KR19990083376A

KR19990083376A - 미생물배양에의한커들란을생산하는방법

Info

Publication number: KR19990083376A
Application number: KR1019990014200A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 이인영; 이중헌; 김미경; 정준기
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원; 김정칠; 주식회사 진웅화학
Priority date: 1998-04-22
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 1999-11-25
Also published as: KR100316467B1

Abstract

본 발명은 미생물 다당류의 일종인 커들란 (curdlan)을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주를 초기 세포 성장 단계에서는 영양소를 충분히 공급하고 커들란 생산 단계에서는 순차적으로 질소원의 고갈을 유도하며 pH를 중성에서 산성으로 전이하는 2 단계의 회분식 또는 유가식 방법으로 배양하여 커들란을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의하면 커들란의 생산성을 0.71 g/l/hr 이상으로 증가시킬 수 있고 탄소원으로 설탕(sugar), 당밀(molasses) 또는 원당(raw sugar)을 사용함으로써 매우 경제적이고 효율적으로 커들란을 생산할 수 있다.

Description

미생물 배양에 의한 커들란을 생산하는 방법 {Process for manufacturing curdlan by microbial culture}

본 발명은 미생물 다당류의 일종인 커들란 (curdlan)을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주를 탄소원으로 설탕(sugar), 당밀(molasses) 또는 원당(raw sugar)을 사용한 배지에서 회분식 또는 유가식 방법으로 배양하여 커들란을 경제적이고 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

미생물이 체외로 분비하는 다당류 (polysaccharides)는 식품 및 석유화학 분야 등에서 폭 넓게 사용되고 있다. 식품 산업에서는 다당류가 안정제, 유화제 또는 증점제로서 사용되며, 석유화학 산업에서는 굴착이나 원유의 회수공정 등에 사용되고 있다. 일반적으로 많은 종류의 미생물이 다당을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 다당의 화학적 조성과 구조는 상대적으로 다당을 생산하는 균주의 특성에 의하여 좌우되며, 미생물의 다당 합성시기도 세포 성장기 또는 성장 정지기 등 미생물에 따라 다른 것으로 알려져 있다.

애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주와 알칼리제네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis) 균주가 미생물 체외로 배출하는 다당은 포도당 단량체가 β-1,3으로 결합한, 물에 불용성인 중성 다당으로 커들란이라 명명되는데, 이는 미국 특허 3,754,925에 기재되어 있다. 이 단일 다당 (homopolymer)은 열을 가하였을 때 비가역적으로 젤 (gel)을 형성하는 특이한 물리화학적 특성을 가지고 있어 식품에 점증제로서 첨가될 뿐만 아니라, 젤리식품, 식이섬유, 필름 및 고정화 담체 등의 폭넓은 용도로 사용되고 있다 (Paul 등,Biotechnol. Adv.,1986, 4, 245-259). 더구나, 최근에는 커들란이 콘크리트의 유동성을 증가시키는 혼화제로 크게 각광을 받고 있으며 (일본,바이오인더스트리,1996, 13, 56-57), 그의 항종양활성도 보고된 바 있어 (Ohno 등,Chem. Pharm. Bull.,1992, 40, 2215-2218) 산업적으로 사용될 잠재력이 크게 증대하였다. 그러므로, 저비용으로 커들란을 대량 생산할 수 있는 기술이 무엇보다도 중요하게 되었다.

1962년 하라다 등은 토양으로부터 분리된 알칼리제네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis)로부터 처음으로 커들란을 생산하였다 (Agr. Biol. Chem.,1966, 30, 746-769). 또한, 기무라 등은 상기 균주를 이용하여 10 % 포도당 농도에서 최대 2.2 % 의 커들란을 생산하였고, 이로부터 커들란의 물리화학적 특성 및 다양한 용도에 대하여 보고하였다 (미국 특허 제 3,754,925 호).

