KR20000023683A

KR20000023683A - 티아졸리디논의 투여에 의한 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 방법

Info

Publication number: KR20000023683A
Application number: KR1019997000140A
Authority: KR
Inventors: 리차드 토마스 캐롤; 리챠드 데니스 다이어; 릴리안 제인 로비쇼우; 브렌다 디라 쉬버스
Original assignee: 로즈 암스트롱, 크리스틴 에이. 트러트웨인; 워너-램버트 캄파니
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1999-01-09
Publication date: 2000-04-25
Also published as: WO1998002160A1; IL127487A0; AU3649197A; NO990076D0; DE69725147T2; NO990076L; ZA976142B; CO4940509A1; HRP970362A2; HK1020533A1; ATE250416T1; TR199900040T2; US5912259A; BR9710467A; EP0914122A1; ES2205247T3; CA2255073A1; PT914122E; JP2001508028A; EP0914122B1

Abstract

본 발명은 알츠하이머 병, 졸중, 다발성 경화증, 및 두부 손상과 같은 신경퇴행성 질환을 5-[[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논 또는 그의 제약학상 허용가능한 염으로 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

티아졸리디논의 투여에 의한 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 방법 {Method for Treating and Preventing Neurodegenerative Disorders by Administering a Thiazolidinone}

신경퇴행성 질환은 나이가 들어가는 사람들에게 더 많아진다. 가장 흔한 신경퇴행성 질환에는 졸중 및 두부 손상, 및 다발성 경화증 및 알츠하이머 병과 같은 만성 질환이 포함된다. 이러한 많은 질병들에 대해 각종 원인이 추정되었지만, 신경퇴행 자체의 직접적인 원인은 밝혀지지 않았다. 예를 들면, 수백만의 사람들을 괴롭히며 나이가 들어가는 사람들에게 더 흔해지고 있는 증후인 알츠하이머 병은 임상적으로, 유전학적으로, 병리학적으로, 및 생화학적으로 이질적인 질병이다. 진단은 치매의 다른 가능한 원인을 배제하여 이루어지고, 질병의 초기 단계에서는 진단이 더 어렵다. 알츠하이머 병을 앓는 환자는, 겉보기에는 경미한 기억 상실로 시작하여 인식 기능의 모든 범위를 포함하는 심각한 치매에 이르는, 인식 기능의 점진적인 상실을 보여준다. 지금까지는, 단지 하나의 치료법으로, 아세틸콜린에스테라제 억제제가, 알츠하이머 병에 대한 임상적인 치료용으로 인정되었다. 그러나, 그의 임상적 효과는 다소 한정되어 있다.

본 발명자는 이제 알츠하이머 병, 졸중, 두부 손상, 및 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환이 티아졸리디논, 특히 5-[[3,5-비스-(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논으로 알려진 화합물, 또는 그의 제약학상 허용가능한 염으로 치료될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 화합물은 미국 특허 제5,143,928호에 기재되어 있다. 이는 시클로옥시게나제 및 5-리포옥시게나제 모두의 활성을 억제하고, 소염제로 유용하다. 본 발명의 목적은 이 화합물을 사용하여 신경퇴행성 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

<발명의 요약>

본 발명은 치료를 요하는 환자에게 유효량의 5-[[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논 또는 그의 제약학상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태는 메탄술포네이트염을 사용한다. Z 기하 이성질체를 사용하는 것도 또한 바람직하다. 또 다른 바람직한 실시 형태는 알츠하이머 병의 예방 또는 치료이다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 예방 또는 치료되는 신경퇴행성 질환은 다발성 경화증이다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 치료되는 질환은 졸중 또는 두부 손상이다.

본 발명은 티아졸리디논의 투여에 의한, 졸중, 두부 손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머 병의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.

용어 "티아졸리디논"은 상기 언급한 특정 화합물, 그의 제약학상 허용가능한 염, 및 그의 각각의 기하 이성질체를 의미한다. 본 발명의 방법에 사용되는 티아졸리디논은, 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제5,143,928호에 기재된 바와 같이 조제 및 제제화한다. 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 것은, 신경퇴행성 질환으로 고생하거나 이러한 질환이 발병할 위험이 있고 치료를 요하는 대상자에게 유효량의 티아졸리디논을 투여하는 것이 전부이다. 용어 "유효량"은, 허용할 수 없는 해로운 부작용을 야기하지 않으면서 신경퇴행성 질환에 대해 임상적으로 긍정적인 반응을 유발하거나 또는 질환을 예방하는데 필요한 티아졸리디논의 투여량을 의미한다. 치료할 질환의 심각성, 개별적인 환자, 및 주치의의 재량에 따라 특정 투여량이 다소 변하기도 하지만, 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방에 일반적으로 효과적인 투여량은 치료 1일당 티아졸리디논 약 0.5 내지 약 500 ㎎일 것이다. 통상적으로 사용되는 투여량은 약 1 내지 50 ㎎을, 1일당 1 내지 4회 투여하는 것이다. 바람직한 투여 경로는 경구이나, 비경구 및 경피성 투여도 고려할 수 있다. 특히 스킨 패취 등과 같은 형태의 방출 제어형 제제는 나이 든 환자의 치료에 특히 적당하다.

