KR19990044342A - 핵산 포획 잔기 - Google Patents

핵산 포획 잔기 Download PDF

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KR19990044342A
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마이클 제이 레인
알버트 에스 비나이트
브라이언 디 팔다즈
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브라이언디.팔다즢
테엠 테크놀로지스,인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 핵산 포획 잔기, 핵산 포획 잔기를 사용하는 방법, 핵산 포획 잔기를 포함하는 반응 혼합물, 및 핵산 포획 잔기를 포함하는 킷에 관한 것이다.

Description

핵산 포획 잔기
배경기술
본 발명은 핵산 서열을 검출하는 방법에 관한 것이다.
핵산의 서열을 검출하는 본 발명의 방법은 의학적 진단과 같은 기술분야에서 광범위하게 사용되고 있다.
종래의 방법중 한가지 방법으로, 예를 들어, 팔코우(Falkow)의 미국특허 제4,358,535호에 기재된 방법에서는, 표적 핵산이 니트로셀룰로오즈 필터와 같은 고형의 표면상에 고정된다. 이러한 표적은 표적에 상보적인 표지된 프로브(probe)와의 혼성화에 의해 검출된다.
그 밖의 방법에는 문헌[Dunnet al., Cell12:33-36(1977)] 및 란키(Ranki)의 미국특허 제4,563,419호에 기재된 검정방법과 같은 "샌드위치 검정(sandwich assay)"으로 일반적으로 설명되는 검정이 포함된다. 이러한 검정에서, 표적 핵산은 포획 프로브에 혼성화되며, 이어서, 표적 핵산에 상보적인 리포터 프로브가 첨가된다. 과량의 프로브를 세척하고, 리포터 프로브의 결합을 측정한다. 용액 샌드위치 검정방법은 밀러(Miller)의 미국특허 제5,374,524호에 기재되어 있다.
문헌[Broude et al.,Proc. Narl. Acad. Sci. USA91:3072(1994)]에는 단일 가닥 영역과 이중 영역을 지닌 고정된 프로브를 사용하는 핵산 포획 시스템이 보고되어 있다. 이러한 시스템은 단순한 단일 가닥 프로브에 비해 증가된 서열 특이성을 지니는 것으로 밝혀졌다.
발명의 요약
본 발명의 방법은 표적 서열에 상보적인 핵산 포획 잔기를 특징으로 하여 표적 핵산 서열을 민감하게 및 선택적으로 검출하는 방법이다.
한가지 관점으로, 본 발명은 a) 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위 또는 이의 일부인 이중 가닥 영역의 말단 염기, 및 표적핵산에 혼성화될 수 있는 단일 가닥 영역을 지니는 단분자 핵산 포획 잔기을 제공하고, b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되도록 하는 조건하에 표적 단일 가닥 핵산, 핵산 포획 잔기, 및 듀플렉스(duplex) 결합 리간드를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며, c) 표적 단일 가닥 핵산을 핵산 포획 잔기에 혼성화시켜, 듀플렉스 결합 리간드를 형성된 분자간 듀플렉스에 결합시킴으로써, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시킴을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시키는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 표적 단일 가닥 핵산 및 핵산 포획 잔기의 단일 가닥 영역에 의해 형성된 제 1 듀플렉스 염기쌍은 일부의 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 코드화하고; 핵산 포획 잔기는 핵산 헤어핀을 포함하며; 핵산 포획잔기는 고형 지지체에 결합되고; 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기는 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시킨다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 a) 구조 A-B-C-D(여기서, A는 표적 단일 가닥 핵산 서열에 사실상 상보적인 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하는 핵산 포획 잔기를 제공하고, b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되도록 하는 조건하에 표적 단일 가닥 핵산 및 핵산 포획 잔기를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며, c) 표적 핵산과 핵산 포획 잔기의 존재 여부를 검출함으로써, 표적 단일 가닥 핵산을 검출함을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산 서열을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, D의 말단 염기는 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위 또는 이의 일부를 포함하고; 반응 혼합물은 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하며; 핵산 포획 잔기는 불용성 지지체상에 고정되고; 듀플렉스 결합 리간드는 어떠한 듀플렉스를 공유결합적으로 변화시키지 않으며; 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기는 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시킨다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 a) 구조 A-B-C-D(여기서, A는 표적 단일 가닥 핵산 서열에 사실상 상보적인 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하는 핵산 포획 잔기를 제공하고, b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되어 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 포함한 분자간 듀플렉스를 형성하도록 하는 조건하에, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며, c) 표적 핵산과 핵산 포획 잔기의 존재 여부를 검출함으로써, 표적 단일 가닥 핵산을 검출함을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산 서열을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 표적 단일 가닥 핵산은 핵산 포획 잔기에 혼성화되어 노출된 듀플렉스를 형성하며; 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 절단부를 포함하지 않으며; 반응 혼합물은 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하며; 듀플렉스 결합 리간드는 서열 특이적이며; 듀플렉스 결합 리간드는 어떠한 듀플렉스를 공유결합적으로 변화시키지 않으며; 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기는 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시킨다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 a) 이중 가닥 영역 및 표적 단일 가닥 핵산에 혼성화될 수 있는 인접한 단일 가닥 영역을 지니는 단분자 핵산 포획 잔기를 제공하고, b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화될 수 있도록 하는 조건하에, 표적 단일 가닥 핵산, 핵산 포획 잔기, 및 듀플렉스 결합 리간드를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며, c) 표적 단일 가닥 핵산을 핵산 포획 잔기에 혼성화시켜, 듀플렉스 결합 리간드가 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위에 결합되도록 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 포함한 분자간 듀플렉스를 형성시킴으로써, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시킴을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시키는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 포획 잔기는 핵산 헤어핀을 포함하며; 핵산 포획 잔기는 고형 지지체에 결합되고; 듀플렉스 결합 리간드는 어떠한 듀플렉스를 공유결합적으로 변화시키지 않으며; 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 절단부를 포함하지 않으며; 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기는 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시킨다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 a) 구조 A-B-C-D(여기서, A는 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하며, 불용성 지지체에 고정되는 핵산 포획 잔기를 제공한다. 바람직한 구체예에서, A는 표적 핵산 서열에 사실상 상보적이며; 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기는 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키고; 핵산 포획 잔기는 표적 핵산 서열이 핵산 포획잔기에 혼성화되어 형성된 듀플렉스가 소정의 듀플렉스 결합 리간드를 포함하도록 선택된다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 고정된 헤어핀, 불용성 지지체, 및 표적 핵산을 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 헤어핀은 표적 핵산 서열이 헤어핀에 혼성화되어 형성된 듀플렉스가 소정의 듀플렉스 결합 리간드에 대한 결합 부위를 포함하도록 선택되고; 반응 혼합물은 듀플렉스 결합 리간드를 포함하며; 듀플렉스 결합 리간드는 서열 특이적이다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 불용성 지지체상에 고정된 헤어핀을 포함하는 표적 핵산의 검출을 위한 킷을 제공한다. 특정의 구체예에서, 킷은 핵산표준을 추가로 포함한다. 특정의 구체예에서, 킷은 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 핵산 헤어핀에 의한 목표 핵산의 포획을 도시한 반응도식이다.
도 2는 포획 잔기로부터의 표지화 이차 프로브의 변위에 의한 목표 핵산의 검출을 도시한 반응도식이다.
도 3은 절단 목표 핵산과 비절단 목표 핵산 사이의 식별을 도시한 반응도식이다.
도 4는 목표 상보적 이차 프로브의 혼성화에 의한 결찰된 목표 핵산의 검출을 도시한 반응도식이다.
도 5는 변동 조건에서 절단 목표 핵산과 비절단 목표 핵산의 결합 효율을 도시한 막대 그래프이다.
도 6은 결합 효율에 대한 세척 완충 염 농도의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 7은 결합 효율에 대한 목표물 복제수의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 8은 헤어핀 포획 잔기에 의한 결찰된 생성물의 검출을 도시한 겔이다.
도 9는 헤어핀 포획 잔기에 의한 결찰된 생성물의 검출을 도시한 또 다른 겔이다.
도 10은 포획 잔기 및 매치되고 비매치된 목표 서열이다.
도 11은 핵산 포획 잔기에 혼성화된 매치되고 비매치된 목표 핵산의 융점을 도시한 그래프이다.
