TW426517B - A process for producing a conjugate of polymyxin B and dextran - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 4 265 17 A7 _B7__五、發明説明（1 ) 本發明係有關一種水溶性多肽徽素B(PMB)或其鹽類 與葡聚醣（dextran)之共軛物（或其鹽類）的製備方法，其 包括多肽徽素B (polymyxin B)或其鹽類與葡聚醣在水 性介質內，於pH為約9.3至約10,較佳為約9.5至約9.7, 而溫度為約30 °C至約35 °C，較佳為約32 °C反應而成。較 佳的方法變化為多肽徽素B硫酸鹽與氧化的葡聚醣在溫度 為約32°C反應，使多肽徽素B分子經由胺鍵共價地接到葡 聚醣。此種經改良的共軛物（或其鹽類）較佳係依本發明方 法製成者，為容易地和不變地再現並顯示明顯地改良的藥 理性質，諸如，與未共軛的多肽徽素B的抗内生毒素活性比 較，其具有較高的力價和更大抗内生毒素活性。 本發明亦包括水溶性共軛物C或其鹽類），其包括多肽 徽素B或其鹽類和葡聚醣，該共軛物（或其鹽類）比未共轭多 肽徽素B的抗內生毒素活性具有更大的抗內生毒素活性。 基於全身性發炎反應症候群（SIRS)和敗血性休克之 有效治療為醫學所上需要，廣泛地被認知及病患基礎甚 大。在已開發國家超過1 00,000 SIRS/敗血症病危病例 需要急性治療，以及接近100萬具有敗血症高危險性的病 患可經由預防得到益處。 内生毒素被認為是SIRS /敗血症的病理發生過程的 主要起始因子/初級介體，此由大量的人體及動物研究獲 得結論，因此對於抗內生毒素所趨使之敗血病，提供一種 清楚的科學理論基礎。內生毒素或脂質多醣類為結構的分 子係衍自革蘭氏陰性細菌之細胞壁。當它們進入血流内， 5 (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 426517 A7 _ B7_ 五、發明説明（2 ) 它們將干擾體溫之調節並引起發燒。它們亦具有一種毒性 效應，導致心臓，肺臟及腎臟衰竭。內生毒素相關疾病為 加護病房病人主要的死因。 在抗生素中奇異的為PMB中和内生毒素之能力，係結 合至内生毒素分子之脂質A區所完成。PMB來自產氣桿菌 [Bacillus ρ ο 1 v m v x a ( B . a e r o s p o r u s )]為一種高度 電荷的親油親水性環狀肽脂質。它亦有用於對付各種的真 菌感染，特別是這些產生於免疫減弱的個體。然而，P MB 具有一些特性使其低於一種理想的抗生素。第一，它在體 内具有短的半衰期，需要重複地給予藥劑，俾使之有效。 第二，當它通過腎臟，將會引起嚴重的損害。第三，在高 劑量時，它具有神經毒性，將會引起呼吸麻痺。 先前的，研究具有共軛的PMB以固定化或固定分子， 參照 Issekutz，J . Immunol. Methods 61 ( 1983) 275-28 1，揭示PMB結合至Sepharose °這些共軛物， 係有用於純化技術，但是不適合供生體内（in νίνοΊ治療 的用途。 為了達到藥理學活性，增長持續時期間，或降低器官 毒性，曾有將藥物與巨大分子量之高分子，諸如葡聚醣， 聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮進行共軛結合。而試圖在聚合 物共範作用的領域中僅有少數成功。例如，procainamide( — 種抗心律不整藥物）之共輥形式為比原來procainamide 具有較低活性並顯示較短的半衰期（Schact等人，Ann N . Y.. Acad . Sc i. 4 16 [ 1 985] 199-211)。同樣地 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） ----:--,----^------iT------Λ (請先閲讀背面之注意♦項再填寫本頁> 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 426517 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（3 ) 前列腺素同系物 B245 ( prostaglandin analog B 2 4 5 )連接 到載體，比原來分子具有較低的功效（藉由數個大小之數 級)(Bamford 等人， Bioch.Biophvs.Acta 8 8 6 [1986] 109-118) 。