본 발명의 방법에 사용되는 티아졸리디논은 몇가지 이유에 있어 이상적으로 적당하다. 첫 번째로, 위장관 및 신장에 대해 비교적 온화하여, 장기간 투여가 가능하다. 두 번째로, 비교적 긴 반감기를 가지므로, 더 적은 투여량으로 효과적인 치료를 할 수 있는데, 이는 나이 든 환자에게 있어 매우 중요하다. 세 번째로, 티아졸리디논은 혈액-뇌 관문을 쉽게 건너가므로, 뇌의 기능에 영향을 미치는 질환을 치료 및 예방하는데 특히 적당하다. 티아졸리디논을, 신경퇴행성 질환을 치료 및 예방하는데 있어서의 그의 유효성을 확증하는 다수의 생물학적 계로 평가하였다. 하기 상세한 실시예는 티아졸리디논의 효능을 확립하는데 사용되는 몇몇 생물학적 검정법을 설명한 것이다. 하기 기재된 모든 연구에 있어서, 사용된 특정 화합물은 (Z)-5-[[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논 메탄술포네이트염이고, CI-1004로 나타내기도 한다.

<실시예 1>

하기 검정은, 티아졸리디논이 동물에 있어서 신경독인 N-메틸-D-아스파테이트 (NMDA)의 선조체내 주사에 의해 유도되는 신경퇴행성의 회복에 효과적이라는 것을 확증하였다.

NMDA (15 nmol/0.5 μL)의 선조체내 주사를, 생후 (PND) 7일 된 수컷 및 암컷 스프라그-다울리 (Sparague-Dawley) 새끼 랫트 (미시간주, 포티지 소재의 찰스 리버 연구소 (Charles River Laboratory))에게 하였다. 이 동물들을 에테르로 마취하고, 피부를 따라 중심선을 절개하여 두개관을 노출시켰다. 새끼 랫트를 소석고 틀에 놓고 이를 정위고정 장치 (코프 인스트루먼트 (Kopf Instruments)사 제품)으로 고정하였다. NMDA (시그마 (Sigma)사 제품)을 0.1M 인산-완충 염수 (PBS) 중에 용해시키고 1N NaOH를 사용하여 pH 7.4로 맞추었다. NMDA (15 nmol/0.5 μL)의 주사액을 26-게이지 해밀턴 (Hamilton) 시린지를 사용하여, 우측 후선조체 (브리그마에 대한 좌표; 경막으로부터 깊이 4.0 ㎜에서, AP -2.0 ㎜, ML 2.5㎜)의 중간에 넣었다. 이 시린지를 주사 후에 제자리에 2 분 동안 방치하여 누출을 막았다. 동물의 체온은 수술 후에 마지막 약물 및 부형제를 주사한 다음 35 ℃ 내지 36 ℃에 맞추어 1 시간 동안 일정 온도로 조절되는 환경 (호바베이터 칙 인큐베이터 (HovaBator chick incubator); 조지아주, 사반나 소재의 비에프지사 (BFG Corp.) 제품)에서 일정하게 유지하였다. 약제 용액은 PBS 중에 제조하였고, NMDA를 선조체내에 주사한지 15 분, 및 2.25 시간 후에 복강 내에 주사하였다. 대조용 동물에게는 동일 용량의 PBS를 투여하였다.

수술 후, 모든 동물들을 5일 동안 어미에게로 돌려보내고, 생후 12 일째에 단두하였다. 뇌를 꺼내어, 대뇌 반구를 분리하고, 각 반구의 습윤중량을 각각 측정하였다. 각 동물에 대한 반구 중량의 차이를 식: 100×(C-I/C)= 손상율 %를 사용하여 비교하였고, 이 값은 주사하지 않은 (C) 대측 반구의 손상에 대해, 주사한 (I) 대뇌 반구 손상의 심각도를 나타낸다. 보호율 %는, 대조군과 비교하여 신경보호 화합물의 상대적인 보호율을 나타내는데 사용하고, 100×[1-(손상_처리%/손상_대조군%)]로 계산하였다. 자료는 모든 군에 대해 평균 손상율 %±S.E.M으로 나타내었다. 독립적인 t-테스트는 통계 비교용으로 사용했다. 앞선 실험은, 반구 중량이 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 조직학적으로 조사된 (α²=0.99, p<0.001, 선형 회귀법) 국소 횡단 면적의 감소와 밀접하게 상호관련되어 있다는 것을 입증하였다. 또한, 이러한 동일한 연구는 선조체내에 PBS를 주사하는 것은 아무런 유의한 손상을 야기하지 않는다는 것도 보여주었다.

