spronk CA et al.： Nat. Struct. Biol, 7, 1100-1104 (2000))、ヒト由 来 Sin3Bの 38〜105残基の領域（Spronk CA et al.： Nat. Struct. Biol, 7, 1100-110 4 (2000))、ヒト由来 Sin3Aの 114〜189残基の領域（Brubaker K et al.： Cell, 103, 65 5-665 (2000))、マウス由来 mSin3Aの 120〜187残基の領域（Spronk CA et al.： Nat . Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000))などが知られており、本願の第 1発明のぺプチ ドはこれらのうちのどれと結合することができるものであってもよい。 Sin3の PAH1ドメイ ンは、天然由来の配列力 なるペプチドであっても、それに他の配列（例えば、大腸 菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にするために付加する人工 配列（例えば、 Gly- Ser- His- Metなど）が付カ卩したものであってもよい。
[0050] 配列 (I)は、 mSin3の PAH1ドメインと結合することができる NRSF/RESTの相互作用領 域に見出される共通配列である。例えば、配列 (I)は、ヒトの NRSF/RESTの 46-53残基 の領域に見出される。 [0051] 本願の第 1発明のペプチドは、神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTの特 定の領域 (例えば、 Sin3の PAH1ドメインと相互作用するアミノ酸残基を含む領域など )と同一のアミノ酸配列からなるものであってもよい。例えば、配列番号 3、 4及び 5の アミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ、ヒトの NRSF/RESTの 43-83残基、 39-55 残基及び 38-57残基の領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列力 なる。
[0052] 本願の第 1発明のペプチドは、 C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加したものであ つてもよい。これにより、ペプチドの溶解性を改善することができる。さらに、芳香環を 有するアミノ酸残基を付加してもよい。これにより、 UVによる濃度の定量を行うことが でさるよう〖こなる。
[0053] 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTの特定の領域 (42-56残基の領域） の C末端側に塩基性アミノ酸残基 (Lys- Lys- Lys- Lys)を付加し、さらに、芳香環を有 するアミノ酸残基 (Trp)を付カ卩したペプチドのアミノ酸配列の一例を配列番号 8に示す
[0054] 本願の第 2発明は、下記のアミノ酸配列：
Φ -X -X2- Φ 2-A -X3-A2-Ala (配列番号 2) (II)
(配列 (II)中、 Φ 1及び Φ2はそれぞれ独立に力さ高い疎水性アミノ酸残基であり、 X1、 X 2及び X3はそれぞれ独立に Pro以外の任意のアミノ酸残基であり、 A1及び A2はそれぞ れ独立に Ala又は Valである）
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチドを提供する。
[0055] Φ 1及び Φ 2の「かさ高い疎水性アミノ酸残基」としては、 Leu、 Ile、 Val、 Met, Phe、 Trp
、 Tyrを例示することができる。このうち、 Leu、 lieが好ましい。
[0056] X1、 X2及び X3のアミノ酸残基としては、 Ala、 Met, Leu、 Val、 Ile、 Phe、 Trp、 Glu、 Asp
、 Arg、 Lys、 His, Gln、 Asn、 Ser、 Thrを例示することができる。このうち、 Ala、 Met, He
、 Asp、 Asnが好ましい。
[0057] 本願の第 2発明のペプチドは、 Sin3の PAH1ドメインと結合することができるものであ るとよい。 Sin3としては、真核生物（例えば、酵母、ショウジヨウバエなど）哺乳動物（例 えば、ヒト、ラット、マウスなど）、両生類 (例えば、アフリカッメガエルなど）に由来する ものを例示することができる。 Sin3の PAH1ドメインとしては、マウス由来 mSin3Bの 31〜 98残基の領域（Spronk CA et al.： Nat. Struct. Biol, 7, 1100-1104 (2000))、ヒト由 来 Sin3Bの 38〜105残基の領域（Spronk CA et al.： Nat. Struct. Biol, 7, 1100-110 4 (2000))、ヒト由来 Sin3Aの 114〜189残基の領域（Brubaker K et al.： Cell, 103, 65 5-665 (2000))、マウス由来 mSin3Aの 120〜187残基の領域（Spronk CA et al.： Nat . Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000))などが知られており、本願の第 2発明のぺプチ ドはこれらのうちのどれと結合することができるものであってもよい。 Sin3の PAH1ドメイ ンは、天然由来の配列力 なるペプチドであっても、それに他の配列（例えば、大腸 菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にするために付加する人工 配列（例えば、 Gly- Ser- His- Metなど）が付カ卩したものであってもよい。