kallikrein，aprotinin, bradykinin 之共軛形式，其生物學力價降低亦曾經被揭示（Odya等人， Biochem.Pharmacol. 2 7 [ 1 9 7 8] 1 73-1 79)，抗腫 瘤藥物 daunorubicin (Hurwitz等人，J.Appl.Biochem. 2 [1980] 25-35)，和 mitomycin C (Takakura 等人， Cancer Res. 44 [ 1 984] 2505-2510)-共軛的酶亦 由於立體阻礙及降低受質的接受性而使生物活性降低 (Blomhoff 等人，Biochem.Biophvs. Acta 757 Γ 1 9 8 3 1 2 0 2-208; Marshall 等人，J.Biol.Chem. 2 5 1 ί 4 ) [ 1 9 7 6 ] 1081-1087; R . L . Foster, Experimentia 3 1 ( 7) [ 1 9 75 ] 772-773; Wileman 等人，J.Pharm. Pharmacol . 3 5 Γ 1 9 8 3 1 762-765) ° 然而，有些在共 軛作用後，改良循環的半衰期之實施例（Wileman, p r s u a : K a n e ο , Chem.Pharm.Bull. 3 7( 1 ) [ 1 9 8 9 ] 218-220)° 有人意圖發展一種PMB形式，它將在血流内停留較長 時間和/或在治療使用劑量不會具有神經或腎臟毒性。美 國第5 ,1 77,059專利案及它在其他國家之同等物，諸如歐 洲專利428486號曾經揭示有關多醣類；諸如葡聚醣或羥 基乙基澱粉，蛋白質諸如白蛋白，以及聚合物諸如聚乙烯 基吡咯烷酮，聚乙二醇和聚乙烯醇等形式的多肽黴素共軛 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐> (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) r

T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 426517 A7 B7 五、發明説明（4 ) 物。該專利特別地揭示一種多肽徽素B與葡聚醣之化學共轭 作用過程，係藉由材料在週遭溫度（諸如，約25 °C或以下） 和pH8.5-9.0反應而成。在該專利所掲示的共軛物比未共 軛的多肽徽素B低毒性，而有關抗內生毒性則未被清楚地定 義，但是，其顯示出，低於或相等於未共軛的多肽徽素B。 本發明方法係為該專利所述製法之改良，並提供多肽 撇素B或其鹽類和葡聚醣之共軛物（或其鹽類〕，與習知 PMB-葡聚醣共軛物比較，驚異地發現，具有改良的特性， 尤其是，比未共軛的多肽微素B具有較大的抗內生毒素活 性，較高的力價，較佳的再現性和改良的藥理學活性。特 別地驚奇，本發明之新穎PMB -葡聚醣共軛物（或其鹽類） 比未共軛PMB具有安定性及可再現地較大的抗內生毒活 性·同時，此種不可預期新穎特性的分子基礎並不十分明 瞭，其可能是，在本發明所使用的反應條件，在共軛物之 製備中，pH改變使基本的側鏈上的質子分布變化。在較高 的pH，一個或更多的側鏈胺基可變成更容易被葡聚醣經由 遺原性胺化反應予以接合。因而，當每一側鏈胺基將具有 一種特別的PKa，較高的pH每次將釋出相同的胺。假使胺 供以一種特殊地有利的接合（由共軛物之力價觀點），然後 較佳的共軛物形式生成，因為特殊的接合途徑對整體構造 有貢獻。此構造提供共軛物在一種安定的再現形式，在活 性的水準比原來PMB活性的水準更高，諸如為原來PMB活 性之1 2 5 %或以上。 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） ----：--；----^-------1T------Λ ·-I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 426517 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) 本發明係有關一種製備一種水溶多肽徽素B和葡聚醣 共鈪物（或其鹽類）的改良方法，其用於治療真菌和細菌感 染以及防止細菌内生毒素所引起的疾病。