<결과>

후선조체에 주사된 NMDA (15 nmol/0.5 μL)는 PBS를 복강내 주사한 대조 동물과 비교하여 동측의 대뇌 반구의 습윤중량에 있어서 20.6±1.8 % (N=10) 감소를 나타내었다. 모든 대조 동물들은 생후 12일 까지 생존하였다. 티아졸리디논은, 2×10 및 3×30 ㎎/㎏의 투여량으로, NMDA-유발 손상을 유의하게 예방하였다 (각각, 28.1±9.2 % 및 49±8.2 %; p<0.04 및 p<0.001). 티아졸리디논 (2×30 ㎎/㎏)을 투여한 한 동물은 생후 12일 까지 생존하지 않았다. 2×30 ㎎/㎏ 투여량에서의 보호가 인도메타신 (indomethacin) 2×30 ㎎/㎏에 의해 제공되는 보호에 필적하였다.

특히 NMDA 수용체에 의해 매개되는, 흥분성 아미노산 신경전달의 과-활성화는, 졸중 또는 신경 손상 후에 발견되는 것과 같은, 대뇌 허혈로부터 유래하는 신경 손상의 대부분에 대한 원인이 된다. 따라서, 티아졸리디논이 NMDA-유발 손상을 회복시킨다는 사실은 대뇌 허혈로부터 유래하는 신경 손상의 치료에 유용하다는 것을 입증한다.

<실시예 2>

티아졸리디논을 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 마우스 모델로 평가하였다. EAE를 유발하는 마우스 마이엘린 염기성 단백질의 단편으로 감작된 마우스에게 상기 화합물을 경구 투여하였다. 동일한 프로토콜 및 신경학적 평가를 사용하여 두번의 실험을 수행하였다. 첫 번째 날에는 감작 4 시간 전에 시작하여, 시험 동물에게 21 일 동안 투여하였다. 티아졸리디논의 효과를 동일하게 감작되고 부형제 만을 투여한 대조 마우스군과 비교하였다. 약제 투여 중단 후에 신경학적 평가를 계속하였다. 하기 표 1 및 2에 기록된 값은 약제로 처치하는 동안만의 반응을 포함한다.

<약물 제조 및 치료>

따뜻한 부형제 (물 중의 0.2 % 트윈 (Tween) 80과 함께 0.5 % 히드록시프로필 메틸셀룰로오스)의 분취량과 티아졸리디논을 유리 유발관 및 균질화용 유봉으로 수동으로 균질화하였다. 부드러운 약물 페이스트를 부형제 중에 점차적으로 현탁시켰다. 10 마리 (실험 1) 및 20 마리 (실험 2)의 군으로 된 마우스에게 약물 및(또는) 부형제를 10 ㎎/㎏ 투여하였다. 마우스에게 실험 첫째날에서 21 일째 까지 투여하였다. 모의-감작된 군에게 부형제 또는 티아졸리디논 30 ㎎/㎏ (실험 1)을 유사하게 투여하였다.

<감작>

염수 중의 마우스 마이엘린 염기성 단백질 (MBP) 단편 (MBP의 N-말단의 아미노산 1 내지 9) 및 가열 살균하여 탈수된 결핵균 (Mycobacteria tuberculosis; MT)로 보강한 디프코 완전 프로인트 보조액 (Difco Complete Freund's Adjuvant; CFA)를 등량부 함유하는 유액을 사용하여 잭슨 실험실 (Jackson Labs)로부터의 PL/J(F1)×SJL/J계 암컷 마우스를 꼬리의 저부에서 0.05 cc를 피하로 2회 감작시켰다. 각 마우스에게, MBP 단편 300 ㎍ (유리 염기 230 ㎍) 및 MT 200 ㎍을 투여한 후, 염수 0.2 cc 중의 바베시아 백일해 독소 (B. pertussis toxin) 200 ng을 안구후부 (정맥내)로 주입하였다. 48 시간 후, 마우스에게 바베시아 백일해 독소를 두 번째로 주사하였다. 실험 1에서의 마우스는 9주 된 것이고, 실험 2의 마우스는 11주 된 것이다.

