KR880001950B1 - 발효법에 의한 5'-구아닐산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

발효법에 의한 5'-구아닐산의 제조방법
본 발명은 5'-크산틸산 생산균주와 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킬 수 있는 균주(이하 5'-크산틸산 전환 균주라 한다)를 혼합 배양하므로써 5'-구아닐산을 보다 효율 좋고 간단하게 제조하기 위한 발효법에 의한 5'-구아닐산의 제조방법에 관한 것이다.
종래 5'-구아닐산의 제조방법으로는, 효모 핵산 가수 분해법과 미생물에 의해 제조된 구아노신을 화학적으로 인산화하는 방법등이 있으나, 이들은 원료 공급상의 문제점 뿐만 아니라 수율 및 생성량이 적다는 등의 단점이 있었다. 또한 일특공소 46-39069와 같은 데코이닌 내성 변이주를 5'-크산틸산 함유 배지에 배양하여 5'-구아닐산으로 발효 전환시키는 방법과 국내 특허공고번호 제 78-344호와 같은 5'-크산틸산 전환 균주가 생산하는 효소액에 5'-크산틸산 또는 그 함유액을 첨가하여 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법등도 있으나, 이러한 제조방법도 전자인 경우에는 5'-구아닐산 이외의 부산물의 생성이 많아 공업적인 제조방법으로는 바람직하지 못한 것이었고 후자의 경우도 5'-크산틸산을 축적 배양시키는 배양 공정과 이를 정제하여 사용할 경우에 있어서 정제 공정 및 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 효소의 생산균 배양 공정등이 매우 복잡하여 5'-구아닐산을 제조하는데 어려운점 등이 있었다.
따라서 본 발명자들은 이와 같은 종래 방법의 단점을 해결하고 간단한 방법으로 고수율의 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 연구 검토하던중, 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환균주를 혼합하므로써 간단한 배양 공정을 거쳐 고수율로 5'-구아닐산을 제조할 수 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.
그러나 본 발명에서 참고로한 종래의 혼합 배양법은 「Amino Acid·NuCleic Acid 제27호, 1973」에 발표된 바와 같이 5'-크산틸산의 함량에 적을 뿐만 아니라 전환율도 낮아(80%수준) 5'-구아닐산을 제조하기 위한 방법으로는 부적합한 것이었다.
즉, 본 발명은 첫째, 5'-크산틸산의 생성축적량을 향상 시킴과 동시에 배양의 조절을 용이하게 하기 위해 5'-크산틸산 전환 균주의 첨가시기를 5'-크산틸산 생산 균주의 생육도가 0.05-0.5(배양액을 50배로 희석하여 파장 562mμ 에서 측정한 광학밀도) 범위 내의 적당한 시기에 첨가하고 첨가 배양이 완료된 후 두균주의 균체량의 합이 PCV (Packed cell Volume)로 30-40%(3,000 rpm 에서 15분간 원심 분리후 측정한 값)가 되도록 식균비율을 1 : 1-15 : 1로 조절하여 식균하므로써 전술한 종래의 혼합 배양법이 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환 균주를 배양 초기에 동시 식균하고 식균 비율을 1 : 1-10 :1로 하기 때문에 배양 완료후 5'-크산틸산의 생성량 및 5'-크산틸산 전환 균주의 균체량등을 조절할 수 없고 식균량 및 배양의 조절이 어려워 5'-크산틸산의 생성이 적은 단점을 해결하였으며, 둘째 본 발명은 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환 균주를 혼합 배양하여 두 균체량의 합이 30-40%(PCV%)로 되는 싯점에서 계면 활성제를 첨가하여 전환시키기 때문에 배양시에 두 균주를 증식 및 5'-크산틸산 생성의 최상 조건으로 유지시켜 배양할 수 있고 전환시에는 5'-크산틸산 전환효소의 최대 활성 조건인 pH 7.4, 온도 42℃에서 전환시키므로써 다른 뉴클레오 타이드로의 분해가 거의 일어나지 않아 전환율도 매우 높기 때문에 종래의 혼합 배양법에서와 같이 계면 활성제를 배양 2일째에 첨가하므로써 5'-크산틸산 전환 균주의 증식과 동시에 전환이 진행되어 온도 30℃에서 배양 및 전환되므로 5'-크산틸산 전환 균주의 증식 조건은 양호하나, 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 조건이 불량하여 다른 뉴클레오 차이드로의 분해가 많이 일어나 전환율이 낮은 방법상의 결점(발효와 공업, 7월호, 1984)을 완전히 해결할 것이다.
즉 본 발명은 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환 균주를 혼합배양하여 두 균체량의 합이 30-40%(PCV%)로 되는 싯점에서 계면 활성제를 첨가하기 때문에 배양시에는 두 균주의 증식 및 5'-크산틸산 생성의 최상 조건으로 배양하고, 전환시에는 5'-크산틸산 전환 효소의 최대 활성 조건인 pHH 7.4, 온도42℃에서 전환시킴으로 다른 뉴클레오 타이드로의 분해가 거의 일어나지 않아 전환율이 매우 높은 특징이 있는 것이다.
전술한 종래의 혼합 배양법과 본 발명을 비교하면 표 1과 같다.
[표 1]
종래의 혼합 배양법과 본 발명의 비교
Figure kpo00001
