KR20000042168A - 간질환관련 표식물질의 검출용 스트립 및 이를 이용한간질환 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간질환으로 인한 혈액 중 생화학적 물질의 변화와 뇨로 배출되는 간질환 관련물질을 측정하는 간질환관련 표식물질의 동시 검출용 스트립과 이를 이용한 간질환 진단방법에 관한 것으로 지피티(GPT), 지오티(GOT), 알부민, 총단백, 빌리루빈 및 유로빌리노겐의 검출시약을 멤브레인에 처리하고 건조시켜 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립을 제조하고 제조한 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립에 시료를 떨어뜨려 육안으로 또는 분광비색계로 색상변화를 계측하므로써 한번의 채혈과 채뇨로 혈액중 간질환과 관련된 표식물질인 빌리루빈, 지오티, 지피티, 알부민, 단백질 유산 탈수소효소양과 뇨중 빌리루빈, 유로빌리노겐, 단백질을 동시에 측정하는 뛰어난 효과가 있고 또 본 발명의 간질환 관련 표식물질 검출용 건식 스트립에 시료를 묻힌 후 발색정도를 자동분석기기는 물론이고 육안으로 판별할 수 있어 보건소 및 대학병원은 물론 개인이 간편하게 사용하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

간질환관련 표식물질의 검출용 스트립 및 이를 이용한 간질환 진단방법

본 발명은 혈액 및 뇨에 함유된 간질환관련 표식(標識)물질의 동시 검출용 스트립 및 이를 이용한 간질환 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 간질환으로 인한 혈액 중 생화학적 물질의 변화와 뇨로 배출되는 간질환 관련물질을 한 세트의 스트립을 이용하여 한번에 측정하는 간질환 진단방법에 관한 것이다.

인체 체액의 생화학적 성분변화 검사는 각종 질병의 진단, 치료 및 예방을 위한 객관적 정보를 제공하고 병태나 병인을 해명하여 질병을 진단, 치료하는데 사용된다. 일반적으로 뇨 중 빌리루빈, 유로빌리노겐의 검출, 혈액중 지오티, 지피티, 총 빌리루빈, 알부민, 단백질양을 측정하여 간 질환을 진단한다. 최근 각종 간의 질병 진단법은 육안으로도 판별이 가능하여 일반인도 사용이 가능한 건식 스트립과, 대량의 시료에 대해 다양한 물질을 한꺼번에 분석하여 질병을 진단하고 객관적인 분석치로 평가하는 자동 분석기기를 이용하는 경향으로 흐르고 있으며 이들은 기존의 복잡한 분석과정 없이도 짧은 시간내에 많은 시료를 정량할수 있어 이용도가 급속히 증가하고 있다. 진단용 자동분석기기는 자가 진단용으로 측정한 측정모니터부터 대학병원에서 사용되는 자동화 진단기기까지 매우 다양하다. 이들은 건식스트립을 이용하여 시료와 반응시키고 반응된 결과를 수치로 해석하는데, 이때 사용되는 건식 스트립은 분석하고자하는 물질과 반응할 수 있는 시약을 미리 멤브레인에 처리하여 적당한 온도에서 건조시킨 시험지로서, 건조상태로 처리된 시약이 액상의 시료와 만나 화학반응을 일으켜 원하는 물질을 반정량할 수 있다. 건식 스트립은 자동분석기기의 시약으로도 많이 사용되지만, 최근에는 육안으로 분석가능하도록 제조되어 일반인도 가정에서 사용이 가능하며 평소 자신의 건강 체크를 위해 사용한다. 특히 혈당의 경우 육안용 혹은 자동분석기용 스트립으로 제조되어 많은 회사에서 시판되고 있으며 포켓용 간이진단 기기로 개발되어 어느곳에서나 수시로 자신의 혈당치를 측정할 수 있다.