본 발명의 방법은 핵산 서열의 검출에 유용하다. 본 발명은 목표 핵산을 검출하는 데에 사용하기 위한 신규한 핵산 포획 잔기를 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 다중 웰 플레이트에서 부동화된 포획 잔기로 수행될 수 있으며; 따라서, 많은 샘플이 동시에 스크리닝될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 최소한 부분적으로 용이하게 자동화되어 스크리닝을 촉진시키고 경제성을 개선시킨다. 포획 잔기는 목표 서열을 선택적으로 결합시켜서, 백그라운드 노이즈를 매우 저수준으로 감소시킬 수 있다. 추가의 장점은 표지 신호가 증폭되어 고감도 검출을 달성한다는 점이다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 가닥"은 DNA 또는 RNA의 가닥, 또는 키메라 DNA-RNA 가닥, 또는 펩티드 핵산과 같은 핵산형 화합물을 의미한다. 핵산 가닥은 또한 변형된 DNA 또는 RNA를 포함하며, 이중 대부분은 당분야에 공지되어 있다.
용어 "목표 핵산 서열" 또는 "목표 가닥"은 검출하려는 핵산 서열을 의미한다. 목표 핵산 서열은 상기 규정된 바와 같이 임의의 핵산 가닥일 수 있으며, 일반적으로 단일 가닥이거나, 당분야에 공지된 방법에 의해 단일 가닥이 될 수 있다. 목표 핵산 서열은 플라스미드, 바이러스, 박테리아, 균류, 효모, 식물 및 사람을 포함하는 동물을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있거나; 목표 핵산 서열은 비천연 공급원으로부터 수득할 수 있다. 목표 핵산 서열은 혈액, 정액, 소변 등과 같은 체액을 포함하는 유기체 또는 조직으로부터 수득할 수 있다. 목표 핵산 서열은 단백질 또는 세포 파편과 같은 오염 또는 간섭 물질을 제거하거나 감소시키기 위해 추출되거나 정제될 수 있다. 이러한 정체 또는 추출 공정은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 매니아티스(Maniatis) 등의 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory(1989)] 또는 벨(Bell) 등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. USA(1981), 78:5759-5763]에 기술된 방법을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 감염성 질환, 유전성 질환, 도는 암과 같은 세포성 질환과 관련된 핵산 서열의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 또한, 하기에 더 상세힌 설명되는 바와 같이 비천연 목표 핵산의 검출을 위해 유용하다.
본원에 사용되는 용어 "인접"은 사이에 끼인 염기에 의해 분리되지 않은 핵산 가닥의 비중첩 세그멘트를 의미한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 목표 핵산에 실질적으로 상보적인 하나 이상의 핵산 영역을 갖고, 분자내 듀플렉스를 형성할 수 있는 2개 이상의 핵산 영역을 갖는 핵산 포획 잔기를 특징으로 한다. 본원에 사용되는 용어 "핵산 포획 잔기" 또는 간단히 "포획 잔기"는 목표 핵산 서열에 선택적으로 결합되고 불용성 지지체에 의해 부동화될 수 있는 부분을 의미한다. 포획 잔기는 목표 가닥을 포획하기 전에, 동시에 또는 후에 고형 지지체 상에서 부동화될 수 있다. 포획 잔기는 목표물에 혼성화되어 목표물을 부동화시킴으로써 목표 핵산을 "포획"할 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산 포획 잔기는 목표 핵산 서열의 한 영역에 실질적으로 상보적인 하나 이상의 영역을 갖는 핵산 가닥을 포함한다. 바람직한 포획 잔기는 하기에 규정되는 바와 같이 핵산 헤어핀이다. 일반적으로, 포획 잔기는 고형 지지체에 결합될 것이다. 고형 지지체에 대한 이러한 결합은 포획 잔기 또는 고형 지지에체 결합되는 결합 부분을 통해 이루어질 수 있다. 특정 양태에서, 포획 잔기는 예를 들어 방사성 동위 원소, 형광 부분, 항체, 항원, 렉틴, 효소 또는 당분야에 널리 공지된 다른 표지물질로 표지화될 수 있다. 포획 잔기가 검출할 수 있는 표지물질을 함유하지 않는 양태에서, 목표 핵산 서열은 이와 같이 표지화될 수 있거나, 대안적으로, 표지화된 이차 프로브가 사용될 수 있다. "이차 프로브"는 목표 핵산 서열의 한 영역 또는 포획 잔기의 한 영역에 상보적인 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 용어 "핵산 헤어핀", "헤어핀 포획 잔기" 또는 간단히 "헤어핀"은 하나 이상의 분자내 듀플렉스가 형성될 정도로 2개 이상의 서로 상보적인 핵산 영역을 포함하는 단일분자 핵산 함유 구조를 의미한다. 헤어핀은 예를 들어 칸터(Cantor) 및 쉼멜(Schimmel) 등의 문헌["Biophysical Chemistry", Part III, p.1183(1980)]에 기술되어 있다. 특정 양태에서, 상보적 핵산 영역은 핵산 가닥을 통해 연결되며; 이들 양태에서, 헤어핀은 단일 가닥의 핵산을 포함한다. 상보성의 영역을 연결시키는 포획 잔기의 한 영역은 본원에서 "루프" 또는 "링커"를 의미한다. 바람직한 양태에서, 루프는 한 가닥의 핵산 또는 변형된 핵산을 포함한다. 바람직한 양태에서, 링커는 수소 결합이 아니다. 다른 양태에서, 루프는 핵산 기재가 아닌 링커 영역을 포함하지만; 루프 영역이 핵산 서열이 아닌 포획 잔기는 본원에서 헤어핀으로 언급된다. 루프 영역에 사용하기에 적합한 비핵산 링커는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 알킬 사슬을 포함한다 [참조예 : Doktrycz et al.(1993) Biopolymers 33:1765]. 루프가 하기에서 설명하기 위해 헤어핀의 단일 가닥 영역일 수 있음이 이해될 것이지만, 헤어핀의 "단일 가닥 영역"은 헤어핀의 비루프 영역으로 언급된다. 루프가 핵산 가닥인 양태에서, 루프는 2 내지 20개의 누클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 3 내지 8개의 누클레오티드를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 루프 또는 링커의 크기 또는 구성은 상보성의 영역이 분자내 듀플렉스를 형성할 수 있게 하도록 선택된다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 유용한 헤어핀은 2개 이상의 염기쌍, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 염기쌍, 더욱더 바람직하게는 8개 이상의 염기쌍을 갖는 하나 이상의 분자내 듀플렉스를 형성할 것이다. 듀플렉스 영역 중의 염기쌍의 수 및 이들의 염기 조성은 듀플렉스 형성의 임의의 바람직한 상대적 안정성을 보장하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 비목표 핵산과 헤어핀의 분자내 듀플렉스 형성 영역의 혼성을 방지하기 위해, 분자내 듀플렉스 영역 중의 염기쌍의 수는 약 4개 이상인 것이 일반적일 것이다. 하기의 실시예 3에 기술된 헤어핀은 16-염기쌍 듀플렉스를 가져서, 분자내 듀플렉스에 대한 예외적 안정성을 제공한다. 분자내 듀플렉스는 약 40개 이하의 염기쌍을 갖는 것이 일반적일 것이다. 바람직한 양태에서, 분자내 듀플렉스는 길이에 있어서 염기쌍이 30개 미만, 더욱 바람직하게는 20개 미만이다.
헤어핀은 하나 보다 많은 루프를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 2개의 분자내 듀플렉스 및 2개의 루프를 형성시킬 수 있는 헤어핀은 본원에서 "이중 헤어핀"으로 언급된다. 바람직한 양태에서, 헤어핀은 목표 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 하나 이상의 단일 가닥 영역을 가질 것이다. "실질적으로 상보적인"은 사용되는 조건하에 목표 핵산 서열에 혼성될 수 있는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서, "실질적으로 상보적인" 단일 가닥 영역은 실제로 목표 핵산 서열에 상보적이다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 유용한 헤어핀은 염기쌍이 5개 이상, 더욱 바람직하게는 8개 이상인 목표 상보적 단일 가닥 영역을 갖는다. 바라직한 양태에서, 헤어핀은 염기쌍이 30개 미만, 더욱 바람직하게는 25개 미만인 목표 상보적 단일 가닥 영역을 갖는다. 목표 상보적 영역은 목표 가닥이 포획 잔기와의 안정한 듀플렉스를 형성하는 것을 보장하도록 선택될 것이다. 포획 잔기가 많은 비목표 서열로부터의 목표 가닥을 검출하기 위해 사용되는 양태에서(예를 들어, 게놈 DNA를 스크리닝하는 경우), 목표 상보적 영역은 비목표 서열의 결합을 방지하도록 충분히 길어야 한다. 목표 특이적 단일 가닥 영역은 포획 잔기 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단일 수 있거나, 2개의 분자내 듀플렉스 영역 사이(예를 들어, 이중 헤어핀 중의 2개의 듀플렉스) 상이)에 위치할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 유용한 헤어핀은 구조 A-B-C-D를 가지며, 여기에서, A는 목표 특이적 핵산 서열이고; B 및 D는 서로 혼성되어 분자내 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며; C는 링커이다.
