KR19990078869A - 효소를 이용한 디,엘-싸이클로쎄린의 전구체 및 디,엘-싸이클로쎄린의 제조방법 - Google Patents
효소를 이용한 디,엘-싸이클로쎄린의 전구체 및 디,엘-싸이클로쎄린의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 효소를 이용하여 D-, 혹은 L-싸이클로쎄린을 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 D,L-쎄린으로부터 화학적인 방법으로 D,L-5-히드록시메틸히단토인을 제조하고 효소화 하이드록실아민을 사용하여 N-카바모일-D, 혹은 L-싸이클로쎄린을 제조한다. 이때 사용되는 효소가 D-히단토이나제이면 N-카바모일-D-싸이클로쎄린이 제조되고 L-히단토이나아제인 경우는 N-카바모일-L-싸이클로쎄린이 얻어진다.
얻어진 N-카바모일-D-, 혹은 L-싸이클로쎄린을 D-카바모일라제로 반응시키면 D-싸이클로쎄린이 제조되고 L-카바모일라제로 반응시키면 L-싸이클로쎄린이 생산된다. 본 발명은 결핵치료제나 정신질환 치료제로 이용되는 D-싸이클로쎄린이나 L-싸이클로쎄린을 경제적으로 고수율로 생산하게 하는 새로운 제조방법이다.
Description
본 발명은 D,L-쎄린으로부터 결핵치료제, 치매 또는 기억력 장애 치료제로 쓰이는 D-싸이클로쎄린 과 L-싸이클로쎄린을 효소를 이용하여 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.
D-싸이클로쎄린(Cycloserine)은 박테리아의 세포벽 합성시 세포벽 내에서 D-알라닌과 경쟁적으로 결합하여 박테리아의 세포벽의 합성을 저해함으로써 항균효과를 나타내는 항생제의 일종이다. 특히 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli) 균주와 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대하여 항균효과가 있을 뿐만 아니라 결핵을 유발하는 마이코박테리아(Mycobacteria) 균주에 대하여도 항균효과를 나타내므로 결핵 치료제로도 사용되고 있다. 특히 D-싸이클로쎄린은 유아 또는 어린이들의 결핵 치료에 세계적으로 많이 사용되는 약제 중의 하나이다. 경우에 따라서는 1차 결핵 치료제 사용 후 발현되는 독성 또는 내성균에 대하여 효과적으로 치료할 수 있는 약제로서 복수약제처방(Multi-drug)요법에서이 약제로 사용되기도 한다.
D-싸이클로쎄린은 알콜 중독으로부터 야기되는 심각한 신장결손 또는 우울증, 간질 등의 정신질환을 가진 환자의 항지표(contra-indicator)로 이용되기도 한다. 또한, D-싸이클로쎄린과 거울 이성질체인 L-싸이클로쎄린은 고셔병(Gaucher's Disease)의 치료에 효과가 있음이 보고되었다.
D-싸이클로쎄린을 중추신경계용 약으로서 치매 치료 또는 기억력 증가를 위한 약제로의 이용이 연구되고 있을 뿐 아니라 싸이클로쎄린의 안전성을 증대시키면서 약효의 증가얻기 위하여 전구체의약(pro-drug)의 형태로 제조하는 기술에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
종래 D-싸이클로쎄린은 크게 세가지 방법으로 제조되고 있다.
첫째로는, D-2-아미노-3-클로로프로피온산(D-2-amino-3-chloropropoinic acid)을 이용하여 트리플루오로초산 무수물(trifluoroacetic anhydride)로 아민(amine)기를 보호한 D-2-(프리플루오로악트아미드)-3-플로로프로피온산(D-2-(Trifluoroactamido)-3-chloropropoinic acid)를 제조한 후 PCL5를 사용한 다음, 히드록시아민(hydroxylamine)으로 처리하여 히드록삼산(hydroxamic acid) 유도체를 얻고, 이를 염기로 처리하여 D-싸이클로쎄린을 얻는 방법이다. 이 방법은 제조공정이 4단계에 불과하지만 고가의 화합물인 D-2-아미노-3-클로로프로피온산를 출발물질로 하기 때문에 생산가격이 매우 비싸다.
둘째로는 D,L-쎄린을 에스테르화하고 에틸이미도벤조에이 트(ethylimidobenzoate)를 이용하여 고리화(cyclization)한 다음, 히드록시아민(hydroxylamine)과 EtONa를 이용하여 히드록삼산을 제조후 산, 염기로 처리하여 D,L-싸이클로쎄린을 얻고, D-주석산(D-Tartaric acid)를 이용하여 D-싸이클로쎄린을 제조하는 방법이다. 두 번째 방법의 경우 D,L-쎄린으로부터 출발하여 7내지 8단계의 화학 반응 공정을 거치므로 제조수율이 낮고, D-주석산 사용 후 수지(Resin)을 이용하여 크로마토그래피 과정을 거쳐야 하는 불편함이 있다.
셋째로는 D-쎄린을 염소화반응, 에스테르화반응 시킨 다음 히드록시아민과 고리화반응시켜 D-싸이클로쎄린을 제조하는 방법이다. 이 방법은 제조공정이 3단계에 불과하지만 고가의 화합물인 D- 쎄린으로부터 출발하기 때문에 생산 가격이 비싸고 D- 쎄린의 아민이 보호기로 보호되지 않기 때문에 히드록시아민과의 고리화반응시 반응성이 떨어져 제조수율이 낮다.
본 발명은 가격이 저렴한 D,L-쎄린으로부터 효소를 이용하여 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린의 전구체 및 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린을 고순도 및 고수율로 제조할 수 있는 새로운 제조 방법을 제공하고자 한다.
제 1 도는 D,L-쎄린으로부터 D,L-싸이클로쎄린의 전구체 및 D,L-싸이클로쎄린을 제조하는 과정을 보여주는 간략 반응도.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, D,L-5-히드록시메틸히단토인을 효소로 처리하여 N-카바모일-D,L-쎄린을 제조하고, 상기 N-카바모일-D,L-쎄린과 히드록시아민을 고리화반응시켜 N-카바모일-D,L-싸이클로쎄린을 제조하는 방법과; 이렇게 제조한 N-카바모일-D,L-싸이클로쎄린을 효소로 처리하여 D,L-싸이클로쎄린을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 D,L-화합물이란 D-화합물, L-화합물 또는 이들의 혼합물을 의미한다. 본 발명과는 별도로, 본 발명에서 출발물질로 사용되는 D,L-5-히드록시메틸히단토인은 D,L-쎄린을 원료로 하여 통상의 화학적 방법으로 제조될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이 D,L-쎄린을 원료로 하여 히드록시메틸히단토인을 화학적으로 합성한 다음 이를 미생물 유래 효소인 히단토이나제를 이용하여 N-카바모일-D-쎄린 유도체를 만들고 이를 고리화시켜 얻은 N-카바모일-D-, 혹은 L-싸이클로쎄린을 다시 미생물 유래 카바모일라제를 이용하여 아민 보호기를 제거하여 D-, 혹은 L-싸이클로쎄린을 제조하는 것이다(도 1). 이때 미생물 유래효소의 입체 특이성에 따라 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린이 생산된다. 예를 들어 D-히단토이나제와 D-카바모일라제 효소를 이용하면 D-싸이클로쎄린이 생성되는 반면에 L-싸이클로쎄린을 생산하고자 할 경우에는 L-히단토이나제와 L-카바모일라제를 사용하면 된다. D,L-쎄린으로부터 제조된 D,L-히드록시메틸히단토인은 히단토이나제에 의한 효소반응이 진행됨에 따라 한 쪽의 이성질체가 다른 쪽으로 전환되는 자발적인 라세미화가 일어나기 때문에 이론적으로 100%의 전환 수율을 얻을 수 있다.
본 발명에서 중요한 효소는 먼저 히단토인 유도체에 작용하여 N-카바모일아미노산을 생산하는 히단토이나제이다. 이 효소는 원래 히단토인 유도체로부터 아미노산을 제조하는데 사용되는 효소로 주로 미생물로부터 유래한 것들이 주로 이용되어 왔다. 미생물 유래의 히단토이나제는 기질에 대한 특이성에 따라 D-히단토이나제와 L-히단토이나제로 구분되는데 지금까지 주로 D-아미노산을 제조하기 위한 D-히단토이나제에 관한 연구가 많이 진행되어 왔으나, 최근에는 L-아미노산의 생산을 위한 L-히단토이나제에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.
다음 단계의 효소로 아민기에 붙어 있는 카바모일 기를 제거하는 효소로 카바모일라제가 이용되는데 이 효소도 작용하는 기질에 대한 특이성에 따라 D-와 L-카바모일라제로 구분되고 대부분 미생물로부터 유래된 것이 사용된다.