종래 간질환관련 표식물질 검출용 스트립 제품은 뇨와 혈액용 스트립이 따로 존재하여 뇨검사를 통한 빌리루빈과 유로빌리노겐, 단백질 검출은 뇨검사용 스트립만을 사용하고 혈액검사를 통한 빌리루빈, 지오티, 지피티, 알부민, 단백질양의 측정은 혈액검사용 스트립으로만 가능하였다. 상기와 같은 혈청 지오티, 지피티의 측정은 잠재성 간장애의 스크링(screening), 급성간염 발병의 조기진단, 무황달성 간염의 진단에 불가결한 검사이고 혈청 지오티와 지피티 활성치의 비는 각종 간질환에서 일정한 경향을 나타내는 수가 많으며 양자의 측정치 해석에 유력한 지표가 되는 경우가 있다. 지오티와 지피티는 아미노산과 α-케토산과의 아미노기 전이를 촉매하는 효소로서 지오티는 아스팔틱산(aspartic acid), 알파케토글루타릭산(α-ketoglutaric acid)과 글루타믹산(glutamic acid), 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 사이의 아미노기를 전이하며 지피티는 알라닌, 알파 케토 글루타릭 산과 글루타믹산, 피루빅산(pyruvic acid) 사이의 아미노기를 전이한다. 혈청 지오티, 지피티의 활성치 상승은 간, 담도질환, 특히 급성간염의 경우에 현저하며 또한 혈청 지오티는 심근경색 일때에 증가되므로 이들 질환의 진단상 유력한 지표가 되는 것이다.

본 발명자들은 단 한번의 채혈과 채뇨로 혈액중 간기능에 관련된 빌리루빈, 지오티, 지피티, 알부민, 단백질과 뇨중 빌리루빈, 유로빌리노겐, 단백질을 동시에 측정할 수 있는 다목적 기능을 지닌 간질환관련 표식물질 검출용 스트립을 제조하였고 이 스트립은 자동분석기기의 기본시료로 이용됨은 물론 육안으로도 판별이 가능하여 개인용, 보건소용, 대학병원용으로 사용할 수 있다.

본 발명에서 제조한 지피티 측정용 스트립의 원리는 하기와 같다.

지피티

L-알라닌 ＋α-케토글루타릭산 ―──→ L-글루타믹산 ＋ 피루빅산

파루베이트 산화효소

피루빅산 ＋ 인산 ＋ 산소 ──→ 아세틸 인산 ＋ 과산화 수소 ＋이산화 탄소

과산화 효소

과산화 수소＋ 환원형 색원체(무색) ――――→ 산화형 색원체(발색)

본 발명의 지피티 측정용 스트립 제조에 있어서, 색원체는 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 사용하였다. 즉, 처리액에 L-알라닌, α-케토글루타레이트, 파루베이트 산화효소, 인산, 과산화효소, 테트라 메틸 벤지딘을 멤브레인에 건조 처리하면 혈액 중 지피티가 기질인 알라닌 및 α-케토글루타레이트와 즉각 반응하여 피루빅산을 생성하고 생성된 피루빅산은 파루베이트 산화효소에 의해 과산화수소를 생성하며 과산화효소에 의해 테트라메틸벤지딘과 반응하여 착색물을 형성한다. 이 원리에 의해 제조된 스트립은 120초-180초 이내에 효소반응이 완료되어 녹색을 띄게되어 혈액중 지피티의 농도를 측정할 수 있다.

본 발명의 지오티 측정용 스트립의 원리는 하기와 같다.

지오티

L-아스팔틱산＋α-케토글루타릭산 ──→ L-글루타믹산＋옥살아세틱산

옥살아세트산 카복실레이즈

옥살 아세트산 ――――→ 피루빅산 ＋ 이산화 탄소

파루베이트 산화효소

피루빅산 ＋ 인산 ＋ 산소 ──→ 아세틸 인산 ＋ 과산화 수소 ＋이산화 탄소

과산화 효소

과산화 수소＋ 환원형 색원체(무색) ――――→ 산화형 색원체(발색)

처리액에 아스파레이트, α-글루타레이트, 옥살아세트산 카복실레이즈(OAC), 파루베이트 산화효소, 인산, 과산화효소, 색원체를 멤브레인에 처리, 건조시키면 혈액중 지오티가 기질인 아스파레이트, α-케토글루타레이트와 즉각 반응하여 옥살아세테이트를 발생하고 발생된 옥살아세테이트가 옥살아세트산 카복실레이즈에 의해 피루빅산을 생성하며 생성된 피브릭산은 파루베이트 산화효소에 의해 과산화수소를 생성하고 이것이 색원체와 반응하여 착색물을 형성한다. 이 원리에 의해 제조된 스트립은 120초-180초 이내에 효소반응이 완료되어 발색된 정도에 따라 혈액중 지오티의 농도를 알 수 있다.

