KR19990021926A - 폴리믹신 포합체 - Google Patents

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마하비르 프라샤드
수쉴 샤르마
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한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터
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Abstract

미포합 (unconjugated) 폴리믹신 B 보다 큰 항내독소 활성을 갖는 수용성 폴리믹신 B/덱스트란 포합체 (또는 그의 염)이 개시되어 있다. 이들은 약 9.3 내지 약 10의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수성 매질중에서 폴리믹신 B 또는 그의 염을 덱스트란과 반응시켜 제조할 수 있다.

Description

폴리믹신 포합체
발명의 개요
본 발명은 약 9.3 내지 약 10, 바람직하게는 약 9.5 내지 약 9.7의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 32℃의 온도에서 수성 매질중에서 폴리믹신 B (PMB) 또는 그의 염을 덱스트란과 반응시키는 것을 포함하는, 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 염)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 한가지 방법은 약 32℃의 온도에서 폴리믹신 B 황산염을 산화된 덱스트란과 반응시켜 폴리믹신 B 분자를 아민 결합을 통해 덱스트란에 공유결합시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법으로 제조된 개선된 포합체 (또는 그의 염)는 용이하고도 일관성있게 재현가능하고, 높은 효능 및 미포합(unconjugated) 폴리믹신 B의 항내독소 활성 보다 큰 항내독소 활성과 같은 상당히 개선된 약리적 특성을 나타낸다.
본 발명은 또한 미포합 폴리믹신 B의 항내독소 활성 보다 큰 항내독소 활성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 염 및 덱스트란을 포함하는, 수용성 포합체 (또는 그의 염)를 포함한다.
전신 감염 반응 증후군 (SIRS) 및 패혈증 쇼크의 효과적인 치료를 위한 의학적 요구가 폭넓게 인식되고 있으며, 환자층이 넓어서 선진국의 경우 긴급한 치료를 요하는 SIRS/패혈증의 경우 100,000건을 넘고 예방하는 것이 이로울 수 있는 패혈증 위험부담이 큰 환자가 거의 1백만명에 달한다.
내독소는 인간 및 동물의 큰 신체에 기초를 둔 SIRS/패혈증의 예방 연구에 서 중요한 개시인자/주요한 매개체로서 인식되므로, 패혈증에 대한 항내독소 접근방식에 대한 명백한 과학적 이론의 근거를 제공한다. 내독소 또는 지방다당류 (lipopolysaccharide)는 그람음성균의 세포벽으로부터 유도된 구조적 분자들이다. 내독소 또는 지방다당류가 혈류에 유입되면 이들로 인해 체온 조절이 방해받고 열이 난다. 이들은 또한 심장병, 폐병 및 신부전증을 초래하는 독성을 갖는다. 내독소와 관련된 질병은 집중적인 치료를 받는 환자들중에서 1차적인 사망 원인이다.
내독소 분자의 지질 A 부위에 결합시킴으로써 달성되는, PMB의 내독소 중화 능력은 항생제들중에서 독특하다. 바실루스 폴리믹사 (Bacillus polymixa) (B. aerosporus)로부터의 PMB는 크게 포화된 양친매성 시클릭 펩티돌지질이다. 이러한 PMB는 또한 특히 면역을 상실한 개체들에게서 발생하는 다양한 진균 감염과 싸우는데 유용하다. 그러나, PMB는 이상적인 항생제 보다는 떨어지는 몇몇 특성들을 가지고 있다. 첫째, 체내에서 짧은 반감기를 가지므로 효과가 있기 위해서는 반복된 투약을 요구한다. 둘째로, 신장을 통과할 때 폭넓은 손상을 일으킬 수 있다. 셋째로, 다량 복용시 호흡 마비를 초래하는 신경독성을 갖는다.
과거에는 연구자들이, 예를 들면 세파로즈 (Sepharose)에 PMB를 결합하는 것이 기재되어 있는 문헌 (Issekutz, J. Immunol. Methods 61 (1983) 275-281)에서 볼 수 있듯이 부동 또는 고정 분자에 PMB를 포합시켰다. 이들 포합체가 정제 기술로는 유용하지만, 생체 치료 용도에는 적합하지 못하다.