따라서, 부동화된 헤어핀은 도 1에 도시된 일반적 구조를 갖는다. 부동화된 헤어핀(10)은 서로 상보적이고 분자내 듀플렉스(또한 본원에서는 "스템"으로서 언급됨)를 형성하는 영역 B 및 D를 갖는다. 헤어핀(10)의 영역 A는 펜던트 단일 가닥이고, 목표 핵산 서열에 최소한 부분적으로 실질적으로 상보적이 되도록 선택하는 것이 바람직하다. 헤어핀(10)의 링커 C는 핵산 서열 B 및 D를 함께 공유결합시키거나 비공유결합시키고, 이들을 분자내 듀플렉스가 형성될 수 있을 정도로 위치시키는(예를 들어, 이들을 충분히 가깝게 보유하는) 멤버이다. 도 1은 스페인서 부분(12)을 통해 불용성 지지체(15)에 부동화된 헤어핀(10)을 도시한 것이다. 링커(12)는 또한 본원에서 "루프"로서 언급된다. 바람직한 양태에서, C는 B 및 D를 공유결합시킨다. 바람직한 양태에서, C는 핵산 서열이지만, 다른 양태에서, C는 핵산 서열이 아니다. 바람직한 양태에서, C는 고형 또는 불용성 지지체와는 상이하다. 다른 바람직한 양태에서, C는 불용성 지지체이다. 도 1은 눈금간(nicked) 듀플렉스(25)를 형성하기 위한, 헤어핀 포획 잔기(10)에 대한 목표 가닥(20)의 혼성화를 추가로 도시한 것이다. 도 1에서, 임의적 듀플렉스-결합-리간드 결합 자리는 존재하지 않을 수 있거나, 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 눈금을 포함하지 않는 위치에 위치할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 헤어핀은 분자내 듀플렉스를 형성하는 영역과 인접하는 하나 이상의 단일 가닥 영역을 가질 것이며, 여기에서 단일 가닥 영역은 실질적으로 목표 서열에 상보적이다. 예시적 양태에서, 핵산 서열 A는 목표 서열에 실질적으로 상보적인 단일 가닥 영역이고, 핵산 서열 B는 영역 D와의 분자내 듀플렉스를 형성하는 영역이다. 특히 바람직한 양태에서, 헤어핀과 목표 핵산 서열과의 혼성화시에, 분자내 헤어핀:헤어핀 듀플렉스 및 분자간 목표물:헤어핀 듀플렉스의 인접 영역을 포함하는 "눈금간(nicked)" 듀플렉스 구조가 형성될 것이다. 이러한 구성은 수가지 장점을 제공한다. 첫 번째로, 분자내 듀플렉스와 분자간 듀플렉스 사이(즉, 목표 서열의 말단 염기와 포획 잔기의 말단 염기 사이)의 염기 스택킹은 크라프코(Khrapko) 등의 문헌[(1991) J. DNA Sequencing Mapping 1:375-388]에 기술된 바와 같이, 간단한 단일 가닥에 대한 혼성화 보다 더 큰 서열 엄격성을 제공한다. 두 번째로, 하기에 설명되는 바와 같이, 눈금간 듀플렉스 구조는 듀플렉스-결합-리간드 결합 자리를 포함할 수 있다. 적합한 듀플렉스-결합 리간드의 존재하에, 정확한 목표 서열에 혼성화시키기 위한 포획 잔기의 능력은 증가되어(즉, 혼성화 효율이 증가되어), 검정의 감도를 증가할 것이다. 또한, 단일 분자 포획 잔기는 이분자 부분에 관한 실험적 어려움을 감소시킨다. 예를 들어, 단일 분자 포획 잔기의 사용은 이분자 듀플렉스 보다 더 적은 실험 단계를 필요로 하고, 듀플렉스 형성 및 안정성의 농도 의존성이 제거되고, 분자내 듀플렉스는 상응하는 분자간 듀플렉스 보다 안정하다. 또한, 포획 잔기의 듀플렉스 영역은 포획 잔기의 목표 특이적 영역을 (예를 들어, 엔트로피적으로) 안정화시켜서, 목표물:포획 잔기 듀플렉스의 형성을 조장한다. 바람직한 양태에서, 포획 잔기의 영역 D는 3' 또는 5' 말단 염기, 즉, 루프 영역 C에 연결되지 않은 말단 염기를 갖는다. 말단 염기는 영역 D의 서열 방향(에를 들어, 5'-3' 또는 3'-5')에 의존하여 영역 D의 3' 또는 5' 말단에 존재할 것이다. 말단 염기에서 종결되는 핵산 서열은 본원에서 "말단 서열"로서 언급된다.
바람직한 양태에서, 핵산 포획 잔기는 고형 지지체에 대한 결합을 허용하도록 유동된다. 고형 지지체에 결합시키기 위한 핵산을 유도하기 위한 많은 방법이 당분야에 공지되어 있다. 포획 잔기는 공유 또는 비공유 결합을 통해 고형 지지체에 결합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산 포획 잔기는 비오틴에 공유결합되어 비오틴일화된 콘쥬게이트를 형성시킨다. 비오틴일화된 콘쥬게이트는 예를 들어 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 유도된 고형 불용성 지지체에 결합시킴으로써 고형 표면에 결합된다. 포획 잔기는 변형된 핵산을 루프 영역에 혼입시킴으로써 고형 지지체에 결합하도록 유도하는 것이 편리할 수 있다. 바람직한 양태에서, 포획 잔기는 루프 영역에서 유도되어 고형 지지체에 대한 결합을 허용한다. 다른 바람직한 양태에서, 포획 잔기는 루프 또는 링커 영역과는 상이한 영역에서 유도된다. 예를 들어, 비오틴 변형 핵산이 루프 영역에 혼입되어 스트렙트아비딘 코팅 고형 지지체에 대한 결합을 허용할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 고형 지지체(예를 들어, 비오틴, 항체 등)에 결합하기 위해 유용한 다양한 부분, 및 이들을 핵산에 결합시키기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 아민 변형 핵산 염기(예를 들어 글렌 리서치(Glen Research)로부터 입수할 수 있음)이 2작용성 가교제(예를 들어, 피어스(Pierce)로부터 입수할 수 있는 비스(술포숙시니미딜 수베레이트))를 통해 고형 지지체(예를 들어, Covalink-NH, 눙크(Nunc)로부터 입수할 수 있는 이차 아미노기로 그라프팅된 폴리스티렌 표면)에 결합될 수 있다. 또 다른 예에서, 술피디릴 작용화 헤어핀(상기 기술된 바와 같은 아민 작용화 헤어핀을 상기 트라우트(Traut) 시약(2-이미노티올란-HCl)으로 처리함으로써 수득됨)은 예를 들어 코닝-코스타(Corning-Costar)로부터 입수할 수 있는 말레이미드 코팅 폴리스티렌 플레이트에 부착될 수 있다. 추가의 스페이싱 부분이 첨가되어 포획 잔기와 고형 지지체의 표면 상이의 입체 장애를 감소시킬 수 있다.
따라서, 대표적 헤어핀 포획 잔기는 하기와 같은 2개의 구조를 포함한다 :
서열 번호 1
및
상기 서열에서, N은 염기를 나타내며, n은 일반적으로 4 내지 50, 바람직하게는 5 내지 30인 정수이다. 이와 같은 헤어핀은 필요하지 않더라도 고체 지지체에 결합하기 위해 루프 영역에 비오틴으로 유도된 것이다.
바람직한 구체예에서, 고체 지지체는 비드(bead), 보다 바람직하게는 자성 비드이다. 비드의 사용은 유도된 핵산 포획 잔기가 원심분리 또는 여과에 의해 반응 혼합물로부터 분리되도록 하며, 자성 비드의 경우에는 자장을 적용시키므로써 상기와 같이 되도록 한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 포획 잔기는 막 또는 반응 용기, 예를 들어 96-웰 플레이트와 같은 표면에 결합된다. 하기에서 보다 충분히 논의되는 바와 같이, 다중웰 플레이트의 사용은 다중 헤어핀을 사용하여 다중 표적 서열을 동시에 스크리닝하도록 하며, 또한 자동화된 장치의 사용은 스크리닝 검정을 수행하도록 한다. 포획 잔기의 결합을 허용하는 표면의 유도는 당업에서 통상적인 것이다. 예를 들어, 스트렙타비딘으로의 표면 피복은 비오티닐화된 포획 잔기의 결합을 허용한다. 스트렙타비딘으로의 표면 피복은 예를 들어, 밀러(Miller)의 미국 특허 제 5,374,524호에 기재되어 있다.