[0058] 配列 (II)は、 mSin3の PAH1ドメインと結合することができる NRSF/RESTの相互作用領 域及び N-CoRの相互作用領域に見出されるコンセンサス配列である。例えば、配列（ Π)は、ヒトの NRSF/RESTの 46- 53残基の領域、ヒトの N-CoRの 1837- 1844残基の領域 に見出される。
[0059] 本願の第 2発明のペプチドは、 C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加したものであ つてもよい。これにより、ペプチドの溶解性を改善することができる。さらに、芳香環を 有するアミノ酸残基を付加してもよい。これにより、 UVによる濃度の定量を行うことが でさるよう〖こなる。
[0060] 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTの特定の領域 (42-56残基の領域） の C末端側に塩基性アミノ酸残基 (Lys- Lys- Lys- Lys)を付加し、さらに、芳香環を有 するアミノ酸残基 (Trp)を付カ卩したペプチドのアミノ酸配列の一例を配列番号 8に示す
[0061] 本願の第 2発明のペプチドは、神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/REST又 は転写コリプレッサー N-CoRの特定の領域（例えば、 Sin3の PAH1ドメインと相互作用 するアミノ酸残基を含む領域など）と同一のアミノ酸配列力もなるものであってもよい。 例えば、配列番号 3、 4及び 5のアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ、ヒトの NR SF/RESTの 43-83残基、 39-55残基及び 38-57残基の領域のアミノ酸配列と同一のァ ミノ酸配列力もなる。また、配列番号 10のアミノ酸配列力もなるペプチドは、ヒトの転 写コリプレッサー N-CoRの 1834-1847残基の領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配 列からなる。
[0062] 本願の第 1発明及び第 2発明のペプチドは、公知の方法で製造することができる。
例えば、市販のペプチド合成機を用いて製造することができるし、慣用の遺伝子組換 え手法により製造することもできる。
[0063] 本願の第 1発明及び第 2発明のペプチドを構成するアミノ酸は、 D体、 L体、 DL体の いずれであってもよいが、天然に存在するアミノ酸は L体であることから、 L体が好まし い。
[0064] 本願の第 1発明及び第 2発明のペプチドは、 NRSF/RESTの Sin3との相互作用部位 をターゲットにした神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。例えば、様々な 神経変性疾患にぉ 、て、 NRSF/RESTや NRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発 現異常が見られるが、これらの遺伝子の発現を制御する薬物候補化合物のスクリー ニングに利用することができる。
[0065] 本願の第 3発明は、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメイン とが形成する複合体を提供する。
[0066] 本願の第 1発明及び第 2発明のペプチド、並びに Sin3の PAH1ドメインは上述した通 りである。
[0067] Sin3の PAH1ドメインは、慣用の遺伝子組換えの手法により製造することができる。マ ウス由来の mSin3Bの PAH1ドメインの塩基配列は、配列番号 15の 7番目〜246番目 の塩基からなる配列である。マウス由来の mSin3Bの PAH1ドメインのアミノ酸配列は配 列番号 16に示される。
[0068] 本願の第 3発明の複合体は、室温で、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドを Si n3の PAH1ドメイン水溶液に添加することにより製造することができる。本願の第 1発明 又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとのモル比は約 1： 1とするとよい。また 、 Sin3の PAH1ドメイン水溶液濃度は、 0.1mM〜2mMとするとよい。複合体の形成は N MRで確認することができる。
[0069] 本願の第 3発明の複合体は、 NRSF/RESTの Sin3との相互作用部位をターゲットに した神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。例えば、様々な神経変性疾患 にお!/、て、 NRSF/RESTや NRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が見ら れるが、これらの遺伝子の発現を制御する薬物候補化合物のスクリーニングに利用 することができる。