혈청 알부민은 혈청 총단백의 50 ~ 70%를 차지하여 혈장교질 삼투압의 유지, 각종 물질의 운반에 중요한 기능을 하고 있다. 임상적으로는 간에서의 합성, 위장관, 신, 간, 세망내피계 등에 의한 이화(異化), 혈과내외에서 분포 이상 누출 등의 제인자에 의해 변동한다. 본 발명에서 개발한 알부민 측정용 스트립은 알부민과 색소와의 결합에 의한 색조(色調)의 변화를 이용해서 알부민농도를 측정하는 색소법을 이용하였으며 브롬 크레졸 그린에 의한 알부민 정량법을 이용하였다. 즉, 비 이온계면활성제인 브릿지 35(Brij-35)를 첨가한 pH 4.2의 구연산완충액에 용해시킨 브롬 크레졸 그린시약과 알부민을 반응시키면 알부민의 결합에 따라 녹색으로 변화한다. 이와같은 원리에 입각하여 멤브레인에 구연산, 브롬 크레졸 그린, 에틸 오렌지(Ethyl Orange), 브릿지 35, 트윈 20를 처리한 후 건조시켜 혈중 알부민 검출용스트립을 제조하였다. 이렇게 제조된 스트립의 멤브레인에 농도가 다른 사람혈청 알부민을 떨어뜨리면 1분후 농도에 따라 녹색으로 발색한다.

혈장단백은 80종 이상이나 되는 많은 단백질로 구성되어 있고, 그 분자량은 대부분 4만∼100만의 범위에 있으며, 당질 또는 지질과 결합하여 복합단백을 형성하고 있는 것이 많다. 임상적으로 혈장단백의 농도 및 조성의 이상은 소화기계의 질환, 수술, 영양결핍, 기아 등과 같은 소화흡수장애, 간 및 세망내피계에서 단백합성의 항진 또는 저하와 같은 합성이상, 임신, 수유기, 갑상선기능항진, 당뇨병, 악성종양, 발열 등과 같은 분해이상, 창상, 출혈, 화상, 체강, 뇨로, 장관으로의 누출이상 등과 같은 배설이상(누출)등의 여러 가지 인자에 의해 일어난다. 총 단백용 스트립을 제조하기 위해 뷰렛(Biuret)법을 이용하였으며 원리는 하기와 같다. 단백용액을 알카리용액에서 2가 구리이온으로 처리하면 착화합물이 생기는데 이것은 구리이온과 펩타이드결합의 카보닐기와 이민기가 반응하여 보라색을 나타낸다. 이 원리에 입각하여 제조된 검출지는 혈액중 단백질의 양에 따라 보라색으로 발색한다.

정상인의 혈중 빌리루빈의 대부분은 망내계(網內係)에서 노화 적혈구의 파괴에 의하여 유리되는 헤모글로빈으로 부터 유래하며 1일의 빌리루빈 생성량은 250-300mg이다. 생성된 비극성의 유리빌리루빈(간접 빌리루빈)은 혈중에서 알부민과 결합하고 간세포막에서 알부민과 떨어져서 섭취되며, 세포내의 Y, Z 수용단백과 결합하여 소포체까지 이동하고 여기서 포합된다. 포합 빌리루빈(직접 빌리루빈)은 UDP-glucuronyl 트랜스퍼라제(transferase)의 작용에 의하여 생성하는 빌리루빈 디글루커로니드(diglucuronide)가 대부분이지만 이 밖에 각종 당류복합체 등이 존재한다. 포합 빌리루빈은 모세담관측에 이송되어 그 융모로부터 모세담관강내에 배설된다. 담즙 중에서 포합 빌리루빈은 담즙산ㆍ레시틴(lecithine)에서 복합 미셀(micelle) 표면에 부착하여 존재하며, 담낭에서 농축되어 담관에 배설된다. 장관내의 포합 빌리루빈은 소장하부ㆍ대장의 세균(대장균ㆍ혐기성균)의 작용에 의하여 탈포합과 몇 단계의 환원작용을 받아 유로빌리노겐으로 변화하고 그 대부분은 분변중에 배설된다. 유로빌리노겐의 일부는 장관에서 재흡수되어 문맥에 들어가고, 그 대부분은 간세포에 흡수되어 다시 담즙중에 배설되며(장-간 순환) 일부는 문맥에서 대순환에 들어가 신으로부터 뇨중으로 배설된다(1일 0.5-2.5mg). 정상인의 혈중 빌리루빈은 대부분이 1mg/dL 이하이며 주로 유리빌리루빈인데 체내 용혈의 항진, 간내 담즙울체, 간외 담즙울체(폐색성황달), 간세포의 빌리루빈 처리과정의 이상(체질성황달ㆍ간세포성황달) 등의 경우에 혈중에 증가하여 황달을 초래한다. 혈중 총 빌리루빈과 그 분획(직접형과 간접형) 측정은 각종 간질환의 진단과 황달의 감별 등에 가장 중요한 검사의 하나이며, 또 뇨중이나 분변중 유로빌리노겐의 측정과 함께 실시하면, 체내 빌리루빈 대사 및 그 처리과정의 이상과 그 병태의 진단에 중요한 정보가 얻어진다. 정상치는 혈청 총 빌리루빈 0.2-1.0mg/dL, 직접 빌리루빈 0-0.4mg/dL이다. 본 발명에서는 디아조늄반응을 이용하여 빌리루빈 측정용 스트립을 제조하였으며 원리는 하기와 같다.

