SK157997A3 - Polymyxin conjugates - Google Patents
Polymyxin conjugates Download PDFInfo
- Publication number
- SK157997A3 SK157997A3 SK1579-97A SK157997A SK157997A3 SK 157997 A3 SK157997 A3 SK 157997A3 SK 157997 A SK157997 A SK 157997A SK 157997 A3 SK157997 A3 SK 157997A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dextran
- polymyxin
- salt
- conjugate
- pmb
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Vo vode rozpustné konjugáty polymyxínu B a dextránu alebo ich soli majú protiendotoxínovú aktivitu väCšiu ako nekonjugovaný polymyxín B. Môžu sa pripraviť reakciou polymyxínu B alebo jeho soli s dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10 a pri teplote od asi 30 °C do asi 35 °C.
Konjugáty, spôsob ich prípravy a farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu prípravy vo vode rozpustných konjugátov (alebo ich solí) polymyxínu B (PMB) alebo jeho solí a dextránu, pričom sa polymyxín B alebo jeho soli nechajú reagovať s dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10, prednostne od asi pH 9,5 do asi pH 9,7, pri teplote od asi 30° do asi 35eC, prednostne okolo 32°C. Výhodný variant spôsobu zahrňuje reakciu síranu polymyxínu B s oxidovaným dextránom pri teplote asi 32°C, pri ktorej dôjde k vytvoreniu kovalentnej väzby medzi polymyxínom B a dextránom amínovou väzbou. Zlepšené konjugáty alebo ich soli pripravené spôsobom podľa vynálezu sa môžu ľahko a reprodukovateľné pripraviť. Tieto konjugáty sa vyznačujú významne zlepšenými farmakologickými vlastnosťami, ako väčšou účinnosťou a väčšou proti-endotoxínovou aktivitou v porovnaní s nekonjugovaným polymyxínom B.
Vynález sa tiež týka vo vode rozpustných konjugátov alebo ich solí, obsahujúcich polymyxín B alebo jeho soľ a dextrán, tieto konjugáty alebo ich soli majú proti-endotoxínovú aktivitu väčšiu ako nekonjugovaný polymyxín B.
Doterajší stav techniky
V medicíne je všeobecne uznávaná potreba účinnej terapie syndrómu multiorgánového zápalového zlyhania (SIRS) a septického šoku. Vysoký počet pacientov, presahujúcich 100 000 kritických prípadov syndrómu multiorgánového zápalového zlyhania a septického šoku vo vyvinutých krajinách vyžaduje okamžitú terapiu a takmer 1 milión pacientov, ohrozených vysokým rizikom sepsy by mohlo mať z profylaxie úžitok.
Na základe velkého počtu štúdií na ľuďoch i na zvieratách je endotoxín považovaný za hlavný iniciátor/primárny mediátor patogenézie syndrómu multiorgánového zápalového zlyhania a dáva vedecké zdôvodnenie sepse. Endotoxíny alebo molekuly prechádzajú z proti-endotoxínovému prístupu k lipopolysacharidy sú štruktúrne bunkových stien gram-negatívnych baktérií. Vnesené do krvného riečišťa môžu byť prekážkou regulácie telesnej teploty a spôsobovať horúčku. Ich toxické účinky vedú k srdcovým, pľúcnym alebo ľadvinovým zlyhaniam. Choroby spôsobené endotoxínmi sú hlavnými príčinami úmrtia pacientov, umiestnených na jednotkách intenzívnej starostlivosti .
PMB je jediné antibiotikum, ktoré je schopné neutralizovať endotoxín tak, že sa naviaže na lipidovú časť A endotoxínovej molekuly. PMB z Bacillus polymyxa (B.aerosporus) je vysoko nabitý amphiphilický cyklický peptidolipid. Je použiteľný tiež proti plesňovým infekciám, zvlášť u pacientov so zníženou imunitou. Pre niektoré svoje vlastnosti však nie je PMB ideálnym antibiotikom. Po prvé, je to krátky polčas v organizme, ktorý vyžaduje, ak má byť antibiotikum účinné, opakované podávanie. Po druhé, pri priechode ľadvinami môže spôsobiť ich rozsiahle poškodenie. Po tretie, vysoké dávky majú neurotoxické vlastnosti spôsobujúce zástavu dychu.
Už skôr konjugovali výskumníci PMB k imobilizovaným alebo fixovaným molekulám, viď napr. Issekutz, J.Immunol. Methods 61. (1983) 275-281, opisujú imobilizácie konjugáciou PMB na Sepharosu. Tieto konjugáty, hoci sú použitelné pri purifikačných postupoch, sa nehodia na terapeutické použitie in vivo.
Spôsob, ktorý vedie k dosiahnutiu farmakologickej aktivity, predĺženiu pôsobenia alebo zníženiu orgánovej toxicity zahrňuje konjugáciu liečiv s vysokomolekulárnymi molekulami ako sú dextrán, polyetylénglykol alebo polyvinylpyrolidín. Pokusy v tomto smere s konjugáciou s polymérmi sa však stretli s obmedzeným úspechom. Napríklad, konjugovaná forma prokaínamidu (antiarytmické liečivo) bola menej aktívna a vykazovala kratší polčas pôsobenia ako natívny prokaínamid (Schacht a spol., Ann N.Y., Acad.Sci. 416. (1985) 199-211).
Podobne analóg prostaglandínu B245 naviazaný na nosič bol menej aktívny (o niekoľko radov) ako natívna molekula (Bamford a spol., Bioch.Biophys.Acta 886. (1986) 109-118). Zníženie biologickej účinnosti bolo tiež opísané pri konjugovaných formách kalikreínu, aprotinínu, bradykinínu (Odya a spol., Biochem. Pharmacol. 27, (1978) 173-179), protinádorové liečivo daunorubicín (Hurwitz a spol., A.Appl.Biochem. 2,(1980)25-35), a mytomycín C (Takakura a spol., Cancer Res.44,(1984) 25052510). Konjugované enzýmy majú tiež zníženú biologickú aktivitu spôsobenú stérickou zábranou a zníženou dostupnosťou substrátu (Blomhoff a spol., Biochem.Biophys.Acta 757, (1983) 202-208; Marshall a spol., J.Biol.Chem. 251, (4) (1976) 10811087, R.L.Foster, Experimentia 31, (7)(1975) 772-773, Wileman a spol., J.Pharm. Pharmacol. 35, (1983)762-765). V niekoľkých prípadoch však dochádza po konjugácii k zlepšeniu obehového polčasu (Wileman, supra; Kaneo, Chem.Pharm.Bull. 37 (1)(1989) 218-220). ' · .
Bolo potrebné vyvinúť formu PMB, ktorá by zostala dlhšie v krvnom riečišti a/alebo nemala v terapeutických dávkach neuro- a nefrotoxické účinky. UPS 5 177 059 a jeho ekvivalenty v iných krajinách, ako EP 428 486 opisujú konjugáty polymyxínu B s polysacharidmi ako s dextránom alebo hydroxyetyl škrobom, bielkovinami ako je albumín, a polymérmi, ako je polyvinylpyrolidón, polyetylénglykol a polyvinylalkohol. Tento vynález opisuje špecifický spôsob chemickej konjugácie polymyxínu Bas dextránom uskutočňujúcej sa pri teplote miestnosti (tzn. asi 25θΰ alebo menej) a pH 8,5-9,0. Konjugáty opísané vo vynáleze sú menej toxické ako nekonjugovaný polymyxín a majú proti -endotoxí novú aktivitu, ktorá nie je jasne definovaná, ale sa zdá byť menšia alebo sa rovná vlastnostiam nekonjugovaného polymyxínu B.
Spôsob prípravy podľa predloženého vynálezu zlepšuje spôsoby opísané v hore uvedených patentoch a zaisťuje prípravu konjugátov alebo ich solí, polymyxínu B alebo jeho solí, majúce prekvapivo zlepšené charakteristiky v porovnaní so známymi PMB-dextránovými protiendotoxínovú aktivitu lepšiu účinnosť, lepšiu farmakologické vlastnosti.
konjugátmi, zvlášť väčšiu ako nekonjugovaný polymyxín B, reprodukovateľnosť a lepšie
Zvlášť prekvapujúce je, že nové
PMB-dextránové konjugáty alebo ich soli, podľa tohoto vynálezu majú porovnateľne a reprodukovateľné väčšiu proti-endotoxínovú aktivitu ako nekonjugovaný PMB. Dôvody na tieto neočakávané nové charakteristiky nie sú na molekulárnej úrovni jasne zrejmé, je však pravdepodobné, že pri reakčných podmienkach, ktoré sú v predkladanom vynálezu použité, zmena pH mení distribúciu protónov bázických postranných reťazcov. Pri vyššom pH jedna alebo viac aminoskupín sa najskôr stane lepšie prístupnou naviazaním reduktívnou amináciou. Pretože každá z amínových skupín má charakteristickú hodnotu pKa, vyššie pH uvoľňuje vždy rovnaký amín. Ak je tento amín obzvlášť vhodný na naviazanie (z pohľadu účinku konjugátu) vznikne lepšia forma konjugátu, pretože výberový spôsob naviazania sa podieľa na celkovej štruktúre. Štruktúra prepožičiava konjugátom porovnateľne dobre reprodukovateľnú hladinu aktivity, ktorá je vyššie ako hladina aktivity natívneho PMB, tzn. 125% alebo viac aktivity ako natívny PMB.
Podstata vynálezu
Podstata vynálezu spočíva v zlepšenej príprave vo vode rozpustných konjugátov alebo ich solí polymyxínu B a dextránu, použiteľných na liečenie plesňových a bakteriálnych infekcií a zabraňujúcich vzniku ochorení spôsobených bakteriálnymi endotoxínmi. Vynález sa týka najmä prípravy vo vode rozpustných konjugátov polymyxínu B a dextránu, alebo ich solí, reakciou polymyxínu B alebo jeho soli s dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10 a teplote od asi 30° do asi 35°C. PMB je peptidové antiobiotikum a osvedčený farmaceutický prostriedok s miernou antibiotickou aktivitou. Je klinicky používaný miestne alebo parenterálne viac ako 40 rokov. Vznik bakteriálnej rezistencie k PMB je veľmi zriedkavý
PMB viaže endotoxín silou asi 10-eM a je schopný zrušiť biologické pôsobenie endotoxínov všetkých klinicky dôležitých gram-negatívnych baktérií veľkého počtu modelov in vitro a in vivo. In vitro sa používa ako štandard na neutralizáciu endotoxínov. Naviac, in vivo, chráni PMB proti patológii bakteriálnych sepsí na mnohých modeloch pri acidóze, hypotenzie a bakteriálnych sepsách a zabraňuje úmrtiam vplyvom gram-negatívnej sepsy u psov, králikov, potkanov a myší. Účinne tiež bráni vzniku sepsy u ľudí, ako sú popálení pacienti.
PMB použitý na prípravu konjugátov v predkladanom vynáleze je komerčne dostupný. PMB sa môže pripraviť fermentáciou Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula. PMB sa skladá zo zmesi niekoľkých príbuzných dekapeptidov. PMB alebo jeho farmaceutický prijateľné soli sú vo vynáleze použité (ako síran polymyxínu B a podobne).
Na prípravu látok uvedených v tomto vynáleze sa môže použiť ktorýkoľvek farmaceutický vhodný dextrán. Na dosiahnutie kovalentnej väzby peptidov je výhodné dextrán chemicky modifikovať napr. oxidovať oxidačným činidlom, napr. jodistanom sodným. Priemerná molekulová hmotnosť dextránu je výhodná od asi 25 000 do asi 500 000, výhodnejšia od asi 50 000 do asi 200 000, ešte výhodnejšia od asi 63 000 do asi 76 000. Molekulová hmotnosť môže byť stanovená napr. gélovou permeačnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Najvhodnejší dextrán sa pripravuje fermentáciou Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512). Obsahuje glukózové jednotky, ktoré sú spojené väzbami a(1-6)-väzbami do dlhých lineárnych reťazcov s približne 5% vetvením. 85% vetvených reťazcov obsahuje 1 až 2 glukózové jednotky, zostávajúcich 15% priemerne 33 jednotiek.
Všeobecný spôsob prípravy konjugátu PMB a dextránu vo vodnom prostredí je opísaný v USP 5 177 059 a je použitý v predloženom vynáleze. Prednostne je v predloženom vynáleze použitý čiastočne oxidovaný dextrán, pripravený pôsobením oxidačného činidla, ako je jodistan sodný (NaJ0A). Pri tomto postupe vznikajú oxidatívnym štiepením vicinálnych diolov glukózových monomérov aldehydy. Reakciou čiastočne oxidovaných dextránov s PMB, alebo jeho solí, vznikajú Schiffove bázy. Príprava konjugátov v tomto vynáleze vyžaduje starostlivú kontrolu pH počas reakcie PMB a dextránu, zvlášť počas vzniku Schiffovej bázy, od asi 9,3 do asi 10, výhodnejšie od asi 9,5 do asi 10, ešte výhodnejšie od asi 9,5 do asi 9,7. Hodnotu pH je najlepšie udržiavať borátovým pufrom, predovšetkým ak obsahuje tetraboritan sodný. Teplota vodného prostredia počas reakcie PMB a dextránu sa musí udržiavať od asi 30° do asi 35°C, lepšie asi 32°C. Následne vnesený borohydrid sodný (NaBH^) redukuje Schiffove bázy a zvyšné aldehydy a vytvára stabilné kovalentné väzby, prednostne medzi jednou alebo viacerými amínovými skupinami, medzi PMB a dextránom. Konjugáty sa výhodne čistia ultrafiltráciou napr. použitím membrán zadržujúcich látky s molekulovou hmotnosťou väčšou ako 10 000, kedy sa odstránia zvyšné PMB, anorganické medziprodukty (napr. boráty) a eventuálne nízkomolekulárne degradačné produkty. Pred čistením je lepšie nastaviť pH vodného média na hodnotu asi 5 až 7.
Výhodný spôsob prípravy v tomto vynáleze sa vyznačuje tým, že zahrňuje;
a) prípravu čiastočne oxidovaného dextránu reakciou dextránu jodistanom sodným;
b) reakcu polymyxínu B alebo jeho solí s pripraveným čiastočne oxidovaným dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10 a teplote od asi 30°C do asi 35°C;
c) pridanie borohydridu sodného do výsledného vodného prostredia ; a
d) čistenie vzniknutého konjugátu polymyxín B-dextrán.
Vynález sa týka vo vode rozpustných konjugátov alebo ich farmaceutický prijateľných solí polymyxínu B, alebo jeho
Ί farmaceutický prijateľných solí a dextránu, konjugáty majúce proti-endotoxínovú aktivitu väčšiu ako je proti-endotoxínová aktivita polymyxínu B, na použitie pri prevencii a liečení syndrómu multiorgánového zápalového zlyhania alebo septického šoku. Zahrňuje tiež také konjugáty alebo ich farmaceutický prijateľné soli, pripravené hore uvedeným spôsobom a konjugáty a ich farmaceutický prijateľné soli získané počas uskutočňovania uvedeného postupu, farmaceutické liečivé prípravky, obsahujúce vo vode rozpustné konjugáty (alebo ich farmaceutický prijateľné soli) polymyxínu B alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli a dextrán ako je uvedené hore; spoločne s najmenej jedným farmaceutický prijateľným nosičom alebo prísadou a použitie týchto konjugátov alebo ich farmaceutický prijateľných solí na prípravu liečiv použiteľných na prevenciu alebo liečenie syndrómu multiorgánového zápalového zlyhania a septického šoku.
Pri spôsobe prípravy podľa tohoto vynálezu, rovnako ako v konjugátoch pripravebých podľa tohoto vynálezu, je molekulový pomer PMB alebo jeho solí k dextránu od asi 1:15 do asi 200:1, najlepšie od asi 1:2 do asi 1:5, najlepšie asi 1,5:5.
Soľ polymyxínu B je výhodne farmaceutický prijateľná soľ PMB. Konjugát sa považuje za vo vode rozpustný, ak jeho rozpustnosť je asi 25 mg/ml alebo väčšia pri 20°C; lepšie 50 mg/ml; najlepšie 65 mg/ml alebo väčšia pri 20°C.
Konjugáty PMB-dextrán a ich soli pripravené podľa vynálezu sa môžu použiť rovnakým spôsobom ako PMB samotný, menovite sa môžu použiť buď samostatne napr. ako antibiotikum pri bakteriálnych alebo plesňových infekciách alebo v kombinácii s inými bakteriálnymi a/alebo protizápalovými prostriedkami. Môžu sa podávať v akejkoľvek forme, ktorá je vhodná na podávanie natívnym PMB napr. intramuskulárne, intravenózne, intratekálne, subkonjuktiválne alebo miestne. Zloženie pre intramuskulárnu injekčnú formu obsahuje typicky účinné množstvo PMB-dextránového konjugátu alebo jeho farmaceutický prijateľné soli v sterilnej vode, fyziologickom roztoku alebo približne
1% prokaínu HCl. Zloženie pre intravenóznu injekčnú formu obsahuje typicky účinné množstvo konjugátu v sterilnej vode. Zloženie pre intravenózne použitie obsahuje typicky účinné množstvo konjugátu v 5% dextróze alebo vode. Zloženie pre intratekálne použitie obsahuje typicky účinné množstvo konjugátu vo fyziologickom roztoku. Na použitie v očnom lekárstve je účinné množstvo konjugátu zmiešané s vodou alebo fyziologickým roztokom a podľa výberu s glycerínom alebo síranom meďnatým na očné kvapky, alebo sa môže pridať do masti alebo suspenzie. Krémy na lokálne použitie, zvlášť na spálené miesta, obsahujú typicky účinné množstvá konjugátu PMB-dextrán alebo jeho farmaceutický prijateľné soli pridané do základu inaktívnych ingrediencií ako parafínový olej, propylénglykol, polyoxypropylén, a emulzifikujúci vosk.
Čistené konjugáty PMB-dextránu alebo jeho farmaceutický použiteľných solí podľa tohoto vynálezu sú v zásade nejedovaté. Množstvo konjugátu podľa tohoto vynálezu, ktoré má byť použité sa môže stanoviť podľa· množstva PMB, ktoré by sa použilo pre uvažovaného pacienta, s ohľadom na stav pacienta, jeho vek, hmotnosť a aktivitu príslušného konjugátu. Vzhľadom na zvýšenú účinnosť konjugátov, menšiu toxicitu a predĺženú dobu pôsobenia je možné zníženie dávky na polovicu alebo menej v porovnaní s natívnym PMB.
Molekulárne hmotnosti konjugátov podľa vynálezu sa môžu stanoviť napr. vysokotlakovou gélovou permeačnou chromatografiou (SEC-HPLC, TSK-GEL G4000 Pwxl, elúcia 40mM fosfátovým pufrom PH 4,4 a detekované laserovým rozptylom pri malých uhloch) a porovnaním s referenčnou vzorkou dextránu majúcim priemernú molekulovú hmotnosť 79 800. Konjugáty podľa tohoto vynálezu majú mať výhodne priemernú molekulovú hmotnosť od asi 55 000 do asi 80 000, výhodnejšie od asi 80 000 najlepšie od asi 63 000 do asi 76 000.
Zlepšené konjugáty podľa tohoto vynálezu sú lepšie reprodukovateľné, ako konjugáty pripravované skôr a majú väčšiu proti-endotoxínovu aktivitu ako nekonjugovaný polymyxín B.
Konjugáty podľa tohoto vynálezu majú zlepšenú proti-endotoxínovú aktivitu, najmä pomer ICeo nekonjugovaného polymyxínu B k IC=o konjugátov je väčší ako 1,0; výhodne väčší ako asi 1,25 alebo 1,3; prednostnejšie väčší ako asi 1,4. Použitie ICso tu znamená koncentráciu polymyxínu B, meranú stanovením metódou s použitím karbocyaninovým farbivom, ktoré ruší 50% posun absorbancie karbocyaninového farbivá pri 450 nm za prítomnosti 0,05 mg endotoxínu z E.coli. Aktivita (v %) je definovaná:
ICso nekonjugovaného polymyxínu B x 100 ICso konjugátu polymyxín B/dextrán
Stanovenie karbocyaninovým farbivom je biochemické stanovenie používané in vitro na stanovovanie proti-endotoxínových vlastností polymyxínu B a konjugátov pripravených podľa tohoto vynálezu. Toto stanovenie je modifikáciou skôr publikovaných uverejnení (Ogawa a Kanoh, Microbiol.Immunol. 28. (1973) 1313-1323; Zey a Jackson, Applied.Microbiol. 26.
(1973) 129-133) a bolo optimalizované na použitie mikrotitračných doštičiek. Pri tomto stanovení konjugát alebo nekonjugovaný PMB (pozitívna kontrola) konkuruje karbocyaninovému farbivu (malá kladne nabitá molekula, ktorá mení spektrofotometrickú absorbaciu pri väzbe na endotoxín) vo väzbe s endotoxínom.
Príprava roztokov na stanovenie pomocou karbocyaninového farbiva;
1) Pripravia sa roztoky 0,15 H octanu sodného a 0,15 M kyseliny octovej. Zmiešaním obidvoch sa získa 0,03 M octanový puf or (40,2 ml, 0,15 M octanu sodného a 159,8 ml 0,15 M kyseliny octovej).
2) 8,0 mg karbocyaninového farbiva sa rozpustí v 12,5 ml etylalkoholu. Tento roztok sa zriedi 37,5 ml octanového pufra. Výsledný roztok je 25% etanolický roztok s obsahom farbiva 160 pg/ml, ktorý musí byt uchovávaný v ľadovom kúpeli v tme a zmiešaný najmenej 30 minút.
3) Sériové riedenie PMB a každého konjugátu sa pripravuje v 40 mM fosfátového pufra (pH =7,4). Každé riedenie je 6x väčšie ako konečná stanovená koncentrácia.
4) Po sonikácii, E.coli 0111:B^ je endotoxín zriedený na 0,5 mg/ml fyziologickým roztokom, zo skôr pripraveného, zamrazeného zásobného roztoku s koncentráciou 1,0 mg/ml fyziologického roztoku.
Stanovenie na doštičkách sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom tak, že do priehlbín sa nanáša vzorka alebo pufor ako prvý;
a) blank: 100 μΐ fyziologického roztoku a 50 μΐ 40 mM fosfátového pufra (pH = 7,4), 3x paralelne;
b) pozitívna kontrola: 100 μΐ endotoxínu a 50 μΐ 40 nM fosfátového pufra (pH = 7,4), 3x paralelne;
c) PMB vzorky: 100 μΐ endotoxínu a 50 μΐ vzoriek PMB, 3x paralelne;
d) negatívne kontroly: 100 μΐ fyziologického roztoku a 50 μΐ vzoriek konjugátov, 3x paralelne;
e) stanovenie: 100 μΐ endotoxínu a 50 μΐ vzoriek konjugátov,
3x paralelne.
Doštičky sa niekoľko minút otáčajú. 150 μΐ farbiva sa pridá do každej priehlbiny, doštičky sa zabalia do fólie a nechajú na ľade v tme 60 minút. Obsah priehlbín sa premieša multikanálovou pipetou a ihneď sa stanoví absorpcia pri 450 nm na zariadení vyhodnocujúcom mikrotitračné doštičky. Výpočet IC sa uskutoční Reed-Muenchovou metódou.
Vynález ilustrujú nasledujúce príklady bez obmedzenia. Všetky teploty sú uvedené v stupňoch Celzia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
A) Oxidácia dextránu litrová, 4-hrdlová banka s okrúhlym dnom sa naplní 2,3 litrami vody na injekčné použitie a 150 g dextránu. Zmes sa mieša do rozpustenia pri 21°“24°C približne 140 otáčkami /min. Pridá sa roztok 3,9 g jodistanu sodného rozpusteného v 60 ml vody na injekčné použitie (mierne exotermné, približne 1°C). Lievik, ktorým sa pridávalo sa opláchne 30 ml vody na injekčné použitie. Výsledná zmes sa ponechá 1 hodinu pri 21°-24°C. Pomocou vákua sa roztok prefiltruje cez 0,22 μτα acetylcelulózovou filtračnou membránou Corning, zohreje sa na 30°-32eC a udržuje pri tejto teplote.
B) Príprava síranu polymyxínu B/borátový pufor
Tento postup sa začína 45 minút pred dokončením oxidácie dextránu, filtrácie a zahriatím viď A hore. 12 litrová 4-hrdlová banka s okrúhlym dnom sa naplní 3,00 1 borátového pufra pH 9,7, teplota pufra sa upraví na 32°C. Ďalej sa pridá 45 g síranu polymyxínu B a vzniknutá suspenzia sa mieša pri 32°C 45 minút. Zmeria sa pH zmesi (na začiatku 9,4) a upraví sa na 9,7 pri 32°C pridaním 30 ml 5 N NaOH.
Príprava borátového pufra: do vypálenej 5 litrovej 4-hrdlovej banky s guľatým dnom sa vnesie 114,3 g tetraboritanu sodného dekahydrátu a 2,906 litrov (2,9 kg) vody na injekčné použitie. Roztok sa zohreje na 32°C a pH sa upraví na 9,7 (pôvodne 9,3) prídavkom 37 ml 5 N NaOH. Roztok sa pomocou vákua sfiltruje cez sterilný acetylcelulózový membránový filter 0,22 Mm Corning s priemerom 90 mm a skladuje sa.
C) Reakcia sulfátu polymyxínu B s oxidovaným dextránom
Predhriaty (30°-32°C) roztok oxidovaného dextránu (podľa časti A) sa pridá čo najrýchlejšie do miešanej zmesi roztoku polymyxínu v borátovom pufri s teplotou 32°C (z časti B). Po pridaní sa zmeria pH (pôvodne 9,5) a upraví sa na 9,7 prídavkom 18 ml 5 N NaOH. Zmes sa mieša pri 32eC 1 hodinu. Do heterogénnej zmesi sa pridá 3,6 g borohydridu sodného v 50 ml vody na injekčné účely. Zmes sa mieša 2 hodiny pri 32°C. K zmesi sa pridá roztok 3,6 g borohydridu sodného v 50 ml vody. Preruší sa zohrievanie a reakčná zmes sa nechá za stáleho miešania ochladiť na teplotu miestnosti počas 14 hodín. pH reakčnej zmesi sa zmeria (10,0) a nastaví sa na 5,7 prídavkom 1,27 litrov 1 N HC1. Výsledná zmes sa mieša po okyslení 10 minút, pomocou vákua sa sfiltruje sterilným 0,22 pm acetylcelulózovým membránovým filtrom Corning; získa sa 6,8 litrov roztoku konju'gátu polymyxín B - dextrán, ktorý sa použije na čistenie.
D) Čistenie ultrafiltráciou »
Roztok konjugátu polymyxín B - dextrán (z časti C) sa čistí s použitím vopred upravenej ultrafiltračnej jednotky CH2PRS firmy Amicon s membránovou patrónou S1Y10. Vyčistený produkt sa vyberie z ultrafiltračnej jednotky a skladuje sa zmrazený na -25°C.
> Podľa analýzy má získaný konjugát nasledujúce charakteristiky;
* ICao = 16,8 pg/ml aktivita = 124,7 % obsah dextránu = 65,37 mg/ml celkový obsah polymyxínu B = 2,47 mg/ml obsah voľného polymyxínu B = 0,65 % pomer PMB; dextrán = 37,71 mg PMB/g dextránu
Ukázalo sa, že aktivita produktu získaného pri reakčnej teplote 32°C a pH 9,5 je asi 125 % aktivity nekonjugovaného PMB.
Príklad 2
Príprava uvedená v príklade 1 sa opakuje a získaný konjugát polymyxín B-dextrán má nasledujúce charakteristiky:
ICso =16,4 Mg/ml aktivita = 125,8 % obsah dextránu = 65,30 mg/ml celkový obsah polymyxínu B = 2,49 mg/ml obsah voľného polymyxínu B = 0,67 % pomer PMB:dextrán = 38,06 mg PMB/g dextránu
Konjugát získaný pri reakčnej teplote 32°C a pH 9,5 vykazuje 126 % aktivity nekonjugovaného PMB.
Príklad 3
Konjugáty polymyxínu B-dextrán boli pripravené postupom uvedeným v príklade 1 (výnimky sú označené) na stanovenie vplyvu teploty na reakciu medzi PMB a dextránom pri pH 9.,7. Stanovilo sa užitočné zaťaženie (mg PMB/g dextránu), priemerná ICso (Mg/ml), a aktivita (%).
Výsledky sú uvedené v tabuľke 1:
Tabulka 1: Vplyv teploty pri pH 9.7 (10 mg PMB; 0,65 g NalO^; 50 g dextránu)
| Vzorka č. | Teplota | Užitočné zaťaženie mg PMB/g dextránu | PriemerIC (Mg/mlT° | Aktivita (%) |
| 3a | 35° | 15,87 | 25,18 | 99,7 |
| 3b | 35° | 19,81 | 26,07 | 91,1 |
| 3c | 35° | 18,58 | 27,67 | 85,0 |
| 3d | 10° | 49,53 | 143,83 | 23,6 |
| 3e | 10° | 54,95 | 187,87 | 9,5 |
| 3f | 10° | 56,03 | 195,7 | 10,8 |
Z príkladu 3 je zrejmé, že znížením reakčnej teploty na 10°C, pri pH 9,7, sa získa produkt s nižšou aktivitou.
Príklad 4
Konjugáty polymyxínu B-dextrán sa pripravili postupom uvedeným v príklade 1 (výnimky sú označené na stanovenie vplyvu pH na reakciu medzi PMB a dextránom. Stanovilo sa užitočné zaťaženie (mg PMB/g dextránu), priemerná hodnota ICso (pg/ml) a aktivita (%) a výsledky sú uvedené v tabuľke 2:
Tabuľka 2: Vplyv pH pri teplote 32°C
| Príklad č. | PH reakcia | Užitočné zaťaženie (mg PMB/g dextránu) | PriemerIC (Mg/mlj° | Aktivita (%) |
| 4a | 4,0“’ | 2,36 | ND | ND |
| 4b | 5,0“’ | 14,34 | ND | ND |
| 4c | 7,0to’ | 15,26 | ND | ND |
| 4d | 7,0b’ | 16,09 | 164,4 | 11,0 |
| 4e | 8,0b) | 32,03 | 107,7 | 17,8 |
| 4f | 8,0b’ | 29,51 | 139,3 | 13,8 |
| 4g | 8,5°’ | 69,94 | 74,5 | 24,0 |
| 4h | 9,0°’ | 50,99 | 22,6 | 95,3 |
| 4i | 9,0°’ | 50,16 | 22,5 | 88,6 |
| 4j | 9,3°’ | 43,33 | 19,4 | 94,0 |
| 4k | 9,3°’ | 39,96 | 19,0 | 95,8 |
| 41 | 9,5°’ | 38,22 | 17,5 | 100,5 |
| 4m | 9,5°’ | 39,9 | 17,8 | 98,1 |
| 4n | 9,7°’ | 36,74 | 15,8 | 133,2 |
| 4o | 9,7°’ | 34,99 | 14,9 | 148,9 |
| 4p | 10,0°’ | 31,89 | 18,7 | 97,3 |
a) octanový pufor; b) fosfátový pufor; c) borátový pufor;
ND: nestanovené (vzorky sú príliš zriedené, nedá sa stanovit)
Hodnoty v tabuľke 2. ukazujú, že zníženie reakčnej teploty na 32°C pri pH medzi 9,5 a 9,7 umožňuje pripraví konjugáty, ktorých aktivita je lepšia ako aktivita nenaviazaného PMB (príklady 41, 4n a 4o), zatiaľ čo ďalšie zvýšenie pH na 10,0 nie je výhodné (príklad 4p).
Príklad 5
Pripravili sa konjugáty polymyxín B-dextrán ako v príklade 1 (výnimku sú uvedené) a merala sa ich protiendotoxínová aktivita. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3:
Tabuľka 3; Vplyv množstva PMB (1,3 g NalO^; pH 9,7; 32°)
| Príklad č. | Podmienky | Užitočné zaťaženie mg PMB/g dextránu | PriemerICso (Mg/ml)s° | Aktivita (%) |
| 5a | 15 g PMB | 36,74 | 15,8 | 133,2 |
| 5b | 15 g PMB | 34,99 | 14,9 | 148,9 |
| 5c | 15 g PMB | 33,81 | 17,6 | 109,0 |
| 5d | 20 g PMB | 46,06 | 19,7 | 121,5 |
| 5e | 20 g PMB | 44,63 | 29,5 | 115,5 |
Výsledky uvedené v tabuľke 3 ďalej potvrdzujú, že optimálne reakčné podmienky sú teplota asi 32°C a pH od asi 9,5 do asi 9,7.
Výsledky uvedené v príkladoch 1 až 5 ukazujú, že pri použití reakčnej teploty od asi 30°C do asi 35°C výhodne 32°C, a pH od asi 9,3 do asi 10, prednostne asi 9,5 do asi 9,7, sa môžu pripraviť zlepšené konjugáty podľa predloženého vynálezu.
7/ /W'-?/·
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (10)
1. Vo vode rozpustný konjugát alebo jeho soľ, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z polymyxínu B alebo jeho soli a dextránu a má proti-endotoxínovú aktivitu väčšiu ako je proti-endotoxínová aktivita nekonjugovaného polymyxínu B, teda pomer ICso nekonjugovaného polymyxínu B k ICso konjugátu je väčší ako 1,0.
2. Konjugát alebo júci sa tým, jeho soli k dextránu jeho soľ podľa nároku 1, vyznač uže molekulový pomer polymyxínu B alebo je od asi 1:15 do asi 200:1.
3. Konjugát alebo jeho soľ podľa nároku 1, v y z n júci sa týl, že· obsahuje dextrán s priemernou lovou hmotnosťou od asi 25 000 do asi 500 000.
a č u— moleku
4. Konjugát alebo jeho soľ podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje dextrán s priemernou molekulovou hmotnosťou od asi 63 000 do asi 76 000.
5. Konjugát alebo jeho soľ podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že má priemernú ' molekulovú hmotnosť od asi 63 000 do asi 76 000.
6. Spôsob prípravy vo vode rozpustných konjugátov alebo ich solí polymyxínu B alebo jeho soli a dextránu, vyznačujúci sa tým, že polymyxín B alebo jeho soľ sa nechá reagovať s dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10 a pri teplote od asi 30eC do asi 35eC.
7. Spôsob podľa nároku 6,vyznačujúci sa tým, že ako soľ polymyxínu B sa použije síran polymyxínu B.
8. Spôsob podľa nároku 6,vyznačujúci sa tým, že priemerná molekulová hmotnosť dextránu je od asi 63 000 do asi 76 000.
b
9. Spôsob podľa nároku 6, na prípravu vo vode rozpustného * konjugátu (alebo jeho soli) polymyxínu B alebo jeho soli a dextránu, vyznačujúci sa tým, že sa
a) pripraví čiastočne oxidovaný dextrán reakciou dextránu s jodistanom sodným;
b) polymyxín B alebo jeho soli sa nechajú reagovať s čiastočne oxidovaným dextránom vo vodnom prostredí pri pH od asi 9,3 do asi 10 a pri teplote od asi 30°C do asi 35°C, a potom sa
c) pridá boróhydrid sodný do vzniknutého vodného prostredia a
d) získaný konjugát sa vyčistí.
10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vo vode rozpustný konjugát, alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, polymyxínu B alebo jeho farmaceu• ticky prijateľnej soli a dextránu, pričom tento konjugát má proti-endotoxínovú aktivitu definovanú v nároku 1, spolu s
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/449,436 US5691304A (en) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | Improved process for preparing polymyxin B/dextran conjugates |
| PCT/EP1996/002256 WO1996037233A1 (en) | 1995-05-25 | 1996-05-24 | Polymyxin conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK157997A3 true SK157997A3 (en) | 1998-04-08 |
Family
ID=23784156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1579-97A SK157997A3 (en) | 1995-05-25 | 1996-05-24 | Polymyxin conjugates |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5691304A (sk) |
| EP (1) | EP0830147A1 (sk) |
| JP (1) | JPH11505216A (sk) |
| KR (1) | KR19990021926A (sk) |
| CN (1) | CN1185115A (sk) |
| AR (1) | AR004488A1 (sk) |
| AU (1) | AU711200B2 (sk) |
| BR (1) | BR9609130A (sk) |
| CA (1) | CA2219778A1 (sk) |
| CO (1) | CO4700478A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ288830B6 (sk) |
| FI (1) | FI974004A (sk) |
| HU (1) | HUP9801750A3 (sk) |
| IL (1) | IL118407A (sk) |
| NO (1) | NO975329D0 (sk) |
| NZ (1) | NZ309764A (sk) |
| PE (1) | PE5398A1 (sk) |
| PL (1) | PL323186A1 (sk) |
| RU (1) | RU2164149C2 (sk) |
| SK (1) | SK157997A3 (sk) |
| TR (1) | TR199701426T1 (sk) |
| TW (1) | TW426517B (sk) |
| WO (1) | WO1996037233A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA964210B (sk) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2263164A1 (en) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Southern Illinois University | Enhancement of antimicrobial peptide activity by metal ions |
| US20080287633A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Drumheller Paul D | Hydrogel Materials |
| US20180028684A1 (en) | 2010-11-01 | 2018-02-01 | Nanoderm Sciences, Inc. | Targeted nanoparticles |
| US9161962B2 (en) | 2010-11-01 | 2015-10-20 | Nanoderm Sciences, Inc. | Targeted therapeutic nanoparticles |
| EP2872120B1 (en) * | 2012-07-16 | 2017-05-03 | Nanoderm Sciences, Inc. | Therapeutic nanoparticles with a polymyxin b as targeting agent |
| CN115321819B (zh) * | 2022-08-15 | 2024-02-13 | 希诺股份有限公司 | 一种高钢化抗菌玻璃杯及其制造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2063326T3 (es) * | 1989-11-15 | 1995-01-01 | Sandoz Ltd | Conjugados de polimixina. |
| US5177059A (en) * | 1989-11-15 | 1993-01-05 | Sandoz Ltd. | Polymyxin B conjugates |
-
1995
- 1995-05-25 US US08/449,436 patent/US5691304A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-05-23 TW TW085106100A patent/TW426517B/zh active
- 1996-05-23 IL IL11840796A patent/IL118407A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-05-23 PE PE1996000379A patent/PE5398A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-24 PL PL96323186A patent/PL323186A1/xx unknown
- 1996-05-24 ZA ZA9604210A patent/ZA964210B/xx unknown
- 1996-05-24 NZ NZ309764A patent/NZ309764A/en unknown
- 1996-05-24 AU AU60007/96A patent/AU711200B2/en not_active Ceased
- 1996-05-24 CZ CZ19973721A patent/CZ288830B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-05-24 CN CN96194171A patent/CN1185115A/zh active Pending
- 1996-05-24 EP EP96917430A patent/EP0830147A1/en not_active Withdrawn
- 1996-05-24 CO CO96026735A patent/CO4700478A1/es unknown
- 1996-05-24 SK SK1579-97A patent/SK157997A3/sk unknown
- 1996-05-24 WO PCT/EP1996/002256 patent/WO1996037233A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-05-24 RU RU97120930/14A patent/RU2164149C2/ru active
- 1996-05-24 BR BR9609130A patent/BR9609130A/pt unknown
- 1996-05-24 HU HU9801750A patent/HUP9801750A3/hu unknown
- 1996-05-24 CA CA002219778A patent/CA2219778A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-24 KR KR1019970708401A patent/KR19990021926A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-05-24 JP JP8532821A patent/JPH11505216A/ja active Pending
- 1996-05-24 TR TR97/01426T patent/TR199701426T1/xx unknown
- 1996-05-24 AR ARP960102707A patent/AR004488A1/es unknown
-
1997
- 1997-10-20 FI FI974004A patent/FI974004A/fi not_active Application Discontinuation
- 1997-11-20 NO NO975329A patent/NO975329D0/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO975329L (no) | 1997-11-20 |
| PE5398A1 (es) | 1998-02-16 |
| CO4700478A1 (es) | 1998-12-29 |
| PL323186A1 (en) | 1998-03-16 |
| CA2219778A1 (en) | 1996-11-28 |
| FI974004A0 (fi) | 1997-10-20 |
| EP0830147A1 (en) | 1998-03-25 |
| CZ288830B6 (cs) | 2001-09-12 |
| HUP9801750A3 (en) | 1998-12-28 |
| MX9709003A (es) | 1998-03-31 |
| BR9609130A (pt) | 1999-02-23 |
| US5691304A (en) | 1997-11-25 |
| IL118407A0 (en) | 1996-09-12 |
| AR004488A1 (es) | 1998-12-16 |
| WO1996037233A1 (en) | 1996-11-28 |
| CN1185115A (zh) | 1998-06-17 |
| ZA964210B (en) | 1997-11-24 |
| TR199701426T1 (xx) | 1998-02-21 |
| AU6000796A (en) | 1996-12-11 |
| TW426517B (en) | 2001-03-21 |
| KR19990021926A (ko) | 1999-03-25 |
| RU2164149C2 (ru) | 2001-03-20 |
| NZ309764A (en) | 1999-04-29 |
| HUP9801750A2 (hu) | 1998-11-30 |
| FI974004A (fi) | 1997-11-25 |
| NO975329D0 (no) | 1997-11-20 |
| CZ372197A3 (cs) | 1998-03-18 |
| IL118407A (en) | 2000-10-31 |
| JPH11505216A (ja) | 1999-05-18 |
| AU711200B2 (en) | 1999-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4228052B2 (ja) | 水溶性ポリエン複合体 | |
| US5177059A (en) | Polymyxin B conjugates | |
| AU2017265005A1 (en) | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins | |
| AU639952B2 (en) | Polymyxin conjugates | |
| KR100354944B1 (ko) | 제약조성물 | |
| KR20120073196A (ko) | 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화 | |
| JP2022058911A (ja) | 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化 | |
| WO1990015628A1 (en) | Polymer/antibiotic conjugate | |
| CA2625426A1 (en) | Dextran and arabinogalactan conjugates of therapeutically active compounds | |
| SK157997A3 (en) | Polymyxin conjugates | |
| KR20010032128A (ko) | 항생제 및 독소결합성 올리고사카라이드 조성물을사용하여 세균성 이질을 치료하는 화합물 및 방법 | |
| MXPA97009003A (en) | Cojugados de polimix |