KR20000054037A - 열 및 산에 안정한 새로운 유산균 락토바실러스헬베티쿠스 ｂｒｄ-001 및 고농도 배양방법 - Google Patents

열 및 산에 안정한 새로운 유산균 락토바실러스헬베티쿠스 ｂｒｄ-001 및 고농도 배양방법 Download PDF

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Abstract

내산성, 내담즙성 및 내열성을 가지는 락토바실러스속의 새로운 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001) 및 이를 고농도로 배양하는 방법에 관한 것이다. 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001은 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수하여 각종 식품, 의약품등에 사용될 수 있으며 또한 생균제로서 사료첨가제로 이용될 수 있다. 변형된 MRS액체배지를 사용하여 유가배양함으로써 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001를 고농도로 배양할 수 있다.

Description

열 및 산에 안정한 새로운 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스 ＢＲＤ-001 및 고농도 배양방법{NOVEL STRAIN LACTOBACILLUS HELVETICUS BRD-001 HAVING THERMAL AND ACID RESISTANCE AND A CULTIVATING METHOD WITH HIGH CONCENTRATION }
본 발명은 새로운 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobacillus helveticus BRD-001) 및 그의 고농도 배양방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 돼지의 분변으로부터 분리된 새로운 유산균으로 내산성, 내담즙성 및 내열성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001 및 그의 고농도 배양방법에 관한 것이다.
사람의 장에는 보통 약 100조(兆)개의 장내세균이 존재하며 그 종류도 400종 이상이다. 그 중 장내세균을 구성하고 있는 구균중에서 비피더스(Bifidus)균을 포함한 유산균은 숙주에 대하여 유해한 대사산물을 생성하지 않으며 유해세균의 증식을 억제하는 정장작용을 한다. 즉, 유산균은 장내 세균의 개선과 정장작용, 장내 부패산물 억제, 암의 억제효과, 변비와 설사의 예방, 영양분의 소화흡수 증진 효과, 비타민 합성 및 이밖에도 장내에서 스테롤(sterol)물질을 성장에 이용함으로써 장으로부터 콜레스테롤 섭취를 감소시켜 순환기 계통의 건강 유지에 도움을 주는 것으로 알려져있다.
유산균의 선택 분리시 조건은, 첫째 내산성 및 내답즙성으로 위산에서 살아남아 장까지 도달할 수 있는 장도달성이 중요하다. 그 해결 방안으로 현재 여러물질로 코팅된 유산균에 대한 제품이 출시되고 있다. 둘째로 항생제 내성으로 각종 항생제 복용자가 유산균을 섭취했을 때 유산균이 장에 정착할 수 있어야한다. 또한 장내환경과 같이 통성 혐기성 조건하에서 성장이 우수하여야한다.
프로바오틱 유산균은 현재 세계의 여러나라에서 개발되어 발효유, 대두발효 식품, 아이스크림, 발효 소세지, 사료 첨가제 등 다양한 제품에 활용되고 있으며 또한 소화기질환의 치료, 유당의 소화촉진, 변비의 완화, 항암, 혈중 콜레스테롤 농도 감소 및 면역기능 활성화 등의 효과를 갖는다는 임상실험의 보고가 늘어남에 따라 일본 및 구미 각국을 비롯한 세계각국에서는 프로바이오틱 유산균을 활용하는 각종 식품, 의약품 및 사료 첨가제가 계속적으로 개발되고 있으며, 그 소비가 계속적으로 증가되는 추세이다.
국내에서 프로바이오틱스 제품들은 약 1000억원 정도의 시장규모를 형성하고 있으며 이들 중의 대부분은(약 90%추정) 외국에서 수입된 종균원말을 가공 포장하고 있는 실정이다.
우리 나라에서도 건강에 대한 인식이 날로 늘어가고, 자연식품에 대한 선호라든가, 항생제의 남용으로 인한 항생제 내성문제 등으로 인한 프로바이오틱스의 사용이 권장되고 있으나 대부분의 프로바이오틱스가 외국에서 수입한 생균 원료를 사용하여 제제화하고 있기 때문에 이러한 생균제의 수입대체 및 국내에서의 프로바이오틱 균주의 자체개발과 생산기술축적이 요구된다.
따라서 통성 혐기적 조건에서의 성장이 우수하고 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수한 균주를 순수분리하는 것이 필요하다. 이에 본 발명자들은 상기의 조건들을 만족시키는 유산균을 탐색하기위해 돼지 및 유아의 분변으로부터 균주의 분리를 실시하여, 내산성, 내담즙성 및 내열성이 있는 균주를 분리하고 분리된 균주의 형태적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 이 균주가 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobaillus helveticus)의 새로운 균주임을 확인하였다.
본 발명의 목적은 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수한 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 유효성분으로하는 건강식품 및 의약품을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 생균제로 사용하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 고농도로 배양하기위한 배지조성 및 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1견지에 의하면,
내산성, 내담즙성 및 내열성을 가지는 락토바실러스속의 새로운 유산균 균주 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001)을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2견지에 의하면,
락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 유효성분으로하는 건강식품이 제공된다.
본 발명의 제 3견지에 의하면,
락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 유효성분으로하는 의약품이 제공된다.
본 발명의 제 4견지에 의하면,
락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 생균제로 사용하는 사료첨가제가 제공된다.
본 발명의 제5견지에 의하면,
효모추출물 0.1∼0.5%, 육즙추출물 0.1∼0.5%, 펩톤 0.3∼0.7%, 포도당 0.1∼0.7%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.05∼0.4%, 암모늄 나이트레이트 0.03∼0.2%, 소디움 아세테이트 0.1∼0.4%, 마그네슘 술페이트 0.01∼0.05% 및 망간 술페이트 0.01∼0.03%(pH 7.0)로 구성된 상기 유산균의 고농도 배양을 위한 변형된 유가배양 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 액체배지 조성물이 제공된다.
본 발명의 제6견지에 의하면,
효모추출물 0.1∼0.5%, 육즙추출물 0.1∼0.5%, 펩톤 0.3∼0.7%, 포도당 0.1∼0.7%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.05∼0.4%, 암모늄 나이트레이트 0.03∼0.2%, 소디움 아세테이트 0.1∼0.4%, 마그네슘 술페이트 0.01∼0.05% 및 망간 술페이트 0.01∼0.03%(pH 7.0)로 이루어진 MRS 액체배지를 발효조에 넣고 121℃이상에서 30~60분간 가압하여 살균하는 단계;
상기 MRS 액체배지를 20~45℃로 냉각하고 유산균을 접종하는 단계;
그 후 상기 혼합물을 20~45℃, 0.5∼1.0VVM의 에어공급 및 150∼300RPM 교반속도하의 발효조에서 배양하는 단계;
배양후 15∼20시간에서 효모추출물과 포도당이 1:2~1:6중량비로 조합된 유가배지 0.1~10리터를 1~24시간동안 일정한 속도로 공급하는 단계;
로 구성된 상기 유산균의 고농도 배양을 위한 유가배양방법이 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명자들은 평택, 안성, 대부도일대의 토양시료를 채취하였고 또한 양돈 및 자돈의 가검물과 0.8세 미만의 유아의 분변을 채취하여, 시료를 멸균 생리 식염수에 넣고 진탕한 후 정치한 후, 정치된 시료액의 상등액을 취하여 희석하고 그 희석액을 MRS배지에 도말하여 40℃에서 48∼72시간 배양하여 생긴 균체를 순수 선발하여 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수한 새로운 균주를 발견하였다.
상기에서 선별된 균주를 배양하여 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 분석한 결과, 그 중에서 자돈의 가검물에서 분리된 본 발명의 균주가 MRS고체배지에서 최대지름 2mm이내의 유백색의 원형집락을 형성하고 0.54∼0.55 ×1.1∼2.72 ㎛의 크기를 갖는 운동성이 없고 포자를 형성하지 않는 간균으로서 20℃로부터 45℃까지의 온도범위에서 생육가능하였다.
생리학적 특성으로는 D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스 (D-Galactose), D-락토오스(D-Lactose)로부터 산생성능을 보였고 D-아미그달린(D-Amygdalin), L-아라비노스(L-arabinose), 셀로비오스(cellobiose), 에스쿨린 (Esculin), D-글루코네트(D-gluconate), D-만니톨(D-mannitol), 멜레지토오스 (melezitose), 멜리비오스(melibiose), 라피노오스(raffinose), L-람노오스(L-rhamnose), D-리보스(D-ribose), 살리신(salicin), L-솔비톨(L-sorbitol), D-자일로오스(D-xylose)로부터는 산생성능을 나타내지 않았다.
이러한 특성은 표 1 및 표 2에서 비교한 바와 같이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobaillus helveticus)의 형태학적, 생리학적 및 배양학적 특성과 매우 유사하였다. 이에 본 발명자들은 이 균주를 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001)로 명명하고 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 4월 10일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 8998P).
형태 및 배양학적 특성
락토바실러스 헬베티쿠스 선발균주 BRD-001
형태학적 특성
크기(㎛) 0.5-0.7 × 2-3 0.54-0.55 × 1.1-2.72
포자 형성 않음 형성 않음
배양학적 특성
온도(℃) 15 성장 안함 성장안함
20 성장 성장
30 성장 성장
40 성장 성장
50 성장 성장
가스(CO2)생산능 없음 없음
운동성 없음 없음
당 이용 생리적 특성
산 생산능 락토바실러스 헬베티쿠스 선발균주 BRD-001
아미그 다알린 이용하지않음 이용하지않음
L-아라비노오스 이용하지않음 이용하지않음
셀로비오스 이용하지않음 이용하지않음
에스클린 이용하지않음 이용하지않음
푸락토오스 변하기쉬움 변하기쉬움
D-갈락토오스 있음 있음
D-글루코오스 있음 있음
글루코네이트 이용하지않음 이용하지않음
락토오스 있음 있음
말토오스 변하기쉬움 변하기쉬움
만니톨 이용하지않음 이용하지 않음
만노오스 변하기쉬움 변하기쉬움
멜레지토오스 이용하지않음 이용하지않음
멜리비오스 이용하지않음 이용하지않음
라피노오스 이용하지않음 이용하지않음
L-람노오스 이용하지않음 이용하지않음
D-리보오스 이용하지않음 이용하지않음
살리신 이용하지않음 이용하지않음
솔비톨 이용하지않음 이용하지않음
슈크로스 변하기쉬움 변하기쉬움
알파, 알파-트레할로오스 변하기쉬움 변하기쉬움
D-자일로오스 이용하지않음 이용하지않음
분리된 본 발명의 균주에 대한 산성 용액(pH2.5의 인산완충액)에서, 본 발명의 균주 생존율은 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼보다 10배이상더 높아 위산조건에서 내산성이 우수함을 알 수 있었다.
본 발명 균주에 대한 담즙 내성시험에서, 담즙산 농도를 0.15%, 0.2%로 한 경우 본 발명의 균주 생존율이 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼보다 20~30%이상 더 높아 담즙산의 인체내 농도 0.1%-0.3%에서 내담즙성이 우수함을 알 수 있었다.
또한, 내열성 시험에서 70℃에서 15분동안 정치한 결과 대조구는 약 1×102CFU/㎖개의 균주가 생존하였으며, 본 발명의 균주는 4.0×104CFU/㎖개의 균주가 생존하여 매우 우수한 열 안정성을 나타내었다.
본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001은 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수하여 정장제 또는 생균제로 사용될 경우 장내 세균의 개선과 정장작용, 장내 부패산물 억제, 암의 억제효과, 변비와 설사의 예방 및 영양분의 소화흡수 증진 효과를 기대할 수 있다. 따라서 본 발명의 균주는 유산균을 유효성분으로 하는 건강식품, 의약품 및 유산균을 생균제로 사용하는 시료첨가제등에 이용된다.
나아가 본 발명은 본 발명의 유산균을 고농도로 배양하기위한 유가배지조성 및 유가배양방법을 제공한다.
상기 유산균의 고농도 배양을 위하여 효모추출물 0.1~0.5중량%, 육즙추출물 0.1~0.5중량%, 펩톤 0.3~0.7중량%, 포도당 0.1~0.7중량%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.05~0.4중량%, 암모늄 나이트레이트 0.03~0.2중량%, 소디움 아세테이트 0.1~0.4중량%, 마그네슘 술페이트 0.01~0.05중량%, 망간 술페이트 0.01~0.03중량%(pH 7.0)로 이루어진 MRS 액체배지를 변화시킨 초기배지를 발효조에 넣고 일반적인 멸균조건하의 121℃이상에서 30~60분동안 살균한 다음 유산균 배양에 적절한 온도인 20~45℃로 냉각하고 상기 종배양균을 무균상태에서 접종한다.
이와 같은 배지조성은 여러번의 반복실험을 통해 최적의 조성을 얻어진것이며, 특히 상기 변형된 MRS 초기 액체배지는 유산균의 유가배양을 위해 유산균의 성장을 저해하는 젖산등의 부산물(byproduct)생성을 억제하도록 탄소원과 질소농도가 보다 낮은 농도로 변형된 것이다.
그 후 유산균 배양시 통상적인 조건인 20~45℃의 온도, 0.5∼1.0VVM의 에어공급 및 150∼300dml 교반속도하의 발효조에서 상기 접종된 유산균을 배양한다. 바람직한 배양온도는 30℃이다. 그 다음 배양후 15∼20시간에서 효모추출물과 포도당이 1:2~1:6의 중량비로 조합된 유가배지 0.1~10리터를 1~24시간동안 일정한 속도로 공급한다. 초기배지내의 포도당이 고갈되는 배양후 15~20시간에 균체성장에 필요한 최소한의 기질로서 효모추출물과 포도당을 공급하여 고농도 배양하도록 하는 것이다. 성장에 필요한 포도당이 상대적으로 효모추출물보다 2배이상 첨가되어야 효과적이며 6배 이상으로 포도당이 첨가되면 젖산등의 부산물이 발생할 수 있다. 효모추출물과 포도당의 바람직한 비율은 1:4중량비이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다.
<실시예 1> 유산균의 분리 및 보존
1999년 4월에서 10월까지 평택, 안성, 대부도일대의 토양시료, 양돈과 자돈의 가검물과 0.8세 미만의 유아의 변을 채취하여, 이 중 1g을 미리 준비된 0.85% 멸균 생리식염수 10㎖에 넣고 진탕한 후 정치시켰다. 그 다음 상등액을 취하여 100~ 10-5까지 희석한 다음 효모추출물 0.5%, 육즙추출물 1.0%, 펩톤 1.0%, 포도당 1.0%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.2%, 암모늄 나이트레이트 0.2%, 소디움 아세테이트 0.5%,마그네슘 술페이트 0.058%, 망간 술페이트 0.028%, 한천 2.0%로 이루어진 MRS 고체배지(pH 7.0)에 100㎕씩 도말하여 40℃에서 약 60시간 배양하였다. 배양된 균체를 관찰하여 유산균의 형태가 서로 다른 균주들을 선택함으로써 순수분리하였다.
분리된 유산균은 MRS 고체배지상에서 배양하여 20% 글리세롤 용액에 현탁시킨 다음 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 냉동보관된 유산균 균주를 MRS 액체배지에 현탁하여 37℃에서 72시간 동안 진탕배양을 실시하고 내산성, 내담즙성 및 내열성 시험을 하기와 같은 방법으로 행하였다. 이들 균주중 내산성, 내담즙성 및 내열성이 모두 우수한 균주를 선별하였으며 이를 BRD-001 균주로 약칭한다.
<실시예 2> 내산성 시험
내산성은 MRS액체배지에서 12시간 배양된 BRD-001 균주와 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼 1ml를 각각 pH2.5의 인산완충액 1ml에 2시간동안 37℃에서 정치한후 100㎕을 MRS고체배지상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하여 생존 균체수를 측정하여 평가하였다.
또한, 대조군으로서 BRD-001과 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼 1ml을 멸균수 1ml에 2시간동안 37℃에서 정치한 후, 100㎕을 MRS고체배지상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 생존 균체수를 측정하여 평가하였다.
그 결과 10-5의 희석농도에서 산처리 되지않은 BRD-001 균주(대조군)는 평균 120개의 콜로니를 형성하였으며 산처리된 BRD-001 균주는 동일한 희석농도에서 평균 62개의 콜로니를 형성하여 대조군에 비해 약 52%의 생존율을 나타내었다.
한편, 산처리된 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스는 대조군에 비해 약 5.2%의 생존율을 나타내었다.
따라서, BRD-001 균주는 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼보에 비하여 10배이상의 우수한 내산성을 나타냈다.
<실시예 3> 내담즙성 시험
내담즙성 시험은 MRS액체배지에서 12시간 배양된 BRD-001 균주와 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼 각 1ml을 담즙산 농도가 0.15%, 0.2%인 옥스갈(Difco) 1ml에 3시간동안 정치시킨 후 그 중 100㎕을 MRS고체배지상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 생존 균체수를 측정하여 평가하였다.
한편, 대조군으로서 BRD-001 균주와 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼 각 1ml을 멸균수 1ml에 3시간동안 정치시킨 후 그 중 100㎕을 MRS고체배지상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 생존 균체수를 측정하여 평가하였다.
그 결과 10-7의 희석농도에서 담즙산이 처리되지않은 BRD-001 균주는 평균 118개의 콜로니를 형성하였으며 담즙산이 처리된 균주 BRD-001은 평균 30개의 콜로니를 형성하여 대조군에 비해 약 25%의 생존율을 나타내었다.
한편, 담즙산처리된 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스는 대조군에 비해 약 18%의 생존율을 나타내었다.
따라서, BRD-001 균주가 스트렙토코커스 페시움 및 락토바실러스 플랜타럼보다 약 20~30%이상 우수한 내답즘성을 갖음을 알 수 있다.
<실시예 4> 내열성 시험
내열성 시험은 70℃의 항온 수조에 15분동안 BRD-001 균주와 스트렙토코커스 페시움, 락토바실러스 플랜타럼 및 락토바실러스 헬베티쿠스 각 1ml(2.28×107CFU/㎖)을 정치시킨 후 100㎕을 MRS고체배지상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 생존균체수를 측정함으로써 평가하였다.
그 결과 생존 BRD-001 균주수는 4.0×104CFU/㎖이고 생존 스트렙토코커스 페시움, 락토바실러스 플랜타럼 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주수는 모두 101~102CFU/㎖이었다.
따라서 BRD-001 균주가 스트렙토코커스 페시움, 락토바실러스 플랜타럼 및 락토바실러스 헬베티쿠스보다 우수한 열안정성을 갖음을 알 수 있다.
<실시예 5> 분리된 유산균의 고농도 배양
500㎖ 베플 삼각플라스크에 효모추출물 0.5%, 육즙추출물 1.0%, 펩톤 1.0%, 포도당 1.0%, 하이드로겐 포스페이트 0.2%, 암모늄 나이트레이트 0.2%, 소디움 아세테이트 0.5%, 마그네슘 설페이트 0.058% 및 망간 설페이트 0.028%로된 MRS 액체배지(pH 7.0) 100㎖를 넣고 121℃에서 15분간 살균하여 냉각하였다.