本願の第 4発明は、被験物質が、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの相互作用に影響を与えるか否かを測定することを含む、神経疾患 の予防及び Z又は治療に効果がある物質をスクリーニングする方法を提供する。 被験物質は、いかなる物質であってもよぐタンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖、 単糖、低分子化合物、核酸 (DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等)な どを例示することができる。
本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの相互作用に影響 を与える力否力を測定する方法の一例を以下に説明する。まず、被験物質の存在下 又は不存在下で、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの 相互作用を測定する。本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメイン との相互作用は、 X線結晶構造解析、核磁気共鳴 (NMR)、中性子回折などによる 原子レベルでの立体構造解析や電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などによる複合体の 形状を観察する方法、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドの立体構造及び Sin3 の PAH1ドメインの立体構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式を コンピュータでシミュレートするドッキングスタディなどの手法を用いることができる。次 に、被験物質の存在下における本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PA HIドメインとの相互作用と、被験物質の不存在下における本願の第 1発明又は第 2 発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの相互作用とを比較する。前者の相互作用と 後者の相互作用に有意差が見られた場合、被験物質は神経疾患の予防及び Z又 は治療に効果がある物質であると判定することができる。被験物質は、本願の第 1発 明又は第 2発明のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの相互作用を強める力もしれない し、弱める力もしれない。神経疾患としては、 NRSF/RESTが関与する疾患を挙げるこ とができ、具体的には、ダウン症、アルッノヽイマ一病、ハンチントン病などの神経変性 疾患、髄芽腫などを挙げることができる。
本願の第 5発明は、本願の第 1発明若しくは第 2発明のペプチド又はそれに対する 抗体を利用して、神経疾患を検出する方法を提供する。 例えば、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドを用いて、被験者から採取した生 検試料における Sin3若しくは Sin3の PAH1ドメインの発現を調べることにより、神経疾 患を検出することができる。あるいはまた、本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドに 対する抗体を用いて、被験者力も採取した生検試料における NRSF/RESTの発現を 調べることにより、神経疾患を検出することができる。
被験者力 採取する生検試料としては、神経組織、神経以外の組織、羊水、血液、 髄液などを挙げることができる。
神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTは、神経細胞特異的な遺伝子の転 写制御の中核を担っている NRSE/RE1に結合する、転写制御因子である。様々な神 経変性疾患にぉ 、て， NRSF/RESTや NRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現 異常が見られる（上述)。
本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドを用いて、被験者力 採取した生検試料 における Sin3若しくは Sin3の PAH1ドメインの発現を調べる場合には、色素、放射性元 素、酵素などでペプチドを標識するとよい。例えば、ピオチン標識したペプチドを巿 販のストレブトアビジンを固定したカラムに添加し、ピオチン アビジン相互作用を利 用して、ペプチドをカラムに固定ィ匕する。次に神経組織の抽出液をそのカラムに添カロ し、 Sin3をカラムに吸着させる。 6 M塩酸グァ-ジンによる変性処理を行った後、 Sin3 の発現量を調べる。発現量に正常値と比べて有意差がある場合は、ダウン症やアル ッハイマー病などの神経変性疾患の疑いがある。
本願の第 1発明又は第 2発明のペプチドに対する抗体を用いて、被験者力 採取 した生検試料における NRSF/RESTの発現を調べる場合には、ウェスタンブロット法、 免疫組織化学分析法、 ELISA法などの手法を用いるとよい。使用する抗体は、測定 の対象となるタンパク質を特異的に認識する抗体であるとよい。抗体は、モノクローナ ル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で 製造することができる。