그 이후, 로포드 등이 커들란의 생산 조건을 개선하기 위하여 바이오 리액터 (reactor)를 개량하거나 연속 조업 방식으로 많은 연구를 수행하여 왔는데, 특히 미국 특허 제 4,355,106 호에 2 단계 연속조업에 의한 커들란의 제조 방법을 상세히 기술한 바 있다. 구체적으로, 상기 방법은 1 단계에서 탄소원과 질소원 등의 영양소가 풍부한 배지를 이용하여 알칼리제네스 패칼리스 ATCC 31749 그리고 ATCC 31750 균주 (후에 이들 균주는 애그로박테리움 속 균주로 동정·명명됨)를 배양한 다음, 상기 배출액을 탄소원은 충분히 있으나 질소원이 없는 2 단계 배지로 유입되게 하여 커들란의 생성을 유도한다. 이 때 1 단계 배양액 내에서는 질소원이 제한 기질로 사용되나 2 단계 배양액으로 유입 시에는 배지 내의 질소원의 농도가 무시할 정도로 적어진다. 또한, 커들란이 생성되는 2 단계 발효조에서 희석율을 0.02 hr^-1(평균 체류 시간이 50 시간)로 조업하는 경우, 최대 커들란 생성양은 7 g/l로 상기 방법에 의한 커들란 생산성은 0.14 g/l/hr 정도이다.

상기와 같은 연속 조업 방식은 높은 생산성을 확보하여 제조 공정의 비용을 절감할 수 있다는 장점이 있지만, 일반적으로 연속 조업 시에는 배출액에서의 생성물 농도가 회분식 또는 유가식 배양에서 보다 낮기 때문에 생성물의 분리·정제에 많은 비용이 요구되는 단점이 있다. 또한, 현재까지 보고된 방법은 모두 포도당을 기질로 사용하는 방법으로써, 기질의 가격이 상대적으로 비싸기 때문에 제조원가가 상승하는 문제가 있다. 따라서, 미생물로부터 커들란을 저렴하게 높은 수율로 생산하기 위하여 새로운 방법의 개발이 요구된다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 계속 연구한 결과, 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주를, 초기 단계에서 질소원을 적절히 공급하여 배양한 다음 커들란 생산 단계에서는 질소원을 제한하는 2 단계의 회분식 또는 유가식 으로 배양하여 커들란의 생산성을 0.71 g/l/hr 까지 증가시켰으며, 이 때 탄소원으로 설탕, 당밀 또는 원당이 사용될 수 있어 경제적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미생물을 탄소원으로 설탕, 당밀 또는 원당을 사용한 배지에서 2 단계의 회분식 또는 유가식 방법으로 배양하여 미생물 다당류의 일종인 커들란 (curdlan)을 고수율로 생산하는 것이다.

도 1은 본 발명의 2 단계 회분식 배양에 의한 설탕으로부터의 커들란 생산에 있어서, 시간의 경과에 따른 pH의 변화, 기질 (슈크로오스, NH₄ ⁺)과 세포의 농도 변화 및 커들란의 농도 변화 양상을 나타낸 것이다.

● pH ○ NH₄ ⁺농도 (g/l)

■ 슈크로오스 농도 (g/l) □ 커들란 농도 (g/l)

..... 질소원이 고갈되는 시점 (22 시간)

도 2는 본 발명의 2 단계 회분식 배양에 의한 원당으로부터의 커들란 생산에 있어서, 시간의 경과에 따른 pH의 변화, 기질 (슈크로오스, NH₄ ⁺, PO₄ ^3-)과 세포의 농도 변화 및 커들란의 농도 변화 양상을 나타낸 것이다.

● pH ○ NH₄ ⁺농도 (g/l)

▽ PO₄ ^3-농도 (g/l) ■ 슈크로오스 농도 (g/l)

□ 커들란 농도 (g/l) ..... 질소원이 고갈되는 시점 (17 시간)

본 발명에서는 미생물을 슈크로오스, 효모 추출물 및 펩톤으로 구성된 영양배지 (pH 7.0)에 접종하여 30 ℃에서 17시간 동안 배양한 다음, 그 배양액을 통기량은 0.5 vvm, 교반속도는 500 rpm이며 탄소원으로 슈크로오스의 초기 농도가 100 ~ 160 g/l, 질소원으로 암모늄의 초기 농도가 0.5 ~ 2.5 g/l, 인산의 초기 농도가 0.5 ~ 3.5 g/l 그리고 무기염을 포함하는 발효배지에서 4N NaOH / KOH를 사용하여 배지의 pH를 6.5 ~ 7.5로 조절하면서 배양하고, 질소원의 고갈로 세포 성장이 끝나면 커들란 생산 단계로 전이되는 회분식 방법에 의해 커들란을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 본 발명에서는 미생물을 슈크로오스, 효모 추출물 및 펩톤으로 구성된 영양배지 (pH 7.0)에 접종하여 30 ℃에서 17시간 동안 배양한 다음, 그 배양액을 통기량은 0.5 vvm, 교반속도는 500 rpm이며 탄소원의 농도가 80 ~ 100 g/l, 인산의 초기 농도가 0.5 ~ 3.5 g/l 그리고 무기염을 포함하는 발효배지에서 질소원으로 암모니아수를 사용하여 배지의 pH를 6.5 ~ 7.5로 조절하면서 배양하고, 커들란 생산 단계로 질소원의 공급을 중단하고 탄소원의 농도를 20 g/l 이상으로 유지하는 유가식 방법에 의해 커들란을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 2 단계 회분식 또는 유가식 방법에 있어서, 커들란 생산 단계에서는 pH를 5.0 ~ 5.5 로 유지하고, 통기량은 0.5 ~ 1.0 vvm으로, 교반속도는 5L 발효기에서 500 ~ 700 rpm, 300L 발효기에서 200 rpm으로 조절하여 용존 산소를 충분히 유지해야 한다.

또한, 배양 시간에 있어서 세포를 짧은 시간에 배양하고, 커들란 생산 단계를 포함하여 5일 이내 동안 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 미생물은 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 ATCC 31750 균주이며, 탄소원으로는 설탕, 원당 또는 당밀을 사용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 미생물을 배양하는데 있어서 회분식 및 유가식 배양 방법을 사용하였다.

첫째, 회분식 배양은 초기 세포 성장 단계에서 세포 성장에 필요한 적절한 양의 질소원과 고농도의 탄소원을 배양액 내에 부가하고 세포 성장이 끝나면 자동적으로 커들란 생산 단계로 전이되는 배양방법이다. 이 때 원당 또는 당밀이 함유한 배지 내의 초기 슈크로오스 농도는 100 g/l 이상인 것이 커들란의 생성에 유리하며, 바람직하게는 100-160 g/l로 첨가하는 것이 좋다.

둘째, 유가식 배양은 초기 세포 성장 단계에서 질소원으로 사용될 수 있는 암모니아수를 사용하여 배지 내의 pH 를 조절하면서 적절한 세포 농도까지 배양하고, 커들란 생산 단계에서는 질소원의 공급을 중단하고 탄소원으로 사용되는 슈크로오스를 높은 농도로 계속 유지시키는 배양 방법이다. 이 때 배지 내의 슈크로오스 농도는 20 g/l 이상으로 유지되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 커들란을 생산하는 모든 균주에 사용될 수 있으나, 애그로박테리움 속 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명은 로퍼드 등 (미국 특허 4,355,106)이 선별하여 사용한 애그로박테리움 (Agrobacterium) ATCC 31750 균주를 슈크로오스, 암모늄, 포스페이트 그리고 그 외 영양분 등이 포함된 배지를 이용하여 배지 내의 pH 를 6.5 - 7.5 범위로 조절하는 동시에 적절한 통기량과 교반 속도를 유지하면서 배양한 다음, 다시 질소원이 고갈된 상태에서 배지 내의 pH 를5.0 - 5.5범위로 전이하고 통기량과 교반 속도를 증가시키면서 커들란이 원활하게 생산되도록 한다. 이 때 유가식의 경우 초기 배양 단계에서는 암모니아수를 이용하여 pH를 조절하고, 커들란 생산 단계에서는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 등을 이용하여 pH를 조절하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 탄소원으로 설탕 (sugar)뿐만 아니라 가격이 아주 저렴한 원당 (raw sugar) 또는 당밀 (molasses)을 사용할 수 있다. 원당은 설탕 제조 시 사용하는 원료로서 사탕무우 또는 사탕수수로부터 얻어지며 설탕성분을 95 % 이상 함유하고 있고, 가격은 설탕의 25-35 % 정도로 매우 저렴하며, 커들란의 생산 시 전후처리 과정이 필요 없다. 당밀은 설탕의 제조 시 부산물로 생산되는 것으로 원액 중 60 % (w/v) 정도의 설탕을 함유한 저렴한 기질이나, 당밀의 사용을 위해서는 당밀이 함유하고 있는 무기염을 제거하기 위하여 열을 가하거나 황산을 처리하는 등 전처리 공정이 필요하며, 또한 당밀을 포함한 발효액은 탁도가 매우 높기 때문에 사용 후에도 환경오염을 줄이기 위하여 별도의 처리가 필요하다. 구체적으로, 설탕을 사용한 회분식 방법으로는 56 g/l (5일 배양), 유가식 배양으로는 60 g/l (4일 배양)의 커들란을 생성하였고, 원당을 사용한 회분식 방법으로 68 g/l (4일 배양), 당밀을 사용한 유가식 방법으로 42 g/l (5일 배양)의 커들란을 생산하여 경제적인 방법임을 확인하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 2 단계 회분식 배양에 의한 설탕으로부터의 커들란 생산