약리학적 활성, 증가되는 지속성, 또는 감소된 기관 독성을 달성하기 위한 한가지 접근방법은 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 큰 분자량을 지닌 거대분자에 약물을 포합시키는 것을 포함했다. 그러나, 중합체 포합의 분야에 있어서의 시도들은 제한적으로만 성공했다. 예를 들어, 포로카인아미드 (항부정맥약)의 포합 형태는 활성이 작고, 천연 프로카인아미드 보다 짧은 반감기를 나타냈다 (Schact 등, Ann N.Y., Acad. Sci. 416 [1985] 199-211). 유사하게, 담체에 결합된 프로스타글란딘 동족체 B245는 천연 분자 보다 효과가 (크기가 여러 차수나) 적었다 (Bamford 등, Bioch. Biophys. Acta 886 [1986] 109-118). 생물학적 효능에 있어서의 감소는 칼리크레인, 아프로티닌, 브라디키닌 (Odya 등, Biochem. Pharmacol. 27 [1978] 173-179), 항종양약 다우노루비신 (Hurwitz 등, J. Appl. Biochem. 2 [1980] 25-35), 및 미토미신 C (Takakura 등, Cancer Res. 44 [1984] 2505-2510)의 포합 형태에 대해 기재되어 왔다. 포합된 효소는 또한 입체 장애 및 감소된 기질 접촉성 때문에 생물학적 활성에 있어서 감소하게 된다 (Blomhoff 등, Biochem. Biophys. Acta 757 [1983] 202-208; Marshall 등, J. Biol. Chem. 251 (4) [1976] 1081-1087; R.L. Foster, Experimentia 31 (7) [1975] 772-773; Wileman 등, J. Pharm. Pharmacol. 35 [1983] 762-765). 그러나, 포합후의 순환 반감기에 있어서의 개선 예들이 몇몇 있다 (Wileman, 상기 참조; Kaneo, Chem. Pharm. Bull. 37 (1) [1989] 218-220).
혈류중에 더 오래 머무르고(머무르거나) 치료 투약시 신경독성 또는 신장독성을 가지지 않는 PMB 형태를 개발하는 것이 바람직할 것이다. USP 제5,177,059호 및 EP 제428486호와 같은 다른 나라에서의 대응 특허에는, 덱스트란 또는 히드록시 에틸 전분과 같은 다당류, 알부민과 같은 단백질, 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐 알콜과 같은 중합체와의 폴리믹신 B 포합체가 기재되어 있다. 이 특허에는 특히 상온 (즉, 약 25℃ 이하) 및 8.5 내지 9.0의 pH에서 물질들을 반응시켜 폴리믹신 B를 덱스트란에 화학적으로 포합시키는 방법이 기재되어 있다. 이 특허에 기재되어 있는 포합체들은 미포합 폴리믹신 B 보다 적은 독성을 가지며, 명백하게 한정되지는 않지만 미포합 폴리믹신 B의 항내독소 활성 이하인 것으로 나타나는 항내독소 활성을 갖는다.
본 발명의 방법은 이 특허에 기재된 방법 보다 개선된 것이고, 놀랍게도 공지된 PMB-덱스트란 포합체와 비교할 때, 개선된 특성, 특히 미포합 폴리믹신 B 보다 큰 항내독소 활성, 큰 효능, 양호한 재현성 및 개선된 약리적 특성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 포합체 (또는 그의 염)를 제공한다. 특히 놀라운 것은 본 발명의 신규 PMB-덱스트란 포합체 (또는 그의 염)가 미포합 PMB 보다 일관되고도 재현성있게 더 큰 항내독소 활성을 갖는다는 것이다. 이 기대밖의 신규 특성에 대한 분자적 근거가 명백하게 이해되지는 않지만, 포합체를 제조하는데 있어서 본 발명에서 사용된 반응 조건에서 pH 변화가 염기성 측쇄상의 양성자 분포를 변경하는 것 같다. 더 높은 pH에서 1개 이상의 측쇄 아미노기는 환원성 아미노화를 거쳐 덱스트란에 결합하는데 더 유용할 수 있다. 각각의 측쇄 아미노기는 특징적인 pKa를 가질 것이므로, 더 높은 pH는 시간 당 동일한 아민을 유리시킬 것이다. 이 아민이 (포합체의 효능의 관점으로부터) 특히 선호되는 결합을 제공하면, 이 특별한 결합 경로는 전체 구조에 더 기여하기 때문에, 더 양호한 형태의 포합체가 발생한다. 이 구조로 인해 일관되고도 재현성 있는 방식으로 포합체에 천연 PMB의 활성 수준 보다 큰 활성 수준, 예를 들면 천연 PMB의 활성 수준의 125% 이상이 부여된다.