尤其是，本發明 係有關一種製備水溶性多肽徽素B/葡聚醣共軛物（或其鹽 類）的製法，其包括多肽徽素B或其鹽與葡聚醣在水性介質 於pH為約9.3至約10，而溫度為約30°C至約35 °C反應。 PMB為一種肽抗生素及被認可的藥劑具有中度的抗生素活 性。曾經在臨床使用達40年以上，係供局部及非經腸道的 使用。PMB之細菌耐性的發展非常稀少。PMB結合内生毒 素具有親和力為約106M在大量的生體外和生體內的模式 中，可由所有臨床重要的革蘭氏陰性細菌中和内生毒素之 生物效應。在生體外，其曾被用於當一種中和内生毒素的 標準。再者，在生體內，PMB在很多動物模式的細菌敗血 症有保護減少病理機制的作用，諸如在腸道細菌感染所引 起的酸血症和低血壓及革蘭氏陰性菌敗血症在狗、兔、鼠 和老鼠當中引起的死亡。它在預防人類敗血症諸如燒傷病 患亦具有潛力。 PMB被使用以便製備本發明共軛物為商場上可取得 者。PMB 可藉由桿菌 Bacillus polymvxa (Prazmowski) Mi gula之發酵作用所製成PMB包括一些相關的十肽之 混合物。PMB或其一種藥學上可接受的鹽類被用於本發明 (諸如多肽徽素B硫酸鹽或其同類）。 使用於本發明製法之葡聚醣可為任何傳統的藥學上可 接受:的葡聚醣。較佳的葡聚醣為化學改質之共軛鍵合至肽 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） I--：--：----^------^--------β - . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 A7 ___ B7_ 五、發明説明（6 ) 類，諸如以一種氧化劑，諸如過捵酸鈉予以氧化。葡聚醣 較佳為具有重量平均分子量為約25,000至約500,000 ; 更佳為約50,000至約200,000 ;最佳為約63,000至約 76,000。分子量之測定，諸如，係使用凝膠滲透高效液體 層析法為之。最佳的葡聚酿為製自Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512)之發酵作用。其包括 葡萄糖單元，係為α[1-6]鍵連接於長鏈具有大約5 % α [1-3]分歧。在分歧鏈中，大約85%具有1至2葡萄糖單元 而其餘15 %平均為33單元。 在水液介質中製備ΡΜΒ及葡聚醣共軛物之一般製備方 法，如美國第5, 1 77,059號專利案所揭示者，可應用於本 發明。在本發明之較佳具體内容，部份氧化的葡聚醣係藉 由與一種氧化劑，諸如過碘酸鈉（Nal04)反應所製備。此 種處理使醛類經由在葡萄糖單體之相鄰二醇類之氧化性裂 解。將部份地氧化的葡聚醣曝露於P MB或其鹽類，而形成 西弗氏（Schiff‘s)鹽基。在本發明範疇內製備共軛物之在 PMB與葡聚醣反應期間，特別是西弗氏鹽基生成階段，需 要細心地控制pH為由約9.3至約10，較佳為由約9.5至約 10，更佳為由約9.5至約9.7。pH較佳係使用一種硼酸鹽 緩衝液，特別是含有四硼酸鈉予以維持。又水液介質之溫 度係保持在由約30 °C至約35 °C，更佳為ΡΜΒ或其鹽類與 葡聚醣反應溫度較佳為32°C。隨後置入氫硼化鈉（NaBH4) 還原西弗氏鹽基並保持醛類以提供安定性，共價鍵連結， 較佳是在PMB與葡聚醣之間經由一個或一個以上的胺鍵為 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〖0X297公釐） ----:--：----^------1T------A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 426517 A7 B7 _ 五、發明説明（7 ) 之。共轭物較佳以超微過遽法（ultrafiltration)精製， 諸如使用10,000分子量截除薄膜，以移除殘留的PMB， 無機性副產物（諸如，硼酸鹽〕和主要的低分子降解產物。 水液介質之pH在精製前較佳調節至約5至7。 因此，本發明製法之較佳内容為包括； U)藉由葡聚醣與過碘酸鈉反應，以製備部份地氧化的 葡聚醣； (b) 多肽黴素B或其鹽與所生成部份地氧化的葡聚醣 在一種水液介質内，在pH為由約9.3至約10，而溫度為由 約3 0 °C至約3 5 °C，予以反應； (c) 氫硼化鈉添至所生成的水性介質；以及 (d) 精製所生成多肽徽素B-葡聚醣共軛物。 本發明亦包括多肽黴素B或其藥學上可接受的鹽和葡 聚醣之水溶性共軛物（或其藥學上可接受的鹽類），該共軛 物具有抗内生毒素活性比未共軛的多肽徽素B的抗内生毒 素活性更大，俾用於預防或治療全身性發炎反應症候群和 敗血性休克。