디아조늄 반응

빌리루빈 + 다이아조늄 염 → 발색

상기 원리에 입각하여 멤브레인에 디페닐설폰염(diphenyl sulfoxide), 나프탈렌 설폰염(1,5 Naphthalein sulfonate), 다이클로로벤젠 다이아조늄 나프탈렌 설폰염(2,4 Dichlorobenzene diazonium - 1,5 naphthalein sulfonate), 옥살산, 도데실설폰염(SDS)를 침적하여 40℃ 열풍건조기에서 건조시켜 빌리루빈 측정용 스트립을 제조하였다. 제조한 스트립의 멤브레인에 빌리루빈을 떨어뜨리면 2분 후 혈액과 뇨 중 빌리루빈의 농도에 따라 진한 분홍색으로 발색한다.

유로빌리노겐은 빌리루빈으로부터 유도된 무색의 화합물로 정상뇨에 1일에 2 Erlich unit 존재한다. 유로빌리노겐은 4개의 피롤 화합물인데 장관내에서 빌리루빈으로부터 세균의 환원작용에 의하여 생성된다. 유로빌리노겐은 장에서 생성되며 소장에서 재흡수되어 신장이나 간에서 부분적으로 분비된다. 생리학상 유로빌리노겐의 상한계는 1mg/dL이며 간질환, 신장염의 진단에 사용되어지며 발색은 4-메톡시 벤젠 다이아조늄염(4-methoxybenzene diazonium tetrafluroborate)에 의한 적색 반응에 기초한다. 상기와 같은 원리에 입각하여 멤브레인에 4-메톡시 벤젠 다이아조늄염과 완충액을 침적하여 40℃ 열풍건조기에서 건조시켜 뇨중 유로빌리노겐 측정용 스트립을 제조하였다. 제조된 스트립의 멤브레인에 유로빌리노겐을 떨어뜨리면 2분 후 뇨중 유로빌리노겐의 농도에 따라 진한 적색을 띄는 분홍색으로 발색한다.

따라서 본 발명의 목적은 상기 사실을 감안하여 안출한 것으로 혈액 및 뇨에 함유된 간질환관련 표식(標識)물질의 동시 검출용 스트립을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 간질환으로 인한 혈액 중 생화학적 물질의 변화와 뇨로 배출되는 간질환 관련물질을 본 발명의 간질환관련 표식물질의 동시 검출용 스트립을 이용하여 한번에 측정하는 간질환 진단방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 간질환관련 표식물질의 동시 검출용 스트립을 사용해 육안으로 발색변화를 관찰하여 간질환 관련물질의 농도를 예측하거나 자동분석기를 이용하여 농도를 측정하므로써 간질환을 진단함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 지피티, 지오티, 알부민, 총단백, 빌리루빈 및 유로빌리노겐의 검출시약을 멤브레인에 처리하여 건조시키므로써 지피티, 지오티, 총단백, 빌리루빈 및 유로빌리노겐을 동시에 측정할 수 있는 다목적 기능을 가진 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립을 제조한 후 제조한 스트립에 시료를 묻힌 후 발색정도를 육안으로 판별하거나 분광비색계로 농도를 측정하므로써 달성하였다.

도 1은 인체 혈액의 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미네이즈(지피티;GPT)측정용 스트립을 이용하여 측정한 지피티 활성도별 분광밀도(K/S)의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 2는 인체 혈액의 글루타메이트 옥살아세테이트 트랜스아미네이즈(지오티;GOT)측정용 스트립을 이용하여 측정한 혈액중 지오티 활성도별 분광밀도의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 3은 인체 혈액의 알부민(albumin) 측정용 스트립을 이용하여 측정한 혈액중 알부민농도별 분광밀도의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 4는 인체 혈액과 뇨 중 총단백(total protein) 측정용 스트립을 이용하여 측정한 혈액중 총단백 농도별 분광밀도의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 5는 인체 혈액과 뇨의 총빌리루빈(total bilirubin) 측정용 스트립을 이용하여 측정한 혈액중 총 빌리루빈 농도별 분광밀도의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 6은 인체 뇨중 유로빌리노겐(urobilinogen) 측정용 스트립을 이용하여 측정한 뇨중 유로빌리노겐 농도별 분광밀도와의 관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 파루베이트 산화효소, 과산화효소, 염화마그네슘, 티아민, 피로포스페이트 크로라이드, 인산염, 알라닌, α-케토 글루타릭산, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 트리스완충액에 용해시켜 멤브레인에 처리한 후 건조시켜 지피티 측정용 스트립을 제조하고 제조한 스트립에 검사시료를 묻힌 다음 발색양상을 관찰하여 시료내의 지피티 활성도를 측정하는 단계; 옥살산 카르복실화 효소, 파루베이트 산화효소, 과산화효소, 염화마그네슘, 티아민 피로포스페이트염, 인산염, L-아스파테이트, α-케토글루타릭산, 테트라메틸벤지딘을 트리스완충액에 차례로 용해하고 멤브레인에 처리한 후 건조시켜 지오티 측정용 스트립을 제조하고 제조한 스트립에 검사시료를 묻힌 다음 발색양상을 관찰하여 시료내 지오티 활성도를 측정하는 단계; 구연산, 브롬크레졸 그린, 에틸오렌지, 브릿지 35 및 트윈 20 혼합액을 멤브레인에 처리하고 건조하여 알부민 측정용 스트립을 제조하고 알부민 농도에 따른 알부민 측정용 스트립의 색상변화를 계측하는 단계; 증류수에 황산동, 티풀을 혼합한 후 멤브레인에 1차 처리 및 건조, 다시 수산화나트륨 용액을 2차 처리 및 건조, 타타레이트, 요오드칼륨, 폴리에틸렌글라이톨을 첨가해 멤브레인에 3차 처리 및 건조하여 총단백 검출용 스트립을 제조하고 단백시료의 농도에 따른 총단백 검출용 스트립의 색상변화를 계측하는 단계; 페닐설폭사이드, 다이클로로벤젠다이아조늄 나프탈렌 설페이트를 에탄올에 용해한 후 멤브레인에 1차 처리 및 건조한 다음 나프탈렌 설포네이트 소듐염, 옥살산, 라우릴설페이트염을 증류수에 용해한 후 멤브레인에 2차 처리하여 빌리루빈 검출용 스트립을 제조하고 빌리루빈의 농도에 따른 빌리루빈 검출용 스트립의 색상변화를 계측하는 단계 및; 인산, 구연산, 4-메톡시벤젠 디아조늄 테트라프로오로보레이트를 메탄올에 용해한 후 멤브레인 처리하고 건조시켜 유로빌리노겐 검출용 스트립을 제조하고 유로빌리노겐의 농도에 따른 유로빌리노겐 검출용 스트립의 색상변화를 계측하는 단계로 구성된다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 지피티 측정용 스트립 제조

파루베이트 산화효소 600unit, 과산화효소 1000unit, 염화마그네슘 10mM, 티아민 피로포스페이트 크로라이드(thiamine pyrophosphate chloride) 1mM, 인산염 1mM, 알라닌 1M, α-케토 글루타릭산 30mM, 3,3',5,5'-테트라 메틸 벤지딘 0.2g을 트리스완충액 100mL에 차례로 녹이고 멤브레인에 처리, 건조시켜 지피티 측정용 스트립을 제조하였다. 표준시약은 시판하고 있는 지오티효소를 20-1000 unit/L 사이의 농도로 희석하여 사용하였다. 혈액중 지피티활성도 측정은 제조한 스트립을 검사하려는 시료에 묻힌 후 3분내에 발색되는 양상을 관찰한 후 색표와 비교하여 활성도를 판정하였다(표 1). 또 지피티 측정용 스트립의 결과를 분광비색계를 이용하여 측정하기 위하여 지피티 표준 시약을 스트립에 처리한 후 분광비색계로 발색정도를 계측하여 최대 흡수 파장을 조사하였다. 실험결과, 600nm 전후의 파장에서 활성도별로 반사광세기를 구분할 수 있었으며 이때 분광비색계는 Hunter Lab.(미국)에서 나온 Ultrascan을 사용하였다. 또 20unit/L~ 1000 unit/L 활성도농도를 지닌 지피티 표준용액을 스트립과 반응시킨후 610nm에서 분광비색계로 반사밀도를 측정하였을 때 활성도와 반사밀도와의 관계는 도 1에 나타낸 바와 같으며 610nm에서 활성도와 반사밀도가 선형적으로 나타났다. 이 곡선에 의해 혈액 중 지피티 활성도를 측정할 수 있다. 따라서 지피티 측정용 스트립으로 혈액 중 지피티의 활성도를 육안과 분광비색계로 측정할 수 있음을 확인하였다.

지피티 활성도별 발색양상

지피티 (unit/L)	발색
0	노랑
20	노랑
40	연녹색
100	녹색
500	녹색
1000	진녹색
10000	청녹색

실시예 2: 지오티 측정용 스트립 제조

옥살산 카르복실화효소(Oxalacetic acid carboxylase)5000 unit, 파루베이트 산화효소 3000unit, 과산화 효소 5000unit, 염화마그네슘 10mM, 티아민 피로포스페이트염(thiamine pyrophosphate chloride) 1mM, 인산염 1mM, L-아스파테이트 400mM, α-케토글루타릭산 15mM, 테트라메틸벤지딘 0.2g을 트리스 완충액 100mL에 차례로 녹이고 멤브레인에 처리, 열풍건조기에서 건조시켜 지오티 측정용 스트립을 제조하였다. 표준시약은 시그마사에서 시판중인 지오티를 20-1000 unit/L 사이 농도로 희석하여 사용하였다. 혈액중 지오티 활성도 측정은 제조한 스트립을 검사하려는 시료에 묻힌 후 3분내에 발색되는 양상을 관찰한 후 색표와 비교하여 활성도를 판정하였으며(표 2) 또 본 발명의 지오티 측정용 스트립에서 효소활성도에 따른 색상변화를 계측하여 최적 분석파장을 측정하였다. 실험결과, 600nm 전후의 파장에서 농도별 반사광세기를 구분할 수 있었고 20unit/L~ 1000 unit/L 활성도 농도를 지닌 지오티 표준용액을 스트립과 반응시킨후 610nm에서 분광비색계로 반사밀도를 측정하였을 때 활성도와 반사밀도와의 관계는 도 2에 나타낸 바와 같이 610nm에서 활성도와 반사밀도가 선형적으로 나타났다. 이 곡선에 의해 혈액 중 지오티 활성도를 측정할 수 있으며 따라서 지오티 측정용 스트립으로 혈액 중 지오티의 활성도를 육안과 분광비색계로 측정할 수 있음을 확인하였다.

지오티 활성도별 발색양상

지오티 (unit/L)	발색
0	노랑
20	노랑
40	연녹색
100	녹색
500	녹색
1000	진녹색
10000	청녹색

실시예 3: 알부민 측정용 스트립 제조

0.1M 구연산 20mL, 브롬 크레졸 그린 10mg, 에틸오렌지 2mg, 브릿지 35 (30%) 0.2mL, 트윈 20 0.2mL 혼합하여 멤브레인에 처리한 후 건조시켜 알부민 측정용 스트립을 제조하였다. 제조한 스트립에 농도가 다른 인간혈청알부민을 떨어뜨린 후 1분후 발색의 정도를 색표화하고 변화된 발색정도에 따라 시료중 알부민의 농도를 결정하였다(표 3). 또 본 발명의 알부민 측정용 스트립 색상변화를 계측하여 최적 분석 파장을 선택하기 위하여 400∼700nm 파장을 분광비색계로 20nm 간격으로 계측하여 그래프화하였다. 실험결과, 630nm 전후의 파장에서 농도별 반사광세기를 구분할 수 있었고 알부민 1g/dL부터 6g/dL까지의 농도에 대한 반사 밀도를 630nm에서 측정한 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 농도와 반사밀도간에 선형적인 관계가 있음을 알았다.