본 발명은 진균 및 세균 감염을 치료하고 세균성 내독소에 의해 야기된 질병을 막는데 유용한 폴리믹신 B와 덱스트린과의 수용성 포합체 (또는 그의 염)를 제조하는 개선된 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 약 9.3 내지 약 10의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수성 매질중에서의 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 반응을 포함하는 수용성 폴리믹신 B/덱스트란 포합체 (또는 그의 염)를 제조하는 방법에 관한 것이다. PMB는 펩티드 항생물질 및 적절한 항생 활성을 갖는 승인된 약제이다. PMB는 40년이 넘게 국부 및 비경구 분야에서 임상적으로 사용되어 왔다. PMB에 대한 세균 내성은 거의 발전하지 못했다. PMB는 약 10-6M의 친화력으로 내독소와 결합하여 많은 실험실 및 생체 모델에서 모든 임상적으로 중요한 그람음성균으로부터의 내독소의 생물학적 효과를 중화시킬 수 있다. 실험실내에서는, PMB가 내독소를 중화시키는 표준물질로서 사용되어 왔다. 더욱이, 생체내에서는 PMB가 장내세균 감염에서 산성증 및 저혈압증과 같은 많은 동물 모델에서의 세균성 패혈증의 병리, 및 개, 토끼, 래트 및 마우스의 그람음성 패혈증에 기인한 치사율을 막는다. PMB는 또한 화상 환자와 같은 인간의 패혈증 예방에도 효능이 있다.
본 발명의 포합체를 제조하는 데 사용된 PMB는 상업적으로 이용가능하다. PMB는 바실루스 폴리믹사 (프라츠모브스키 (Prazmowski)) 미굴라 (Migula)를 발효하여 제조될 수 있다. PMB는 여러개의 관련된 데카펩티드의 혼합물로 구성된다. PMB 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 본 발명에 유용하다 (폴리믹스 B 황산염 및 그와 유사한).
본 발명의 방법에 사용된 덱스트란은 모든 종래의 제약상 허용가능한 덱스트란일 수 있다. 바람직하게는, 덱스트란은 산화제 예를 들면, 과요오드산나트륨에 의해 산화되는 것과 같이 화학적으로 펩티드에 공유결합하도록 변형된다. 덱스트란은 바람직하게는 약 25,000 내지 약 500,000, 더 바람직하게는 약 50,000 내지 약 200,000, 더욱 더 바람직하게는 약 63,000 내지 약 76,000의 중량 평균 분자량을 가져야 한다. 분자량은 예를 들면, 겔 투과 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 가장 바람직한 덱스트란은 루코노스토크 (Leuconostoc) 장간막제 (NRRL B-512)의 발효에 의해 제조된다. 이것은 대략 5% α[1-3] 분지를 갖는 선형 장쇄에 α[1-6] 결합된 글루코스 단위를 포함한다. 분지쇄중에서 약 85%는 1개 내지 2개의 글루코스 단위를 갖고 나머지 15%는 평균 33개의 단위를 갖는다.
수성 매질에서 PMB와 덱스트란과의 포합체를 제조하는 일반적인 방법은 USP 제5,177,059호에 기재되어 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 부분 산화된 덱스트란은 과요오드산나트륨 (NaIO4)과 같은 산화제와 반응시켜 제조된다. 이런 처리에 의해 글루코스 단량체상의 인근 디올의 산화성 분할을 거쳐 알데히드가 생성된다. 부분 산화된 덱스트란이 PMB 또는 그의 염으로 노출되면 시프 (Schiff) 염기가 형성된다. 본 발명의 범위내의 포합체의 제조는 PMB와 덱스트란과의 반응 동안, 특히 시프 염기 형성 단계 동안, 약 9.3 내지 약 10, 바람직하게는 약 9.5 내지 약 10, 더 바람직하게는 약 9.5 내지 약 9.7의 pH로 주의깊게 조절하는 것이 요구된다. pH는 바람직하게는 붕산염 완충제를, 특히 테트라붕산나트륨을 포함하는 완충제를 사용하여 유지된다. 또한, PMB 또는 그의 염과 덱스트란을 반응시키는 동안 수성 매질의 온도는 약 30℃ 내지 약 35℃, 더 바람직하게는 약 32℃로 유지된다. 수소화붕산나트륨 (NaBH4)의 후속적인 투입은 시프 염기 및 나머지 알데히드를 감소시켜 PMB와 덱스트란 사이에 잔류 무수물을, 바람직하게는 1개 이상의 아민 결합을 통해 안정한 공유 결합을 제공한다. 이 포합체는 바람직하게는 나머지 PMB, 무기 부산물 (붕산염 등), 및 잠재적 저분자량 분해물을 제거하기 위해, 분자량 10,000의 차단막을 사용하는 것과 같은 한외여과에 의해 정제된다. 수성 매질의 pH는 바람직하게는 정제에 앞서 약 5 내지 7로 조정된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 방법은
a) 덱스트란을 과요오드산나트륨과 반응시켜 부분 산화된 덱스트란을 제조하고,
b) 폴리믹신 B 또는 그의 염을 약 9.3 내지 약 10의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수성 매질중에서 생성된 부분 산화된 덱스트란과 반응시키며,
c) 생성된 수성 매질에 수소화붕산나트륨을 첨가하고,
d) 생성된 폴리믹신 B-덱스트란 포합체를 정제하는
것을 포함한다.