其亦包括此種共軛物（或其藥學上可接受的鹽 類），係獲自上述所定義之製法，和此種共軛物（及其藥學 上可接受鹽類），其當獲自上述所揭示之製法者；藥學組成 物包括一種如上述所定義之多肽黴素B或其藥學上可接受 鹽類與葡聚醣的水溶性共軛物（或其藥學上可接受鹽類）以 及一種藥學上可接受的載體或稀釋劑；和這些共軛物〔或其 藥學上可接受鹽類）使用於製備一種醫藥品以便用於預防 或治療全身性發炎反應症候群及敗血性休克。 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X四7公釐） ---：--：----t------IT------Λ . " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 2 6517 A7 B7 _ 五、發明説明（8 ) 在本發明的方法，以及其所製備的共軛物，PMB或其 鹽與葡聚醣之分子比為由約1:15至約200:1;更佳為由約 1:2至約1:5 :最佳為約1.5:5。 一種多肽徽素B之鹽類較佳為一種PMB之藥學上可接 受的鹽。 一種共軛物被視為水溶悭，假使在20°C於水中之溶解 度為約25毫克/毫升或以上；較佳為約50毫克/毫升或以 上；更佳為約60奄克/毫升或以上；最佳為約65毫克/毫 升或以上。 依本發明所製得之PMB -葡聚醣共軛物（及其鹽類）的 使用可依如同PMB本身相同的方式使用，意即，它們可以 單獨使用，諸如，作為一種細菌性或真菌性感染之抗生素， 或與其他殺菌劑和/或抗發炎劑併用。它們可以任何形式 給予，如同原本PMB方便地給予，諸如，肌肉注射，靜脈 注射，脊椎內注射，結膜內用藥或局部地給予。以此配方 供肌肉注射典型地包括一種有效量的PMB -葡聚醣共轭物 (或其藥學上可接受鹽類）在無菌水，生理食鹽水或大約地 1 %普羅卡因.H C1。靜脈內注射配方典型地包括一種有效 量的共軛物在5 %右旋糖及無菌水。脊椎內注射配方典型地 包括一種有效量的共軛物在生理食鹽水內。供局部地眼 用，一種有效量的共軛物可與水或生理食鹽水混合，和任 意地甘油及硫酸銅混合供作點眼劑，或其可製成一種軟膏 或懸浮液。乳膏，供局部地使用，特別在灼傷區域使用， 典型地包括有效量的ΡΜΒ-葡聚醣共軛物（或藥學上可接受 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1^ [ t .n n H ϋ n I n n n I ^ n n n ~, I n --. (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) 4 2651 7 A7 B7 經濟部_央標隼局員工消费合作社印製 五、發明説明（9 ) 的鹽〕置入無活性組成份之基質，諸如液體礦脂，丙二醇’ 聚氧乙烯，聚氧丙烯和乳化臘。 本發明之所精製的PMB-葡聚醣共軛物（或其藥學上可 接受鹽類）為主要地無毒性。本發明共軛物之使用童係基於 特殊病患所需原來的PMB之童，考慮因素如治療情況，年 齡和體重，和使用特別的共軛物之活性而決定。與原來的 PMB比較，劑量將減用一半或以上，其係由於共軛物之活 性有地增加，而降低的毒性和其活性之期間增加所致。 本發明共轭物之分子量得以測定，諸如，使用粒子排 阻高速液體層析法（SEC-HPLC，TSK-GEL G4000 PWxl，以40mM磷酸緩衝液在pH4.4溶離，用低角度雷 射光散射偵測），以葡聚酷標準品具有重量平均分子量 (MW) 79,800作基準。本發明共軛物較佳具有重量平均分 子量為由約55,000至約80,000 ;更佳為由約60,000至 約80,000;最佳為由約63,000至約76,000 ° 本發明所改良的共轭物具有較佳的再生性超過先前技 藝的共轭物，其具有抗内生毒素活性比未共軛物的多肽徽 素B更大。本發明的共轭物具有改良的抗內生毒素活性，意 即，未共轭的多肽徽素B之IC5。；對本發明共軛物之IC5()之 比例大於1.0;較佳大於約1.25或1.3;更佳為大於1.4。 在此所用之IC5。意指多肽黴素B之濃度以一種羰花青 (carbocyanine)染料分析法，其在0.005毫克來自大腸 菌〔E· coli)之內生毒素存在下，在450nm羰花青染料之 13 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---·--^----裝---. . I (請先閲讀背面之注意事項再士寫本頁) 訂 -泉 經濟部中央標隼扃員工消費合作杜印裝 4 265 1 7 A7 _B7_____ 五、發明説明（10 ) 吸光度位移被減除5 0 %予以測定。