<신경학적 평가>

동물들의 체중을 재고, 감작 전과 21일 동안 자주 EAE 증상을 평가하였다. EAE 지수: (0.5= 약간 기운이 없는 꼬리, 1= 기운이 없는 꼬리 또는 제자리로 돌아가는 것이 느림, 1.5=약간 기운 없는 꼬리 및 제자리로 돌아가는 것이 느림, 2= 부전마비/경미한 마비 또는 실금, 2.5= 경미한 마비 및 제자리로 돌아가는 것이 느리거나 또는 완전 마비 (뒷다리 하나), 3=뒷다리 마비 (양쪽 모두), 3.5= 뒷다리 마비 (양쪽 모두) 및 기운 없는 몸통, 4= 추가로 앞다리 마비, 4.5= 머리의 움직임만 있음, 5= 빈사 상태, 사전 EAE 증상 후 사망). 평가자는 약물 처치 및 사전 행동 점수에 대해 모르고 있었다.

여러 군들 간의 질환의 증상을 EAE 심각성, 발생빈도, 발병 시간, 누적 지수, 치사, 및 체중 감소에 대해 비교하였다. 피크 EAE 점수: 한 군 중에서, 증상의 지속 기간에 상관 없이, 각 마우스의 가장 높은 점수의 평균치; EAE 발생빈도: 임의의 연속적인 3일간 총 3.0 이상의 EAE 점수를 나타내는 것으로 규정된, EAE 증상을 나타내는 마우스의 평균 수; EAE 치사: 죽은 동물은 0.5 초과의 EAE 지수의 사전 증거를 필수적으로 나타내어야 했음; EAE 발병일: 총 점수 3.0 이상의 연속 3일의 첫 번째날. 누적 EAE 지수는 동물 각각에 대해 계산하였다. 그 다음, 동물의 누적 점수의 평균은 날마다 결정했다. 최대 체중 감소: 한 군 중의 각각의 동물에 대해 가장 낮은 체중의 평균. (주: 누적 EAE 지수 및 최대 체중 감소는 심하게 병든 동물이 없어지는 치사에 의해 영향을 받을 수 있다. 동물들을 평가한 날의 수도 또한 누적 점수에 영향을 미칠 수 있으므로 "실험-내"에서만 비교할 수 있다). 투약 장애로 인해 또는 EAE의 아무런 사전 증상 없이 죽은 마우스는 연구로부터 제외하였다. 실험군들은 유사한 것으로 가정하고, 투-테일드 (Two-tailed) t-테스트로 통계적인 유의성을 비교하였다.

<결과>

<실험 1>

부형제 감작된 대조군은, 일일 EAE 점수 및 신경학적 기준 스펙트럼 (표 1)으로 알 수 있는 바와 같이, 확고한 EAE 증상을 나타내었다. 부형제 또는 티아졸리디논 30 ㎎/㎏으로 처리한 모의-감작된 마우스 군이 질환의 증상을 거의 나타내지 않고 죽지 않는 반면, 대조군은 3/10 EAE 치사를 나타내었다 (표 1). 10 ㎎/㎏ 군이 일일 EAE 점수의 억제, 발생빈도 감소, 누적 EAE 점수 감소, 및 체중 손실 감소를 시사한 반면, 티아졸리디논 3 또는 10 ㎎/㎏으로 처리한 감작된 마우스는 21 일째 까지 (부형제 대조군과 비교하여) EAE 점수의 유의한 감소를 나타내지 않았다 (표 1).

티아졸리디논 30 ㎎/㎏으로 처리한 감작된 마우스는 10 일 이내에 3 마리가 치사를 나타내었다. 그들이 나타낸 사전 증상은, 정위 반사의 결함 뿐이었다 (점수= 1.0). 상기 군에 대한 자료는, (A) EAE로 지정된 치사 (n=9) 및 (B) 연구에서 제외한 비-EAE 관련성으로 지정된 치사의 두 가지 방식으로 계산하였다. 15일째에서야 통계적으로 유의한 감소가 나타나지만 (p≤0.05), 두가지 방법으로의 계산은 10일째 내지 21일째에 일일 EAE 점수가 감소되는 경향을 나타내었다. 방법 A를 사용하여 계산할 경우, 10 ㎎/㎏ 군에 유사한 억제의 기색이 보이더라도, 전체적인 EAE 증상에서는 유의한 감소가 없었다 (표 1). 방법 B를 사용하여 계산할 경우, 피크 EAE 점수 및 중량 손실에서의 유의한 감소가 나타났다(표 1).