본 발명에서 언급된 히단토이나제는 주로 슈도모나스(Pseufomonas), 바실러스(Bacillus), 아그로박터(Agrobacter), 써머스(Thermus), 아쓰로박터 (Arthrobacter) 등에서 유래한 것들이 이용될 수 있으며 생산하고자 하는 최종 산물의 형태(D- 혹은, L-싸이클로쎄린)에 따라 D-히단토이나제, 혹은 L-히단토이나제가 사용될 수 있다. 또한 카바모일라제의 경우에는 수도모나스(Pseudomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 꼬마모나스(Comanonas), 블라스토박터(Blastobacter), 바실러스(Bacillus)등으로부터 유래한 것들이 사용될수 있으며 히단토이나제와 마찬가지로 생산하고자 하는 최종생산물의 형태(D-혹은, L-싸이클로쎄린)에 따라 D-카바모일라제 또는 L-카바모일라제가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 효소의 형태는 야생 미생물을 배양하여 얻어진 조효소액을 사용할 수도 있고 이를 적당한 담체에 고정화 시킨 고정화 효소도 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 방법을 더욱 상세히 설명한다.
먼저 D,L-쎄린으로부터 화학적인 방법으로 D,L-5-히드록시메틸히단토인을 제조하여 효소공정의 출발물질로 사용한다. D-싸이클로쎄린의 생산을 위한 효소로서 슈도모나스, 바실러스 그리고 아그로박테리윰 유래의 D-히단토이나제를 이용한다. 상기의 미생물을 적당한 배지에서 배양한 원심분리하여 미생물 균체를 분리하고 여기에 Mn(+2)가 1mM정도 포함된 Tris-HCl(pH8.0)완충용액에 분산시키고 분쇄기를 이용하여 분쇄한다. 분쇄된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하여 조효소액을 제조한다. 기질인 D,L-5-히드록시메틸히단토인이 적당량(10g/L 정도)포함된 완충용액과 조효소액을 1리터 교반형 반응기에 첨가하고 40℃ 정도에서 pH를 8.0근처로 적정하면서 반응을 수행한다. 반응이 완전히 끝나면 반응산물에 SOCl2등을 이용하여 염소화반응을 진행한 후 NaHCO3등과 같은 염기와 히드록시아민을 첨가하여 고리화시킨다. 여기서 얻어진 산물은 아그로박테리움이나 바실러스 유래의 D-카바모일라제를 이용하여 반응시키면 D-싸이클로쎄린이 생산된다. D-카바모일라제는 D-히단토이나제의 경우와 마찬가지로 조효소액을 제조한 다음 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에서 같은 방법으로 반응을 진행시킨다. 효소대신에 아질산으로 처리할 경우에도 D-싸이클로쎄린이 얻어지게 된다. D,L-5-히드록시메틸히단토인으로부터 두 효소를 이용하여 D-싸이클로쎄린을 생산하는 경우 수율은 약 55~60% 정도에 이르렀다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공된 것으로써, 본 발명의 범위를 제안하고자 하는 것은 아니다.
실시예
1) 균체의 배양 및 조효소의 제조
바실러스 균주를 미리 최적화한 배지에 접종하여 45℃에서 17시간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 세포를 얻었다. 이를 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 현탁시키고 초음파기로 파쇄한 후 다시 원심분리하여 상등액을 얻고 이를 D-히단토이나제의 조효소원으로 사용하였다. 다음, 아그로박테리움 균주를 최적화한 배지에 접종하여 40℃에서 배양하여 세포를 얻은 다음 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)에 현탁시켜서 위와 같은 방법으로 조효소액을 제조하여 D-카바모일라제의 효소원으로 사용하였다.
2) D,L-쎄린으로부터 D,L-5-히드록시메틸히단토인의 제조
250ml의 교반형 반응기에 증류수 50ml, D,L-쎄린 5g(0.048몰)과 포타슘시아네이트 5.04g(0.77몰)을 첨가한 후 D,L-쎄린이 완전히 용해될 때까지 교반한 다음 강산이 될 때까지 희석 황산 용액을 서서히 적가한다. 반응액을 2시간동안 환류 시킨 다음 냉각하여 생성된 결정물을 여과 및 건조하여 D,L-5-히드록시메틸히단토인 5g(수율: 80%)을 얻었다.
3) D,L-5-히드록시메틸히단토인으로부터 N-카바모일-D-쎄린의 제조
1L 교반형 반응기에 D,L-5-히드록시메틸히단토인을 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 10g/L 정도로 첨가한 후 D-히단토이나제 조효소 용액을 50ml(총 단백질 1g 정도)을 첨가한다. 40℃로 온도를 유지하면서 1N NaOH 용액으로 반응액 pH를 8.0으로 적정하면서 반응을 수행하였다. 약 20시간 정도 경과하여 반응이 멈추었을 때 반응액을 여과하여 여과액을 얻어서 발색 반응과 HPLC로 산물을 정량하였다. 반응수율은 약 85% 정도였다.
4) N-카바모일-D-쎄린으로부터 N-카바모일-D-싸이클로쎄린의 제조
위에서 얻어진 N-카바모일-D-쎄린 용액을 농축시킨 후 1,4-디옥산 20미리리터를 넣고 마그네슘 설페이트로 건조시킨 다음 과량의 SOCl2를 첨가한 후 50도에서 반응시킨 다음 냉각시키고 NaHCO3등과 같은 염기와 히이드록시아민을 첨가하여 고리화시켰다. 이때 수율은 80% 정도이다. 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린은 NMR과 IR로 확인하였다.
5) N-카바모일-D-싸이클로쎄린으로부터 D-싸이클로쎄린의 제조
두 가지 서로 다른 방법으로 N-카바모일-D-싸이클로쎄린으로부터 D-싸이클로쎄린을 제조하였다.
먼저 위에서 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린 5g(0.03몰)을 0도에서 3.5노르말 염산 20ml에 용해시키고 증류수 10ml에 녹인 아질산나트륨을 적가한 후 반응용액을 농축한 다음 에탄올 20ml와 이소프로판올 10ml를 투입하여 얻은 결정물을 여과 후 감압 건조하여 D-싸이클로쎄린 2.95g이 생성된다. 이 경우의 수율은 약 85%이상 되었으며 생성된 D-싸이클로쎄린은 NMR과 IR로 확인하였다.
두 번째 방법으로는 D-카바모일라제 효소를 이용하는 것으로 위에서 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린을 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)에 10g/L정도 되도록 1L 교반형 반응기에 첨가하여 D-카바모일라제 효소용액을 50ml(총 단백질 1g 정도) 첨가 하였다. 반응액의 온도를 40℃로 조절하고 1N HCl용액으로 반응액 pH7.0으로 조절하면서 반응을 수행하였다. 반응시간이 20여시간 경과하였을 때 반응액을 여과시킨 후 증류를 하여 농축한 다음 에탄올 40ml와 이소프로판올 20ml를 투입하여 얻은 결정물을 여과 후 감압건조하여 D-싸이클로쎄린 2.78g이 생성된다. 이 경우의 수율은 약 80%이상 되었으며 생성된 D-싸이클로쎄린은 NMR과 IR로 확인하였다.
본 발명에 의한 방법에 따르면, 저렴한 D,L-쎄린으로부터 화학적으로 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린의 전구체를 제조하고 효소적 방법으로 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린을 제조함으로써 고순도 및 고수율의 D-싸이클로쎄린과 L-싸이클로쎄린을 얻을 수 있다.
Claims (9)
- D,L-5-히드록시메틸히단토인을 효소로 처리하여 N-카바모일-D,L-쎄린을 제조하고, 상기 N-카바모일-D,L-쎄린과 히드록시아민을 고리화반응시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 N-카바모일-D,L-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제1항에 있어서 상기 효소는 바실러스, 슈도모나스, 아그로박테리움, 아쓰로박터, 써머스로 이루어지는 군에서 유래된 하나 이상의 D-히단토이나제인 것을 특징으로 하는 N-카바모일-D,L-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제1항에서 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린을 효소로 처리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 D-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제3항에 있어서 상기 효소는 아그로박테리움, 바실러스, 꼬마모나스, 블라스토박터로 이루어지는 군에서 유래된 하나 이상의 D-카바모일라제인 것을 특징으로 하는 D-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제1항에서 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린에 아질산을 처리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 D-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제 1항에 있어서 상기 효소는 바실러스, 슈도모나스, 아그로박테리움, 아쓰로박터, 써머스로 이루어지는 군에서 유래된 하나 이상의 L-히단토이나제인 것을 특징으로 하는 N-카바모일-D,L-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제1항에서 얻어진 N-카바모일-L-싸이클로쎄린을 효소로 처리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 L-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제7항의 효소가 바실러스, 슈도모나스, 아그로박테리움, 아쓰로박터, 써머스로 이루어지는 군에서 유래된 하나 이상의 L-카바모일라제인 것을 특징으로 하는 L-싸이클로쎄린의 제조방법.
- 제1항에서 얻어진 N-카바모일-D-싸이클로쎄린에 아질산을 처리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 L-싸이클로쎄린의 제조방법.
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