본 발명은 또한 전신 감염 반응 증후군 및 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료 처치에 사용하기 위한, 미포합 폴리믹신 B의 항내독소 활성 보다 더 큰 항내독소 활성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 제약상 허용가능한 염과 덱스트란의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염)를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 정의된 방법에 의해 제조가능한 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염) 및 상기 기재된 방법에 의해 제조된 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염), 상기 정의된 폴리믹신 B 또는 그의 제약상 허용가능한 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염) 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물, 전신 감염 반응 증후군 및 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료 처치용 약물의 제조에 있어서의 이들 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염)의 용도를 포함한다.
본 발명의 방법, 및 본 발명의 방법에 의해 생성된 포합체에서, PMB 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비는 약 1 : 15 내지 약 200 : 1, 더 바람직하게는 약 1 : 2 내지 약 1 : 5, 가장 바람직하게는 약 1.5 : 5이다.
폴리믹신 B의 염은 바람직하게는 PMB의 제약상 허용가능한 염이다.
포합체는 20℃에서 약 25 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 약 50 ㎎/㎖ 이상, 더 바람직하게는 약 60 ㎎/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 약 65 ㎎/㎖ 이상의 수용해도를 갖는 경우 수용성인 것으로 간주된다.
본 발명에 따라 제조된 PMB-덱스트란 포합체 (및 그의 염)는 PMB 그 자체의 사용과 일치되는 방식으로 사용될 수 있으며, 즉 단독으로, 예를 들면 세균성 또는 진균성 감염에 대한 항생제로서, 또는 다른 세균성 및(또는) 감염방지제와 병용하여 사용될 수 있다. 이들은 천연 PMB가 통상적으로 예를 들면, 근육내, 정맥내, 초내 (intrathecally), 결막하 또는 또는 국부적으로 투여되는 어떤 형태로든지 투여될 수 있다. 따라서 근육내 주사용 제형은 전형적으로 멸균수, 생리 식염수 또는 대략 1%의 프로카인·HCl 중 유효량의 PMB-덱스트란 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염)를 유효량을 포함한다. 정맥내 제형은 전형적으로 5% 덱스트로즈 및 멸균수 중 유효량의 포합체를 포함한다. 초내 제형은 전형적으로 생리 식염수 중 유효량의 포합체를 포함한다. 국부적으로 눈에 사용하기 위한 경우, 유효량이 물 또는 생리 식염수, 및 임의로는 글리세린, 및 접안용 황산구리과 섞일 수 있으며, 또는 연고나 현탁액으로 만들어질 수 있다. 국부적인 사용하기 위한 크림, 특히 화상부용의 크림은 전형적으로 액상 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 유화 왁스와 같은 불활성 성분의 기재에 유효량의 PMB-덱스트란 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염)를 포함한다.
본 발명의 정제된 PMB-덱스트란 포합체 (또는 제약상 그의 허용가능한 염)는 본질적으로 무독성이다. 사용되는 본 발명의 포합체양은 전형적으로 치료되는 증상 및 환자의 나이와 체중, 및 사용되는 특정 포합체의 활성과 같은 요인을 고려하여, 특정한 환자를 위해 처방되어지는 천연 PMB의 양을 기준으로 결정될 수 있다. 천연 PMB에 비해 1/2 이상의 투약 감소는 포합체 활성의 효과적인 증가, 포합체 독성의 감소 및 포합체 활성의 지속성 증가에 기인하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 포합체의 분자량은 예를 들면, 79,800의 중량 평균 분자량 (MW)을 갖는 덱스트란 표준물질을 기준으로 하여, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (pH 4.4에서 40 mM 인산염 완충제로서 용리되고, 저각 레이저광 산란으로서 검출되는 SEC-HPLC, TSK-GEL G4000 PWx1)를 이용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 포합체는 바람직하게는 약 55,000 내지 약 80,000, 더 바람직하게는 약 60,000 내지 약 80,000, 가장 바람직하게는 약 63,000 내지 약 76,000의 중량 평균 분자량 (MW)을 갖는다.