알부민 농도별 발색양상

알부민(g/dL)	발색
1	밝은 연두
2	흐린 연두
3	흐리고 진한 연두
3.5	흐린 녹색
4	흐리고진한 녹색
5	진한 녹색
6	진한 녹색

실시예 4: 총단백 검출용 스트립 제조

증류수 100mL에 황산동 6g, 티풀 3mL을 넣어 잘 혼합하여 멤브레인에 처리한 후 항온건조기에서 건조시켰다. 100mL 증류수에 수산화 나트륨 14g을 완전히 용해 시킨 후 제1차 침지용액이 묻있는 멤브레인에 처리하여 건조시킨 다음 타타레이트염(potassium sodium tartrate)과 요오드칼륨, 폴리에틸렌글라이콜을 첨가해 멤브레인에 처리한 후 건조시켰다. 플라스틱판에 제조한 스트립을 양면 테이프를 이용해 부착시켰다. 총단백 표준시료는 12g/100mL 소혈청 알부민액을 희석하여 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 2, 4, 6, 8, 10g/dL로 제조하였으며 이때 발색양상은 표 4에 나타낸 바와 같다. 또 본 발명의 단백 측정용 스트립 색상변화를 계측하여 최적 분석 파장을 선택하기 위하여 400∼700nm 파장을 분광비색계로 20nm 간격으로 계측하여 그래프화하였다. 실험결과, 550nm에서 최대 흡수를 보였으며 이 파장에서 단백질 표준액 0.03g/dL부터 10g/dL까지의 반사밀도는 도 4에 나타낸 바와 같이 농도와 선형적인 관계를 나타냈다.

총 단백 농도별 발색양상

총단백(g/dL)	발색 양상
0	하늘색
0.03	하늘색
0.1	하늘색
0.3	하늘색
1	진한 하늘색
2	엷은 보라
4	흐린보라
6	보라
8	약간 진한보라
10	진한보라

실시예 5: 빌리루빈 검출용 스트립 제조

페닐 설폭사이드 2g, 다이 클로로 벤젠 다이아조늄 나프탈렌 설페이트(2,4 Dichlorobenzene diazonium - 1,5 naphthalein sulfonate) 0.2g을 에탄올에 용해시킨 후 멤브레인에 처리하여 40℃ 열풍건조기에서 건조시키고 1,5 나프탈렌 설포네이트 소듐염 1g, 옥살산 2g와 라우릴 설페이트염 1.5g을 증류수 100mL에 용해시키고 1차 침적용액이 처리된 멤브레인에 재처리하였다. 제조한 스트립의 멤브레인에 농도가 다른 빌리루빈을 떨어뜨린 후 2분후 발색의 정도를 색표와 비교하여 혈액중 빌리루빈의 농도를 결정하였다. 20g/dL 빌리루빈표준액을 10, 5, 2, 1, 0.5g/dL로 희석한 후 발색양상 결과를 표 5에 나타냈다. 또 본 발명 빌리루빈 측정용 스트립 색상변화를 계측하여 최적 분석 파장을 선택하기 위하여 400∼700nm 파장을 분광비색계로 계측한 결과 470nm에서 최적 반응을 보였으며 스트립을 이용하여 빌리루빈 0.2g/dL부터 20g/dL 까지의 농도에 대한 반사 밀도를 측정한 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 선형적으로 나타났다.

빌리루빈측정용 스트립의 농도별 발색양상

빌리루빈 (mg/dL)	발색
0.2	흰색
1	흐린 분홍
2	밝은 분홍
5	분홍
10	진 분홍
20	진 분홍

실시예 6: 유로빌리노겐 검출용 검출지 제조

인산(m-phosphoric acid)10.0g, 구연산 3g, 4-메톡시벤젠 디아조늄 테트라플루로보레이트(4-methoxybenzene diazonium tetrafluroborate) 0.2g을 30% 메탄올에 용해시켜 멤브레인에 처리한 후 40℃ 열풍건조기에서 건조시켰다. 제조한 스트립의 멤브레인에 농도가 다른 유로빌리노겐을 떨어뜨린 후 2분후 발색의 정도를 색표와 비교하여 혈액중 유로빌리노겐의 농도를 결정하였다. 유로빌리노겐 표준액을 0.1, 1, 2, 4, 8mg/dL로 희석하여 발색양상을 살펴본 결과 표 6과 같았다. 또 본 발명의 유로빌리노겐 측정용 스트립 색상변화를 계측하여 최적 분석 파장을 선택하기 위하여 400∼700nm 파장을 분광비색계로 20nm 간격으로 계측하였다. 실험결과, 도 6은 유로빌리노겐 0.1g/dL부터 8g/dL 까지의 농도를 측정한 반사 밀도이며 550nm에서 선형적으로 나타났다.