특정 구체예에서, 다수의 표적 서열을 검출하기 위해 다수의 헤어핀 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 구체예에서는 필요하지 않더라도 각각의 헤어핀에 대해 동일하고, 루프 및 분자내 듀플렉스 형성 영역을 포함하는 불변 영역, 및 목적하는 표적 서열에 따라 어느 한 헤어핀과 인접한 헤어핀과 상이한 가변의 표적 특이 영역을 갖는 헤어핀을 합성하는 것이 유리하다. 이러한 결과를 달성하는 어느 한 방법으로는 불변 영역에 상응하는 충분량의 핵산 가닥을 합성한 후, 당업에 공지된 방법(예를 들어, 목적하는 서열의 화학적 합성 또는 결찰)에 의해 각각의 표적 서열에 적합한 가변 영역상에 부가하는 것이 있다.
바람직한 구체예에서, 포획 잔기는 표적 핵산 서열로 혼성화되는 경우에 닉(nick)이 있는 듀플렉스(예를 들어, 갭이 없는 듀플렉스)가 형성되도록 선택된다. 이러한 결과는 여러 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 서열을 포획 잔기와 접촉시키기 전에, 표적 핵산은 공지되어 있으며 정의된 인식 서열에서 표적 가닥을 분해시키는 제한 효소와 같은 시제로 처리될 수 있다. 따라서, 분해 후 표적 핵산 서열은 공지된 염기 또는 염기들로 종결될 것이다. 포획 잔기 및 제한 효소는 포획 잔기를 선택적으로 분해된 표적 가닥으로 혼성화시키는 경우에 닉이 있는 듀플렉스를 제공하도록 선택될 수 있다. 선택적으로 표적 가닥은 특이적 염기 또는 염기들로 "말단화"되어, 공지된 말단 서열을 제공할 수 있다. 예를 들어, 표적 가닥은 화학적 방법(예를 들어, 포스포라미디트 화학법) 또는 생화학적 방법(예를 들어, 보충 가닥으로 혼성화되는 경우에 폴리머라제 연장 또는 리가제 촉매 결찰)에 의해 변형되어 공지된 말단 서열을 제공할 수 있다. 그러나, 당업자들에 의해 포획 잔기으로의 표적 가닥의 결합시에 형성된 듀플렉스는 몇몇 구체예에서 갭 또는 다수의 갭을 가질 수 있음을 인지할 것이다.
바람직한 구체예에서, 상기 포획 잔기는 표적 핵산 서열이 포획 잔기를 혼성화시키는 경우에 이로써 형성된 표적:포획 잔기가 하나 이상의 듀플레스 결합 리간드에 대해 결합 부위를 함유하도록 선택된다. 듀플렉스 결합 리간드는 단일 가닥에 우선하여 듀플렉스 핵산을 결합시키는 잔기이다. 바람직한 듀플렉스 결합 리간드는 비인식 부위보다 강하게 결합된 듀플렉스 핵산의 인식 부위(또는 결합 부위)를 (결합하고 있음을)인식하며, 본원에서 "서열 특이적" 듀플렉스 결합 부위로 언급된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 표적: 포획 잔기 듀플렉스는 서열 특이적 듀플렉스 결합 리간드에 대하여 결합 부위를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 미리 선택된 듀플렉스 결합 리간드를 결합한다. 또 다른 바람직한 듀플렉스 결합 리간드는 부위 특이성을 나타내지 않으며, 본원에서 "서열 비특이적" 듀플렉스 결합 리간드로 언급된다. 듀플렉스 결합 리간드의 예로는 제한 효소, 폴리머라제, 리가제 등과 같은 효소, 악티노마이신 D와 같은 약제, 브롬화에티듐과 같은 서열 비특이적 삽입제 등이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 듀플렉스 결합 리간드는 서열 특이적이거나 서열 비특이적이건간에 어떠한 듀플렉스도 공유적으로 변형시키지 않는다. 예를 들어, 어떠한 공유 결합, 예를 들어 포획 잔기 또는 표적 핵산의 공유 결합을 생성 및/또는 분해하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 듀플렉스 결합 리간드는 리가제 또는 폴리머라제가 아닌 다른 것이다.
또 다른 구체에에서, 표적: 포획 잔기 듀플렉스는 서열 비특이적 듀플렉스 결합 리간드에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
포획 잔기는 표적 가닥의 말단 염기와 조합되는 경우에 분자내 듀플렉스 형성 영역의 말단 염기가 듀플렉스 결합 리간드에 대한 결합 부위를 형성화도록 선택될 수 있다. 즉, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 표적체를 포획 잔기으로 혼성화시키므로써 형성된 듀플렉스중에 닉을 포함한다. 예를 들어 듀플렉스 결합 리간드 악티노마이신 D는 우선적으로 서열 5'-AGCT-3'에 결합한다. 예시적으로, 포획 잔기는 분자내 듀플렉스의 일부로서 5' 말단 서열 5'-CT를 갖도록 선택되고, 표적 가닥이 3'-말단 서열-AG-3'을 갖독 선택(또는 변형)될 수 있다. 따라서, 표적 가닥이 포획 잔기으로 혼성화되는 경우, 닉이 있는 듀플렉스 5'-AG-CT-3'이 형성되며, 여기서 "G-C"는 G 및 C사이의 닉을 나타낸다. 이러한 구체예는 상이한 길이의 표적 서열(예를 들어, 절단 및 비절단된 표적물)간의 식별에 이용되는 경우에 특히 유용하다. 헤어핀 포획 잔기으로 혼성될 때, 보다 긴 표적 서열이 돌출물을 형성하는 경우, 닉 부위를 포함하는 인식 부위를 갖는 듀플렉스 결합 리간드의 첨가는 하기 및 실시예 1 및 2에서 보다 상세하게 나타나는 바와 같이 절단 및 비절단된 표적 서열간의 식별을 향상시킬 수 있을 것이다.
포획 잔기는 또한 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위가 분자내 듀플렉스(예를 들어, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 닉을 포함하지 않는다)를 포함하지 않는 영역에서 형성되도록 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위는 어떠한 닉도 포함하지 않는다. 예를 들어, 표적 서열은 서열 5'-AGCT-3'을 함유하도록 선택될 수 있다. 따라서, 헤어핀 포획 잔기의 표적 특이적 영역은 보충 서열을 함유할 것이며, 악티노마이신 D는 표획 가닥의 포획 잔기와의 결합시 형성된 듀플렉스를 인식할 것이다. 듀플렉스 결합 리간드의 존재는 (듀플렉스 결합에 의해)형성된 표적: 포획 잔기 듀플렉스의 양을 증가시킬 것이며, 이에 따라 민감도를 개선시킬 것이다.
포획 잔기는 또한 하나 이상의 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위가 표적 가닥의 헤어핀으로의 결합시에 형성되도록 선택될 수 있다. 결합 부위는 단일 듀플렉스 결합 리간드(예를 들어, 수개의 악티노마이신 D 결합 부위), 또는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 악티노마이신 D 부위 및 EcoRI 부위)에 대해 존재할 수 있다. 적합한 듀플렉스 결합 리간드를 부가하므로써, 검출 민감도와 표적 민감도간의 바람직한 균형이 얻어질 수 있다.
또한, 듀플렉스 변성 시제가 포획 잔기에 결합하는 표적물의 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 즉, 듀플렉스 변성제는 듀플렉스 형성을 불안정화시키는 데, 특히 듀플렉스가 미스매치(mismatch)된 핵산 서열의 혼성화를 초래하도록 하는 데 사용될 수 있다. 듀플렉스 변성제는 적합한 단일 가닥 형성 및 불리한 듀플렉스 형성 수단을 포함한다. 온도 증가(가열)는 듀플렉스 변성제로서 사용될 수 있지만, 바람직하지는 않다. 바람직한 구체예에서, 듀플렉스 변성제는 화학 또는 생화학 시제이다. 듀플렉스 변성제의 예로는 효소 및 단일 가닥 결합 단백질(예를 들어, 대장균으로부터의), G-5 단백질, 유전자 32 단백질, Rec A, 및 헬리카제, 뿐만 아니라 요소와 같은 화학 변성제가 포함된다. 듀플렉스 변성제는 의심스러운 듀플렉스 변성제의 존재 및 부재하에 듀플렉스의 Tm을 측정하므로써 확인될수 있는데, 듀플렉스 변성제는 Tm이 보다 낮을 것이다. 바람직한 듀플렉스 변성제는 하나 이상의 듀플렉스를 불안정화시키는 데 충분량으로 사용되는 경우에 반응 혼합물의 기타 성분에 나쁜 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 듀플렉스 변성제는 폴리머라제 또는 리가제와 같은 효소의 활성을 억제하지 않을 것이다(이러한 효소의 활성이 바람직한 경우).