본 발명의 개선된 포합체는 선행 기술의 포합체를 능가하는 더 양호한 재현성 및 미포합 폴리믹신 B의 항내독소 활성 보다 더 큰 항내독소 활성을 갖는다. 본 발명의 포합체는 개선된 항내독소 활성을 가지며, 즉 미포합 폴리믹신 B의 IC50의 비 대 본 발명의 포합체의 IC50의 비는 1.0초과, 바람직하게는 약 1.25 또는 1.3초과, 더 바람직하게는 약 1.4 초과이다. 본 명세서에서 사용된 IC50은 이. 콜리 (E. coli)로부터의 내독소 0.05 ㎎의 존재하에 450 ㎚에서의 카르보시아닌 염료의 흡수 전이 50%를 폐기하는 카르보시아닌 염료 분석에 의해 측정된 폴리믹신 B의 농도를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 활성 (%)은 하기와 같이 정의된다.
카르보시아닌 염료 분석법은 폴리믹신 B 및 본 발명의 포합체의 항내독소성을 측정하는데 이용되는 실험실내 생화학적 분석법이다. 이 분석법은 이전 문헌 (Ogawa and Kanoh, Microbiol.Immunol. 28 [1984] 1313-1323; Zey and Jackson, Applied Microbiol. 26 [1973] 129-133)으로부터 수정되었고 극소역가 플레이트에 사용하기에 최적화된다. 이 분석법에서 포합체 또는 미포합 PMB (양성 조절)는 내독소에 대한 카르보시아닌 염료 (내독소에 결합되어 있을 때 분광광도 흡수에서 변화하는 작은 양이온 화합물)에 필적한다.
카르보시아닌 염료 분석법을 위한 시약의 제조는 하기와 같다.
1) 0.15 M 아세트산나트륨 용액 및 0.15 M 아세트산 용액을 제조한다. 이 두 물질을 합쳐 0.03 M의 아세트산염 완충제를 만든다 (0.15 M 아세트산나트륨 40.2 ㎖ 및 0.15 M 아세트산 159.8 ㎖).
2) 카르보시아닌 염료 8.0 ㎎을 에틸 알콜 12.5 ㎖에 녹인다. 이것을 아세트산염 완충제 37.5 ㎖로 희석시킨다. 이것이 25% 에탄올 중 160 ㎍/㎖의 최종 염료 용액이다. 이 용액을 암소에서 얼음에서 보관하고 30분 이상 혼합한다.
3) 일련의 PMB 희석액 또는 각각의 포합체를 40 mM의 인산염 완충제로 제조한다 (pH=7.4). 각각의 희석액은 최종 시험 농도 보다 6배 더 크다.
4) 초음파 처리후에, 이. 콜리 0111:B4내독소를 이전에 제조된 결빙된 모액 농도 1.0 ㎎/㎖ 0.9% 식염수로부터 0.5 ㎍/㎖ 0.9% 식염수로 희석한다.
플레이트를 장치하고 시료 또는 완충제를 먼저 극소역가 웰에 첨가하여 하기와 같이 분석을 수행한다.
a) 바탕값 : 100 ㎕의 식염수 및 50 ㎕의 40 mM 인산염 완충제 (pH=7.4)를 3회;
b) 양성 조절 : 100 ㎕의 내독소 및 50 ㎕의 40 mM 인산염 완충제 (pH=7.4)를 3회;
c) PMB 시료 : 100 ㎕의 내독소 및 50 ㎕의 PMB 시료를 3회;
d) 음성 조절 : 100 ㎕의 식염수 및 50 ㎕의 포합체 시료를 3회;
e) 실험상 : 100 ㎕의 내독소 및 50 ㎕의 포합체 시료를 3회.
플레이트를 수분동안 회전시킨다. 150 ㎕의 염료를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 포일로 싸서 암소에서 60분 동안 얼음에 보관한다. 웰을 다중채널 피펫으로 섞고 극소역가 플레이트 판독기상에서 450 nm에서 즉시 판독한다. IC50측정을 위한 리드-무엔히 (Reed-Muench) 계산을 수행한다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
실시예 1
A) 덱스트란의 산화
2.31ℓ의 주사용 물 및 150 g의 덱스트란으로 5-1 4구 둥근바닥 플라스크를 채웠다. 혼합물을 21℃ 내지 24℃에서 대략 140 rpm으로 교반시켜 용해시켰다. 주사용 물 60 ㎖ 중 3.9 g의 과요오드산나트륨 용액을 첨가하였다 (미량의 발열, 대략 1℃). 부착된 깔때기를 30 ㎖의 주사용 물로 헹구었다. 생성된 혼합물을 21℃ 내지 24℃에서 1시간 동안 저장하였다. 이 용액을 0.22 μ의 코닝 (Cornig) 셀룰로스 아세트산염 90 ㎜ 막 여과지를 통해 진공 여과시켰고 30℃ 내지 32℃로 가열하여 이 온도로 유지하였다.