유로빌리노겐 측정용 스트립의 농도별 발색양상

유로 빌리노겐 (mg/dL)	발색
0.1	흰색
1	흐린 분홍
2	밝은 분홍
4	진 분홍
8	적 분홍

본 발명은 상기 실시예를 들어 설명한 바와 같이 지피티, 지오티, 알부민, 총단백, 빌리루빈 및 유로빌리노겐의 검출시약을 멤브레인에 처리하여 건조시켜 제조한 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 한번의 채혈과 채뇨로 혈액중 간질환과 관련된 표식물질인 빌리루빈, 지오티, 지피티, 알부민, 단백질 유산 탈수소효소양과 뇨중 빌리루빈, 유로빌리노겐, 단백질을 동시에 측정하는 뛰어난 효과가 있고 또 본 발명의 간질환 관련 표식물질 검출용 건식 스트립에 시료를 묻힌 후 발색정도를 자동분석기기는 물론이고 육안으로 판별할 수 있어 보건소 및 대학병원은 물론 개인이 간편하게 사용하는 뛰어난 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (10)

1. 간질환과 관련된 표식물질의 검출시약을 멤브레인에 처리하고 건조시켜서 제조한 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립.
2. 제 1항에 있어서, 상기 간질환과 관련된 표식물질이 지피티, 지오티, 알부민, 총단백질, 빌리루빈, 유로빌리노겐 중 어느하나임을 특징으로 하는 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립.
3. 제 1항 기재의 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립을 검사하려는 시료에 묻힌 후 발색을 육안으로 관찰하거나 또는 분광비색계로 측정함을 특징으로 하는 간질환의 진단방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질은 인체의 혈액 또는 뇨로부터 채취됨을 특징으로하는 진단방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 파루베이트 산화효소 600unit, 과산화효소 1000unit, 염화마그네슘 10mM, 티아민 피로포스페이트 크로라이드(thiamine pyrophosphate chloride) 1mM, 인산염 1mM, 알라닌 1M, α-케토 글루타릭산 30mM, 3,3',5,5'-테트라 메틸 벤지딘 0.2g을 트리스완충액 100mL에 차례로 녹이고 멤브레인에 처리 후 건조시킴을 특징으로 하는 지피티(GPT) 측정용 건식스트립
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 옥살산 카르복실화효소(Oxalacetic acid carboxylase) 5000 unit, 파루베이트 산화효소 3000unit, 과산화효소 5000unit, 염화마그네슘 10mM, 티아민 피로포스페이트염(thiamine pyrophosphate chloride) 1mM, 인산염 1mM, L-아스파테이트 400mM, α-케토글루타릭산 15mM, 테트라메틸벤지딘 0.2g을 트리스 완충액 100mL에 차례로 녹이고 멤브레인에 처리, 열풍건조기에서 건조시킴을 특징으로 하는 지오티(GOT) 측정용 스트립.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 0.1M 구연산 20mL, 브롬크레졸 그린 10mg, 에틸오렌지 2mg, 브릿지 35 (30%) 0.2mL, 트윈 20 0.2mL과 혼합하여 멤브레인에 처리한 후 건조시킴을 특징으로 하는 알부민 측정용 건식스트립.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 증류수 100mL에 황산동 6g, 티풀 3mL을 넣어 혼합하여 멤브레인에 처리한 후 건조시킨 다음 100mL 증류수에 수산화 나트륨 14g을 완전히 용해하여 상기 1차 처리된 멤브레인에 처리하여 건조시킨 다음 타타레이트염(potassium sodium tartrate)과 요오드칼륨, 폴리에틸렌글라이콜을 첨가하여 다시 멤브레인에 처리한 후 건조시킴을 특징으로 하는 총단백 측정용 건식스트립.
9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환 관련 표식물질 검출용 건식스트립은 페닐설폭사이드 2g, 다이클로로벤젠 다이아조늄 나프탈렌 설페이트(2,4 Dichlorobenzene diazonium - 1,5 naphthalein sulfonate) 0.2g을 에탄올에 용해시킨 후 멤브레인에 처리하여 40℃ 열풍으로 건조시킨 후 1,5 나프탈렌 설포네이트 소듐염 1g, 옥살산 2g와 라우릴 설페이트염 1.5g을 증류수 100mL에 용해시켜 상기 1차 처리된 멤브레인에 재처리하여서 됨을 특징으로하는 빌리루빈 측정용 건식스트립.
10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 간질환관련 표식물질 검출용 건식스트립은 인산(m-phosphoric acid) 10.0g, 구연산 3g, 4-메톡시벤젠 디아조늄 테트라플루로보레이트(4-methoxybenzene diazonium tetrafluroborate) 0.2g을 30% 메탄올에 용해시킨 것을 멤브레인에 처리하여 40℃로 열풍건조함을 특징으로 하는 유로빌리노겐 측정용 건식스트립.