듀플렉스 결합 리간드가 또한 듀플렉스 변형제(예를 들어, 제한 효소, 리가제 등)인 경우, 기타 검출 방법이 가능하다. 표적: 포획 잔기 듀플렉스를 예를 들어, 듀플렉스 선택성 제한효소와 같은 듀플렉스 변형제로 접촉시키는 것은 듀플렉스를 선택적으로 변형시킬 수 있으나, 비결합된 표적 잔기 또는 비결합된 포획 잔기의 변형시킬 수는 없다. 표적 잔기 및 포획 잔기의 적합한 선택으로, 표적 잔기이 포획 잔기 또는 표적 서열의 변형을 검출하므로써 검출된다. 예시적 구체예에서, 포획 잔기는 당업에 공지된 것과 같은 검출가능한 표지로 표지화되고, 표적 가닥은 포획 잔기으로 혼성화된다. 이에 따라 형성된 표적: 포획 잔기 분자내 듀플렉스는 이후 제한 효소에 의해 분해된다. 포힉 잔기의 표지된 단편의 검출은 이로써 가치 있는 표적 서열의 존재를 검출할 수 있게 된다.
바람직한 구체예에서 포획 잔기가 고체 지지체에 결합된 후 표적 가닥으로 접촉되지만, 특정 구체예에서는 표적 가닥과 포획잔기 둘다 용액중에 있으면서 표적 가닥을 포획 잔기와 접촉시키는 것이 바람직할 수 있다. 이후, 포획 잔기:표적 가닥 듀플렉스는 적합하게 유도된 표면과 접촉시키므로써 고체 지지체상에서 부동화될 수 있다. 예를 들어, 포획 잔기가 상기에서 논의된 바와 같이 비오틴으로 유도된 경우, 포획 잔기:표적 가닥 듀플렉스는 스트렙타비딘 피복된 표면과 접촉시키므로써 부동화될 수 있다. 또한, 추가의 프로브(예를 들어, 제 2 또는 리보터 프로브)가 사용되는 경우, 상기 프로브는 포획 잔기가 고체 지지체에 부동화되기 전 또는 후에 부가될 수 있다.
본 발명의 방법은 천연 및 합성 핵산 서열 모두를 검출하는 데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 유기체의 게놈으로부터 핵산을 검출하는 데 사용할 수 있다. 기타 구체예에서, 본 발명의 방법은 가닥 분해, 결찰, 연장, 변형 등과 같은 핵산 반응의 생성물을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 3에서 두개의 프로브의 결찰 생성물을 검출하기 위한 핵산 포획 잔기의 사용이 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의방법은 직접적으로 혼성화에 의해서 또는 간접적으로 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 또는 리가제 연쇄 반응으로부터의 증폭 생성물의 검출에 의해 핵산 서열을 검출하는 데 사용될 수 있다.
하기 실시예 6에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 포획 잔기는 단일 염기에 의해 구별되는 표적 서열들을 구별할 수 있다. 실시예 6에서 기술된 실험에서, 단일 염기의 미스매치는 표적 서열의 특정 염기에서 3개의 가능한 단일 염기 치환중 2개에 대해 검출되었다. 3번째 치환은 식별에 있어 그다지 중요하지 않다. 이론에 얽매이고자 하지 않는 경우, 사용된 특정 서열에서 존재하는 최인접 스택킹(stacking)이 이러한 결과의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 따라서, 스템(stem) 영역에서 상이한 서열을 갖는 헤어핀 잔기의 사용은 이러한 표적을 적합하게 식별할 수 있게 하는 것으로 여겨진다. 또한, 적합한 서열의 사용은 표적 서열(및 표적 서열의 어떠한 위치에서도)에서 가능한 모든 단일 염기 변화를 식별하는 데 충분할 것이다. 그러나, 필요에 따라 후속 실험이 상이한 포획 잔기를 사용하여 수행되어 가능한 모호한 잔기를 해결할 수 있게 된다. 바람직한 구체예에서, 포획 잔기는 특정 표적물에 대해 단일 염기 미스매치의 식별이 가능하도록 선택된다.
표적 핵산의 검출은 다양한 방법으로 수행될 수 있으며, 이들 중 몇몇은 당해기술분야에 공지되어 있다. 하나의 예가 되는 구체예에서, 도 2에서와 같이, (불용성 지지체(15)에 고정되는) 포획 잔기(10')의 표적 보완 영역에 상보적인 검출 가능한 표지(52)로 표지된 제 2 프로브(50)는 반응 혼합물중의 포획 잔기(10')에 하이브리다이징될 수 있다. 이러한 예가 되는 구체예에서, 표적 핵산은 프로브(40)의 결찰 및 포스페이트(42)를 통해서 형성된 결찰 생성물(45)이다. 그런 후, 존재하는 어떠한 표적 서열이 포획 잔기으로부터 2차 프로브를 디스플레이할 조건하에서, 표적 핵산을 함유하리라 생각되는 샘플이 유입된다. 도 2의 상부 반응 개략도에는 다수의 고정된 포획 잔기(10')과 다수의 프로브(40(포스페이트(42)와 반응) 및 44))의 반응이 도시되어 있으며, 상기 반응물에 2차 프로브(50)가 하이브리다이징된다. 포획 잔기(10')을 세척하여 비결합된 프로브(40 및 44)를 제거하고, 포획 잔기(10')에 결합된 상태로 잔류하는 표지된 2차 프로브(50)의 양을 측정한다. 예로서, 도 2의 상부 패널에서, 프로브(44)는 포획 잔기(10')에 결합되지 않으며, 2차 프로브(50)는 프로브(40)에 의해 대체되지 않는다. 도 2의 하부 반응 개략도에는 포획 잔기(10')과 다수의 결찰된 생성물(45)의 반응이 도시되어 있다. 도 2의 하부 반응 개략도에서, 결찰된 생성물(45)중의 몇몇이 포획 잔기(10')에 하이브리다이징되며, 2차 프로브(50)를 대체시킨다. 포획 잔기(10')에 결합된 2차 프로브(50)의 양의 감소는, 대조군과 비교하여, 표적 서열(45)이 존재함을 나타낸다. 또한, 세척 단계에서 세척된 프로브의 양을 측정할 수 있다. 임의의 듀플렉스 리간드 결합 부위(30')가 또한 도시되어 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 포획 잔기를 사용하여 분열된(또는, 그러하지 않은 경우, 변화된) 표적 가닥과 비분열된 가닥을 구별할 수 있다. 검출 가능한 표지(52')를 갖는 절단된 가닥(48)은 (불용성 지지체(15)에 고정되는) 포획 잔기(10')과 상보적인 반면에, 검출 가능한 표지(52')를 또한 갖는 비절단된 가닥(40')은 비상보적인 돌출 영역(55)을 갖기 때문에, 포획 잔기(10")에 효과적으로 결합되지 않는다. 표적 가닥은, 예를 들어, 제한 효소로 절단될 수 있다. 이와 같이, 샘플은 제한 효소로 처리되며, 생성물은 적합하게 설계된 포획 잔기으로 인큐베이션된다. 도 3의 상부 패널은 포획 잔기(10")에 비절단된 가닥(40')의 하이브리다이징이 선호되지 않는 쌍방향 화살표에 의해 나타내어진 바와 같이, 비절단된 가닥(40')이 포획 잔기(10")에 안정하게 결합되지 않을 것이다. 도 3의 하부 패널에서, 쌍방향 화살표는 포획 잔기(10")에 절단된 가닥(48)의 선호된 결합을 나타내며, 반면에 비표지된 단편(49)은 (10")에 결합되지 않는다. 결합된 생성물(48)의 표지(52')를 검출함으로써, 표적 서열의 존재가 검출된다. 임의의 이중-결합-리간드 결합 부위(30")가 또한 도시되어 있다. 이러한 개략도는 본래의 표적 가닥의 말단에 인접한 부위에서 발생되지 않는 핵산 서열을 검출하는데 사용하려는 본 발명의 포획 잔기를 허용한다.
또 다른 검출 방법은 도 4에 도시되어 있다. "샌드위치" 검정법과 관계되며, 포스페이트(42)를 통해 프로브(40' 및 44')의 결찰로부터 생성된 생성물의 검출에 특히 유용한 이러한 구체예에서, (불용성 지지체(15)상에 고정되는) 포획 잔기(10")은 단지 하나의 프로브, 한 예로서, 프로브(44')의 영역에 상보적이다. 2차 프로브(50')(검출 프로브라 칭함)는 표지 잔기(52')으로 표지되며, 프로브(40')의 영역에 상보적이다. 도 4의 상부 반응 개략도에 나타내어진 바와 같이, 다수의 비결찰된 프로브(44')는 포획 잔기(10"')에 하이브리다이징되지만, 표지되지 않기 때문에 검출되지 않는다. 비결찰된 프로브(40')는 세척된다. 도 4의 하부 반응 개략도로 나타내어진 바와 같이, 프로브(40' 및 44')의 결찰 생성물(45')은 포획 잔기(10"')에 결합되며, 검출 프로브(50')는 결찰 생성물(45')의 영역(47)에 하이브리다이징된다; 이와 같이 하면, 단지 결찰된 생성물만이 검출된다.
본 발명의 포획 잔기으로 표적 핵산을 검출하는 그 밖의 개략도가 가능하다는 것은 당업자에게는 자명할 것이다. 예를 들어, 표적 핵산은 포획 잔기와의 하이브리다이징 전후에 증폭되어 민감도를 개선시킨다.
본 발명에 따르면, 포획 잔기에 표적 핵산의 결합을 검출하는데 다수의 표지가 유용하다. 당해기술분야에 공지된 방법중에서도 특히 방사성 동위원소(예를 들어,32P), 형광 표지, 효소(예를 들어, 비색법에 사용될 수 있는 알칼리성 포스파타아제 및 양고추냉이의 페록시다아제), 항체, 화학 발광, 생물 발광 등이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비색법을 사용하여 포획 잔기에 표적 가닥의 결합을 검출할 수 있다. 상술한 바와 같이, 원하는 검출 방법에 따라 표지를 포획 잔기, 표적 핵산 또는 2차 프로브에 부착시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 바람직하지는 않지만, 크로마토그래피 또는 전기영동법으로 포획 잔기에 표적 가닥의 결합을 검출할 수 있다.
본 발명의 방법은 수작업으로도 용이하지만, 자동화된 장치를 사용하는 것을 채택하는 것이 용이하다. 예를 들어, (아래 실시예 5에 보다 상세하게 기술된) 다수의 웰 플레이트로 사용하기 위한 자동화된 피펫팅 및 자동화된 판 판독기의 사용을 통해서 동시에 다수의 분석을 수행할 수 있는 로봇 웍스테이션이 이용된다. 이와 같이, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 자동화된 장치와 함께 수행된다. 자동화된 장치를 사용하게 되면 하나 이상의 표적 핵산 서열에 대하여, 단일 또는 다수 샘플을 신속하고, 저렴하게 분석할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 반응 혼합물을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 반응 혼합물은 고정된 헤어핀, 고형물 또는 불용성 지지체, 비고정된 헤어핀, 표적 핵산 가닥, 서열 특이적 듀플렉스 리간드, 비서열 특이적 듀플렉스 리간드, 공유 결합을 생성시키거나 분열시키지 않는 듀플렉스 리간드, 이중 변이체, 표준 중의 하나 이상을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 핵산을 검출하기 위한 킷을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 킷은 고정된 헤어핀, 비고정된 헤어핀, 고형물 또는 불용성 지지체, 표준, 서열 특이적 듀플렉스 리간드, 비서열 특이적 듀플렉스 리간드, 어떠한 공유 결합을 생성시키거나 분열시키지 않는 듀플렉스 리간드, 이중 변이체, 사용 안내서중의 하나 이상을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "표준"은 포획 잔기의 단일 가닥이 형성된 영역에 실질적으로 상보적이 되도록 사전에 선택된 핵산 가닥을 언급한다.
실시예
실시예 1
듀플렉스 리간드 및 이중 변이체의 다양한 조건하에서 "절단된" 올리고누클레오티드와 본래의 올리고누클레오티드를 구별하는 핵산 헤어핀 포획 잔기의 능력을 시험하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
상업적으로 유용한 올리고누클레오티드 합성기(어플라이드 바이오시스템즈 ABI-380B)상에서 표준 원안을 사용하여 방사성 동위원소로 표지된 13머 프로브 1 ("절단된" 프로브) 5'-CAGCG CGTTT TAG-3'(서열번호:3) 및 17머 프로브 2("비절단된" 프로브) 5'-CAGCG CGTTT TAGCT TA-3'(서열번호:4)를 합성하였다. 하기 방식으로 고정된 핵산 헤어핀을 준비하였다: 200㎕의 BN 완충액(1M NaCl/1mM EDTA/0.025% 트리톤(Triton)-X 100/10mM 트리스 HCl, pH 7.5)중의 1mg의 사전에 세척한 스트렙타비딘-코팅된 마그네틱 비즈(다이날(Dynal)에서 구입)를 온화하게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 (DNA 합성기상에서 합성된) 500pmol의 비오틴화된 헤어핀으로 인큐베이션시켰다. 비오틴화된 헤어핀은 하기 구조를 갖는다:
헤어핀과 상보적인 프로브의 하이브리다이제이션이 듀플렉스 리간드 액티노마이신 D에 대한 결합 부위(예를 들어, 5'-AGCT-3')를 형성하도록 헤어핀 및 프로브를 선택하였다. 그런 후, 비즈를 BN 완충액으로 세번 세척하여 비부착된 헤어핀을 제거하였다. 약 20%(200pmol)의 헤어핀을 비즈에 결합시키는 방사성 표지된 비오틴화된 헤어핀으로 별도의 실험을 수립하였다.
각 실험에 대하여, 고정된 헤어핀(실험에 대하여 약 2pmol 헤어핀)과 함께 20㎕의 BN 완충액중의 20,000CPM(약 2fmol)로 20㎍의 비즈를 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 후, 다양한 농도에서 요소 및/또는 악티노마이신 D를 함유하는 완충액으로 상기 비즈를 세번 세척하였다(도 5 참조). 이어서, 상기 비즈를 자석을 사용하여 완충액으로부터 제거하였다. 비즈 및 조합된 완충액의 세렌코브(Cerenkov) 카운팅은 CPM(비즈)/[CPM(비즈)+CPM(완충액)]으로 퍼센트 결합의 계산을 허용하였다.
결과는 도 5에 도시되어 있다. 예기된 바와 같이, 이중 변이체의 농도가 증가함에 따라, 결합된 올리고누클레오티드의 양이 감소하리라는 것은 분명하다(도 5A 참조). 중요하게는, "비절단된" 17-머의 결합이 "절단된" 13머의 결합 보다 날카롭게 떨어지기 때문에, 절단된 올리고누클레오티드와 비절단된 올리고누클레오티드 사이의 구별은 보다 높은 이중 변이체 농도에서 증가한다. 일정한 요소 농도에서, 악티노마이신 D의 양을 증가시키게 되면 절단된 및 비절단된 올리고누클레오티드 둘 모두의 결합이 증가되며, 두 올리고누클레오티드 사이의 구별은 감소된다(도 5B). 이와 같은 결과가 또한 예기된다. 종국적으로, 도 5C에는 요소의 농도를 변확시키면서 악티노마이신 D의 농도가 일정하게 보유되는 효과가 도시되어 있으며; 이들 조건하에서 올리고누클레오티드 구별은 약 8M 요소에서 가장 높다는 것을 입증하고 있다.
이들 결과는 절단된 및 비절단된 올리고누클레오티드가 구별될 수 있으며, 구별의 이러한 수준이 듀플렉스 리간드 또는 이중 변이체의 농도를 변화시킴으로써 조정된다는 것을 명백하게 나타내고 있다.
실시예 2
올리고누클레오티드 결합에 관한 세척 완충액의 염 농도의 효과, 및 상보적인 올리고누클레오티드와 비상보적인 올리고누클레오티드를 구별하는 헤어핀 잔기의 능력을 하기 실험에서 시험하였다.
13-머 프로브 1(서열번호:3), 17-머 프로브 2(서열번호:4), 및 헤어핀 포획 잔기를 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 자동 DNA 합성기상에서 표준 방법을 사용하여 비상보적인 20-머 5'-TTATA ATTAA CCGGT ATATA-3'(서열번호:6)를 또한 합성하였다. 염 농도를 감소시키면서 함유시킨 세가지 세척 완충액으로 비즈를 세척한다는 것을 제외하고는, 상기에 기술된 바와 같이 결합 실험을 수행하였는데; 제 1 세척 완충액은 1M NaCl을 함유하였고, 제 2 세척 완충액은 0.1M NaCl을 함유하였으며, 제 3 세척 완충액은 0.01M NaCl을 함유하였다. 세척 용액중 어떠한 것도 요소 또는 악티노마이신 D을 함유하지 않았다.
상보적/비상보적인 구별에 관한 다양한 세척 완충액 염 농도의 효과는 도 6에 도시되어 있다. 제 1 세척한 후, 높은 염 농도에서, 상보적인 올리고누클레오티드의 결합은 예기된 바와 같이 가장 컸으며; 17-머는 헤어핀 포획 잔기에 효과적으로 결합할 수 없으며 이중 형성을 불안정하게 하는 4-염기 단편을 지녔다. 낮은 염 농도에서 연속적으로 세척하게 되면 어떠한 경우에는 모든 올리고누클레오티드가 세척되지만, 상보적 올리고누클레오티드와 비상보적 올리고누클레오티드 사이의 구별이 개선된다. 개선된 구별은 비상보적 올리고누클레오티드의 결합에 있어 상당량의 감소에서 유래되지만, 상보적 누클레오티드의 결합은 단지 약간 감소된다. 상보적 13-머와 17-머 사이의 구별은 염 농도가 1M에서 0.1M로 감소하는 경우에 또한 개선된다. 저염 세척후에, 약 70%의 상보적 가닥이 포획 잔기에 결합된 상태로 잔류한다.
실시예 1의 결과와 함께, 본 실시예의 결과는 (세척 완충액에서의) 염, 듀플렉스 리간드, 및 이중 변이체의 농도가 최적의 민감도 또는 최적의 선택도(구별), 또는 민감도와 선택도 사이의 균형이 달성되도록 조작될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실험은 헤어핀 잔기에 표적의 결합이 상대적으로 매우 엄격한 세척에도 불구하고 생존할 수 있을 정도로 충분히 강하다는 것을 보여주고 있다.
실시예 3
상보적 표적 가닥과 비상보적 가닥을 구별하는 포획 잔기의 능력을 하기 실험에서 시험하였다. 표적 가닥에 관한 걸려있는 "테일(tail)"의 효과를 또한 시험하였다.
실시예 1에서 사용된 헤어핀 포획 잔기를 13-머 상보적 가닥(서열번호:3), 22-머 상보적 가닥 5'-GGCGT TAACC AGCGC GTTTT AG-3'(서열번호:7), 및 비상보적 26-머 가닥 5'-TACCG GAAGG AATTC TTCGT GCATG A-3'(서열번호:8)중의 하나의 올리고누클레오티드로 인큐베이션시켰다. 실시예 1에서와 같이 실험을 수행하였다. 수개의 복사 번호에서 상기 프로브를 시험하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.
도 7A 및 7B에 도시한 바와 같이, 상보적 가닥(13-머 및 22-머 둘 모두, 쌍을 이루지 않은 9-염기 "테일"을 지님)은 포획 헤어핀에 잘 결합된다. 이러한 결과는 포획 잔기의 "스템(stem)", 또는 분자내 이중 영역에 근접하지 않은 9-머 "테일"이 (포획 잔기의 스템에 근접한 쌍을 이루지 않은 말단을 가지며 상당히 불안정화된 실시예 2의 "비절단된" 프로브와는 대조적으로) 표적 결합 효율에 관해 매우 작은 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 26-머 비상보적 프로브는 예기된 바와 같이 포획 잔기에 거의 결합하지 않음을 나타낸다(<2%)(도 7C). 이들 결과는 포획 잔기가 표적 서열과 비표적 서열을 효과적으로 구분할 수 있음을 입증한다.
실시예 4
결찰 반응의 생성물을 포획하여 검출하는 포획 잔기의 능력을 하기 실시예에서 입증하였다.
이러한 표적 서열은 대장균(E. coli) rhsA 유전자에 상응하는 32-메르 5'- ATTTT TTGCA AATTT TTATT TGCCCGAGTATA -3'(서열 번호.9)이다. 생성물에 상보적인 두 개의 프로브, 즉 프로브 1(17-메르) 및 프로브 2(15-메르)가 하기에 도시되어 있다.
프로브 1: 5'- TTATT TGCCC GAGTA TA -3' 서열 번호. 10
프로브 2: 5'- ATTTT TTGCA AATTT -3' 서열 번호. 11
프로브 1은 표준 키나아징 프로토콜에 이어32P를 갖도록 5'-인산화 반응을 유발시켰다. 리게이션 반응을 20㎕의 총 부피하에 완충제( 50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 25㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 1mM ATP) 중의 0.1nmol의 프로브 2 및 20,000 CPM 프로브 1(약 1fmol)을 갖는 미세원심분리 튜브에서 수행하였다. 표적 농도를 0.1μM 내지 1fM의 10 단계로 다양화시켰다. 샘플을 90℃에서 5분 동안 가열한 후, 실온에서 냉각시킴으로써 어닐링시켰다. T4 리가아제(400 단위)를 첨가하고(효소 대조군도 포함), 샘플을 37℃에서 2 내지 4 시간 동안 인큐베이팅 시켰다. 리가제를 90℃에서 5분 동안 불활성화시켰다.
그 후, 20㎕의 BN 완충제중에 20㎍의 스트렙타비딘 피복 자석의 미세비드를 리게이션 방응 혼합물에 첨가하였다. 미리 하기에 도시된 비오틴화 헤어핀 포획 잔기를 갖는 비드를 유도하였다:
비드는 총 4pmol의 부동화된 헤어핀 포획 잔기를 갖는다. 샘플을 약하게 교반시키면서 20 내지 30 분동안 실온에서 인큐베이팅시킨 후, 자석을 갖는 완충제로부터 이를 분리시키고, BN 완충제로 세 번 세척하였다. 그 후, 생성물을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하였다. 필름을 24시간 동안 노출시켰다. 헤어핀 포획 잔기를 처리하지 않은 대조군 샘플을 또한 분석하였다.
결과는 도 8 및 9에 도시되어 있다. 도 8의 바닥 파넬은 헤어핀 포획 잔기로 처리하기 전에 반응 혼합물(대조군 혼합물)의 밴드 형태를 나타낸다. 더 낮은 밴드는 프로브를 처리하지 않았다; 주요 상위 밴드는 리게이션화된 생성물이다. 높은 복사체 수에서 작은 밴드는 인공적인 것이다. 리게이션된 생성물은 표적의 104복사체에서 시각적으로 볼수 있다. 매우 적은 비리게이션된 프로브가 도시되고, 이것은 리게이션된 생성물에 대한 시스텝의 높은 선택도를 입증한다. 또한, 시스텝의 민감성은 거의 대조 혼합물(낮은 파넬), 즉 표적의 104내지 105복사체와 거의 동일하다(상위 파넬에 도시된 낟알 모양의 형태는 인공적인 것과 관련이 없다). 높은 표적 복사체 수에서, 헤어핀에 의해 포획된 리게이션된 생성물의 양이 감소함을 주목하라; 이것은 리게이션된 생성물과 경쟁적인 표적의 과다한 존재에 기인한 것으로 여겨진다.
도 9에는 800 단위의 T4 리가아제로 수행되는 유사한 시험이 도시되어 있다. 결과는 도 8과 유사하다. 낮은 파넬에서 "109"으로 표지된 레인은 흠있는 실험에 의해 야기되었다.
실시예 5
상기 실시예는 다중 표적 핵산 서열에 대한 샘플의 자동 스크리닝을 위한 멀티-웰 플레이트의 사용을 설명한다.
비오틴닐화 DNA 헤어핀은 실시예 1에 설명된 방법에 따라 합성되었다. 하나의 DNA 헤어핀 서열을 관심있는 각각의 표적 서열에 대해 합성하였다. 예를 들어, 낭포성 섬유증의 스크리닝에 있어서, 상이한 돌연변이체에 대응하고, 상기 질병을 진단하는 수개의 서열이 이용되었다.
96-웰 플레이트의 각각의 웰을 예를 들어 밀러(Miller)에 의해 미국 특허 제 5,374,524호에 설명된 바와 같이 스트렙타비딘으로 피복시키고, 한 서열의 비오티닐화 헤어핀의 대다수를 각각의 웰에 부동화시켰다. 유리된 헤어핀을 완충제로 세척함으로써 제거하고, 준비된 로봇 워크스테이션에 위치시켰다. 워크스테이션에 각각의 웰에 100㎕의 완충제를 첨가하도록 프로그램하였다. 완충제는 요소(5M) 및 악티도마이신 D(400μM)을 함유한다. 완충제의 첨가는 10㎕의 샘플 DNA의 용액을 첨가에 의해 수행된다. 96-웰 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨 후, 반응 혼합물을 자동 피펫으로 각각의 웰로부터 제거하였다. 웰을 완충제로 3번 린스하여, 비결합 DNA를 제거한다. 그 후, 표적 서열의 영역에 상보적이고, 잘 공지된 기술에 따라 알칼린 포스파타아제의 공유 결합에 의해 표지된 제 2 프로브를 함유하는 용액을 첨가하였다. 샘플을 다시 인큐베이팅시키고, 비혼성화된 프로브를 제거하였다. 엘을 완충제로 린스한 후, BCIP(5-브로모-4- 클로로-3-인돌릴포스페이트) 및 NBT(니트로블루 테트라졸리움) 용액으로 처리하였다. DNA 샘플에 결합하는 헤어핀을 갖는 웰은 통상적인 플레이트 판독기에 의해 해독되는 파란색을 띨 것이다.