B) 폴리믹신 B 황산염/붕산염 완충액의 제조
이 제조는 상기 A)의 덱스트란 산화, 여과 및 가온을 완료하기 45분 전에 시작하였다. 12-1, 4구 둥근바닥 플라스크를 pH 9.7의 붕산염 완충제 3.00ℓ로 채우고 완충제의 온도를 32℃로 조정하였다. 그 다음, 폴리믹신 B 황산염 45 g을 첨가하였고, 생성된 현탁액을 32℃에서 45분 동안 교반시켰다. 혼합물의 pH를 측정하였고 (초기 9.4), 5 N NaOH 30 ㎖을 첨가하여 32℃에서 pH 9.7로 조정하였다.
붕산염 완충제를 하기와 같이 제조하였다: 가열 처리된 5-1, 4구 둥근바닥 플라스크를 114.3 g의 테트라붕산염나트륨 십수화물 및 2.906 ℓ (2.90 ㎏)의 주사용 물로 채웠다. 이 용액을 32℃까지 가열하였고 5 N NaOH 37 ㎖를 첨가하여pH를 9.7 (초기에는 9.3)로 조정하였다. 이 용액을 0.22 μ의 코닝 셀룰로스 아세트산염 90 ㎜ 막 여과지를 통해 진공 여과시키고 저장하였다.
C) 폴리믹신 B 황산염과 산화된 덱스트란과의 반응
예열 (30℃ 내지 32℃)한 산화된 덱스트란 용액 (A부분)을 32℃에서 붕산염 완충제 중 폴리믹신 B 황산염의 교반 혼합물 (B부로부터)에 가능한 빠르게 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물의 pH를 측정하였고 (초기에는 9.5), 5 N NaOH 18 ㎖를 첨가하여 pH를 9.7로 조정하였다. 이 혼합물을 32℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 이 비균질 혼합물에 50 ㎖의 주사용 물 중 수소화붕산나트륨 3.6 g의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 32℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 이 혼합물에 또 다른 새로이 제조한, 50 ㎖의 주사용 물 중 수소화붕산나트륨 3.6 g의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 32℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 이 혼합물에 50 ㎖의 주사용 물 중 수소화붕산나트륨 3.6 g의 용액을 첨가하였다. 가열을 제거하고 14시간이 넘게 교반시키면서 반응 혼합물을 상온까지 냉각되도록 하였다. 반응 혼합물의 pH를 측정하였고 (10.0), 1 N HCl 1.27 ℓ를 첨가하여 pH를 5.7로 조정하였다. 생성된 혼합물을 산성화시킨 후에 10분 동안 교반시켰고, 멸균시킨 0.22 μ의 코닝 셀룰로스 아세트산염 막 여과지를 통해 진공 여과시켜, 폴리믹신 B-덱스트란 포합체 용액 6.81 ℓ를 제조하여 다음에서 정제하였다.
D) 한외여과에 의한 정제
폴리믹신 B-덱스트란 포합체 용액 (C부분)을 전처리된, S1Y10 막 카트리지가 구비된 아미콘 CH2PRS 한외여과 유닛 (Amicon CH2PRS Ultrafiltration Unit)을 이용하여 정제하였다. 정제된 생성물을 한외여과 유닛으로부터 제거하였고 -25℃에서 동결 저장하였다.
얻어진 포합체를 분석한 결과, 생성물은 하기 특성을 갖는 것으로 나타났다:
IC50= 16.8 ㎍/㎖
활성 = 124.7%
덱스트란 함량 = 65.37 ㎍/㎖
폴리믹신 B 총 함량 = 2.47 ㎍/㎖
유리 폴리믹신 B 함량 = 0.65%
PMB : 덱스트란 비율 = 37.71 ㎎ PMB/g 덱스트란.
얻어진 생성물은 32℃의 반응 온도 및 pH 9.5에서 미포합 PMB의 활성의 약 125%인 활성을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 2
실시예 1의 과정을 반복하여 하기 특성을 갖는 폴리믹신 B-덱스트란 포합체를 생성하였다.
IC50= 16.4 ㎍/㎖
활성 = 125.8%
덱스트란 함량 = 65.30 ㎍/㎖
폴리믹신 B 총 함량 = 2.49 ㎍/㎖
유리 폴리믹신 B 함량 = 0.67%
PMB : 덱스트란 비율 = 38.06 ㎎ PMB/g 덱스트란.
다시, 제조된 포합체는 32℃의 반응 온도 및 pH 9.5에서 미포합 PMB와 비교할 때 약 126%의 활성을 갖는다.