在此所用之活性（％〕的 定義如下： 未共軛物的多肽黴素B之ICS。 ______ X 1 0 0 多肽徽素B/葡聚醣共轭物之ic5。 羰花青染料分析法為一種生體外生化學分析法，俾用 來測定多肽徽素B和本發明共軛物之抗内生毒素特性。此分 析法法由先前報告（Ogawa and Kanoh/ Microbiol. Immunol. 2 8 [ 1 9 84] 1313-1323; Zey and

Jackson，Applied Microbiol. 26 [1973] 129- 133)改良而來，而最完善則係使用微力價平板。在此分析 法共軛物或未共軛的PMB〔正對照組）與羰花青染料（一種 小陽離子化合物，當與内生毒素結合時光亮比色法吸光度 的變化）以便内生毒素比對。 羰花青染料分析用試劑之配製如下： 〔1〕一種0.15M乙酸鈉溶液和0.15M乙酸溶液配製 之。該二種合併（40.2毫升的0.15M乙酸鈉和159.8毫升 的0.15M乙酸）以製備一種0.03M乙酸緩衝液。 (2)8.0毫克羰花青染料溶解於12.S毫升的乙醇。在 此用37.5毫升乙酸鹽緩衝液稀釋。此最後的染料溶液在 25%乙醇中為160微克/毫升。其保持在冰冷，在黑暗中， 並混合至少30分鐘。 14 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----；--；----裝------訂------京 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 265 1 7 A7 B7 五、發明説明（11 ) (3) PMB之一系列稀釋或各共轭物在40mM磷酸鹽緩 衝液（pH = 7.4)内製備之。各稀釋為6倍並超過其最終試 驗濃度。 (4) 在超音波處理後，大腸菌E. coil 0111:B4内生 毒素，由事先配製，冷凍的貯存液濃度為1.0毫克/毫升， 0.9%食鹽水，稀釋至0.5毫克/毫升0.9%食鹽水。 平板經組合和分析依下述進行，首先添加樣品或緩衝 液至微力價皿： (a)空白試驗：100微升食鹽水和50微升的40mM磷 酸鹽緩衝液〔pH = 7.4)，分三次試驗； 〔b)正對照組：100微升内生毒素和50微升的40mM 磷酸鹽緩衝液（pH = 7.4)，分三次試驗； (c) PMB樣品：100微升内生毒素和50微升的PMB樣 品，分三次試驗； (d) 負對照組：100微升食鹽水和50微升的共軛物樣 品，分三次試驗； (e) 試驗組：100微升内生毒素和50微升的共軛物樣 品，分三次試驗； 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 平板經旋轉幾分鐘。150微升染料添至各皿而平板包 覆箔（foil)並置於冰上及黑暗中歷時60分鐘。各皿以多管 式吸管混合並立刻地在450nm在微力價平板讀取機讀取 之。進行IC5。評估係以Reed-Muench計算之。 本發明以下所列舉實施例並非限制本發明。所有溫度 以攝氏表示之15 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公嫠） 426517 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 _B7______五、發明説明（！2 ) 實施例1 : (A) 葡聚醯之氧化 取一 5升四頸圓底燒瓶，倒入2.31升注射用水和150 克葡聚醣。混合物在21° -24°以大約140ιτρπι攪拌使其 溶解。取3.9克過碘酸鈉在60毫升注射用水之溶液加入（溫 和地放熱，大約1° )。添加漏斗用30毫升注射用水洗滌。 所形成混合物置於21° -24°歷經1小時。溶液經由無菌 0.22微米（以）Corning乙酸纖維素90毫米（mm)薄膜過 濾器真空過濾且加溫至30° -32°並保持該溫度。 (B) 製備多肽徽素B硫酸鹽/硼酸鹽緩衝液 此項製備在葡聚醣氧化完成前45分鐘開始，由上述 (A)過濾和加溫。取一 12升四頸圓底燒瓶，倒入3.00升 PH9.7硼酸鹽緩衝液，而緩衝液之溫度調節至32° 。接著 加入45克多肽徽素B硫酸鹽，將所生成懸浮液在32°攪拌 45分鐘。測定混合物之pH(最初為9.47)，在32°藉由添 加30毫升的5N NaOH，調節至pH9.7。 