상기 분석, 특히 표준 장비를 이용한 분석은 신속하고, 임의의 원하는 표적 핵산을 검출하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.
실시예 6
단일 염기 미스매치를 식별하기 위해 헤어핀 포획 잔기의 능력을 하기 실험에서 시험하였다. 실시예 1(서열 번호.5)의 부동화 헤어핀은 실시예 1(서열 번호.3)의 매치 프로브 및 도 10에 도시된 것으로서 3'-말단 염기가 C, A 또는 T인 것을 제외한 매치 프로브에 동일한 미스매치 프로브는를 포획하는데 이용된다. 실험적 조건은 실시예 1에서와 동일하다. 결과는 도 11에 도시되어 있으며, 이것은 온도의 작용에 따라 용융되는 듀플렉스 분획을 나타낸다.
도 11에 도시될 수 있는 바와 같이, 표적 가닥의 3'말단에서 A 또는 T 치환의 온도는 표적:포획 듀플렉스 잔기의 용융 온도보다 현저하게 낮다. 따라서, 표적에서 단일-염기 미스매치의 식별이 가능하다. 흥미롭게도, 표적의 3'-말단에서 C의 치환은 상기 경우에서 듀플렉스 잔기의 용융 온도보다 상당히 낮은 것은 아니다.
당 분야에 숙련된 이들은 잘 공지할 수 있을 것이며, 또는 본 원에 설명된 특정 공정에 대해 다만 정해진 실험, 다수의 장비를 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 대응물은 본 발명의 범위내로 여겨지며, 하기 청구 범위에 적용된다.
본 원에 설명된 모든 참조 및 특허 출원의 내용을 참조 문헌으로서 본 원에 이용하였다.
다른 구체예들은 하기 청구 범위에 해당된다.
(1) 일반적 사항
(i) 출원인: 마이클 제이. 레인; 알버트 에스. 비나이트 및 브라이언 디. 팔다즈
(ii) 발명의 명칭: 핵산 포획 잔기
(iii) 서열의 수: 12개
(ⅳ) 연락처:
(A) 주소: 레이브 앤 코크파일드
(B) 스트리트: 슈트 510 스테이트 스트리트 60
(C) 도시: 보스턴
(D) 주: 매사츄세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 02109-1875
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 # 1.25
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 08/519,197
(B) 출원일: 1995-8-25
(ⅷ) 변리사/대리인 상황:
(A) 성명: 루이스 이어스
(B) 등록 번호: 35,965
(C) 참고/서류 번호: TMI-012
(ⅸ) 통신처:
(A) 전화: (617) 227-7400
(B) 팩스: (617) 227-5941
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 38 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 염기
(B) 존재 위치: 19
(C) 기타 정보: /각주 = "비오티닐화된 티미딘"
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 혼합 특징
(B) 존재 위치: 38
(D) 기타 정보: /각주 = " N은 4 내지 50개 추가 염기 사이를 나타낸다"
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :1:
(2) 서열 번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 38 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 염기
(B) 존재 위치: 20
(C) 기타 정보: /각주 = "비오티닐화된 티미딘"
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 혼합 특징
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보: /각주 = " N은 4 내지 50개 추가 염기 사이를 나타낸다"
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 13 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :3:
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :4:
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 50 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 염기
(B) 존재 위치: 19
(C) 기타 정보: /각주 = "비오티닐화된 티미딘"
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :5:
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :6:
TTATAATTAA CCGGTATATA
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :7:
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 25 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :8:
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 32 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :9:
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :10:
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 15 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :11:
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 52 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 염기
(B) 존재 위치: 34
(C) 기타 정보: /각주 = "비오티닐화된 티미딘"
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :12:

Claims (34)

  1. a) 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위 또는 이의 일부인 이중 가닥 영역의 말단 염기, 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 단일 가닥 영역을 지니는 단분자 핵산 포획 잔기를 제공하고,
    b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되도록 하는 조건하에 표적 단일 가닥 핵산, 핵산 포획 잔기, 및 듀플렉스 결합 리간드를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며,
    c) 표적 단일 가닥 핵산을 핵산 포획 잔기에 혼성화시켜, 듀플렉스 결합 리간드를 형성된 분자간 듀플렉스(duplex)에 결합시킴으로써, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시킴을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 표적 단일 가닥 핵산 및 핵산 포획 잔기의 단일 가닥 영역에 의해 형성된 제 1 듀플렉스 염기쌍이 일부의 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 코드화시키는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 핵산 헤어핀을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 고형 지지체에 결합되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기가 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 방법.
  6. a) 구조 A-B-C-D(여기서, A는 표적 단일 가닥 핵산 서열에 사실상 상보적인 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하는 핵산 포획 잔기를 제공하고,
    b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되도록 하는 조건하에 표적 단일 가닥 핵산 및 핵산 포획 잔기를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며,
    c) 표적 핵산과 핵산 포획 잔기의 존재 여부를 검출함으로써, 표적 단일 가닥 핵산을 검출함을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산 서열을 검출하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, D의 말단 염기는 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위 또는 이의 일부를 포함하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 반응 혼합물이 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 불용성 지지체상에 고정되는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드가 어떠한 듀플렉스를 공유 결합적으로 변화시키지 않는 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기가 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 방법.
  12. a) 구조 A-B-C-D(여기서, A는 표적 단일 가닥 핵산 서열에 사실상 상보적인 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하는 핵산 포획 잔기를 제공하고,
    b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화되어 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 포함한 분자간 듀플렉스를 형성하도록 하는 조건하에, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며,
    c) 표적 핵산과 핵산 포획 잔기의 존재 여부를 검출함으로써, 표적 단일 가닥 핵산을 검출함을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산 서열을 검출하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 표적 단일 가닥 핵산이 핵산 포획 잔기에 혼성화되어 노출된 듀플렉스를 형성하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위가 절단부를 포함하지 않는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 반응 혼합물이 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드가 서열 특이적인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드가 어떠한 듀플렉스를 공유 결합적으로 변화시키지 않는 방법.
  18. 제 12 항에 있어서, 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기가 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 방법.
  19. 구조 A-B-C-D(여기서, A는 핵산 서열이고, B 와 D는 서로 혼성화되어 분자간 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 서열이며, C는 결합기임)를 포함하며, 불용성 지지체에 고정되는 핵산 포획 잔기.
  20. 제 19 항에 있어서, A가 표적 핵산 서열에 사실상 상보적인 핵산 포획 잔기.
  21. 제 19 항에 있어서, 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기가 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 핵산 포획 잔기.
  22. 제 20 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 표적 핵산 서열이 핵산 포획 잔기에 혼성화되어 형성된 듀플렉스가 소정의 듀플렉스 결합 리간드를 포함하도록 선택되는 핵산 포획 잔기.
  23. a) 이중 가닥 영역 및 표적 단일 가닥 핵산에 혼성화될 수 있는 인접한 단일 가닥 영역을 지니는 단분자 핵산 포획 잔기를 제공하고,
    b) 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기가 혼성화될 수 있도록 하는 조건하에, 표적 단일 가닥 핵산, 핵산 포획 잔기, 및 듀플렉스 결합 리간드를 포함하는 반응 혼합물을 형성시키며,
    c) 표적 단일 가닥 핵산을 핵산 포획 잔기에 혼성화시켜, 듀플렉스 결합 리간드가 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위에 결합되도록 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위를 포함한 분자간 듀플렉스를 형성시킴으로써, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시킴을 포함하여, 표적 단일 가닥 핵산과 핵산 포획 잔기의 혼성화를 촉진시키는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 핵산 헤어핀을 포함하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 핵산 포획 잔기가 고형 지지체에 결합되는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드가 어떠한 듀플렉스를 공유 결합적으로 변화시키지 않는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드 결합 부위가 절단부를 포함하지 않는 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 핵산 포획 잔기의 말단 염기와 표적 단일 가닥 핵산의 말단 염기 사이에서 적층되는 염기가 분자간 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 방법.
  29. 고정된 헤어핀,
    불용성 지지체, 및
    표적 핵산을 포함하는 반응 혼합물.
  30. 제 29 항에 있어서, 헤어핀이, 표적 핵산 서열이 헤어핀에 혼성화되어 형성된 듀플렉스가 소정의 듀플렉스 결합 리간드에 대한 결합 부위를 포함하도록 선택되는 반응 혼합물.
  31. 제 29 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하는 반응 혼합물.
  32. 제 30 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드가 서열 특이적인 반응 혼합물.
  33. 고정된 헤어핀,
    불용성 지지체, 및
    핵산 가닥을 포함하는, 표적 핵산의 검출을 위한 킷.
  34. 제 33 항에 있어서, 듀플렉스 결합 리간드를 추가로 포함하는 킷.
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