실시예 3
폴리믹신 B/덱스트란 포합체를 실시예 1 (상이한 부분만 언급함)의 과정에 따라 제조하여 pH 9.7에서 PMB와 덱스트란간의 반응 온도의 효과를 측정하였다. 유효하중 (㎎ PMB/ g 덱스트란), 평균 IC50(㎍/㎖) 및 활성 (%)을 측정하였고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
pH 9.7에서 온도의 효과 (10g PMB; 0.65g NaIO4; 50g 덱스트란)
실시예번호 온도 (℃) 유효하중(㎎ PMB/ g 덱스트란) 평균 IC50(㎍/㎖) 활성 (%)
3a 35 15.87 25.18 99.7
3b 35 19.81 26.07 91.1
3c 35 18.58 27.67 85.0
3d 10 49.53 143.83 23.6
3e 10 54.95 187.87 9.5
3f 10 56.03 195.7 10.8
실시예 3으로부터 pH 9.7에서 반응 온도가 10℃로 저하될 때, 제조된 생성물은 감소된 활성을 갖는다는 것으로 나타났다.
실시예 4
폴리믹신 B/덱스트란 포합체를 실시예 1 (상이한 부분만 언급함)의 과정에 따라 제조하여 PMB와 덱스트란간의 반응 pH의 효과를 측정하였다. 유효하중 (㎎ PMB/ g 덱스트란), 평균 IC50(㎍/㎖) 및 활성 (%)을 실시예 3에 따라 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
온도 32℃에서 pH의 효과 (15g PMB; 1.3g NaIO4; 50g 덱스트란)
실시예 번호 반응의 pH 유효하중(㎎ PMB/ g 덱스트란) 평균 IC50(㎍/㎖) 활성 (%)
4a 4.0a) 2.36 ND ND
4b 5.0a) 14.34 ND ND
4c 7.0b) 15.26 ND ND
4d 7.0b) 16.09 164.4 11.0
4e 8.0b) 32.03 107.7 17.8
4f 8.0b) 29.51 139.4 13.8
4g 8.5c) 69.94 74.5 24.9
4h 9.0c) 50.99 22.6 95.3
4i 9.0c) 50.16 22.5 88.6
4j 9.3c) 43.33 19.4 94.0
4k 9.3c) 39.96 19.0 95.8
4l 9.5c) 38.22 17.5 100.5
4m 9.5c) 39.9 17.8 98.1
4n 9.7c) 36.74 15.8 133.2
4o 9.7c) 34.99 14.9 148.9
4p 10.0c) 31.89 18.7 97.3
a) 아세트산염 완충제; b) 인산염 완충제; c) 붕산염 완충제
ND: 측정 불가 (시료가 너무 묽어서 이들 변수는 측정하기 어려움).
표 2의 데이터는 9.5 내지 9.7의 pH를 사용하여 32℃까지 반응 온도를 감소시켜도, 결합되지 않은 PMB 보다 탁월한 활성을 갖는 포합체의 제조가 가능한 반면에 (실시예 4l, 4n 및 4o), pH가 10 이상 더 증가하는 것은 특별히 이롭지않다는 (실시예 4p) 것을 나타낸다.
실시예 5
폴리믹신 B/덱스트란 포합체를 실시예 1(상이한 부분만 언급함)에 따라 제조하였고 그들의 항내독소 활성을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
PMB양의 효과 (1.3g NaIO4; pH 9.7; 32℃)
실시예번호 조건 유효하중(㎎ PMB/ g 덱스트란) 평균 IC50(㎍/㎖) 활성 (%)
5a 15 g PMB 36.74 15.8 133.2
5b 15 g PMB 34.99 14.9 148.9
5c 15 g PMB 33.81 17.6 109.0
5d 20 g PMB 46.06 19.7 121.5
5e 20 g PMB 44.63 19.5 115.5
표 3의 결과는 또한 최적 조건이 약 32℃의 반응 온도 및 약 9.5 내지 약 9.7의 pH에 있을 때라는 것을 더욱 확인해준다.
전체적으로, 실시예 1 내지 5의 데이터는 따라서 약 30℃ 내지 약 35 ℃, 바람직하게는 약 32℃의 반응 온도 및 약 9.3 내지 약 10, 바람직하게는 약 9.5 내지 약 9.7의 pH를 사용하므로써 본 발명의 개선된 포합체가 제조된다는 것을 나타낸다.

Claims (36)

  1. 미포합 (unconjugated) 폴리믹신 B의 항내독소 활성 보다 큰 항내독소 활성을 갖고, 즉 포합체의 IC50에 대한 미포합 폴리믹신 B의 IC50의 비율이 1.0 보다 큰, 폴리믹신 B 또는 그의 염 및 덱스트란을 포함하는 수용성 포합체 (또는 그의 염).