<실험 2>

(1) 부형제, (2) 티아졸리디논 10 ㎎/㎏, 또는 (3) 티아졸리디논 30 ㎎/㎏으로 처리한 감작된 마우스의 3개의 더 큰 군으로 앞의 연구를 반복하였다. 13일째 내지 19일째에서의 일일 EAE 점수는 약간 높고, 20일째 내지 52일째에는 경감이 거의 없고 보다 중증의 전체 신경학적 기준을 갖지만, 부형제로 감작된 대조군에서의 EAE 발병은 실험 1과 유사하였다(표 1과 표 2를 비교).

10 또는 30 ㎎/㎏의 티아졸리디논은 일일 EAE 점수 또는 전체 EAE 반응 (피크 점수, 발생빈도, 발병, 치사, 누적 점수 또는 체중 손실)에 대해 아무런 영향도 미치지 않았다 (표 2). 모든 군에 있어서의 치사는 EAE의 증상 후에 일어났다.

EAE 모델은 다발성 경화증에서 나타난 것과 유사한 증후를 나타낸다. 티아졸리디논에 대해 작성된 자료는, 티아졸리디논이 EAE에 있어서의 몇몇 신경학적 증상을 경감시키므로 다발성 경화증으로 고생하는 환자를 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다.

마우스의 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)

처치/경구 투여첫째날: 95/11/20	EAE	체중 손실 (최대 %)
처치/경구 투여첫째날: 95/11/20	피크 점수	체중 손실 (최대 %)	발생빈도	발병 (일)	치사	누적 점수
모의	0.8±0.4	0/9	--	0/9	1.3±0.5	95.8±0.6
모의-CI-1004 30 ㎎	0.8±0	0/9	--	0/9	1.4±0.6	98.5±1.1
대조	3.9±0.4	10/10	12.4±0.6	3/10	17.9±3.2	78.4±2.9
CI-1004 3 ㎎	3.7±0.3	10/10	12.2±0.3	2/10	20.3±1.7	80.1±2.0
CI-1004 10 ㎎	3.0±0.6	7/10	12.1±1.5	2/10	10.9±1.7	85.8±3.0
CI-1004 30 ㎎^a	3.1±0.6	7/9	1.27±2.2	3/9	10.9±3.4	86.1±3.8
CI-1004 30 ㎎^b	2.1±0.6 (p<0.05)	4/6	16.0±2.1	0/6	9.4±3.4	90.4±4.6 (p<0.05)
^aEAE로 인한 것으로 지정된 치사^b미지의 원인으로 인한 것으로 지정된 치사; 계산에서 제외되는 값임

처치/경구 투여첫째날: 95/11/03	EAE	체중 손실 (최대 %)
처치/경구 투여첫째날: 95/11/03	피크 점수	체중 손실 (최대 %)	발생빈도	발병 (일)	치사	누적 점수
대조	4.3±0.2	20/20	11.6	7/20	30.5±2.5	80.8±1.4
CI-1004 10 ㎎/㎏	4.5±0.7	19/19	11.8	10/20	31.3±3.6	76.9±1.4
CI-1004 30 ㎎/㎏	4.3±0.2	20/20	12.4	8/20	28.9±2.7	81.8±1.6

<실시예 3>

티아졸리디논의 추가 시험은, 티아졸리디논이 리포다당류-자극된 소교세포 및 피질성 세포 혼합 배양물에 있어서 산화 질소 신타제의 활성을 억제한다는 것을 확증하였다. 산화 질소 생성의 감소는 산화 질소 신타제 유도 억제의 결과이고, 티아졸리디논이 뇌조직에 대한 손상을 제한한다는 추가의 증거이다.

BV-2 소교세포를 6-웰 배양 플레이트에서 10 % 우태아 혈청이 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 성장시켰다. 활성화하기 전에, 세포에 각종 양의 티아졸리디논을 함유하는 신선한 배지를 제공하였다. 약물 처리 1 시간 후, 소교세포를 리포다당류 (LPS, 4 ㎍/㎖)로 활성화하고, 5 % CO₂함유 분위기중 37 ℃의 인큐베이터에 넣었다. 16 시간 후, 배양물의 유도가능한 산화 질소 신타제 (iNOS) 활성도 및 발현도를 평가하였다. iNOS 활성도는 그리스 반응 (Griess reaction)을 사용하여 결정하였다. 세포-무함유 배양액을 동 부피의 그리스 시약 (물 중의 0.1 % 나프틸렌디아민 디히드로클로라이드 1 부피와 혼합한 5 % 인산 중의 1.0 % 술파닐아미드 1 부피)와 혼합하고, 5 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 560 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 표준으로서 아질산 나트륨을 사용하여 샘플의 농도를 결정하였다. 세포 단백질을 추출하고, iNOS에 대해 특이적인 단클론성 항체를 이용한 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 수행함으로써, iNOS 발현도를 평가하였다.