ウェスタンプロット法で測定する場合には、抗体は、 1251標識プロテイン A、ペルォキ シダーゼ結合 IgGなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定す る場合には、抗体は、蛍光色素、フヱリチン、酵素などで標識するとよい。 ELISA法で 測定する場合には、抗体は、ペルォキシダーゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素で標識 するとよ 、。
例えば、髄液における NRSF/RESTの発現レベルが高ければ、髄芽腫であると判定 してもよい。また、神経細胞核内における NRSF/RESTの発現レベルが高ければ、ノ、 ンチントン病などの神経疾患の疑 、がある。
実施例
[0070] 以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発 明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
[0071] 〔実施例 1〕
『実験方法』
1)試料調製
a) NRSF/REST(a.a.43- 83)及び mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28- 107)の調製
公表されている配列データをもとに RT-PCR法によって NRSF/REST及び mSin3Bの c DNAを得た（Naruse Y et al.： Proc.Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999))。 得られた cDNAをインビトロジェン (株）社製 TAクローユングベクターにサブクローニン グした。次にアマシャムバイオサイエンス (株)社製 GST融合タンパク質発現用べクタ 一 (pGEX-2T)の BamHト EcoRIサイトに NRSF/REST(a.a.43- 83)のフラグメントを挿入 し、大腸菌 BL21(DE3)株（Novagen社製）に形質転換した。同様に Novagen社製 His タグタンパク質発現用ベクター（pET-28a)の Ndel-BamHIサイトに mSin3Bの PAH1ドメ イン (a.a.28-107)のフラグメントを挿入し、大腸菌 BL21(DE3)株に形質転換した。液体 培地中、 37°Cで培養し、和光純薬工業 (株）社製 isopropy卜 β -D- thiogalactopyranosi deにより発現誘導を行った。集菌、菌体破砕処理後、破砕上清に対して順に、ァフィ 二ティクロマトグラフィー、トロンビンによる GST及び Hisタグ切断、ゲルろ過クロマトダラ フィ一の各処理を行い、 目的試料を得た。試料の同定にはブルカー'ダルト-タス社 製質量分析装置 BIFLEXまたは AutoFLEXを用いた。 NRSF/REST(a.a.43- 83)の分子 量は 4511、 mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28-107)の分子量は 9585であり、相当する m/z により確認を行った。また、大腸菌を15 NH C1を唯一の窒素源、 13C-グルコースを唯一
4
の炭素源とする M9最小培地で培養することにより、 mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28-10 7)の13 C/15Nもしくは15 N標識体を得た。多核多次元 NMR法によって矛盾無く帰属が行 えることから mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28-107)の確認ができた。
[0072] pGEX-2Tの BamHI- EcoRIサイトに挿入した NRSF/REST(a.a.43- 83)のフラグメントの DNA配列を配列番号 14に示す。配列番号 14の 1番目〜6番目の塩基からなる配列（ GGATCC)は BamHIサイトであり、 7番目〜129番目の塩基からなる配列は NRSF/RE ST(a.a.43-83)の DNA配列であり、 131番目〜136番目の塩基からなる配列 (GAATT C)は EcoRIサイトである。 NRSF/REST(a.a.43-83)のアミノ酸配列は配列番号 3に示す
[0073] pET- 28aの Ndel- BamHIサイトに挿入した mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28- 107)のフラ グメントの DNA配列を配列番号 15に示す。配列番号 15の 1番目〜6番目の塩基から なる配列 (CATATG)は Ndelサイトであり、 7番目〜246番目の塩基からなる配列は mSi n3Bの PAH1ドメイン (a.a.28- 107)の DNA配列であり、 250番目〜 255番目の塩基力 なる配列 (GGATCC)は BamHIサイトである。 mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28- 107)のァ ミノ酸配列は配列番号 16に示す。
[0074] b)合成ペプチドの調製
NRSF/REST(a.a.39— 55)、 NRSF/REST(a.a.64— 80)、 NRSF/REST(a.a.38— 57)、 NRSF/ REST(a.a.68- 83)、 NRSF/REST(a.a.42- 56)および N- CoR (a.a.1829 -1847)は、常法 のペプチド合成法で合成し、精製した。試料の同定にはアプライドバイォシステムズ 社製 Voyager- DEまたはブル力一'ダルト-タス社製質量分析装置 BIFLEXまたは Aut oFLEXを用いた。 NRSF/REST(a.a.39— 55)、 NRSF/REST(a.a.64— 80)、 NRSF/REST(a. a.38— 57)、 NRSF/REST(a.a.68— 83)、 NRSF/REST(a.a.42— 56)および N— CoR (a.a.1829 -1847)の分子量は順に、 1739、 1937、 2053、 1790、 2182、 1835であり、相当する m/z により確認を行った。