  2. 제1항에 있어서, 비율이 약 1.25 또는 1.3 보다 큰 포합체 (또는 그의 염).
  3. 제1항에 있어서, 비율이 약 1.4 보다 큰 포합체 (또는 그의 염).
  4. 제1항에 있어서, 항내독소 활성이 0.9% 식염수 1㎖ 당 이. 콜리 (E. coli)로부터의 내독소 0.05 ㎎의 존재하에 450 ㎚에서의 카르보시아닌 염료의 흡수 전이 50%를 폐기하는 포합체의 농도로서 포합체의 IC50이 측정되는 카르보시아닌 염료 분석법에 의해 측정된 것인 포합체 (또는 그의 염).
  5. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비가 약 1 : 15 내지 약 200 : 1인 포합체 (또는 그의 염).
  6. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비가 약 1 : 2 내지 약 1 : 5인 포합체 (또는 그의 염).
  7. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란이 약 25,000 내지 약 500,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 포합체 (또는 그의 염).
  8. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란이 약 50,000 내지 약 200,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 포합체 (또는 그의 염).
  9. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란이 약 63,000 내지 약 76,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 포합체 (또는 그의 염).
  10. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 55,000 내지 약 80,000의 중량 평균 분자량을 갖는 포합체 (또는 그의 염).
  11. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 60,000 내지 약 80,000의 중량 평균 분자량을 갖는 포합체 (또는 그의 염).
  12. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 63,000 내지 약 76,000의 중량 평균 분자량을 갖는 포합체 (또는 그의 염).
  13. 폴리믹신 B 또는 그의 염을 약 9.3 내지 약 10의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수성 매질중에서 덱스트란과 반응시키는 것을 포함하는, 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 염)의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, pH가 약 9.5 내지 약 9.7인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 온도가 약 32℃인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 반응이 폴리믹신 B 또는 그의 염을 1개 이상의 아민 결합을 통해 덱스트란에 공유결합시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 폴리믹신 B 염이 폴리믹신 B 황산염인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비가 약 1 : 15 내지 약 200 : 1인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비가 약 1 : 2 내지 약 1 : 5인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 폴리믹신 B 또는 그의 염 대 덱스트란의 분자비가 약 1.5 : 5인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 덱스트란이 약 25,000 내지 약 500,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  22. 제13항에 있어서, 덱스트란이 약 50,000 내지 약 200,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  23. 제13항에 있어서, 덱스트란이 약 63,000 내지 약 76,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  24. 제13항에 있어서, 덱스트란이 부분 산화된 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 덱스트란이 과요오드산나트륨을 사용하여 부분 산화된 것인 방법.
  26. 제13항에 있어서, pH를 붕산염 완충제를 사용하여 유지하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 붕산염 완충제가 테트라붕산나트륨을 포함하는 것인 방법.
  28. 제13항에 있어서, 수소화붕산나트륨과의 후속 반응을 포함하는 방법.
  29. 제13항에 있어서, 후속적으로 수성 매질의 pH를 약 5 내지 7로 조정하고, 생성된 포합체를 정제하는 것을 더 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 포합체를 한외여과를 통해 정제하는 방법.
  31. 제13항에 있어서,
    a) 덱스트란을 과요오드산나트륨과 반응시켜 부분 산화된 덱스트란을 제조하고,
    b) 폴리믹신 B 또는 그의 염을 약 9.3 내지 약 10의 pH 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수성 매질중에서 생성된 부분 산화된 덱스트란과 반응시키며,
    c) 생성된 수성 매질에 수소화붕산나트륨을 첨가하고,
    d) 생성된 포합체를 정제하는
    것을 포함하는, 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 염)의 제조 방법.
  32. 제1항에서 정의된 항내독소 활성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 제약상 허용가능한 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염) 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석액을 포함하는 제약 조성물.
  33. 전신 감염 반응 증후군 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료 처치에 사용하기 위한, 제1항에서 정의된 항내독소 활성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 제약상 허용가능한 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염).
  34. 제13 또는 31항의 방법으로 제조될 수 있는, 제1항에서 정의된 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염).
  35. 제13 또는 31항의 방법으로 제조된, 제1항에서 정의된 폴리믹신 B 또는 그의 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염).
  36. 전신 감염 반응 증후군 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료 처치용 약물의 제조에 있어서, 제1항에서 정의된 항내독소 활성을 갖는, 폴리믹신 B 또는 그의 제약상 허용가능한 염과 덱스트란과의 수용성 포합체 (또는 그의 제약상 허용가능한 염)의 용도.
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