결과는, 티아졸리디논이 활성화된 BV-2 소교세포에서 산화 질소의 생성을 억제한다는 것을 증명하며, IC₅₀은 2.4 μM이었다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 iNOS 효소의 검사는, 관찰된 활성의 감소가 단백질 발현의 감소와 관련이 있음을 보여주었다. 합해서 생각하면, 이러한 자료는, 티아졸리디논이 활성화된 소교세포에서 iNOS의 발현을 방지하여 이러한 세포에 의해 유리된, 신경 독성의 산화 질소의 양을 감소시킬 수 있다는 것을 증명한다.

혼합 피질 배양물을 이용한 실험을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포를 모으고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 배양하고, 6-웰 플레이트 중에서 증식시켰다. 이러한 실험에 있어서, 티아졸리디논 (10 μM)도 또한 배양물의 LPS 활성과 관련된 산화 질소 신타제 활성의 증가를 방지하였다. 비-LPS 활성화된 배양액을 티아졸리디논으로 처리할 경우, 기초 NO 생성에 있어서의 현저한 감소도 또한 관찰되었다. NO 생성에 있어서의 이러한 감소는 이러한 배양물에서 정상 신경교 활성과 관련된 iNOS 발현의 억제로 인한 것으로 생각된다. 또한, 이는 신경 염증과 관련된 신경독성 감소에 있어서 티아졸리디논의 유용성을 나타낸다.

<실시예 4>

또한, 티아졸리디논은 시토킨 IL-1β의 생성 뿐만 아니라, ICAM-1 및 E-셀렉틴의 세포-표면 발현도 차단한다. 또한, 이 화합물은 생체 외에서 산소 및 글루코오스 결손에 대해 보호한다.

대뇌 허혈은 생체외에서 피질 뉴런의 배양물 중의 산소 및 글루코오스를 저감시킴으로써 모델링할 수 있다. 이 연구를 하기 위해, E 18일 째에 스프라그-다울리 랫트 태아의 뇌로부터 피질성 뉴런을 분리하였다. 대뇌 반구를 절단하고, 분리하고, 0.1 % 트립신이 함유된 행크스 균형 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution; HBSS) 중에 연화시켰다. 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagles Medium; DME), 및 가열-불활성화된 10 % 마혈청 및 6 % 우태아 혈청이 1:1로 보충된 햄스 영양소 혼합물 (Ham's Nutrient mixture) F-12을 첨가하여 세포 농도를 620,000 세포/㎖에 맞추었다. 96-웰 폴리에틸렌이민-코팅된 배양 플레이트의 각각의 독립적인 웰에 세포 현탁액 100 μL 분취량을 피펫팅하였다. 4 일 후, 8 % CO₂의 분위기중 37 ℃의 인큐베이터 중에서, 각 웰로부터 배지 100μL를 꺼내고, 10 % 마혈청을 갖는 DME/F12 100 μL로 대체하고, 여기에 5-플루오로-2-데옥시우리딘 30 ㎍/㎖ 및 우리딘 70 ㎍/㎖를 첨가하여 신경교 세포의 추가 분할을 방지하였다. 배양물을 매 2 내지 3일 마다 분석한 후, 반 부피 (100 μL)를 DME/F12 (10 % 마혈청)으로 대체하였다.

HBSS 50 μL 중에서 저산소/저혈당 환경 (91 % N₂/8 % CO₂/1 % O₂, 1mM 글루코오스, 37℃)에 세포를 시간을 달리하여 노출시켰다. 그 다음, 배양액을 정상 산소 인큐베이터 (21 % O₂/8 % CO₂, 25 mM 글루코오스)에 복귀시키고, 24 시간 후에 세포내 효소 락테이트 탈수소효소 (LDH)를 측정함으로써 세포 치사도를 정량 분석하였다. 저산소증/저혈당증을 유도하기 전에 세포를 티아졸리디논 또는 다른 약물에 1시간 동안 노출시켰다. 티아졸리디논 1μM의 농도는 아무 영향을 미치지 않으나, 10 μM는 세포가 생존능을 손실하기 전의 저산소증/저혈당증의 기간을 현저하게 증가시킨다. 예를 들면, 저산소/저혈당 환경에 4시간 동안 노출시킨 결과, 대조 조건에서 뉴런을 약 50 % 죽였으나, 티아졸리디논 10 μM로 처리한 세포의 노출은 뉴런의 치사를 나타내지 않았다. 유사한 효과가 인도메타신 100 μM로도 나타났다. 이러한 결과는 이 모델계에서 NMDA 길항제에 의해 나타났던 것과 유사하였다. 유사한 현상이 혈관 폐색 또는 손상 후 뇌에서 나타났으므로, 이러한 결과는 티아졸리디논이 대뇌 허혈로부터 유래하는 신경학적 질환의 치료에 유용하다는 것을 확증한다.

<실시예 5>

티아졸리디논은 하기 실험에서 개의 연수막 평활근 세포의 신경퇴행성을 감소시키는 것으로 나타났다.

개의 평활근 세포를 새로 얻은 나이든 개의 뇌척수막으로부터 분리하였다. 각각의 개는 앞서 독물학적 연구에서 부형제 대조군으로 사용했고, 비르투레이트염을 과량 투여하여 인도적으로 희생시켰다. 나이든 개는 인간의 상태와 유사한 맥관 장애를 나타내었다. 평활근 세포는 알츠하이머 병의 더치 형태 (Dutch form)에서 나타나는 대뇌 세포 근장애 부위이다. 이러한 세포의 절충은 궁극적으로 대뇌 혈관의 우발증상 및 몇몇 사람의 사망을 야기한다.

뇌척수막으로부터의 세포를 분리하고, 생화학 연구에 사용하거나 형태학적 연구를 위한 비코팅된 현미경 슬라이드로 이동시키기 전에, 조직 배양 플레이트 상에서, 10 % 우태아 혈청 및 항생제가 포함된 둘베코의 최소의 필수적인 배지 중에서 약 1주일 동안 배양을 지속하였다. 이러한 평활근 세포는 뇌 혈관 세포를 대표하고, 이들은 수회 이동시킬 수 있다. 세포독성을 유도하기 위해, 혈청-무함유 배지에서 42개의 아미노산 길이를 갖는 10 내지 20 μM의 아밀로이드 β-펩티드로 세포를 처리하였다. 이 펩티드는 인간 β-펩티드 서열에 상응한다. 이 펩티드를 사용하기 직전에 물에 용해시킨다. 이러한 소량의 단백질이 알츠하이머 병으로 사망한 인간의 뇌의 사후 샘플에서 관찰되는 단백질의 농도에 근접한다고 생각된다.

평활근 세포를 인간 단백질 서열로 처리함으로써, 세포핵의 비스벤즈이미드 (훽스트 (Hoechst) 33258) 염색으로 증명된 바와 같이 1-주 기간 동안 평활근 세포의 70 % 내지 85 %가 세포 소멸에 의해 죽은 것으로 나타났다. 죽은 세포의 핵은 응축되고 단편화되었다. 형광 현미경으로 3개의 범위를 각각 5회 측정하여 정상핵 및 세포 소멸핵을 계수함으로써 퍼센트를 결정하였다. 약간의 공간적인 의존성이, 정상이라고 판단된 세포는 티오플라빈 S 염색 및 형광 현미경으로 결정하여 아밀로이드 누적이 거의 없다는 것에서 인지되었다. 통계적으로 유의한 세포독성이 확립된 제일 처음은 24 시간만이었다.

티아졸리디논 (5 % DMSO/물 v/v 중의 20 내지 30 μM)를 배지에 첨가하고, 이 배지를 37 ℃에서 24 시간 동안 저장하였다. 티아졸리디논은 아밀로이드에 의해 유발되는 세포사를 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 배양물을 부형제만으로 처리하여서는 아밀로이드 세포독성이 바뀌지 않았다. CI-1004의 보호 효과는, 세포에 대한 아밀로이드 누적이 감소된다는 사실로 더 확정되었으며, 이로서 티아졸리디논이 아밀로이드의 세포 수용체를 감소시키거나 아밀로이드 수용체의 분산을 야기한다는 것을 의미한다.

상기 생물학적 자료는 티아졸리디논이 급성 또는 만성 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방에 유용하다는 것을 확증한다. 따라서, 이 화합물은 졸중, 두부 손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머 병의 치료 및 예방에 특히 적당하다.

상기 언급한 바와 같이, 티아졸리디논은 또한 작용 기간이 길고 필요치 않는 부작용이 사실상 없기 때문에 나이든 환자의 치료에 매우 적당하다. 티아졸리리디논의 독물학적 특성은 마우스나 랫트에 대한 경구 및 혈관내 1회 투여 연구, 및 랫트나 개에 대한 다회 경구 투여 연구로 평가한다. 티아졸리디논을 개 및 원숭이에게 경구 독성을 차츰 올리면서 투여하여, 가장 민감한 비설치종을 결정하였다. 뇌의 혈관 주위의 단핵성 침윤물을 초기 13-주 개 연구에서 조사한 후, 원숭이에 대한 다회 투여 연구를 수행하여 다른 비설치종에서도 유사한 효과가 나타나는지 결정하였다. 초기 13-주 개 연구를 반복하여 혈관 주위 효과의 재현성을 평가하였다. 투여-범위를 알아내는 연구를 임신한 랫트 및 토끼에 대해 수행하고, 유전자 독성 가능성을 생체외 및 생체내에서 평가하였다. 이러한 연구의 결과는 티아졸리디논의 독물학적 측면이 NSAID와 유사하다는 것을 확증하였고, 연구 대상 종은 유사한 정량적 및 정성적 방식으로 반응하였다. 명백한 장기 독성과는 관련이 없는 고유 NSAID-형 간 효소 유발이 랫트 및 개에게서 나타났다. 랫트 및 개에 있어서 비스테로이드계 항-염증성 약물-연관된 위장 영향, 랫트에 있어서 소신장 영향이 최종 13-주 연구에서 관찰되었다. 전형적인 NSAID-연관된 변화는 13 주 동안 처리한 원숭이에게서는 관찰되지 않았다. 미시적으로 밝혀진 표면상의 회맹부 침식이 13-주 원숭이 연구에서 관찰되었으나, 발생빈도 및 심각성이 투여량 또는 전신성계 노출에 연관된 것이 아니므로 이러한 손상은 약물에 의한 것이 아니다. 최종 연구에서 무영향 (no-effect) 투여량에의 노출에 근거하여, 노출시 종간의 미소한 차이가 있기는 하나, 랫트가 가장 민감한 종이었고, 그 다음이 개 및 원숭이였다. C max 및 AUC(0-24)를 각각 0.97 ㎍/㎖ 및 16.5 ㎍·hr/㎖로 하여 10 ㎎/㎏을 투여한 수컷 랫트에게서는 아무런 영향이 관찰되지 않았다. 암컷 랫트에 있어서 10 ㎎/㎏일 때 신장 영향이 나타났으나, Cmax 및 AUC는 동일한 투여량에서 수컷의 약 두배였다. 이러한 자료는 티아졸리디논이 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환으로 고생하는 다양한 범위의 환자, 특히 나이든 환자의 치료에 적당하다는 것을 확증한다.

티아졸리디논은 편리한 비경구, 경피성, 및 경구 투여를 위한 통상적인 부형제와 함께 제제화할 수 있다. 바람직한 치료 방법으로는 경구 투여를 사용한다. 하기 실시예 6은 졸중 및 두부 손상과 같은 신경퇴행성 질환의 예방을 위해 환자에게로의 투여, 및 알츠하이머 병 및 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환으로 고생하는 환자의 치료에 적당한 통상적인 캡슐 제형을 설명한 것이다.

<실시예 6>

성분	1000 캡슐당 양
성분	1 ㎎/캡슐	10 ㎎/캡슐	50 ㎎/캡슐	100 ㎎/캡슐
티아졸리디논	1.289 g	12.891 g	64.455 g	128.910 g
콜로이드상 이산화 규소, NF	2.000 g	2.000 g	4.000 g	4.000 g
락토오스, NF	93.000 g	82.000 g	51.000 g	31.000 g
옥수수 전분, NF	232.711 g	202.109 g	121.545 g	70.090 g
크로스카멜로오스 나트륨, NF	9.000 g	9.000 g	9.000 g	9.000 g
히드록시프로필 메틸셀룰로스, USP	5.000 g	5.000 g	10.000 g	2.000 g
활석, USP	7.000 g	7.000 g	10.000 g	13.000 g
증류수, USPa	충분량	충분량	충분량	충분량
총충전량	350.000 g	320.000 g	270.000 g	258.000 g
^a분말 블랜드의 제조에 사용되나 건조 작업 중에 제거된다. 물은 최종 생성물 중에는 없다.

성분들을 균일하게 블렌딩하고, 건조하고, 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 유효한 일당 1 내지 4회 경구 투여용 젤라틴 캡슐에 충전한다.

Claims

치료를 요하는 환자에게 유효량의 5-[[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논 또는 그의 제약학상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 방법.
제1항에 있어서, 사용 화합물이 메탄술포네이트염의 형태인 방법.
제2항에 있어서, 사용 화합물이 (Z)-5-[[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-4-히드록시-페닐]메틸렌]-2-이미노-4-티아졸리디논 메탄술포네이트염인 방법.
제1항에 있어서, 치료되는 질환이 알츠하이머 병인 방법.
제1항에 있어서, 치료되는 질환이 다발성 경화증인 방법.
제1항에 있어서, 치료되는 질환이 졸중인 방법.
제1항에 있어서, 치료되는 질환이 두부 손상인 방법.