그 후 실시예 1에서 배양한 BRD-001 균주를 무균상태에서 1백금니량만큼 접종하여 30℃에서 12시간동안 배양하였다.
그 결과 광밀도(OD)가 660㎚의 파장에서 5∼6인 균체를 얻었다.
또한 상기 BRD-001 균주를 고농도로 배양하기 위해 조성이 변화된 효모추출물 0.3%, 육즙추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 포도당 0.5%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.2%, 암모늄 나이트레이트 0.1%, 소디움 아세테이트 0.3%, 마그네슘 설페이트 0.04% 및 망간 설페이트 0.02%으로 이루어진 MRS 액체 초기배지(pH 7.0) 2.5ℓ를 5ℓ발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균한 다음 30℃로 냉각하고 상기 종배양균을 무균상태로 접종하였다.
그 후 접종된 배양균을 30℃의 온도, 1.0VVM의 에어공급 및 200rpm의 교반속도하의 발효조에서 배양하였으며 초기의 포도당이 고갈되는 배양후 17시간에서 효모추출물과 포도당이 1:4 중량비로 조합된 유가배지 1리터를 12시간동안 일정한 속도로 공급하였다. 그 결과 660㎚의 파장에서 광밀도가 14∼16인 균체를 얻었다.
따라서 상기 균체를 유가 배양하는 경우 배양균 농도가 약 3배 증가됨을 알 수 있다.
본 발명의 새로운 균주 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001)는 열안정성이 우수하고 산에 대한 내산성력과 담즙산에 대한 내담즙성이 우수하여 사료첨가용의 생균제로 사용될 수 있으며 사람에게는 각종 식품, 의약품에 프로바이오틱 유산균으로 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 유가배양방법은 초기배지내의 기질농도를 낮게 유지하여 균체 성장을 저해하는 젖산의 성장을 억제함으로써 상기 유산균을 고농도로 배양할 수 있다.

Claims (6)

  1. 내산성, 내담즙성 및 내열성을 갖는 락토바실러스속의 새로운 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001(Lactobaillus helveticus BRD-001).
  2. 제1항의 유산균을 유효성분으로하는 건강식품.
  3. 제1항의 유산균을 유효성분으로하는 의약품.
  4. 제1항의 유산균을 생균제로 사용하는 사료첨가제.
  5. 효모추출물 0.1~0.5중량%, 육즙추출물 0.1~0.5중량%, 펩톤 0.3~0.7중량%, 포도당 0.1~0.7중량%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.05~0.4중량%, 암모늄 나이트레이트 0.03~0.2중량%, 소디움 아세테이트 0.1~0.4중량%, 마그네슘 술페이트 0.01~0.05중량% 및 망간 술페이트 0.01~0.03중량%(pH 7.0)로 구성된 상기 유산균의 고농도 배양을 위한 유가배양 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 액체배지 조성물.
  6. 효모추출물 0.1~0.5중량%, 육즙추출물 0.1~0.5중량%, 펩톤 0.3~0.7중량%, 포도당 0.1~0.7중량%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.05~0.4중량%, 암모늄 나이트레이트 0.03~0.2중량%, 소디움 아세테이트 0.1~0.4중량%, 마그네슘 술페이트 0.01~0.05중량% 및 망간 술페이트 0.01~0.03중량%(pH 7.0)로 이루어진 MRS 액체배지를 121℃이상에서 30~60분간 가압하여 살균하는 단계;
    상기 MRS 액체배지를 20~45℃로 냉각하고 락토바실러스 헬베티쿠스 BRD-001을 접종하는 단계;
    그 후 20~45℃, 0.5∼1.0VVM의 에어공급 및 150∼300dml 교반속도로 발효조에서 배양하는 단계;
    배양후 15∼20시간에서 효모추출물과 포도당이 1:2~1:6중량비로 조합된 유가배지 0.1~10리터를 1~24시간동안 일정한 속도로 공급하는 단계;
    로 구성된 상기 유산균의 고농도 배양을 위한 유가배양방법.
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