[0075] NRSF/REST(a.a.39— 55)、 NRSF/REST(a.a.64— 80)、 NRSF/REST(a.a.38— 57)、 NRSF/ REST(a.a.68- 83)、 NRSF/REST(a.a.42- 56)および N- CoR (a.a.1829 -1847)のアミノ酸 配列をそれぞれ配列番号 4、 6、 5、 7、 8および 17に示す。
[0076] 2)相互作用実験
NRSF/RESTの相互作用候補領域（a.a.43-83、 39-55、 38-57、 64-80、 68-83)を各 々 N標識された mSin3Bの PAHl水溶液に添カ卩し、 Ή-15Ν HSQCを測定することによ り、相互作用に必要な領域を求めた。結合比を調べるため、リン酸緩衝液中 (pH 6.6) で15 N標 t識された mSin3Bの PAHlドメインに NRSF/REST (a.a.42-56)を濃度を変えて加 え、 1H-15N HSQCによりシグナルの変化を観測した。なお、 NRSF/REST(a.a.42-56) は難溶性であるため、 C末端側に塩基性残基 (KKKK)を付加して溶解性を改善し、更 に UVによる濃度の定量を行うために芳香環を有する残基 (W)を付ける工夫をした。同 様に15 N標識された mSin3Bの PAH1ドメインと N- CoR (a.a.1829-1847)との相互作用を1 H-15N HSQCにより観測した。 NMR測定には全てブルカー社製 Avance 700を用いた
[0077] NRSF/REST(a.a.42-56)の C末端に KKKK及び Wを付カ卩したアミノ酸配列を配列番 号 8に示す。
[0078] 3)複合体の構造解析
多核多次元 NMR法により、 20mMリン酸緩衝液中 (pH 7.5)、温度 293Kで mSin3Bの P
AH1ドメインと NRSF/REST(a.a.38- 57)の構造解析を行った。 mSin3Bの PAH1ドメイン の化学シフト値とランダムコイルの化学シフト値力 化学シフトインデックスを作成し、 二次構造の傾向を予測した。また、 fH}-15N NOEを測定し、分子内運動から構造に 関する情報を得た。
[0079] 『実験結果』
1) NRSF/RESTの mSin3Bの PAH1ドメインとの相互作用領域の特定
表 1で下線を引いた残基を有する試料は、 1H-15N HSQC測定において図 2右に示 すような複合体のスペクトルを与えた。
[0080] 表 1.相互作用実験に用いた配列
[0081] [表 1]
NRS F / REST ス ク 1
APQL IMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNN 複合体
Figure imgf000018_0001
AELAAPQLIMLANVALT 複合体
3 8 - 57 KAELAAPQL IMLANVALTGE 複合体
DYLVGEERQMAELMPVG 単体
GEERQMAELMPVGDNN 単体
AAPQL IMLANVALTGKKKKW 複合体 [0082] 2) NRSF/REST(a.a.42-56)の滴定実験
O.lmMの15 N標識された mSin3Bの PAH1ドメインに対して、 NRSF/REST (a.a.42- 56) をモル比で 1:0、 1:0.5、 1:1、 1:2になるように添カ卩した時の1 H-15N HSQCを測定し、そ のスペクトルの一部を図 3に示した。 NRSF/RESTの濃度が増えるに従って、 mSin3B単 体のシグナルは消失し、複合体中の mSin3B由来の新たなシグナルが現れた。 NMR のタイムスケールに対して遅い交換過程であることが示された。また、 mSin3B PAH1: NRSF/REST力 l:lの場合と 1:2の場合では、差は認められなかった。よって、 mSin3B の PAH1ドメインと NRSF/RESTは 1:1で複合体を形成することが示された。
[0083] 3)複合体中の mSin3Bの PAH1ドメインの二次構造
図 4にスピン スピン結合定数3 J 、隣接残基間および中位の1 H- NOE、化学
ΗΝΗ α
シフトインデックス、
Figure imgf000019_0001
ΝΟΕ、予測された二次構造の結果を示した。 PAH1ドメイ ンは 4本の αヘリックスカゝら構成され、
Figure imgf000019_0002
NOEより、 C末端側に運動性の低 V、領域があることが示された。
[0084] 4)コリプレッサー N- CoRと mSin3Bの PAH1ドメインの相互作用実験
O.lmMの15 N標識された mSin3Bの PAH1ドメインに対して、 N- CoRをモル比で 1:0、 1: 0.2、 1:0.4、 1:0.6、 1:0.8、 1:1、 1:2、 1:3になるように添カロした時の1 H-15N HSQCを測定 し、それらの重ね合わせのスペクトルの一部を図 5に示した。 N- CoRの濃度変化に従 つて、シグナルの位置がシフトし、 NMRのタイムスケールに対して速い交換過程であ ることが示された。