硼酸鹽緩衝液之製備如下：一種加熱處理5升四頸圓底 燒瓶，倒入114.3克的四硼酸鈉十水合物（硼砂）和2.906 升（2.90公斤）注射用水。溶液加熱至32°並添加37毫升 的SN NaOH pH調節至9.7(最初為9·3)。溶液經由無菌 0.22微米（M)CorrUiig乙酸纖維素90毫米薄膜過濾器真 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 210X297公嫠） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 426517 A7 B7_五、發明説明（) 空過濾和貯存。 CC)多肽徽素B硫酸鹽和氣化的葡聚醣反應 預先加溫（30° -32° )，氧化的葡聚醣[來自（A〕部 分]並盡可能快速地添至在32°已攪拌之硼酸緩衝液内的 多肽黴素B硫酸鹽[來自（B)部分]〇在添加完成後，測定混 合物之pH(最初為9.5)並加入18毫升的5N NaOH調節 pH為9.7。混合物在32°攪拌一小時。在不均質混合物添 加在S0毫升注射用水溶液内之3.6克氫硼化鈉。混合物在 32°攪拌二小時。此混合物另外加入新鮮配製的在50毫升 注射用水溶液内之3.6克氫硼化鈉。混合物在32°攪拌二 小時。在此混合物再加入在50毫注射用水溶液內之3.6克 氫硼化鈉。移除加熱和反應混合物讓其冷却至室溫且攪拌 1 4小時°測定反應混合物之p Η ( 1 0 · 0 )並加入1.2 7升的 IN HC1調節至pH 5.7。所生成混合物在酸化後攪拌10 分鐘，並經由無菌0.22微米（M) Corning乙酸纖維素薄 膜過濾器真空過濾，可製成6.81升多肽黴素B-葡聚醣共軛 物之溶液，其繼續供精製之用。 (D〕超微過濾予以精製 多肽徽素B-葡聚醣共軛物[來自（C)部分]之溶液使用 預先處理的 Am icon CH2PRS Ultrafiltration Unit 具有SIY10薄膜筒予以精製。己精製的產物由超微過濾裝 置移除和在-25°冷凍貯存。 所得共轭物經分析，顯示產物具有下列特性： ICS()= 16.8微克/毫升 17 ------_------^------订------Λ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29*/公釐） 426517 經濟部t央榇隼局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（14 ) 活性=1 2 4.7 % 葡聚醣含童= 65.37毫克/毫升 全部多肽徽素含量=2.47毫克/毫升 游離多肽徽素含量= 0.65 % PMB :葡聚醣比例= 37·71毫克PMB /克葡聚醣 其顯示在反應溫度32°和ρΗ9.5,所得產物具有活性 為未共轭物ΡΜΒ活性之大約125 %。 實施例2 : 重複實施例1之方法而生成一種多肽徽素Β -葡聚醣共 軛物具有下列特性： ICSQ= 16.4微克/毫升 活性=1 2 S . 8 % 葡聚醣含量= 65.30毫克/毫升 全部多肽黴素含量=2.49毫克/毫升 游離多肽徽素含量= 0.67% PMB :葡聚醣比例=38.06毫克卩1^[8/克葡聚醣 再者，在反應溫度32°和pH9.5,所得共軛物具有活 性為未共轭PMB活性之大約126%。 實施例3: 多肽徽素B/葡聚酷共軛物依實施例1之方法製備之 (除了所示以外），以決定PMB與葡聚醣之間在PH9.7反應 溫度之影響。測定Pay lo ad(毫克PMB/克葡聚醣〕， 18 I------^----裝------訂------泉 (請先閣讀背面之注項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 4 265 1 7 A7 B7 五、發明説明（is ) 平均〖C5Q(毫克 < 毫升）及活性（％)，而結果如表1所示： 表1:在PH9.7溫度之影響 (10 克 Ρ Μ B ; 0.65 克 N al 04; 50 克葡聚醣） 實施例 編號 溫度 Payload (¾克PMB/克葡聚釀） 平均ic50 微歡毫升 活性 (%) 3a 35° 15.87 25.18 99.7 3b 35。 19.81 26.07 91.1 3c 35° 18.58 27.67 85.0 3d 10。 49.53 143.83 23.6 3e 10。 