상술한 바와 같이 본 발명은 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환균주를 혼합 배양하여 5'-구아닐산을 제조하는 방법으로써, 5'-크산틸산 전환 균주의 첨가시기를 5'-크산틸산 생산 균주의 생육도가 광학밀도(562mμ ×50배) 0.05-0.5범위의 적당한 시기에 배양 완료후, 5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환균주의 균체량의 합이 30-40%(PCV%)가 되도록 식균 비율을 1 : 1- 15 :1 로 조절하여 식균하므로 써 5'-크산틸산 생성량이 많아지고, 또한 두 균주를 혼합 배양후 계면 활성제를 첨가하여 전환시키므로 5'-크산틸산 전환 효소의 최적 활성조건인 pH 7.4, 온도 42℃에서 전환시킬 수 있어 전환율을 향상시키고 5'-구아닐산을 고수율로 얻을 수 있는 특징이 있는 것이다.
5'-크산틸산 생산 균주와 5'-크산틸산 전환 균주의 식균비율과 5'-크산틸산 전환 균주의 첨가 시간별 농도와 배양 시간 및 전이율은 표 2와 같다.
[표 2]
5'-크산틸산 전환 균주의 첨가 시간별 성적 비교
Figure kpo00002
다음의 실시예에서 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
종배지 : 포도당 50g, 호모엑기스 10g, 펩톤 5g, 육즙 5g, 염화나트륨 2.5g, 증류수 1, 살균전 pH 7.3
발효 배지 : 포도당 200g, KH2PO4, KHPO4, 각 20g, CaCl20.1g,MgSO420g, MnSO42㎎, Fe2SO410㎎, ZnSO41㎎, 비오틴 30μg, 티아민·HCL 5mg, 알라닌 10mg, 효모 엑기스 5mg, 아데닌 50mg, 구아닌 30mg, 증류수 11, 살균전 pH 8.5
상기 종배지( 5'-크산틸산 생산 균주와 전환 균주)와 발효 배지를 공살균된 500ml 진탕용 삼각 플라스크와 2.6자훠멘터에 각 90ml와 900ml씩 분주하고 115℃에서 15분간 가압 살균 하였다.
배양 방법 : 종배양한 5'-크산틸산 생산 균주 브레비 박테리움 암모니아게네스 D-1550-40 주배양액 90ml를 발효배지에 식균하고 배양하다가 5'-크산틸산 생산 군주의 생육도가 0.3(광학밀도 : 파장 562μm, 희석 50배) 되는 싯점에서 주배양한 5'-크산틸산 전환 균주 브레비 박테리움 암모니아게네스 BA 17-2주 배양액 18ml를 식균하여 호기적 조건하에서 30℃ pH 6-8로 조절 하면서 배양 하였다. 배양 완료 후 5'-크산틸산 생산 균두와 전환 균주의 균체량의 합은 37%(PVC %, 원심 분리 3,000 rpm, 15분)였으며 5'-크산틸산의 생성량은 43.5g/l이었다.
전환 방법 : 상기한 방법으로 배양이 완료되면 즉시 계면 활성제 POESA(polyoxyethylene stearylamine)를 첨가하고 온도와 pH를 42℃ 7.4로 맞춘 후 10-12시간 전환시킨 결과 5'-구아닐산 생성량은 40.4g이었다. 이 반응액 1l를 염산으로 pH 2.0으로 맞추고 활성탄으로 흡착시킨 후 에틸 알코올로 용출하여 상온에서 감압 농축하고, 이 농축액을 pH2.5로 조정하여 음이온 교환수지 도엑스(Cl 형)1×2 수지탑에 흡착시키고 염산으로 용출한 후 감압 농축하여 가성 소다로 pH 7.0으로 조정하고 에틸 알코올 존재하에 0℃로 방치하여 5'-구아닐산나트륨 조결정 32.5g을 얻었다.
[실시예 2]
5'-크산틸산 전환 효소의 종배양액 9ml를 식균한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 결과 배양 완료 후 두 균주의 균체량의 합은 34%였으며 5'-크산틸산은 44.7g/l 생성 되었다. 실시예 1과 동일한 방법으로 5'-구아닐산나트륨 조결정 31.9g을 회수 하였다.
[실시예 3]
실시예 1과 동일한 발효 배지에 5'-크산틸산 생산 균주 900ml를 식균하고 배양하다가 5'-크산틸산 생산 균주의 생육도가 0.5가 되는 시점에서 종배양된 5'-크산틸산 전환 균주 배양액 18ml를 식균하고 배양한 결과, 배양완료 후 두 균주의 균체량의 합은 35%였으며, 5'-크산틸산은 44.1g/l 생성되었다. 실시예 1과 동일한 방법으로 5'-구아닐산나트륨 조결정 30.8g을 회수하였다.
[실시예 4]
실시예 1과 동일한 발효 배지에 5'-크산틸산 생산 균주 90ml를 식균하고 배양하다가 5'-크산틸산 생산균주의 생육도가 0.05가 되는 시점에서 종배양된 5'-크산틸산 전환 균주 6ml를 식균하고 배양한 결과, 배양 완료 후 두 균주의 균체량의 합이 33%였으며 5'-크산틸산은 36.4g/l 생성 되었다. 이를 실시예 1과 동일한 방법으로 회수하여 5'-크산틸산나트륨 조결정 24.9g을 얻었다.

Claims (2)

  1. 공지의 브레비박테리움 암모니아게네스종 5'-크산틸산 생산 균주의 생육도가 0.05-0.5(배양액을 50배로 희석하여 파장 562mμ에서 측정한 광학밀도)인 범위 내에서 공지의 브레비박테리움 암모니아게네스종 5'-크산틸산 전환 균주를 첨가하고, 혼합 배양이 완료된 후 두 균체량의 합이 30-40PCV%로 되는 시점에서 계면 활성제를 첨가하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킴을 특징으로 하는 발효에 의한 5'-구아닐산의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 두 균체량의 합이 상기 5'-크산틸산 생산 균주와 상기 5'-크산틸산 전환 균주와의 식균 비율을 1 : 1-15-1로 조절하므로써 유지 됨을 특징으로 하는 5'-구아닐산의 제조 방법.
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