[0085] 『討論』
NRSF/REST 43- 55残基を含む試料は、 mSin3Bの PAH1ドメインと NMRによる構造解 析可能な 1 : 1の安定な複合体を形成することが分力つた。また、 N-CoR(a.a.1829-18 47)は NRSF/RESTよりも弱いながら、 PAH1ドメインと相互作用することが判明した。こ れらの配列およびコンセンサス配列と、 Madlと mSin3の PAH2ドメインの複合体の立体 構造を基に Vuisterらのグループ (a)と Radhakrishnanらのグループ (b)が提唱している（ van Ingen H et al.： Biochemistry, J, 4り- 54 (2004)、 Swans on KA et al.： Nat. Struc t. Mol. Biol, 11, 738-746 (2004))、 PAH2ドメインに結合する SID (Sin3- interaction d omain)のコンセンサス配列を表 2に示した。 Φはかさ高い疎水性残基、 Xはプロリン以 外の任意の残基を表す。 PAH1ドメインに結合する SIDと、 PAH2ドメインに結合する SI Dは共に特徴的な疎水性アミノ酸力も構成されており、類似している。しかし、 mSin3B の PAH2ドメインに結合する SIDの配列において、 2番目の Φが PAH1ドメインの場合で は A/Vになっており、また PAH1ドメインの C末端側には Φが無い、という違いがある。
[0086] 表 2. mSin3に結合する SIDのコンセンサス配列
[0087] [表 2]
Figure imgf000020_0001
[0088] NRSF/REST (a.a.43- 56)、 N- CoR (a.a.1834- 1847)、 mSin3B PAH1に結合する SIDゝ Madl (a.a.6- 21)、 mSin3B PAH2に結合する SID a)及び mSin3A PAH2に結合する SID b)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 9、 10、 2、 11、 12及び 13に示す。
[0089] PAH1ドメインは 4本の aヘリックス力も構成されて 、ることが示され、また PAH2ドメイ ンも 4本の αヘリックスから構成されていることが示されている（van Ingen H et al.： Bi ochemistry, 43, 46-54 (2004)、 Swanson KA et al.： Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 738- 746 (2004)) o PAH1と 2のアミノ酸配列の相同性も非常に高レ、が、 PAH2ドメインにある ヘリックス 2と 3の間のフレキシブルなループは PAH1ドメインにはなぐまた PAH1ドメイ ンの C末端には固定されたループ領域が存在することが示された。
[0090] 以上のように mSin3の各 PAHドメインに、選択性の違!、や、親和性の違 、と 、つた相 互作用のバリエーションをもたせることによって、様々な DNA結合性転写制御因子や コリプレッサーと結合し、状況に応じた転写抑制を行うことができるのであろう。
[0091] 『まとめ』
1) NRSF/REST (a.a.38- 57)と mSin3Bの PAH1ドメインは、 1: 1で複合体を形成すること を確認した。
[0092] 2)複合体の構造解析から、 mSin3Bの PAH1ドメインは 4つの aヘリックスから構成され ていることと、 C末端に PAH2ドメインにはない、固定されたループ領域が存在すること を示した。
[0093] 3) mSin3Bの PAH1ドメインに結合する SIDのコンセンサス配列を提示した。 PAH1ドメイ ンの SIDは PAH2ドメインの SIDと認識配列が異なっていることが分かった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0094] 本発明のペプチド及び複合体は、 NRSF/RESTの Sin3との相互作用部位をターゲッ トにした神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。
配列表フリーテキスト
[0095] <配列番号 1 >
配列番号 1は、 NRSF/RESTにおける、 mSin3との相互作用に必要なアミノ酸配列を 示す。
<配列番号 2 >
配列番号 2は、 NRSF/REST及び N-CoRにおける、 mSin3との相互作用に必要な共 通のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 3 >
配列番号 3は、 NRSF/RESTの 43-83残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 4>
配列番号 4は、 NRSF/RESTの 39-55残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、 NRSF/RESTの 38-57残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 6 >
配列番号 6は、 NRSF/RESTの 64-80残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 7>
配列番号 7は、 NRSF/RESTの 68-83残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 8 >
配列番号 8は、 NRSF/RESTの 42-56残基の C末端側に Lys-Lys- Lys-Lysと Trpを付 加したアミノ酸配列を示す。
<配列番号 9 >
配列番号 9は、 NRSF/RESTの 43-56残基のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 10 >
配列番号 10は、 N- CoRの 1834- 1847残基のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 11 >
配列番号 11は、 Madlの 6-21残基のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 12 >
配列番号 12は、 mSin3Bの PAH2ドメインに結合する SIDのコンセンサス配列を示す。 く配列番号 13 >
配列番号 13は、 mSin3Aの PAH2ドメインに結合する SIDのコンセンサス配列を示す く配列番号 14 >
配列番号 14は、 pGEX-2Tの BamHI- EcoRIサイトに挿入した NRSF/REST(a.a.43- 83 )のフラグメントの DNA配列を示す。
く配列番号 15 >
配列番号 15は、 pET- 28aの Ndel- BamHIサイトに挿入した mSin3Bの PAH1ドメイン (a. a.28-107)のフラグメントの DNA配列を示す。
<配列番号 16 >
配列番号 16は、 mSin3Bの PAH1ドメイン (a.a.28-107)のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 17 >
配列番号 17は、 N- CoRの 1829-1847残基のアミノ酸配列を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 下記のアミノ酸配列：
Leu- lie- Met- Leu- Ala- Asn-Va卜 Ala (配列番号 1) (I)
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチド。
[2] 配列 (I)の N末端側に Gin及び/又は C末端側に Leuをさらに含む、請求項 1記載のぺ プチド。
[3] 配列 (I)の N末端側に Ala-Pro- Gin及び/又は C末端側に Leu-Thrをさらに含む、請求 項 1記載のペプチド。
[4] Sin3の PAH1ドメインと結合することができる、請求項 1〜3のいずれかに記載のぺプ チド。
[5] 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/RESTの特定の領域と同一のアミノ酸配列 力もなる、請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチド。
[6] 配列番号 3、 4又は 5の 、ずれかのアミノ酸配列からなる、請求項 5記載のペプチド。
[7] C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、請求項 1〜6のいずれか〖こ記載のぺプチ ド、。
[8] さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、請求項 7記載のペプチド。
[9] 配列番号 8のアミノ酸配列力 なる、請求項 8記載のペプチド。
[10] 下記のアミノ酸配列：
Φ -X -X2- Φ 2-A -X3-A2-Ala (配列番号 2) (II)
(配列 (II)中、 Φ 1及び Φ2はそれぞれ独立に力さ高い疎水性アミノ酸残基であり、 X1、 X 2及び X3はそれぞれ独立に Pro以外の任意のアミノ酸残基であり、 A1及び A2はそれぞ れ独立に Ala又は Valである）
を含む、アミノ酸残基数 8〜50個のペプチド。
[II] Sin3の PAH1ドメインと結合することができる、請求項 10記載のペプチド。
[12] 神経選択的サイレンサー結合因子 NRSF/REST又は転写コリプレッサー N- CoRの特 定の領域と同一のアミノ酸配列からなる、請求項 10又は 11に記載のペプチド。
[13] 配列番号 3、 4、 5又は 10のアミノ酸配列力もなる、請求項 12記載のペプチド。
[14] C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、請求項 10〜 13のいずれかに記載のぺ プチド。
[15] さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、請求項 14記載のペプチド。
[16] 配列番号 8のアミノ酸配列力もなる、請求項 15記載のペプチド。
[17] 請求項 1〜16のいずれかに記載のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとが形成する複合 体。
[18] 被験物質が、請求項 1〜16のいずれかに記載のペプチドと Sin3の PAH1ドメインとの 相互作用に影響を与えるか否かを測定することを含む、神経疾患の予防及び Z又は 治療に効果がある物質をスクリ一二ングする方法。
[19] 請求項 1〜16のいずれかに記載のペプチド又はそれに対する抗体を利用して、神 経疾患を検出する方法。
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