54.95 187.87 9.5 3f 10° 56.03 195.7 10.8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 由實施例3可得知，當反應溫度低至1〇°在PH9.7， 所得產物之活性降低。 實施例4 : 多肽黴素B/葡聚醣共軛物依實施例1之方法製備（除 了所示以外），以決定PMB與葡聚醣之間反應pH之影響。 如實施例3例定Payload(毫克PMB/克葡聚醣〕，平均 ICS。（微克/毫升〕及活性（％〕，而結果如表2所示： 表2:在溫度32° dH之影響 (15 克 PMB; 1.3 克 NaI04; 50克葡聚醣） 19 -泉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（2! 0 X 297公釐） 2 65 1 7 A7 B7 五、發明説明（) 實施例 編號 反應之pH Payload (奄克PMB/^ 葡聚醣】 平均ic50 微^/毫升 活性 (%) 4a 4.0a> 2.36 ND 丨丨丨 ' ND 4b 5.0s) 14.34 ND ND 4c 7.0W 15.26 ND ND 4d 7.0b, 16.09 164.4 11.0 4e 8.0b) 32.03 107.7 17.8 4f 8.0b, 29.51 139.4 13.8 4g 8.5C) 69.94 74.5 24.9 _4h 9.0C) 50.99 22.6 95.3 4i 9.^ 50.16 22.5 88.6 4j 9.3C) 43.33 19.4 94.0 4k 9.3C) 39.96 19.0 95.8 4] 9.5C, 38.22 17.5 100.5 4m 9.5C> 39.9 17.8 98.1 4n 9.7C> 36.74 15.8 133.2 4〇 9.7C) 34.99 14.9 148.9 |_ 4p 10.0C) 31.89 18.7 97.3 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 a)乙酸鹽緩衝液；b)磷酸鹽緩衝液；C)硼酸鹽緩衝液； ND :未測定（樣品太稀釋無法測定這些參數） 由表2之數據顯示，降低反應溫度至32° ，同時使用 PH包括9.5和9.7之間，仍使製成之共軛物具有活性超出 未結合PMB(實施例41,4η及4〇)，同時再増加pH至 pHIO，並沒有特別地有利（實施例4p)。 20 本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS > A4規格（210x297公釐） 4265彳 7

7 7 A B 五、發明説明（i?) 實施例5 : 依實施例1(除了所示以外），製備多肽黴素/葡聚醣共 軛物和測定它們的抗內生毒素活性。其結果示於如下之表 3 : 峩3:PMB用量之影響 (1 .3克 NaI04:pH9.7; 32° ) 實施例 編號 條件 Payload (毫克 葡聚醱） 平均ic50 微升 活性 (%) 5a 15 g PMB 36.74 15.8 133.2 5b 15 g PMB 34.99 14.9 148.9 5c 15 g PMB 33.81 17.6 109.0 5d 20 g PMB 46.06 19.7 121.5 5e 20 g PMB 44.63 19.5 115.5 (讀先聞讀背面之注#^項再填寫本頁) -裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在表3之結果進一步確認在反應溫度為約32°而pH 約9.5至約9.7為最佳條件。 總之’由實施例1至5之數據顯示，本發明所改良之共 軛物，其用於反應溫度由約30°至約35° ，較佳為約32。， 而pH由約9.3至約10，較佳為約9·5至約9.7之結果最 佳0 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 426517 A8 RB C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 1. 一種水溶性多肽黴素B或其鹽和葡聚醣共輛物之製 法’此共耗物具有抗内生毒素活性大於未共軛物多 肽黴素β之抗内生毒素活性，亦即，其令未共耗多 肽黴素Β之IC5G對共輛物之ic5。之比例大於約 1 · 4 ’其令抗内生毒素活性之測定係藉由羰花青染 料分析法’其中共軛物之1(：5。