본 발명은 커들란을 제조하기 위하여, 용존산소 분석기와 pH 조절기를 갖춘 5 리터 발효기 (한국발효기, 한국)를 사용하여 애그로박테리움 속 균주를 회분식으로 배양하였다. 구체적으로, 본 발명은 애그로박테리움 속 ATCC 31750 균주를 영양 배지 (4 g 슈크로오스, 1 g 효모 추출물, 1 g 펩톤, pH 7.0) 200 ml에 접종하여 30℃에서 17시간 동안 배양하고 그 배양액을 하기 표 1의 발효 배지 2800 ml에 첨가하였다. 이 때 통기량은 0.5 vvm으로 교반속도는 500 rpm으로 pH는 4 N NaOH / KOH 를 사용하여 7 로 조절하였으며, 22 시간동안 배양 후에 세포 농도는 5.5 g/l 에 달하였다.

배양액 내에 질소원이 고갈되면서 커들란이 생성되기 시작하였는데, 이때 배양액 내의 pH 는 4 N NaOH / KOH 와 2 N HCl을 사용하여 5.5 로 조절하였고, 통기량은 0.5 에서 1.0 vvm 그리고 교반 속도는 500 에서 700 rpm으로 조절하여 용존 산소가 충분한 상태에서 커들란이 원활히 생산되도록 하였다. 그 결과 총 배양시간 5일 이내에 축적된 커들란이 56 g/l 에 달하였으며, 이 때 소모한 슈크로오스에 대한 커들란의 생산 수율은 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)를 상회하였다.

이상의 세포 성장 단계와 커들란 생산 단계에 있어서, 시간에 따른 pH의 변화, 기질 (슈크로오스, NH₄ ⁺)의 농도 변화 및 세포와 커들란의 농도를도 1에 도시하였다.

상기 배양액을 원심분리하고 주로 세포와 커들란으로 이루어진 침전물에 최종 농도가 1 N이 되도록 NaOH 용액을 첨가하여 30분 동안 현탁함으로써 커들란 만을 선택적으로 용해한 다음 5000 rpm으로 원심분리하여 침전된 세포를 분리하였다. 커들란을 함유한 상등액에 다시 염산 용액을 첨가하여 pH 를 4-6으로 맞추면 커들란이 불용성 상태의 젤이 되는데, 이를 증류수로 세 번 세척하여 순수한 커들란을 얻을 수 있었다. 이 때 수확한 커들란을 젤 침투 크로마토그래프 (gel permeation chromatograph)를 사용하여 분자량을 측정하였다. 풀루란 (pullulan)을 표준 시료로 하여 분자량을 구한 결과, 본 발명의 커들란은 분자량이 약 50만에 달함을 알 수 있었다.

발효 배지 (1 리터당)

슈크로오스	140 g
인산암모니움 ((NH₄)₂HPO₄)	3 g
인산 칼륨 (KH₂PO₄)	1 g
황산마그네슘 (MgSO₄·7H₂O)	0.5 g
황산철 (FeSO₄·7H₂O)	0.05 g
황산망간 (MnSO₄4H₂O)	0.02 g
염화코발트 (CoCl₂·6H₂O)	0.01 g
염화아연 (ZnCl₂)	0.01 g

비교예 1. 교반속도와 통기량을 달리한 커들란 생산

실시예 1에서는 커들란 생산 단계에 있어서 통기량을 0.5 에서 1.0 vvm 그리고 교반 속도를 500 에서 700 rpm 으로 조절하여 용존 산소가 충분하도록 조절한 반면, 본 비교예에서는 커들란 생산 단계에서의 통기량을 0.5 vvm 그리고 교반 속도를 각각 400 그리고 300 rpm 으로 조절하였으며, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 그 결과 총 배양시간 5일 이내에 축적된 커들란은 교반 속도를 400 rpm 으로 조절한 경우 42 g/l 였으며, 300 rpm 으로 조절한 경우 10 g/l 미만이었다. 이 때 소모한 슈크로오스에 대한 커들란의 생산 수율은 실시예 1과 같이 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)정도였으며 커들란의 분자량도 거의 같았다.

이상의 비교예로부터 커들란 생산 단계에서는 통기량 및 교반 속도를 증가시킴으로써 배양액 내의 용존 산소 양을 충분하게 유지하는 것이 커들란 생산에 매우 유리함을 확인할 수 있었다.

비교예 2. 배양 pH를 달리한 커들란 생산

실시예 1에서는 커들란 생산 단계에서 배양액 pH를 5.5 로 조절한 반면, 본 비교예에서는 커들란 생산 단계에서의 배양액 pH를 6 또는 7로 조절하였으며, 나머지 과정은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 총 배양시간 5일 이내에 축적된 커들란은 pH를 6으로 조절한 경우 45 g/l였으며, pH를 7로 조절한 경우는 38 g/l이었다. 이 때, 소모한 슈크로오스에 대한 커들란 생산 수율은 실시예 1과같이 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)정도이었으며 커들란의 분자량도 거의 같았다.

이상의 비교예로부터 커들란 생산 단계에서 배양액 내의 pH 를 5.5 이하로 유지시키는 것이 커들란 생산에 매우 유리함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 2 단계 회분식 배양에 의한 설탕으로부터의 커들란 생산 - 배지조성 중 인산암모늄의 초기농도 증가

실시예 1에서는 커들란을 제조하기 위하여 용존산소 분석기와 pH 조절기를 갖춘 5 리터 발효기 (한국발효기, 한국)를 사용한 반면, 본 실시예에서는 300 리터 발효기 (한국발효기, 한국)를 사용하고 배지 조성 중 초기 인산암모늄 농도를 실시예 1의 경우보다 2배 높은 6 g/l로 하여 실시예 1과 동일한 과정에 의해 애그로박테리움 속 균주를 회분식으로 배양하였다.

애그로박테리움 속 ATCC 31750 균주를 영양 배지 (8 g 슈크로오스, 2 g 효모 추출물, 2 g 펩톤, pH 7.0) 400 ml을 함유한 1 리터 플라스크 4 개에 각각 접종하여 30℃에서 17시간 동안 배양한 다음 그 배양액 (1.6 리터)을 표 1의 발효 배지 16 리터를 함유한 30 리터 규모의 1차 발효조에 첨가하였다. 이 때 통기량은 0.4 vvm으로 교반 속도는 200 rpm으로 pH 는 7로 조절하였다. 하루 동안 세포를 배양한 다음 상기 표 1의 발효 배지 144 리터를 함유한 300 리터 발효기에 1차 발효조 배양액을 첨가하였다. 발효 배지 조성은 6 g/l 인산 암모늄을 사용한 것을 제외하고는 상기 표 1의 조성과 동일하였다. 세포 성장 단계에서 24시간동안 배양한 세포 농도는 10.5 g/l에 달하였는데, 이는 실시예 1의 방법에 의한 22시간 배양시의 세포 농도인 5.5 g/l보다 우수함을 알 수 있다.

배양액 내에 질소원이 고갈되면서 커들란이 생성되기 시작하였는데, 이 때 배양액 내의 pH는 4 N NaOH / KOH 및 2 N HCl을 사용하여 5로 조절하였으며, 통기량은 0.5에서 1.0 vvm 그리고 교반 속도는 200 rpm으로 조절하여 용존 산소가 충분한 상태에서 커들란이 원활히 생산되도록 하였다. 그 결과 총 배양시간 5일 이내 축적된 커들란은 64 g/l에 달하였는데, 실시예 1의 방법에 의해 축적된 커들란 58 g/l에 비해 우수하였다. 이 때, 소모한 슈크로오스에 대한 커들란 생산 수율은 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)정도였고, 커들란의 분자량도 실시예 1의 결과와 동일하였다.

이상으로부터 발효배지 내의 질소원 (인산암모늄)의 공급을 증가시키는 것이 세포농도를 증가시키는데 효과적이며 커들란의 생산에도 유리함을 알 수 있었다.

실시예 3. 2 단계 유가식 배양에 의한 설탕으로부터의 커들란 생산

실시예 1에서는 커들란의 생산에 있어서 세포 성장 단계에서 4 N NaOH / KOH 를 사용하고 pH를 7로 조절하였으며 초기 발효 배지 조성만을 사용한 반면, 본 실시예에서는 세포 성장 단계에서 암모니아수를 사용하고 pH를 7로 조절하였으며, 커들란 생산 단계에서는 배양액 내 슈크로오스 농도가 20 g/l 이하로 떨어지지 않도록 연속적으로 슈크로오스를 공급하였다. 그 외는 실시예 1과 동일한 방법으로 애그로박테리움 속 균주를 배양하였다.

본 실시예에서는 초기 세포 성장 단계에서 암모니아수로 배지의 pH를 조절하여 질소원이 고갈되지 않게 함으로써 세포 농도가 24 시간 내에 16 g/l에 이르게 되는데, 이는 실시예 1 (22일간 배양시의 세포농도 5.5 g/l)에 비해 월등한 수치이다. 또한, 커들란 생산 단계로의 전환은 암모니아수를 4 N NaOH / KOH로 대체하여 pH 를 조절하고 배양액 내의 질소원을 고갈시킴으로써 이루어졌다. 실시예 1과 동일한 조건으로 4일간 배양한 경우 60 g/l의 커들란을 수확할 수 있었는데, 이 때 생산성이 0.625 g/l/hr인 것으로 나타나 앞서 보고된 (미국 특허 제 4,355,106호) 연속 발효 방법에서의 생산성인 0.14 g/l/hr 보다 월등히 향상됨을 알 수 있었다.

실시예 4. 2 단계 회분식 배양에 의한 원당으로부터의 커들란 생산

본 발명은 커들란을 제조하기 위하여, 용존산소 분석기와 pH 조절기를 갖춘 5 리터 발효기 (한국발효기, 한국)를 사용하여 애그로박테리움 속 균주를 회분식으로 배양하였다. 구체적으로, 본 발명은 애그로박테리움 속 ATCC 31750 균주를 영양 배지 (4 g 슈크로오스, 1 g 효모 추출물, 1 g 펩톤, pH 7.0) 200 ml에 접종하여 30℃에서 17시간 동안 배양하고 그 배양액을 하기 표 2의 발효 배지 2800 ml에 첨가하였다. 이러한 세포성장 단계에서의 통기량은 0.5 vvm으로 교반속도는 500 rpm 으로 pH 는 4 N NaOH / KOH 를 사용하여 7로 조절하였다. 17시간 동안의 배양 후에 세포 농도는 10.5 g/l 에 달하였다. 배양액 내에 질소원이 고갈되면서 커들란이 생성되기 시작하였는데, 이 때 배양액 내의 pH 는 4 N NaOH / KOH 와 2 N HCl 을 사용하여 5.5 로 조절하였으며, 통기량은 0.5 에서 1.0 vvm 그리고 교반 속도는 500 에서 700 rpm으로 조절하여 용존 산소가 충분한 상태에서 커들란이 원활히 생산되도록 하였다. 그 결과 총 배양시간 4일 이내에 축적된 커들란이 68 g/l 에 달하였으며, 이 때 소모한 원당에 대한 커들란의 생산 수율은 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)를 상회하였다. 이 때 생산성이 0.71 g/l/hr인 것으로 나타나 앞서 보고된 (미국 특허 제 4,355,106호) 연속 발효 방법에서의 생산성인 0.14 g/l/hr 보다 월등히 향상됨을 알 수 있었다.

이상의 세포 성장 단계과 커들란 생산 단계에 있어서, 시간에 따른 pH의 변화, 기질 (슈크로오스, NH₄ ⁺ _,PO₄ ^3-)의 농도 변화 및 세포와 커들란의 농도를도 2에 도시하였다.

상기의 배양액을 원심분리하고 주로 세포와 커들란으로 이루어진 침전물에 최종 농도가 1 N 이 되도록 NaOH 용액을 첨가하여 30분 동안 현탁하여 커들란만을 선택적으로 용해한 후, 5000 rpm으로 원심분리하여 침전된 세포를 분리하였다. 커들란을 함유한 상등액에 다시 염산 용액을 첨가하여 pH 를 4-6 으로 맞춤으로써 불용성 상태의 커들란 젤을 얻고, 이를 증류수로 세 번 세척하여 순수한 커들란을 얻을 수 있었다. 수확한 커들란을 젤 침투 크로마토그래프 (gel permeation chromatograph)를 사용하여 분자량을 측정하였다. 풀루란(pullulan)을 표준 시료로 하여 분자량을 구한 결과, 본 발명의 커들란의 분자량이 약 50만에 달함을 알 수 있었다.

발효 배지 (1 리터당)

원당 (raw sugar)	140 g
염화암모늄 (NH₄Cl)	4.42 g
인산칼륨 (KH₂PO₄)	1.43 g
황산마그네슘 (MgSO₄·7H₂O)	0.5 g
황산철 (FeSO₄·7H₂O)	0.05 g
황산망간 (MnSO₄4H₂O)	0.02 g
염화코발트 (CoCl₂·6H₂O)	0.01 g
염화아연 (ZnCl₂)	0.01 g

비교예 3. 교반속도와 통기량을 달리한 커들란 생산

실시예 4에서는 커들란 생산 단계에 있어서 통기량을 0.5 에서 1.0 vvm 그리고 교반 속도를 500 에서 700 rpm으로 조절하여 용존 산소가 충분하도록 조절한 반면, 본 비교예에서는 커들란 생산 단계에서의 통기량을 0.5 vvm 그리고 교반 속도를 각 400과 300 rpm으로 조절하였으며, 나머지 과정은 실시예 4 과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과 총 배양시간 4일 이내에 축적된 커들란은 교반 속도를 400 rpm 으로 조절한 경우에 40 g/l였으며, 300 rpm으로 조절한 경우에는 18 g/l 미만이었다. 이 때 소모한 원당에 대한 커들란의 생산 수율은 실시예 4과 같이 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스) 정도였으며 커들란의 분자량도 거의 같았다.

이상의 비교예로부터 커들란 생산 단계에서는 통기량 및 교반 속도를 증가시킴으로써 배양액 내의 용존 산소 양을 충분하게 유지하는 것이 커들란의 생산에 매우 유리함을 확인할 수 있었다.

비교예 4. 배양 pH를 달리한 커들란 생산

실시예 4에서는 커들란 생산 단계에서 배양액 pH를 5.5 로 조절한 반면, 본 비교예에서는 커들란 생산 단계에서의 배양액 pH를 6 또는 7 로 조절하였으며, 나머지 과정은 실시예 4과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 총 배양시간 4일 이내에 축적된 커들란은 pH를 6으로 조절한 경우 44 g/l 인 것으로 나타나고, pH 를 7 로 조절한 경우는 35 g/l인 것을 알 수 있었다. 이 때 소모한 원당에 대한 커들란 생산 수율은 실시예 4와 같이 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)정도였으며, 커들란의 분자량도 거의 같았다.

비교예 5. 배양액 내 인산칼륨(KH ₂ PO ₄ ) 농도에 따른 커들란 생산

실시예 4에서는 초기 배양액 내의 인산칼륨의 농도를 1.43 g/l로 하였는 반면, 본 비교예에서는 초기 배양액 내의 인산칼륨의 농도를 각각 0.29, 3.5, 6.0, 그리고 8.0 g/l로 첨가하고, 나머지 과정은 실시예 4과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 총 배양시간 4일 이내에 축적된 커들란은 배양액 내의 인산칼륨의 농도가 0.29 g/l일 때 커들란 생산이 10 g/l미만이었고, 3.5 g/l일 때 60 g/l 이었고, 6.0 g/l일 때 62 g/l, 그리고 8.0 g/l 일 때 38 g/l이었다. 이 때 소모한 원당에 대한 커들란 생산 수율은 실시예 4와 같이 0.5 (g-커들란/g-슈크로오스)정도였다.

이상의 비교예로부터 커들란 생산시 초기 인산의 농도를 0.5 - 4.5 g/l로 배양액에 첨가하는 것이 커들란 생산에 매우 유리함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 2 단계 유가식 배양에 의한 당밀로부터의 커들란의 생산

본 실시예에서는 커들란 생산에 있어서 경제성을 높이기 위하여 설탕보다 훨씬 저렴하고 슈크로오스를 리터 당 85 g 이상 함유한 당밀을 사용하여 실시예 3과 동일한 방법으로 조업하였다. 이 때 당밀로는 당밀 내에 다량 함유된 칼슘을 제거하기 위하여 황산을 첨가하고 pH 를 2.5 로 맞추어 하루 정도 지난 후 중화시킨 다음 멸균한 것을 사용하였고, 인산 암모늄 (3 g/l)을 제외한 다른 영양소는 첨가하지 않았다. 실시예 3와 동일한 과정으로 암모니아수로 pH를 7로 조절하여 20 시간 동안 배양하고 세포 농도가 10 g/l에 달한 다음에 암모니아수를 4 N NaOH / KOH로 대체하여 질소원의 고갈을 야기시키면서 커들란 생산 단계에서 배양액의 pH 를 5.5 로 조절하였다. 실시예 3과 동일한 조건으로 5 일간 배양하여 42 g/l 의 커들란을 수확하였다.

본 발명에서는 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주를 질소원이 충분히 있는 조건에서는 세포가 성장하고 순차적으로 질소원이 고갈되면서 커들란이 생성되는 2 단계의 회분식 또는 유가식 방법으로 배양하는데, 특히 커들란이 생성되는 단계에서 pH를 산성으로 전이하고, 통기량과 교반속도를 조절하여 용존 산소를 충분하게 유지시킴으로써 짧은 시간 안에 커들란의 생산을 극대화할 수 있다.

또한, 본 발명의 배양액에 첨가하는 탄소원으로는 설탕, 원당, 당밀을 사용할 수 있는데, 모두 높은 농도로 커들란을 생산한다. 특히 원당의 경우, 원당 전부를 커들란으로 전환 시 커들란에 대한 원당의 전환수율은 0.5 g/l정도로서, 가장 높은 농도 (68 g/l)로 커들란을 생산할 수 있을 뿐 아니라 가격이 매우 저렴하여 경제적으로 널리 이용될 수 있다.

Claims

커들란 생산 미생물을 탄소원, 질소원, 인산염 및 무기염을 포함하는 발효배지에서 회분식 또는 유가식으로 배양하여 커들란을 생산하는 방법에 있어서, 1) 세포 성장단계에서는 질소원을 포함한 영양원이 충분하도록 하고, 배지의 pH는 6.5 ~7.5로 조절하며, 2) 커들란 생산단계에서는 배지 내 질소원의 고갈로 세포 성장이 끝나면 커들란 생산단계로 전이되고 이때 배지의 pH를 5.0 ~ 5.5로 조절하여 커들란을 고수율로 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 회분식은 미생물을 탄소원의 초기 농도 (슈크로오스양 기준)가 100 ~ 160 g/l, 질소원으로 초기 암모늄의 농도가 0.5 ~ 2.5 g/l, 인산의 초기 농도가 0.5 ~ 4.5 g/l 되도록 배지를 조성하여 커들란을 고수율로 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 유가식은 미생물을 탄소원의 초기 농도 (슈크로오스양 기준)가 80 ~ 140 g/l, 인산의 초기 농도가 0.5 ~ 4.5 g/l인 발효배지에서 질소원으로 암모니아수를 사용하여 배지의 pH를 조절하면서 미생물을 배양하고, 커들란 생산 단계에서 질소원의 공급을 중단하고 탄소원의 농도 (슈크로오스양 기준)를 20 g/l 이상으로 유지시키는 것을 특징으로 하는 커들란을 고수율로 생산하는 방법.
제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포 성장 단계와 커들란 생산 단계에서 5L 발효기에서 통기량은 0.5 ~ 1.0 vv2m으로, 교반속도는 500 ~ 700 rpm , 300L 발효기에서 200 rpm으로 조절하여 산소전달계수를 100 hr^-1이상으로 하여 용존 산소를 충분히 유지하도록 하는 것을 특징으로 하는 커들란을 고수율로 생산하는 방법.
제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 미생물은 애그로박테리움 (Agrobacterium) 속 균주인 것을 특징으로 하는 커들란을 고수율로 생산하는 방법.
제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 탄소원은 설탕, 원당 또는 당밀 중에서 하나 이상을 선택하는 것을 특징으로 하는 커들란을 고수율로 생산하는 방법.