之測定，係在每毫升 0.9 %食鹽水〇·〇5毫克來自大腸菌之内生毒素存 在下’幾花青染料在450nm吸光度位移被減除 50 %之共軛物的濃度為之；以及該共軛物（或其鹽） 具有重量平均分子量為由約60,000至約80,〇〇〇 ; 其包括多肽黴素B或其鹽與葡聚醣在水液介質内， 於pH為由約9.3至約10 ’而溫度為由約3〇它至約 35 °C反應而成’其中多肽黴素b或其鹽共價地結合 至葡聚醣’係經由一個或一個以上的胺鍵；該多狀 徽素B或其鹽對葡聚醣之分子比例為由1:2至約 1:5;葡聚醣具有重量平均分子量為由約5〇, 〇〇〇 至約200,000 ;以及’任意地，葡聚糖曾被部份氧 化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2. 如申請專利範圍第1項所述之製法供製備一種水溶 性多肽黴素B或其鹽與葡聚醣之共軛物（或其鹽）， 其包括： a)藉由葡聚醣與過碘酸鈉反應，以製備部份地氣 化的葡聚醣： 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 公告本 申請曰期 η.广^ 案 號 ί σ (pt £〇> 類 別 }< ^/7( (以上各欄由本局填註） 修正. A4 !诎充 C4 426517 發明 S1專利'説明書 發明 新型 名稱 發明 創作 人 中 文 英 文 姓 名 國 籍 住，居所 多狀徽素B和葡聚醣共軛物之製法 A PROCESS FOR PRODUCING A CONJUGATE OF POLYMYXIN B AND DEXTRAN 1) 普拉沙德科特史瓦拉卡帕 2) 葛雷伯卡達西 3) 安德魯庫什羅維 4) 菲利普雷克 1) 印度 2) 美國 3) 美國 4) 美國 1) 美菌紐澤西州07054韬西帕尼法柏路4號 2) 美國紐澤西州07886洛克大道希爾伯羅巷3〇 3) 美國紐澤西州07836佛蘭德艾利生路7號 4) 美國紐澤西州07950摩理斯平原布魯克拉恩道 經濟部中央梯隼局舅工消費合作社印掣 姓 名 (名稱） 諾瓦提斯公司 國 籍 瑞士 三、申請人 住、居所 (事務所） 瑞士貝士勞市CH-4058史瓦滋瓦達里215號 代表人 姓 名 漢斯.魯道夫·赫斯 安東尼歐，納托里 1 裝 訂 線 4 265 1 A5 B5

   四、中文發明摘要（發明之名稱： 多肽黴素B和葡聚醣共輛物之製法 本發明係有關水溶性多肽黴素（polymyxin) B/葡聚醣 共軛物（或其鹽類），其比未共軛多肽黴素B更具有抗内生毒 素活性。它們可製自多肽黴素B或其鹽與葡聚醣在水性介質 内’於pH值為約9.3至約10，而溫度為約30°C至約351反 應而成者。 ------------裝I <:請先閲讀背面之注*.事項再4'寫本頁各櫊} 英文發明摘要（發明之名稱 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 426517 A8 RB C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 1. 一種水溶性多肽黴素B或其鹽和葡聚醣共輛物之製 法’此共耗物具有抗内生毒素活性大於未共軛物多 肽黴素β之抗内生毒素活性，亦即，其令未共耗多 肽黴素Β之IC5G對共輛物之ic5。之比例大於約 1 · 4 ’其令抗内生毒素活性之測定係藉由羰花青染 料分析法’其中共軛物之1(：5。之測定，係在每毫升 0.9 %食鹽水〇·〇5毫克來自大腸菌之内生毒素存 在下’幾花青染料在450nm吸光度位移被減除 50 %之共軛物的濃度為之；以及該共軛物（或其鹽） 具有重量平均分子量為由約60,000至約80,〇〇〇 ; 其包括多肽黴素B或其鹽與葡聚醣在水液介質内， 於pH為由約9.3至約10 ’而溫度為由約3〇它至約 35 °C反應而成’其中多肽黴素b或其鹽共價地結合 至葡聚醣’係經由一個或一個以上的胺鍵；該多狀 徽素B或其鹽對葡聚醣之分子比例為由1:2至約 1:5;葡聚醣具有重量平均分子量為由約5〇, 〇〇〇 至約200,000 ;以及’任意地，葡聚糖曾被部份氧 化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2. 如申請專利範圍第1項所述之製法供製備一種水溶 性多肽黴素B或其鹽與葡聚醣之共軛物（或其鹽）， 其包括： a)藉由葡聚醣與過碘酸鈉反應，以製備部份地氣 化的葡聚醣： 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐）