KR19980703459A - 진단 및 치료용의 방사선 표지된 펩티드 - Google Patents

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리차드 티. 딘
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페트리시아 에이. 맥다니엘스
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Abstract

본 발명은 방사선 치료 시약 및 펩티드, 방사선 진단 시약 및 펩티드, 및 표지된 방사선 진단제 및 방사선 치료제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈관 활성 장 수용체 결합 펩티드, 혈관 활성 장 펩티드의 유도체 및 유사체, 및 방사성 동위 원소로 방사선 표지된 상기 펩티드의 구체예 이외에도, 방사선 진단 및 방사선 치료 목적을 위해 상기 펩티드를 제조하고, 방사선 표지시키고 사용하는 방법 및 킷에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 테크네튬-99m로 방사선 표지된 혈관 활성 장 펩티드의 혈관 활성 장 수용체 펩티드 유도체 및 유사체 및 신티그래피 영상화제로서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 구체적으로 방사선 치료제로서 사용하기 위해 레늄-186(186Re) 또는 레늄-188(188Re)과 같은 세포 파괴 방사성 동위 원소로 방사선 표지된 혈관 활성 장 펩티드의 혈관 활성 장 수용체 결합 펩티드 유도체 및 유사체에 관한 것이다. 포유류 체내에서 진단학적 및 치료학적으로 상기 펩티드를 제조하고, 방사선 표지시키고 사용하는 방법 및 킷도 또한 제공된다.

Description

진단 및 치료용의 방사선 표지된 펩티드
천연의 혈관작용 장내 펩티드(VIP)는 사육돈의 소장으로부터 분리된 28 아미노산 펩티드이다[문헌: Said and Mutt. 1970, Science 169: 1217-1218]. 이러한 펩티드는 헬로데르민(helodermin), 세크레틴, 소마토스타틴, 및 글루카곤을 포함하는 구조적으로 관련된 소펩티드계에 속한다.
일반식 I
HSDAVFTDNYTRIRKQMAVKKYLNSILN. 아미드
(여기서, 아미노산에 대한 단일문자 약어는 문헌[Zubay, Biochemistry 2d ed., 1988, MacMillan Publishing: New York, p. 33]의 설명은 참조로 인용한다).
VIP의 생물학적 효과는 새포내 고리 아데노신 모노포스페이트 시그날화 시스템에 결합되는 막 결합된 수용체 단백질의 활성에 의해 중재된다. VIP는 조직 및 기관에서의 상이한 생물학적 활성의 변화를 조절한다. VIP는 세포 대사활성을 조절하여 외분비 및 내분비 분비작용을 조절한다. VIP는 또한 평활근의 이완을 유도하고 혈관확장 효과를 유발시킨다. VIP는 또한 세포증식의 조절 및 케라틴세포, 평활근세포, 교감 신경모세포, 히포캄펠 세포 및 시험관내 NIH 3T3 세포를 포함하는 다수의 상이한 세포형태로의 생존과 관련이 있다.
VIP 수용체는 위장관 전체에 광범위하게 분포되어 있고, 다양한 그밖의 세포형태로 발견된다. 다수의 VIP 수용체는, 예를 들어, 선암종, 유방암, 흑색종, 신경모세포종 및 췌장암종의 암세포에서 발현된다. 사실, VIP에 대한 고친화성 결합부위(VIP 수용체 단백질을 포함)의 발현은 이러한 종양세포의 마커이다. 이들 세포에 대한 VIP의 특이적 결합은 마카로 이용하여 생체내의 암세포를 편재시키고 동정할 수 있다.
67Ga,99mTc(이하 Tc-99m이라 한다),111In,123I,125I,169Yb, 또는186Re를 포함한 다양한 방사선 핵종이 방사선 영상화에 유용한 것으로 공지되어 있다. 사람에서의 최적의 방사선 영상화에 있어서 다수의 인자가 고려되어야 한다. 검출효능을 최대화하기 위해서는 200 내지 200keV 범위의 감마 에너지를 방출하는 방사선 핵종이 바람직하다. 환자에게 흡수되는 방사선 양을 최소화하기 위해서는 방사선 핵종의 물리적인 반감기가 영상화 과정이 이루어질 수 있는 한 가능한 한 짧아야 한다. 어느 날짜 및 어느 시간에 대해서도 시험이 수행될 수 있도록 임상부위에 항상 허용될 수 있는 방사선 핵종의 공급원이 유리하다.123
I 또는125I를 사용한 VIP 서열(Tyr10또는 Tyr22)중의 티로신 잔기에서 VIP 유사체를 방사선요오드화하는 방법은 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방사선요오드화종은 암세포상의 수용체에 결합하는 VIP를 검정하는데 사용된다.
문헌[Boissardet al., 1986,Cancer Res. 46:4406-4413]에는 VIP의 방사선요오드화 방법 및 사람 결장 선암종 세포에 결합시키는 방법이 기재되어 있다.
문헌[El Battariet al., 1988,J. Biol. Chem.263: 17685-17689]에는 VIP의 방사선요오드화 방법 및 사람 결장 선암종 세포에 결합시키는 방법이 기재되어 있다.
문헌[Shafferet al., 1987,Peptides 8: 1101-1106]에는 VIP의 방사선요오드화 방법 및 사람 소세포 및 비소세포 암종 세포에 결합시키는 방법이 기재되어 있다.
문헌[Svobodaet al., 1988,Eur. J. Biochem. 176: 707-713]에는 VIP의 방사선요오드화 방법 및 래트 형질전환된 췌장 포상세포에 결합시키는 방법이 기재되어 있다.
문헌[Gespachet al., 1988,Cancer Res.48: 5079-5083]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 유방암 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌[Mulleret al., 1989,J. Biol. Chem.264: 3647-3650]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 신경모세포종 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌[Leeet al., 1990,Peptides 11: 1205-1210]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 소세포 및 비소세포 암종 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌[Parket al., 1990,Cancer Res.50: 2773-2780]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 위장암 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌Bellanet al., 1992,Exp. Cell Res.200: 34-40]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 흑색종 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌[Moodyet al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4345-4349]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 사람 비소세포 폐 암종 세포에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
문헌[Virgoliniet al., 1994,Cancer Res.54: 690-700]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 일차 종양 및 종양세포주에의 이의 결합방법이 기재되어 있다.
131I를 사용하여 Y10또는 Y22에 VIP 유사체를 방사선 요오드화하는 방법은 기술분야에 공지되어 있다.
문헌[Hassanet al., 1994,Nucl. Med. Biol. 21: 865-872]에는 VIP의 방사선 요오드화 방법 및 신티그래프로 래트에 생체내 방사선 표지를 분포시키는 방법이 기재되어 있다.
이러한 방법들을 적용하여 방사선 영상화, 특히 신티그래피로 생체내 종양세포를 검출할 수 있다. VIP는 그러한 방사선 영상화에 유용한 마커인데, 그 이유는 많은 상이한 종양세포가 VIP에 높은 친화성 결합부위(VIP 수용체 단백질)를 나태내기 때문이다. 그러나, 방사선 요오드화된 펩티드는 시판에는 큰 단점이 있다.123I는 고가이며 공급이 제한되어 있다. 또한, 요오드 방사선화된 방사성 약제는 임상부위에 정상적으로 제조될 수 없다.
Tc-99m 은 바람직한 방사선 핵종인데, 그 이유는 Tc-99m이 140keV의 방사선을 방출하며, 물리적인 반감기가 6시간이고, 몰리브덴-99/테크내튬-99m 발생기를 사용하여 용이하게 원하는 부위에 위치시킬 수 있기 때문이다. 기술분야에 사용된 그밖의 방사선 핵종은 Tc-99m보다 유리하지 못하다. 그러한 이유는 그러한 방사선 핵종의 반감기가 길어서 환자에게 많은 양이 흡수되기 때문이다(예, 인듐-111). 또한, 그러한 다른 방사선 핵종의 감마선 에너지는 Tc-99m보다 현저하게 낮거나(예, 요오드-125), 높고(예, 요오드-131), 그로인해 양호한 신티그래프 영상화에 적절하지 못하기 때문이다. 게다가, 많은 바람직하지 않은 방사선 핵종은 온-사이트 발생기를 사용하여 생성시킬 수 없다.
Tc-99m은 금속착화 잔기에 의해 유리하게 킬레이트되는 전이금속이다. Tc-99m을 결합시킬 수 있는 방사선표지 착화 잔기는 다양한 특이적 결합 화합물에 공유결합하여 그러한 특정한 결합 화합물을 방사선 표지화하는 수단을 형성할 수 있다. 그러한 이유는 대부분의 일반적인 Tc-99m의 화학종, 퍼테크네테이트(TcO4)이 방사성 약제로서 유용할 정도로 충분히 강하게 대부분의 특이적 결합 화합물에 직접 결합할 수 없기 때문이다. Tc-99m의 그러한 방사선표지 착화잔기와의 착화는 염화주석과 같은 환원제의 사용으로 인한 퍼테크네테이트의 화학적 환원을 유발한다.
Tc-99m이 신티그래피 영상화에 바람직한 방사선 핵종이기는 하지만, 펩티드를 표지화하는데 광범위하게 사용되지 않았다[참조문헌; Lamberts, 1991,J. Nucl. Med.32: 1189-1191]. 그러한 이유는 보다 큰 단백질 분자(즉, 크기 ＞10,000 달톤)를 Tc-99m으로 표지화하는 종래의 공지된 방법이 펩티드(10,000달톤 이하의 분자크기)를 표지화하는데 적합하지 못하기 때문이다. 결론적으로, 방사선 핵종을 펩티드에 공유결합시킴으로써 대부분의 펩티드를 방사선표지하여 킬레이터가 부위 선택적으로 펩티드의 특이적 결합특성을 방해하지 않는 펩티드에서의 위치에 혼입되는 것이 요구된다.
펩티드를 Tc-99m으로 표지화시키는 방법이 공동소유 미국특허 제 5,225,180호 및 공동계류중인 미국특허출원 제07/653,012호, 제07/807,062호, 제07/851,074호, 제07/871,282호, 제07/886,752호, 제07/893,981호, 제07/902,935호, 제07/955,466호, 제07/977,628호, 제08/019,864호, 제08/044,825호 및 제08/073,577호, 제08/092,355호, 제08/095,760호, 제08/210,822호 및 PCT 국제출원 PCT/US92/00757호, PCT/US92/10716호, PCT/US93/02320호, PCT/US93/03687호, PCT/US93/93/04794호, PCT/US93/05372호, PCT/US93/06029호, PCT/US93/09387호 및 PCT/US94/01894호에 기재되어 있으며, 본 발명에서는 상기 특허 및 특허출원을 참조로 인용한다. 그러나, 상기된 참조 특허 및 특허원에는 테크네튬-99m-표지된 혈관작용 장내 펩티드를 제조하는 방법이 기재되어 있지 않다.
Tc-99m 착물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지되어 있으며, 그러한 예를 이하 참조사항으로 기재하고자 한다:
바이어네(Byrne)등의 미국특허 제4,4341512호, 제4575,556호 및 제4,571,430호에는 호모시스테인 티오락톤 유도된 이작용성 킬레이트화제가 기재되어 있다.
프리츠버그(Fritzberg)등의 미국특허 제4,444,690호에는 2,3-비스(메르캅토아세타미도)프로파노에이트를 기본으로 하는 일련의 테크네튬-킬레이트화제가 기재되어 있다.
노스코(Nosco)등의 미국특허 제4,925,650호에는 Tc-99m 킬레이트화 착물이 기재되어 있다.
콘도(Kondo)등의 유럽특허 공보 제483704 A1호에는 메르캅토-Gly-Gly-Gly 잔기로 Tc-99m 착물을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
유럽특허 제84109831.2호에는 신장기능 모니터링제로서 비스아미도, 비스티올 Tc-99m 리간드 및 이의 염이 기재되어 있다.
문헌[Davissonet al., 1981,Inorg. Chem. 20: 1629-1632]에는 옥소테크네튬 킬레이트 착물이 기재되어 있다.
문헌[Fritzberget al., 1982,J. Nucl. Med. 23: 592-598]에는 N, N'-비스(메르캅토아세틸)-2,3-디아미노프로파노에이트를 기본으로하는 Tc-99m 킬레이트화제가 기재되어 있다.
문헌[Byrneet al., 1983,J. Nucl. Chem. 24: P126]에는 호모시스테인 함유 Tc-99m 킬레이트화제가 기재되어 있다.
문헌[Brysonet al., 1988,Inorg. Chem. 27: 2154-2161]에는 과량의 리간드에 불안정한 테크네튬-99의 중성의 착물이 기재되어 있다.
문헌[Misraet al., 1989,Tet. Lett. 30: 1885-1888]에는 방사선 표지화용의 비스아민 비스티올 화합물이 기재되어 있다.
특이적 결합화합물을 방사선 표지하는 킬레이트화제의 용도가 기술분야에 공지되어 있으며, 그러한 예를 일반적인 참조사항으로 이하 기재하고자 한다:
갠소우(Gansow)등의 미국특허 제4,472509호에는 Tc-99m 킬레이트-컨쥬게이트된 단일클론성 항체를 제조하고 정제하는 방법이 기재되어 있다.
스타브리아노폴로스(Stavrianopoulos)의 미국특허 제4,943,523호에는 금속킬레이트화 잔기를 포함한 검출 가능한 분자가 기재되어 있다.
프리츠버그(Fritzberg)등의 유럽특허 제86100360.6호에는 테크네튬-표지된 영상화제를 제조하는데 유용한 디티올.디아미노. 또는 디아미도카르복실산 또는 아민 착물이 기재되어 있다.
알버트(Albert)등의 영국특허출원 제8927255.3호에는 아미노 말단에 결합된 킬레이트화 그룹을 통해111I로 표지된 옥트레오티드와 같은 소마토스타틴을 이용한 방사선 영상화 방법이 기재되어 있다.
알버트등의 유럽특허출원 WO 91/01144호에는 성장인자, 호르몬, 인터페론 및 사이토킨과 연관되고 펩티드의 아미노 그룹을 통해 방사선 핵종 킬레이트화 그룹에 공유결합된 특이적 인식 펩티드를 포함하는 방사선 표지된 펩티드를 사용한 방사선 영상화 방법이 기재되어 있다.
피쉬만(Fischman)등의 국제특허출원 공보 WO93/13317호에는 킬레이트화 잔기에 결합된 화학주성 펩티드가 기재되어 있다.
문헌[Kwekkeboomet al., 1991,J. Nucl. Med.32: 981 Abstract #305]은 소마토스타틴 유사체를111In으로 방사선 영상화하는 방법에 관한 문헌이다.
문헌[Albertet al., 1991, Abstract LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991]에는111In-표지된 디에틸렌-트리아미노펜타아세트산-유도된 소마토스타틴 유사체의 용도가 기재되어 있다.
문헌[Coxet al., 1991, Abstract, 7th International Symposium on Radiopharmacology, p. 6]에는 Tc-99m-,131I- 및111In-표지된 소마토스타틴 유사체를 신티그래피로 생체내에서 내인성 종양을 방사선 편재시키는데 사용하는 용도가 기재되어 있다.
특이적 결합 화합물, 주로 큰 단백질을 Tc-99m으로 표지화하는 방법이 기술분야에 공지되어 있으며, 그러한 예를 이하 참조사항으로 기재하고자 한다:
나토위치(Hnatowich)등의 미국특허 제4,668,503호에는 Tc-99m 단백질 방사선표지화 방법이 기재되어 있다.
톨만(Tolman)의 미국특허 제4,732,684호에는 메탈로티오네인의 분자 및 단편을 표적화하는 컨쥬게이트화 방법이 기재되어 있다.
니콜로티(Nicolotti)등의 미국특허 제4,861,869호에는 항체와 같은 생물확적 분자와 컨쥬게이트를 형성하는데 유용한 이작용성 결합제가 기재되어 있다.
프리츠버그등의 미국특허 제4,965,392호에는 단백질을 표지화하는 다양한 S-보호된 메르캅토아세틸글리실글리신-기재 킬레이터가 기재되어 있다.
쇼차트(Schochat)등의 미국특허 제5,061,641호에는 하나 이상의 펜덴트(pendent) 술프하이드릴 그룹을 포함하는 단백질의 직접 방사선 표지화 방법이 기재되어 있다.
프리츠버그등의 미국특허 제5,091,514호에는 단백질을 표지화하는 다양한 S-보호된 메르캅토아세틸글리실글리신-기재 킬레이터가 기재되어 있다.
구스타브슨(Gustavson)등의 미국특허 제5,112,953호에는 단백질을 표지화하는 Tc-99m 킬레이트화제가 기재되어 있다.
카시나(Kasina)등의 미국특허 제5,175,257호에는 분자를 표적화하는 다양한 배합물 및 Tc-99m 킬레이트화 그룹이 기재되어 있다.
딘(Dean)등의 미국특허 제5,180,816호에는 이작용성 킬레이트화제를 통해 단백질을 방사선 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
선드레하겐(Sundrehagen)의 국제특허출원 공보 WO85/03231호에는 단백질을 표지화하는 Tc-99m이 기재되어 있다.
레노(Reno) 및 비티노(Bottino)의 유럽특허출원 제87300426.1호에는 항체를 Tc-99m으로 방사선 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
브레머(Bremer)등의 유럽특허출원 제97118142.6호에는 항체 분자를 방사선 표지화하는 Tc-99m이 기재되어 있다.
팩(Pak)등의 유럽특허출원 WO88/07382호에는 항체를 Tc-99m으로 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
죠드만스(Geodemans)등의 PCT 출원 WO89/07456호에는 사이클릭 티올 화합물, 특히, 2-이미노티올란 및 이의 유도체를 사용하여 단백질을 방사선 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
딘등의 국제특허출원 공보 WO 89/12625호에는 단백질을 표지화하는 Tc-99m에 대한 이작용성 결합제가 기재되어 있다.
쇼에마커(Schoemaker)등의 국제특허출원 공보 WO90/06323호에는 금속 결합영역을 포함하는 키메라 단백질이 기재되어 있다.
토른백(Thornback)등의 EPC 출원 제90402206.8호에는 티올 함유 화합물, 특히 2-이미노티올란을 이용한 방사선 표지된 단백질 또는 펩티드의 제법 및 용도가 기재되어 있다.
구스타브슨등의 국제특허출원 공보 WO91/09876호에는 단백질을 방사선 표지화하는 Tc-99m 킬레이트화제가 기재되어 있다.
문헌[Rhodes, 1974, Sem. Nucl. Med. 4: 281-193]에는 사람 혈청 알부민을 테크네튬-99m으로 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
문헌[Khaw et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 1011-1019]에는 생물학적 활성의 거대분자를 Tc-99m으로 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
문헌[Schwartz et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 333]에는 하이드라지노니코틴아미드 그룹을 사용하여 단백질을 Tc-99m으로 표지화하는 방법이 기재되어 있다.
펩티드를 표지화하는 연구가 선행기술에서 보고되어 있다.
이지(Ege)등의 미국특허 제4,832,940호에는 편재된 T-림프구를 영상화하는 방사선 표지된 펩티드가 기재되어 있다.
모르간(Morgan)등의 미국특허 제4,986,979호에는 염증부위를 영상화하는 방법이 기재되어 있다.
플라네간(Flanagan)등의 미국특허 제5,248,764호에는 방사선 표지 킬레이트 잔기와 심방 나트륨 배설 증가인자 유도된 펩티드 사이의 컨쥬게이트가 기재되어 있다.
렌비(Ranby)등의 1988년 PCT/US88/02276호에는 방사선 표지된 화합물을 피브린에 공유결합시킴을 포함하여 동물에서의 피브린 침전을 검출하는 방법이 기재되어 있다.
리(Lee)등의 1989년 PCT/US89/01854호에는 동맥을 영상화하는 방사선 표지된 펩티드를 기재하고 있다.
모르간등의 국제특허출원 공보 WO90/10463호에는 염증부위를 영상화하는 방법이 기재되어 있다.
플라네간등의 유럽특허출원 제 90306428.5호에는 유기 킬레이트화분자 세트를 통해 합성 펩티드 단편을 표지화하는 Tc-99m이 기재되어 있다.
스튜틀(Stuttle)의 PCT 출원 공보 WO90/15818호에는 RGD 함유 올리고펩티드를 표지화하는 Tc-99m이 기재되어 있다.
로드웰(Rodwell)등의 1991년 PCT/US91/03116호에는 분자 인식단위와 이펙터 도메인의 컨쥬게이트가 기재되어 있다.
콕스(Cox)의 국제특허출원 PCT/US92/04559호에는 두 시스테인 잔기를 함유하는 방사선 표지된 소마토스타틴 유도체가 기재되어 있다.
로드스등의 국제특허출원 공보 WO/93/12819호에는 금속 이온 결합 도메인을 포함하는 펩티드가 기재되어 있다.
라일(Lyle)등의 국제특허출원 공보 WO93/15770호에는 Tc-99m 킬레이터 및 Tc-99m으로 표지된 펩티드가 기재되어 있다.
커플린(Coughlin)등의 국제특허출원 공보 WO93/21151호에는 표적화분자를 방사선 표지하는 티오우레아 그룹을 포함하는 이작용성 킬레이트화제가 지재되어 있다.
문헌[Knightet al., 1990, 37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, Abstract #209]에는 Tc-99m 표지된 펩티드를 이용한 혈전 영상화방법이 기재되어 있다.
문헌[Babichet al., 1993,J. Nucl. Med.34: 1964-1974]에는 하이드라지노니코틴아미드 유도체를 포함하는 Tc-99m 표지된 펩티드가 기재되어 있다.
VIP 수용체 결합 펩티드 및 이의 단편, 유사체 및 의사체의 방사선 표지된 유도체가 또한 치료학적으로 사용될 수 있다. 이러한 사용에 있어서, 세포독성 방사선 동위원소 레늄-186 및 레늄-188이 특히 유리하게 사용된다.
따라서, 신티그래피제로 사용되도록 Tc-99m으로 방사선 표지될 수 있으며, 방사선 치료제로 사용되도록 레늄-186 또는 레늄-188로 방사선 표지될 수 있는 합성(통상의 제조방법으로 제조되고 규칙적인 수용을 용이하게 함) VIP 수용체 펩티드 및 이의 유도체, 유사체 및 의사체가 여전히 요구되고 있다. Tc-99m, Re-186 또는 Re-188, 및 이들의 Tc-99m-, Re-186-, 및 Re-188 표지된 유도체를 함유하는 소량의 합성 VIP 수용체 결합 펩티드, 및 이의 유도체, 유사체 및 의사체가 본 발명에 의해 제조될 수 있으며, 이들은 상기된 요구를 충분히 충족시키고 있다.
본 발명은 방사선 치료제 및 방사선 치료용 펩티드, 방사선 진단제 및 방사선 진단용 펩티드에 관한 것이며, 그러한 방사선 표지된 방사선 진단제 및 치료제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수용체 결합 혈관작용 장내 펩티드(본래의 혈관작용 장내 펩티드(VIP) 및 이의 단편, 유도체, 유사체 및 의태체를 포함함) 및 테크네튬-99m(Tc-99m)과 같은 감마선 방출 동위원소로 표지된 상기 화합물의 구체예에 관한 것이며, 그러한 펩티드를 제조하며, 방사선 표지하고, 사용하여 포유동물의 신체 부위를 영상화하는 방법 및 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 레늄-186(186Re) 및 레늄-188(188Re)과 같은 세포독성 방사선 동위원소로 표지된 수용체 결합 혈관작용 장내 펩티드, 및 이의 유도체, 유사체 및 의사체(擬似體)에 관한 것이며, 그러한 화합물을 제조하여, 방사선 표지하고 포유동물 체내에 치료학적으로 사용하는 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 방사선 치료 적용 및 방사선 진단 적용, 특히 신티그래피 영상법 적용을 위해 Tc-99m, Re-186 또는 Re-188 표지화 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드를 사용하는 방사성 약제를 제공한다. 본 발명은 또한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 이의 유도체, 유사체 및 의태물로 이루어진 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 제공하고, 상기 화합물은 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합된다. 본 발명은 상기 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약 및 신티그래피 영상화제, 방사선 진단제 및 방사선 치료제인 방사선 표지화 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 제공한다.
본 발명의 신티그래피 영상화제는 테크네듐-99m로 방사선 표지된 수용체 결합 혈관성 작용 장 펩티드 시약을 포함한다. 본 발명의 방사선 치료제는 레늄-186 또는 레늄-188로 방사선 표지된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 포함한다. 또한 상기 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약 및 이것의 방서성 표지된 구체예를 제조하고 사용하는 방법이 제공되어 있다.
본 발명은 시약이 테크네튬 또는 레늄 방사선 표지를 킬레이트시킬 수 있는 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 합성, 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드(VIP 단편을 포함하는 합성 화합물, 이의 유도체, 유사체 및 의태물로서 언급됨)인 경우, 방사성 약제를 제조하는 시약을 제공한다. 킬레이트화 부분은 시약의 합성 동안에 시약내로 함유된다. 부가적으로, 본 발명의 테크네튬 또는 레늄 표지된 방사성 약제는 방사선 요오드화 네거티브 VIP의 친화도의 약 1/10 이상인 VIP 수용체 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Tc-99m로 방사선 표지된 본 발명의 시약을 포함하는 방사선 치료제를 제공한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 레늄-186 및 레늄-188로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 파괴성 방사성 동위 원소로 표지된 본 발명의 시약을 포함하는 방사선 치료제를 제공한다. 시약 및 Tc-99m, Re-186 또는 Re-188인 방사선 표지의 착물은 환원제, 예를 들어 제 1 주석 이온의 존재하에서 본 발명의 시약과 방사선 표지를 반응시킴으로써 형성된다. 본 발명의 시약을 갖는 Tc-99m, Re-186 또는 Re-188의 착물도 또한 예비 환원된 방사선 표지 착물의 리간드 변환에 의해 제조됨으로서 제공된다.
이와 같이, 본 발명은 또한 킬레이트화 부분이 Tc-99m과 안정하게 착물을 형성하는 본 발명의 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 포함하는 신티그래피 영상화제를 제공한다.
본 발명은 또한 레늄-186 또는 레늄-188로 방사선 표지된 본 발명의 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드인 방사선 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체중에 본 발명의 방사선 표지된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일면은 바람직하게 신티그래피 영상화제를 포함하는 방사선 치료 및 방사선 진단 방사성 약제를 제조하는 시약을 제공한다. 각각의 상기 시약은 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 혈관 활성 장 펩티드, 유도체, 유사체 또는 의태물인 화합물로 구성된다.
방사선 표지화제를 제조하기 위해 본 발명에 의해 제공된 시약의 제 1 일면은 하기 화학식을 갖는 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 상기에 설명된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드로 각각 이루어진 시약이다:
C(pgp)5-(aa)-C(pgp)5
상기식에서, (pgp)5는 수소 또는 티올 보호기이고 (aa)는 티올기를 포함하지 않는 a- 또는 b-아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 아미노산은 글리신이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 신티그래피 영상화제이다. 그러나 또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 방사선 치료제이다.
제 2 구체예에서, 본 발명은 방사선 진단 및 방사선 치료제를 형성하도록 방사선 표지될 수 있고, 각각 하기 화학식을 갖는 부분을 함유하는 단일 티올을 포함하는 킬레이트기에 공유적으로 결합된 혈관 활성 장 펩티드를 포함하는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 제공한다:
A-CZ(B)-{C(RaRh)}n·X
상기식에서,
A는 H, HOOC, H2NOC, (펩티드)-NHOC, (펩티드)-OOC, Re 2NCO, 또는 Rd이고;
B는 H, SH 또는 -NHRc, -N(Rc)-(펩티드) 또는 Rd이고;
Z는 H 또는 Rd이고;
X는 SH 또는 -NHRc, -N(Rc)-(펩티드) 또는 Rd이고;
Ra, Rb, Rc및 Rd는 개별적으로 H 또는 직쇄 또는 측쇄 또는 고리형 저급 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2 이고;
Rc은 C1-C4알킬, 아미노산 또는 2 내지 약 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드이며;
(1) B가 -NHRc또는 -N(Rc)-(펩티드)인 경우에, X는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
(2) X가 -NHRc또는 -N(Rc)-(펩티드)인 경우에, B는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
(3) B가 H 또는 Rd인 경우에, A는 HOOC, H2NOC, (펩티드)-NHOC 또는 (펩티드)-OOC이고, X는 SH이며 n은 0 또는 1이고;
(4) A가 H 또는 Rd인 경우, 그리고 B가 SH인 경우에, X는 -NHRc또는 -N(Rc)-(펩티드)이고 X가 SH인 경우, B는 -NHRc또는 -N(Rc)-(펩티드)이며 n은 1 또는 2이고;
(5) X가 H 또는 Rd인 경우, A는 HOOC, H2NOC, (펩티드)-NHOC, 또는 (펩티드)-OOC이며 B는 SH이고;
(6) Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H2NOC, (펩티드)-NHOC, 또는 (펩티드)-OOC이고 B는 SH이며 n이 0이다. 바람직한 구체예에서, 제제는 신티그래피 영상화제이다. 그러나 또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 방사선 치료제이다.
상기 킬레이트화 부분의 바람직한 구체예는 하기 화학식을 갖는다:
R1-CO-(아미노산)1-(아미노산)2-Z
상기식에서,
(아미노산)1및 (아미노산)2은 각각 개별적으로 티올기를 포함하지 않는 일차 a- 또는 b-아미노산이고,
Z는 시스테인, 호모시스테인, 이소시스테인, 페니실아민, 2-메르캅토에틸아민 또는 3-메르캅토프로필아민인 티올 함유 부분이며,
R1은 저급 (C1-C4) 알킬, 아미노산 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드이다. Z가 시스테인, 호모시스테인, 이소시스테인 또는 페니실아민인 경우에, 상기 부분의 카르보닐기는 히드록실기, NR3R4기(여기에서, R3및 R4는 개별적으로 H 도는 저급 (C1-C4) 알킬, 아미노산 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드임)에 공유적으로 결합된다. 또는 상기 구체예는 하기 화학식을 갖는다:
Y-(아미노산)2-(아미노산)1-NHR2
상기식에서,
Y는 시스테인, 호모시스테인, 이소시스테인, 페니실아민, 2-메르캅토에틸아민 또는 3-메르캅토프로필아민인 티올 함유 부분이고,
(아미노산)1및 (아미노산)2은 각각 개별적으로 티올기를 포함하지 않는 일차 a- 또는 b-아미노산이며,
R2는 H 또는 저급 (C1-C4) 알킬, 아미노산 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드이다. Y가 시스테인, 호모시스테인, 이소시스테인 또는 페니실아민인 경우에, 상기 부분의 아미노기는 -H, 아미노산 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드에 공유적으로 결합된다.
본 발명의 상기 일면의 특정 구체예에서, 킬레이트화 부분은 하기 화학식을 갖는다:
IIa. -(아미노산)1-(아미노산)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X},
IIb. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(아미노산)1-(아미노산)2,
IIc. -(일차 α,β- 또는 β,γ-디아미노산)-(아미노산)1-{A-CZ(B)-{C
(R1R2)n}-X}, 또는
IId. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(아미노산)1-(일차 α,β- 또는 β,γ-디아미노산)
상기식에서,
(아미노산)1및 (아미노산)2은 각각 개별적으로 티올기를 함유하지 않는 자연발생, 수정, 치환 또는 변형된 α- 또는 β-아미노산이고;
A는 H, HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, (아미노산 또는 펩티드)-OOC 또는 R4이고;
B는 H, SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
Z는 H 또는 R4이고;
X는 SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
R1, R2, R3및 R4는 개별적으로 H 또는 직쇄 또는 측쇄 또는 고리형 저급 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2인 정수이고;
(펩티드)는 2 내지 약 10개의 아미노산의 펩티드이며;
(1) B가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, X는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
(2) X가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, B는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
(3) B가 H 또는 R4인 경우에, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이고, X는 SH이며 n은 0 또는 1이고;
(4) A가 H 또는 R4인 경우, 그리고 B가 SH인 경우에, X는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이고 X가 SH인 경우, B는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이며 n은 1 또는 2이고;
(5) X가 H 또는 R4인 경우, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이며 B는 SH이고;
(6) Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이고 B는 SH이며 n이 0이다.
부가 바람직한 구체예는 화학식을 갖는다: -Gly-Gly-Cys-, Cys-Gly-Gly-, Gly-Gly-Cys-, (ε-Lys)-Gly-Cys-, (δ-Orn)-Gly-Cys-, -(γ-Dab)-Gly-Cys-, (β-Dap)-Lys-Cys- 및 -(β-Dap)-Gly-Cys-. (상기 화학식에서, ε-Lys는 보편적인 α-아미노기보다 ε-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 리신 잔기이고; δ-Orn는 보편적인 α-아미노기보다 δ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 오르니틴 잔기이고; γ-Dab는 γ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 2,4-디아미노부티르산 잔기이며; β-Dap는 β-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 1,3-아미노프로피온산 잔기이다.)
그러나 본 발명의 또 다른 구체예는 포유류 체내 부위를 영상화시키거나 방사선 치료 목적으로 방사성 동위 원소로 방사선 표지될 수 있고, 각각 비스아미노-비스티올 킬레이트화 부분인 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 혈관 활성 장 펩티드를 포함하는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약을 제공한다. 본 발명의 상기 구체예에서 비스아미노 비스티올 킬레이트화 부분은 하기 화학식을 갖는다:
(상기식에서,
각 R은 개별적으로 H, CH3또는 C2H5일 수 있고;
각 (pqp)5는 개별적으로 티올 보호기 또는 H일 수 있고;
m, n 및 p는 개별적으로 2 또는 3이고;
A는 직선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로시클릴 이들의 조합체 또는 이의 치환된 유도체이며;
X는 펩티드임)
또는
(상기식에서,
각 R은 개별적으로 H, CH3또는 C2H5이고;
m, n 및 p는 개별적으로 2 또는 3이고;
A는 직선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로시클릴 배합체 또는 이의 치환된 유도체이며;
V는 H 또는 CO-펩티드이고;
R'는 H 또는 펩티드이고;
단 V가 H인 경우에, R'이 펩티드이고 R'가 H인 경우에, V가 펩티드이다.
X는 펩티드임). 본 발명의 목적을 위해서, 상기 구조를 갖는 킬레이트화 부분은 BAT 부분으로서 언급될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제는 신티그래피 영상화제이다. 그러나 또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 방사선 치료제이다.
본 발명은 또한 방사성 약제 및 (i) 하기 화학식(I)의 군 및 (ii) 하기 화학식(II)의 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드를 포함하는, 상기 방사성 약제를 제조하기 위한 시약을 제공한다:
I
II
상기식에서,
n, m 및 p는 각각 개별적으로 0 또는 1인 정수이고;
각 R'는 개별적으로 H, 저급 알킬, C2-C4히드록시알킬, 또는 C2-C4알콕시알킬이고,
각 R은 개별적으로 H 또는 R(여기에서, R는 티올기를 포함하지 않는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐임)이며,
R 또는 R' 중의 하나는 L(여기에서, L은 금속 킬레이터를 표적 부분에 결합시키는 2가 결합기 부분임)이고, R'인 L인 경우에, NR'2는 아민이다.
바람직한 구체예에서, L은 C1-C6직쇄, 측쇄 또는 고리형 알킬기, 카르복실 에스테르, 카르복사미드, 술폰아미드, 에테르, 티오에테르, 아민, 알켄, 알킨, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-결합, 치환되거나 비치환된 벤젠 고리, 또는 아미노산 또는 2 내지 약 10개의 아미노산의 펩티드, 또는 이들의 조합체이다.
바람직한 구체예에서, R는 C1-C6직쇄, 측쇄 또는 고리형 알킬기; -CqOCr-, -CqNHCr- 또는 -CqSCr-기(여기에서, q 및 r은 각각 1 내지 5의 정수이며, q와 r의 합은 6 이하임); (C1-C6) 알킬-X(여기에서, X는 히드록실기, 치환된 아민, 구아니딘, 아미딘, 치환된 티올기, 또는 카르복실산, 에스테르, 인산염, 또는 황산염기; 페닐기 또는 할로겐, 히드록실, 치환된 아민, 구아니딘, 아미딘, 치환된 티올, 에테르, 인산염, 또는 황산염기로 치환된 페닐기; 인돌기; 1내지 3개의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유하는 C1-C6헤테로고리기 또는 이들의 조합체이다.
본 발명의 바람직한 킬레이트화 부분은 하기 화학식(III)을 갖는 킬레이터를 포함한다:
III
상기식에서,
R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, C2-C4히드록시알킬, 또는 C2-C4알콕시알킬이고;
R3, R4, R5및 R6는 개별적으로 H, 티올기를 포함하는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
R7및 R8은 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 저급 히드록시알킬 또는 저급 알콕시알킬이고;
L은 2가 결합기이며
Z는 혈관 활성 장 펩티드이다.
본 발명의 부가 바람직한 금속 킬레이터는 하기 화학식(IV)을 갖는 킬레이터를 포함한다:
IV
상기식에서,
R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, C2-C4히드록시알킬, 또는 C2-C4알콕시알킬이고;
R3, R4, R5및 R6는 개별적으로 H, 티올기를 포함하는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
R3, R4, R5또는 R6중 하나는 Z-L-HN(CH2)n-(여기에서, L은 2가 결합기이고, Z는 표적 부분이며, n은 1 내지 6의 정수임)이고;
R7및 R8은 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 저급 히드록시알킬 또는 저급 알콕시알킬이며;
X는 아미노기, 치환된 아미노기 또는 -NR1-Y(여기에서, Y는 아미노산, 아미노산 아미드, 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드임)이다.
본 발명의 더욱 바람직한 금속 킬레이터는 하기 화학식(V)을 갖는 킬레이터를 포함한다:
V
상기식에서,
R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 저급 히드록시알킬, 또는 저급 알케닐알킬이고;
R3및 R4는 개별적으로 H, 티올기를 포함하는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
n은 1 내지 6의 정수이고;
L은 2가 결합기이며
Z는 혈관 활성 장 펩티드 부분이다.
본 발명의 부가 바람직한 킬레이트화 부분은 하기 화학식(VI)을 갖는 킬레이터를 포함한다:
VI
상기식에서,
L은 2가 결합기이며
Z는 혈관 활성 장 펩티드 부분이다.
본 발명의 가장 바람직한 킬레이트화 부분은 하기 화학식을 갖는 킬레이터를 포함한다:
(아미노산)1-(아미노산)2-시스테인-,
(아미노산)1-(아미노산)2-이소시스테인-,
(아미노산)1-(아미노산)2-호모시스테인-,
(아미노산)1-(아미노산)2-페니실아민-,
(아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토에틸아민-
(아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토프로필아민-,
(아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토-2-메틸프로필아민-,
(아미노산)1-(아미노산)2-3-메르캅토프로필아민-,
상기식에서, (아미노산)은 티올기를 포함하지 않는 일차 α- 또는 β-아미노산이고, 상기 킬레이터는 공유 결합을 통해 킬레이터의 카르복실 말단 또는 아미노산기중 하나상의 측쇄와 함께 표적 부분 또는 결합기에 결합된다.
또한 본 발명의 가장 바람직한 킬레이터는 (아미노산)1이 α,γ- 또는 β,γ-아미노산이고, α- 또는 β-아미노기는 유리 아민이고 α,γ- 또는 β,γ-아미노산은 γ 아미노기를 통해 공유적으로 결합되는 상기 화학식의 킬레이터를 포함한다.
다른 가장 바람직한 킬레이터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다:
-시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
-이소시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
-호모시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
-페니실아민-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
2-메르캅토아세트산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
2- 또는 3-메르캅토프로피온산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
2-메르캅토-2-메틸프로피온산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
상기식에서, (아미노산)은 티올기를 포함하지 않는 일차 α- 또는 β-아미노산이고, 상기 킬레이터는 공유 결합을 통해 킬레이터의 아미노 말단 또는 아미노산기중 하나상의 측쇄로 표적 부분 또는 결합기에 결합된다.
특히 바람직한 금속 킬레이터는 -Gly-Gly-Cys-, Arg-Gly-Cys-, (ε-Lys)-Gly-Cys-, (δ-Orn)-Gly-Cys-, -(γ-Dab)-Gly-Cys-, (β-Dap)-Lys-Cys- 및 -(β-Dap)-Gly-Cys-. (상기 화학식에서, ε-Lys는 보편적인 α-아미노기보다 ε-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 리신 잔기이고; δ-Orn는 보편적인 α-아미노기보다 δ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 오르니틴 잔기이고; γ-Dab는 γ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 2,4-디아미노부티르산 잔기이며; β-Dap는 β-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유적으로 결합되어 펩티드 결합을 형성하는 1,3-아미노프로피온산 잔기이다.)
상기 화학식(III)의 바람직한 킬레이트화 부분의 예는 하기 화학식(VII)를 갖는 킬레이터 부분을 형성하는 킬레이터 Gly-Gly-Cys-이다:
VII.
상기 화학식(VII)를 갖는 킬레이터 리간드는 하기 화학식(VIII)를 갖는 옥소테크늄 착물을 형성한다:
VIII.
상기에 제시된 바와 같이 상기 화학식(V)를 갖는 더욱 바람직한 킬레이트화 부분의 예는 하기 화학식(IX)의 킬레이트화 부분을 형성하는 Lys-(ω-펩티드)-Gly-Cys 아미드이다:
IX.
상기 화학식(IX)를 갖는 킬레이터 리간드는 하기 화학식(X)를 갖는 옥소테크늄 착물을 형성한다:
X.
상기에 제시된 바와 같이 상기 화학식(II)를 갖는 킬레이트화 부분을 포함하는 본 발명에 의해 제공된 방사성 약제를 제조하기 위한 시약의 예는 하기 화학식(XI)의 킬레이트화 부분을 형성하는 (표적 부분)-Cys-Gly-α,β-디아미노프로피온아미드이다:
XI.
상기 화학식(XI)를 갖는 방사선 진단제는 하기 화학식(XII)를 갖는 옥소테크늄 착물을 형성한다:
XII.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 킬레이트화 부분은 펩티드를 포함하는 아미노기에서 다른 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드에 공유적으로 결합된다. 본 명세서에 설명되는 바와 같이, 합성 동안에 펩티드내로 킬레이트화 부분을 혼입시키거나 화학적 합성 동안에 펩티드내로 킬레이트화 부분에 대한 특정 결합 부분을 혼입시키는 것이 특히 유용하다. 리신 잔기의 측쇄중의 아미노기는 여러 위치에서 혈관 활성 장 펩티드중에 존재하여 킬레이트화 부분의 부위 특정 결합에 유용하지 않다. 특히, 티올기는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드에 킬레이트의 결합을 위한 특이한 결합 부위로서 바람직하다.
또한 본 발명은 시험관 화학적 합성에 의해 본 발명의 펩티드 시약을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 수용체 결합 혈관 활성 펩티드는 고체상 펩티드 합성에 의해 합성된다.
본 발명은 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 본 발명의 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드를 포함하는 방사선 표지된 혈관 활성 수용체 결합제를 제조하는 시약을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 시약은 Tc-99m로 방사선 표지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 시약은186Re 또는188Re로 방사선 표지된다.
본 발명은 또한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약과 방사성 동위 원소의 착물인 제제 이외에, 본 발명의 펩티드 시약을 방사선 표지시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공되는 신티그래피 영상화제는 환원제의 존재하에서 본 발명의 혈관 활성 장 펩티드 시약과 Tc-99m을 반응시킴으로써 형성된 Tc-99m 표지화 착물을 포함한다. 바람직한 환원제는 제한하지 않고서, 디티오나이트 이온, 제 1 주석 이온 및 제 1 철 이온을 포함한다. 본 발명의 상기 Tc-99m 착물은 또한 본 명세서에 제공된 바와 같이 예비 환원된 Tc-99m 착물의 리간드 교환에 의해 본 발명의 혈관 활성 장 펩티드 시약을 Tc-99m로 표지시킴으로써 형성된다.
본 발명은 또한 본 발명의 혈관 활성 장 펩티드 시약으로부터 방사선 표지된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드를 제조하는 킷을 제공한다. 본 발명의 펩티드 시약을 방사선 표지시키기 위한 킷은 상기 시약을 방사선 표지시키기 위해 본 발명의 미리 결정된 양의 펩티드 시약 및 충분한 양의 환원제가 들어있는 밀폐병으로 구성된다. 본 발명의 킷의 바람직한 구체예의 한 일면에는 Tc-99m로 본 발명의 펩티드 시약을 방사선 표지시키기 위한 킷이 있다. 바람직한 방사성 동위 원소가 레늄-186 및 레늄-188인 경우에, 방사선 치료제를 제조하기 위한 킷도 또한 제공되어 있다.
본 발명은 진단학적 및 치료학적으로 본 발명의 방사선 표지된 혈관 활성 장 수용체 결합 펩티드 시약을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에는, 생체내에서 감마 신티그래피 영상을 얻음으로써 포유류 체내의 영상화 부위를 영상화시키기 위한 Tc-99m 표지화 펩티드 시약인 신티그래피 영상화제를 사용하는 방법이 제공되어 있다. 이러한 방법은 본 발명의 방사선 표지된 펩티드 시약을 진단학적 유효량으로 투여하는 단계 및 포유류 체내 부위에서 편재된 방사선 표지에 의해 방출된 감마선을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 동물, 바람직하게는 사람에게서 VIP 표지화 질환을 완화시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 동물에게 방사선 표지된 VIP 수용체 결합 펩티드 시약을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 시약은186Re 및188Re로 방사선 표지된다.
본 발명은 또한, 자성, 상자성, 초자성 또는 초상자성 금속 원자, 이온 또는 입자와 착물화된 금속 결합 부분에 공유결합된 VIP 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 및 생체내의 종양 또는 다른 조직 부위에서 이러한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 복합체의 위치를 자성 기본 검출하기 위해 이러한 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 생체내에 종양 및 다른 혈관 활성 장 수용체 발현 조직을 위치시키기 위한 비방사능 방법을 제공한다.
본 발명의 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 및 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약은 또한 다가 결합 부분으로 구성될 수 있다. 본 발명의 다가 결합 부분은 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 또는 킬레이트 부분 또는 양자 모두에 공유적으로 결합할 수 있는 2 이상의 동일한 결합제 작용기로 구성된다. 바람직한 결합제 작용기는 일차 또는 이차 아민, 히드록실기, 카르복실산기 또는 티올 활성기이다. 바람직한 구체예에서, 다가 결합 부분은 비스-숙신이미딜메틸에테르 (BSME), 4-(2,2-디메틸아세틸)벤조산(DMBA), N-{2-(N',N'-비스(2-숙신이미도-에틸)아미노에틸)}-N6,N9-비스(2-메틸-2-메르캅토-프로필)-6,9-디아자노난아미드(BAT-BS), 트리스(숙신이미딜에틸)아민(TSEA), 비스-숙신이미도헥산(BSH), 4-(O-CH2CO-Gly-Gly-Cys.아미드)-2-메틸프로피온페논(ETAC), 트리스(아세트아미도에틸)아민, 비스-아세트아미도메틸 에테르, 비스-아세트아미도에틸 에테르, α,ε-비스-아세틸리신, 리신 및 1,8-비스-아세트아미도-3,6-디옥사-옥탄, 또는 이의 유도체로 구성된다.
본 발명의 구체적인 바람직한 구체예는 일부 바람직한 구체예 및 청구항의 보다 상세한 설명 부분에 따라 자명해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 방사성 약제의 제조 또는 진단 및 치료에서 시약으로서 유용한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 및 이들의 단편, 유도체, 유사체 및 의태물을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드의 양태는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 이들의 단편, 유도체, 유사체 및 의태물이 킬레이트화 부분에 결합되어 있는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약이다. 이러한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약은 방사선 진단제 또는 방사선 치료제를 제공하도록 방사성 표지될 수 있다. 본 발명의 방사성 표지화제를 사용하는 방사선 진단 응응용의 일례는 VIP 수용체 생성 종양의 위치 및 정도를 검출할 수 있는 신티그래피 영상화이다. 본 발명의 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 시약은 또한 방사선 치료용으로 레늄-186 또는 레늄-188과 같은 세포독성 방사성 동위원소로 방사선 표지시키는 것이 유리할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 신티그래피 영상화제는 방사능 검출 수단(감마-카메라 또는 신티그래피 검출기 프로브를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)으로 검출할 수 있는 방사성 표지화제를 포함하는 것을 의미한다.
다른 한편으로는, 본 발명의 방사선 치료 양태는 레늄-186 또는 레늄-188로 표지시키는 것이 유리하다. 이러한 양태는 악성 또는 양성 종양을 포함하는 세포의 표면 상에 VIP 수용체의 발현을 통해 VIP 또는 VIP 유사체를 결합시킬 수 있는 이러한 종양의 성장을 특징으로 하는, 결장 직장암 및 다른 질환을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 동물, 바람직하게는 사람의 VIP-관련 질환 또는 다른 질환의 치료에 유용하다.
본 발명을 위해, 용어 VIP 수용체 결합 친화도는, 특히 해리 상수, 억제 상수 또는 IC50값에 의해 결합 친화도를 측정하는 방법을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정되는 바와 같은 결합 친화도를 의미한다. 표현 방사선 요오드 VIP의 친화도의 1/10 이상의 친화도를 갖는은 친화도가 방사선 요오드 VIP의 친화도 보다 10배 이상 낮지 않고, 억제 상수(Ki) 또는 IC50이 방사선 요오드 VIP의 값의 10배 이하임을 의미한다.
킬레이트화 부분, 및 본 발명에 의해 제공되는 티올 보호기{(pgp)5}에 공유 결합된 티올을 함유하는 이러한 킬레이트화 부분에 공유 결합된 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드에서, 티올 보호기는 하기의 보호기와 동일하거나 상이할 수 있지만, 이들로 제한되지 않을 수 있다 :
-CH2-아릴 (아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);
-CH2-(아릴)2(아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);
-CH2-(아릴)3(아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);
-CH2-(4-메톡시페닐);
-CH-(4-피리딜)(페닐);
-C(CH3)3;
-9-페닐플루오레닐;
-CH2NHCOR (R은 비치환 또는 치환된 알킬 또는 아릴임);
-CH2NHCOOR (R은 비치환 또는 치환된 알킬 또는 아릴임);
-CONHR (R은 비치환 또는 치환된 알킬 또는 아릴임);
-CH2-S-CH2-페닐.
바람직한 보호기는 화학식 -CH2 2 -NHCOR을 가지며, 여기에서 R은 탄소수 1 내지 8개의 저급 알킬, 페닐, 또는 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시 도는 저급 알콕시카르보닐로 치환된 페닐이다.
본 발명을 위해, 용어 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드(들)은 당업자에 의해 인지되는 다양한 세포 유형으로 발현되는 VIP 수용체에 특이적으로 결합되는 자연 발생 VIP, 이들의 단편, 유사체 또는 유도체를 포함한다. VIP의 수용체 결합 특성을 모방하도록 디자인된 화합물(즉, 의태물)이 또한 상기 정의에 포함되고, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 시약의 특히 바람직한 양태는 하기 시약을 포함한다 :
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.(β-Dap)KCK.아미드).아미드
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.GGCK.아미드).아미드
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.(δ-Orn)GCK.아미드).아미드
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(BAT).아미드
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGGC.아미드
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.GGCE.아미드).아미드 및
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(ε-K)GC.아미드.
모든 자연 발생 아미노산은 표준 약칭법을 사용하여 약칭된다 (이것은 문헌[G. Zubay, Biochemistry(2d. ed.), 1988(MacMillen Publishing: New York) p.33]에서 발견할 수 있다). 본 발명을 위해, 자연 발생 아미노산은 친유성(알라닌, 이소로이신, 로이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 피롤린, 트립토판 및 발린, 및 시스테인의 S-알킬화 유도체), 친수성(아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 세린), 산성(글루타르산 및 아스파르트산), 염기성(아르기닌, 히스티딘 및 리신)을 특징으로 한다. ε-K는 리신 잔기의 측쇄 상의 ε-아미노기를 통한 공유 결합을 나타내는 것이다. δ-Om은 대표적 α-아미노기 보다는 δ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유결합되어 펩티드 결합을 형성하는 오르니틴 잔기를 나타낸다. γ-Dab는 γ-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유결합되어 펩티드 결합을 형성하는 2,4-디아미노부티르산 잔기를 나타낸다. β-Dab는 β-아미노기가 인접 아미노산의 카르복실기에 공유결합되어 펩티드 결합을 형성하는 1,3-디아미노프로피온산 잔기를 나타낸다. (BAT)는 N6,N9-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-6,9-디아자노난산을 나타내고; K.(BAT) 및 Lys.(BAT)는 아미노산 측쇄 상의 ε-아미노기에서 (BAT)로 아실화된 아미노산 리신을 나타내고; C(BAT) 및 Cys(BAT)는 S-(N6,N9-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-6,9-디아자노난-1-일)시스테인을 나타내고; (BAM)은 N1,N1-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-1,4,10-트리아자데칸을 나타내고; (BAT-BM)은 N-{2-(N1,N1-비스(2-말레이미도에틸)아미노에틸}-N9-(t-부톡시카르보닐)-N6,N9-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자노난아미드이고; (BAT-BS)는 N-{2-(N1,N1-비스(2-숙신이미도에틸)아미노에틸}-N6,N9-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-6,9-디아자노난아미드이고; (BMME)는 비스-말레이미도메틸에테르이고; (BSME)는 비스-숙신이미도메틸에테르이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 하기의 아미노산 및 아미노산 유사체가 하기의 약어에 의해 표현된다 : Acm은 술피딜 보호기 아세트아미도메틸이고; Pen은 페니실아민이고; Aca는 6-아미노카프로산이고; Hly는 호모리신이고; Apc는 L-{S-(3-아미노프로필)시스테인이고; Fd는 D-페닐알라닌이고; Wd는 D-트립토판이고; Yd는 D-티로신이고; Cpa는 L-(4-클로로페닐)알라닌이고; Thp는 4-아미노-테트라히드로티오피란-4-카르복실산이고; D-Nal은 D-2-나프틸알라닌이고; Dpg는 디프로필글리신이고; Nle는 노르로이신이고; Hcy는 호모시스테인이고; Hhc는 호모호모시스테인이고; Alb는 아미노이소부티르산이고; Nal은 2-나프틸알라닌이고; D-Nal은 D-2-나프틸알라닌이고; Ain은 2-아미노인단-2-카르복실산이고; Achxa는 4-아미노-시클로헥시랄라닌이고; Amf는 4-아미노메틸-페닐알라닌이고; Aec는 S-(2-아미노에틸)세린이고; Apc는 S-(3-아미노프로필)시스테인이고; Aes는 O-(2-아미노에틸)세린이고; Aps는 O-(3-아미노프로필)세린이고; Abu는 2-아미노부티르산이고; Nva는 노르발린이다.
본 발명에 의해 제공되는 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 및 이들의 유도체 및 유사체는 생체외에서 화학적으로 합성시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드는 일반적으로, 펩티드 합성기에서 제조하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 킬레이트화 부분, 또는 킬레이트화제에 대한 독특한 결합 부분이 생체외에서의 화학적 합성 동안 펩티드에 공유결합되도록 합성되며, 화학적 전환은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 합성되는 동안 킬레이트화 부분, 또는 독특한 결합 부분에 공유결합된 이러한 펩티드가 공유결합의 특정 자리를 결정할 수 있기 때문에 유리하다.
본 발명의 킬레이트화 부분은 펩티드 합성 동안, 또는 펩티드 합성 동안 혈관 활성 장 펩티드 내로 혼입되는 독특한 아미노산에 대한 결합을 통해, 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 이들의 유도체 또는 유사체 내로 도입된다. 시스테인 또는 호모시스테인은 펩티드 합성 동안 펩티드 중의 특정 위치에서 혼입될 수 있고, 킬레이트화 부분은 나중에 시스테인 또는 호모시스테인 티올기에 자리 특이적으로 공유결합될 수 있다. 본 발명은 킬레이트화 부분을 자리 선택적 방식으로 사실상 펩티드 중의 임의의 위치에 혼입시키는 것을 제공한다. 본 발명은 특히, 아미노산 측쇄에 결합된 방사선 표지화 킬레이트화 부분을 포함하는 아미노산 유도체를 제공하며, 여기에서 킬레이트화제, 또는 킬레이트화제가 후속적으로 자리 특이적으로 결합된 독특한 아미노산이 펩티드 중의 특정 위치에서 생체외 펩티드 합성 동안 펩티드 내에 혼입되어 있다. 본 발명은 또한, 방사선 표지 킬레이트화 부분이 카르복실 말단에서 펩티드 내에 혼입되어 있는 펩티드를 제공한다. 바람직한 양태에서, 방사선 표지 킬레이트화제는 합성 혈관 활성 장 펩티드의 아미노산의 측쇄 내에 또는 그 위에 혼입되며, 여기에서 아미노산은 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이다 :
-SDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드
다른 바람직한 양태에서, 방사선 표지 킬레이트화 부분은 펩티드의 아미노산의 측쇄 중에 있는 자리에서 합성 혈관 활성 장 펩티드 내로 혼입되며, 여기에서 아미노산은 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이다 :
-NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드
다른 바람직한 양태에서, 방사선 표지 킬레이트화 부분은 펩티드의 천연 또는 대용 아미노산의 측쇄 중에 있는 자리에서 합성 혈관 활성 장 펩티드 내로 혼입되며, 여기에서 아미노산은 펩티드의 하기 서열 중의 아미노산이다 :
-KQMAVKKYLNSILN.아미드
추가의 양태에서, 방사선 표지 킬레이트화 부분은 펩티드의 카르복실산 말단에서 합성 혈관 활성 장 펩티드 내로 혼입된다.
본 발명의 시약의 특정 장점은 이들이 방사선 표지 킬레이트화 부분, 또는 킬레이트화제가 후속적으로 자리 특이적으로 결합될 수 있는 독특한 아미노산이 합성 동안 펩티드 내로 혼입되도록 제공된다는 점이다. 이것은, 혈관 활성 장 펩티드 또는 혈관 활성 장 펩티드 단편, 유사체 또는 유도체 중의 공지된 위치에서 킬레이트화제를 위치시켜서 VIP 수용체에 대한 펩티드의 친화도가 감소되는 것을 피하도록 하기 때문에 유리하다. 킬레이트화제를 종래에 공지된 펩티드 내로 도입시키는 방법은 펩티드보다 훨씬 더 크고, 킬레이트화 부분의 비-자리 특이적 도입의 효과에 민감한 단백질에 대해 최초로 개발된 방법으로부터 우세하게 개발되었다. 종래의 방법을 사용하여 생성된 펩티드는, 종래의 방법을 사용할 경우에 펩티드 결합 친화도를 감소시키는 방식으로 킬레이트화제를 도입시킬 가능성으로 인해, 본 발명의 펩티드 중의 킬레이트화제의 자리 특이적 도입과 비교하여 불리하다.
또한, 본 발명의 장점은 펩티드가 화학적으로 합성된 펩티드로서 제공된다는 점이다. 그 이유는 화학적 합성이 질이 조절되고 약제학적으로 적합한 생성물을 제공할 수 있기 때문이다. 화학적 합성 방법은 앱센트(absent)를 제거하거나 시험하기 위해 고비용의 실험을 필요로 하는 병원균(바이러스, 미코플라즈마 등)의 도입을 수반할 수 있는 생물학적 합성 및 추출과 같은 다른 방법 보다 바람직하다. 화학적 합성에 의해 제조되는 생성물은 제조하는 데에 비용이 덜 들고 성공적 조절 승인에 더욱 순응하여, 약제학적 구체물을 병원 및 시장에 신속히 공급하기 위한 능력을 제공한다.
방사능 테크네튬과 본 발명의 시약의 복합체를 생서시키는 데에 있어서, 바람직하게는 Tc-99m 퍼테크네테이트의 염이 환원제의 존재하에 시약과 반응한다. 바람직한 환원제는 디티오나이트, 제 1 주석 및 제 1 철 이온이며; 가장 바람직한 환원제는 염화 제 1 주석이다. 이러한 복합체를 제조하기 위한 수단은 표지시키려는 예정된 양의 본 발명의 시약 및 시약을 Tc-99m으로 표지시키기 위한 환원제가 들어있는 밀폐병을 포함하는 킷 형태로 제공되는 것이 유리하다. 대안적으로, 복합체는 본 발명의 시약을 테크네튬과 전달 리간드로서 공지된 또다른 화합물의 미리 형성된 불안정 복합체를 반응 시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 방법은 리간드 교환법으로서 공지되어 있으며, 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 불안정 복합체는 예를 들어 타르타르산염, 시트르산염, 글루콘산염 또는 만니톨과 같은 전달 리간드를 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명에 유용한 Tc-99m 퍼테크네테이트염 중에는, 나트륨염, 또는 암모늄염 또는 저급 알킬 암모늄염이 포함된다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 테크네튬-표지화 또는 레늄-표지화 펩티드를 제조하기 위한 킷이 제공된다. 적절한 양의 펩티드 시약이 펩티드를 Tc-99m, Re-186 또는 Re-188로 표지시키기에 충분한 양으로, 염화 제 1 주석과 같은 환원제를 함유하는 바이알 내에 도입된다. 기술된 바와 같은 적절한 양의 전달 리간드(예를 들어, 타르타르산염, 시트르산염, 글루콘산염, 글루코헵탄산염 또는 만니톨)이 또한 포함될 수 있다. 킷은 또한, 예를 들어 삼투압을 조절하기 위한 약제학적으로 허용되는 염, 완충제, 방부제 등과 같은 통상적인 약제학적 보조 물질을 함유할 수 있다. 킷의 성분은 액체, 동결 또는 건조 형태일 수 있다. 바람직한 양태에서, 킷 성분은 동결건조된 형태로 제공된다.
본 발명에 따르는 Tc-99m, Re-186 및 Re-188 표지된 방사성 약제는 적절한 양의 Tc-99m, Re-186 또는 Re-188, 또는 이들의 방사성 핵종 복합체를 바이알 내에 첨가하고, 하기의 실시예 2에 기술된 조건하에 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 방사능적으로 표지된 신티그래피 영상화제는 적절한 양의 방사능을 갖도록 제공된다. Tc-99m 방사능 복합체를 생성시키는 데에 있어서, 1㎖당 약 0.01 내지 100 밀리퀴리(mCi)의 농도로 방사능을 함유하는 용액 중에서 방사능 복합체를 생성시키는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명에 의해 제공되는 영상화 시약은 영상화될 수 있는 기관 중의 질환, 및 종양, 특히 위장관 종양, 더욱 구체적으로는 결장 직장 종양을 진단하기 위한 결장과 같은 기관을 포함하는 VIP 수용체의 발현 또는 과발현의 자리를 가시화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, Tc-99m 표지화 펩티드 시약은 단일 단위 주입 용량으로 투여된다. 본 발명에 의해 제공되는 Tc-99m 시약은 수성 식염 매질과 같은 정맥내 주입을 위한 임의의 통상적인 매질 중에서, 또는 혈장 매질 중에서 정맥내 투여될 수 있다. 일반적으로, 투여하려는 단위 용량은 약 0.01 내지 약 100mCi, 바람직하게는 1 내지 20mCi의 방사능을 갖는다. 단위 용량으로 주입하려는 용액의 양은 약 0.01 내지 약 10㎖이다. 정맥내 투여 후에, 생체내 영상화가 수분 동안 이루어질 수 있다. 그러나, 영상화는 바람직하다면 수시간 또는 그 이상 동안 이루어질 수 있다. 대부분의 경우에, 충분한 양의 투여된 용량이 약 0.1 시간 내에 영상화시키려는 부분에 축적되어, 신티포토를 얻을 수 있을 것이다. 진단을 위한 신티그래피 영상화의 임의의 통상적인 방법이 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 기술된 바와 같은 특정 종양의 방사선 치료를 위해 사용될 수 있는 레늄-186 또는 레늄-188과 같은 세포독성 방사성 동위원소로 방사선 표지된 펩티드를 제공한다. 이를 위해, 약 10 내지 약 200mCi의 방사성 동위 원소가 임의의 적합한 임상 경로를 통해, 바람직하게는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 자성, 상자성, 초자성 또는 초상자성 금속 원자, 이온 또는 입자와 착화된 금속 결합 부분에 공유결합된 VIP 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드, 및 생체내의 종양 또는 다른 조직 부위에서 이러한 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 복합체의 위치를 자성 기본 검출하기 위해 이러한 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 생체내에 종양 및 다른 혈관 활성 장 수용체 발현 조직을 위치시키기 위한 비방사능 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 진단 및 방사선 진단제, 및 치료 및 방사선 치료제를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 제제의 방사선 표지화 양태, 예를 들어 Tc-99m 표지화 신티그래피 영상화제에 대해, 효과적인 진단 및 치료량의 본 발명의 진단 및 방사선 진단제, 및 치료 및 방사선 치료제가 투여된다. 방사선 진단 양태에서, 방사선 표지의 위치는 감마 섬과 조영술과 같은 통상적인 방법을 사용하여 검출된다. 비방사능 진단 양태에서, 본 발명의 상자성 금속 표지화 진단제의 축적 자리의 위치는 자기 공명 영상화 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명을 위해, 방사선 치료는 고통 완화 내지 치료의 치료 효과로서 정의된다.
본 발명에 의해 제공되는 영상화제는 종양을 영상화시키기 위해, 특히 일차 및 정적 신형성 자리를 영상화시키기 위해 유용하며, 여기에서 상기 신형성 세포, 특히 통상적인 방법을 사용하는 검출이 임상적으로 어려운 이러한 일차 및 특히 정적 결장 직장 종양 세포가 VIP를 발현시킨다.
당업자들은 당분야에 공지된 많은 생체내 방법 중 어느 하나를 사용하여, 효과적인 방사성 약제를 확인하고, 시험하고 특징화시킬 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 방법은 특히, VIP 그자체에서, 그리고 본 발명의 방사성 약제를 방사선 표지화 VIP와의 경쟁에 사용하는 실험에서, 또는 본 발명의 방사성 약제와의 경쟁에서 비표지화 VIP를 사용하는 반대 실험에서, 동족 VIP 수용체에 대한 본 발명의 방사성 약제의 결합의 해리 상수 또는 억제 상수의 결정, 및 이러한 결합과 방사선 표지된, 예를 들어135I-표지된 방사성 약제의 결합의 친화도 또는 결합성의 비교를 포함한다.
본 발명의 실시에서, 효과적인 방사선 진단 및 방사선 치료제는 하기와 같이 제조된다. 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드 및 혈관 활성 장 펩티드 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 본 발명의 시약은 킬레이트화 부분을 화학적 합성 동안 펩티드 내에 혼입시키는 본 발명의 방법을 사용하여 합서된다. 그다음, 본 발명의 시약은 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, 바람직하게는 ReO 착물로서 레늄과 착화된다. VIP 수용체 결합은 하기 실시예 4에 기술된 바와 같이, 방사선 요오드 VIP를 사용하여 본원에 기술되는 바와 같은 생체외 경쟁 결합 검정에서 평가된다.
이들 화합물을 제조하고 표지시키는 방법은 하기의 실시예에서 더욱 상세히 설명된다. 이들 실시예는 상기 기술된 방법의 특정 양태 및 유용한 결과를 예시하며, 예시를 위해 기재한 것이고 제한적이지는 않다.
실시예 1
BAT 킬레이터의 합성
A.N-Boc-N'-(5-카르복시펜틸),N,N'-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민의 합성
a.2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로파날
무수 THF(테트라하이드라푸란: 2ℓ)중에 용해된 트리페닐메틸메르캅탄(362.94g, 1.31 몰, 100몰%)을 아르곤하에서 빙욕으로 냉각시켰다. 수소화나트륨(오일중 60%:54.39g, 1.35 몰, 104몰%)을 20 분 동안 나누어 첨가하였다. 2-브로모-2-메틸프로파날(206.06g, 1.36 몰, 104몰%; 참조: Stevens Gillis, 1957.J. Amer. Chem. Soc.79:3448-51)을 20분 동안 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 12 시간 동안 교반하였다. 반응물을 물(1ℓ)로 급냉시키고, 디에틸 에테르(3 x 1ℓ)로 추출하였다. 에테르 추출물을 수집하여 포화된 NaCl 용액(500㎖)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하였다. 감압하에서 용매를 제거하여 두꺼운 오랜지색 오일을 얻었다. 미정제 오일을 톨루엔(200㎖)중에서 용해시키고, 고온의 헥산으로 2ℓ로 희석하였다. 혼합물을 소결된 유리 깔대기를 통해 여과시키고, 12 시간 동안 -5℃ 로 냉각하였다. 형성된 백색 결정성 고체를 여과에 의해 제거하여 266.36g의 표제 화합물(수율 59%)을 수득하였다. 생성된 화합물의 융점은 83-85℃인 것으로 측정되었다. 핵자기 공명 특성 시험으로 하기 분자 기호가 얻어졌다:
b. N,N '-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민.
에틸렌디아민(1.3㎖, 0.0194 몰, 100몰%)를 아르곤하에서 메탄올(40㎖) 및 무수 THF(40㎖)중에 용해된 2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로파날(13.86g, 0.0401 몰, 206몰%)에 첨가하고, 아세트산을 적가하여 pH를 6으로 조절하였다. 상기 용액을 20℃에서 20분 동안 교반하였다. 나트륨 시아노보로하이드라이드(1.22g, 0.0194몰, 100몰%)를 첨가하고, 반응물을 3 시간 동안 실온에서 교반하였다. 나트륨 시아노보로하이드라이드(1.08g)를 추가로 첨가하고, 반응물을 17 시간 동안 20℃에서 교반하였다. 나트륨 시아노보로하이드라이드(1.02g) 최종 분량을 첨가하고, 반응물을 아르곤하에서 6 시간 동안 환류하에 가열하였다. 반응물을 0.5M HCl(100㎖)로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(2 x 100㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 수집하고, 2M NaOH(60㎖)로 세척하고, 이어서 포화된 NaCl 용액(60㎖)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하였다. 감압하에서 용매를 제거하여 16.67g의 미정제 생성물을 수득하고, 이 생성물을 톨루엔/헥산으로 결정화시켜 백색 결정의 표제 화합물 10.20g(수율 73%)를 수득하였다. 생성된 화합물의 융점은 83-86℃인 것으로 측정되었다. 핵자기 공명 특성 시험으로 하기 분자 기호가 얻어졌다:
c.N-(5-카르복에톡시펜틸)-N,N'-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민
K2CO3(1.92g, 13.9밀리몰, 100몰%)를 CH3CN(60㎖)중의N,N'-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민(10.03g, 13.9밀리몰)에 첨가한 후, 에틸 5-브로발레레이트(3.30㎖, 20.8 밀리몰, 150몰%)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 아르곤하에서 환류하에 가열하였다. 이후, 용액을 페이스트로 농축시키고, 0.25M KOH(100㎖) 및 에틸 아세테이트(100㎖)사이에서 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1 x 50㎖)로 추출하고, 결합된 에틸 아세테이트층을 50㎖의 물과 NaCl 용액(2 x 50㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 오렌지색 오일로 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)(300g의 플래시 실리카, 100% CHCl3내지 MeOH/CHCl3)로 정제하여 순수한 표제 화합물(7.75g, 수율 66%)을 수득하였다. FABMS 분석으로 849의 (MH+)(화합물 C55H64N2O2S2의 분자량 계산치 849.24와 비교하여)가 얻어졌다.
d.N-Boc-N'-(5-카르복시펜틸)-N,N'-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민
1M KOH(25㎖, 25.0밀리몰, 274 몰%)를 디옥산(200㎖)중의N-(5-카르보에톡시펜틸)-N,N'-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)에틸렌디아민(7.75g, 9.13밀리몰)에 첨가한 후, 물(250㎖)을 첨가하였다. 이후, 균질한 용액을 얻어질 때까지 디옥산을 교반하면서 적가하였다. 반응물을 밤새 느린 환류하에 가열하였다. 대부분의 디옥산을 회전식 증발에 의해 제거하고, 용액의 pH를 1M KH2PO4로 ∼7 내지 8로 조절하고, NaHCO3로 농축하였다. 이후, 이 용액을 에틸 아세테이트(3 x 75㎖)로 추출하고, 결합된 유기층을 NaCl 용액(50㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 포움/고체로 농축시켰다(6.35g, 수율 85%).
상기 반응의 미정제 생성물에 (BOC)2O(3.35g, 15.4 밀리몰, 200몰%), CH3CN(50㎖) 및 메틸렌 클로라이드(50㎖)를 부가한 후, 트리에틸아민(1.0㎖, 7.2 밀리몰, 93몰%)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 아르곤하에 실온에서 교반하였다. 이후 반응 용액을 농축시키고, 물(100㎖)와 에틸 아세테이트(50㎖) 사이에서 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1 x 50㎖)로 추출하고, 결합된 에틸 아세테이트층을 5% 시트르산 및 NaCl 용액(50㎖, 각각)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 오렌지색 오일로 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(200g의 플래시 실리카, 100% CDCl3내지 5% 메탄올/클로로포름)로 정제하여 순수한 표제 화합물(2.58g, 수율 36%)을 수득하였다. FABMS 분석으로 921의 (MH+)(화합물 C58H68N2O4S2의 계산치 921.31와 비교하여)가 얻어졌다.
B.N-Boc-N'-(5-카르복시펜틸)-N,N'-비스[2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]에틸렌디아민
a. N,N'-비스 [2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]에틸렌디아민
메탄올(500㎖)중의N,N'-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)에틸렌디아민(11.23g, 47.5 밀리몰; 참조: DiZio et al., 1991, Bioconjugate Chem2: 353 and Corbin et al., 1976. J. Org. Chem.41: 489)을 얼음/물 욕으로 냉각시킨 후, 45분 동안 기체 암모니아로 농축시켰다. 이 용액에 4-메톡시벤질 클로라이드(17.0㎖, 125밀리몰, 264몰%)를 부가하였다. 반응물을 아르곤하에서 교반하면서 밤새 실온으로 가온시켰다. 이 용액을 페이스트로 농축시킨 후, 디에틸 에테르(150㎖) 과 0.5M KOH(200㎖)사이에서 분배시켰다. 수성층을 디에틸 에테르(2 x 50㎖)로 추가 추출하였다. 결합된 유기층을 NaCl 용액으로 세척하고, 투명한 무색 오일로 농축시켰다. 이후, 디에틸 에테르(200㎖)에 용해된 오일을 더 이상의 침전물이 관찰되지 않을 때까지 디옥산중에서 4.0M HCl로 산성화시켰다. 백색 침전을 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 백색 고체를 pH ∼ 2에서 고온수로 재결정화시켰다. 생성물을 여과에 의해 수집하여 모노 및 디-HCl 염의 혼합물로서 29.94g을 얻었다. HCl 염을 1M KOH(100㎖)과 에틸 아세테이트(100㎖) 사이에서 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(2 x 30㎖)로 추출하고, 결합된 유기층을 NaCl 용액으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜, 밝은 황색 오일로서 유리 염기로 순수한 생성물을 수득하였다(18.53g, 수율 82%). 핵자기 공명 특성 시험으로 하기 분자 기호가 얻어졌다:
b.N-(5-카르보에톡시펜틸)-N,N'-비스[2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]에틸렌디아민
CHCN3(50㎖)중의N,N'-비스[2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]-에틸렌디아민(4.13g, 8.66밀리몰)을 K2CO3(1.21g, 8.75밀리몰, 101몰%)에 첨가한 후, 에틸 5-브로모발레레이트(2.80㎖, 17.7밀리몰, 204몰%)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 환류하에서 교반하고, 진공하에서 페이스트로 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(100㎖)와 0.5M KOH(100㎖) 사이에서 분배시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1 x 50㎖)로 추출하고, 결합된 유기층을 NaCl 용액(50㎖)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 황색 오일로 농축시켰다(∼6g). 표준상 정제 HPLC(25분 동안 100% CHCl3내지 5% 메탄올/클로로포름)로 정제하여 순수한 표제 화합물을 수득하였다 (1.759g, 수율 34%). FABMS 분석으로 605의 (MH+)(화합물 C33H52N2O4S2의 계산치 604.90와 비교하여)가 얻어졌다. 핵자기 공명 특성 시험으로 하기 분자 기호가 얻어졌다:
c.N-Boc-N'-(5-카르복시펜틸)-N,N'-비스[2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]에틸렌디아민
THF(40㎖)중의N-(5-카르보에톡시펜틸)-N,N'-비스[2-(4-메톡시벤질티오)-2-메틸프로필]에틸렌디아민(586㎎, 0.969밀리몰)에 물(30㎖) 및 1M KOH(2.5㎖, 2.5 밀리몰, 260몰%)을 부가하였다. 이 균질한 용액을 밤새 느린 환류하에 가열하였다. 이후, 용액을 실온으로 냉각시키고, THF를 회전식 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 50㎖의 물로 희석하고, 1M HCl로 pH를 ∼2 내지 3으로 조절하였다. 용액을 에틸 아세테이트(3 x 30㎖)로 추출하고, 결합된 유기층을 NaCl 용액(50㎖)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜, 미정제 산을 수득하였다(422㎎, 수율 75%).
상기 반응의 미정제 생성물에 CH3CN(40㎖) 및(BOC)2O(240㎎, 1.10 밀리몰, 150몰%)를 첨가한 후, 트리에틸아민(0.200㎖, 1.43 밀리몰, 196몰%)를 첨가하였다. 이 균질한 용액을 밤새 아르곤하에 실온에서 교반하였다. 이후, 상기 용액을 페이스트로 농축시키고, 에틸 아세테이트(25㎖)와 1M KH2PO4(25㎖) 사이에서 분배시켰다. 유기층을 5% 시트르산(2 x 25㎖) 및 NaCl 용액(25㎖)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 황색 오일로 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(50㎖의 플래시 실리카 겔, 100% 클로로포름 내지 15% 메탄올/클로로포름)로 정제하여 순수한 표제 화합물(344㎎, 수율 70%)을 수득하였다. FABMS 분석으로 677의 (MH+)(화합물 C36H56N2O6S2의 계산치 676.97와 비교하여)가 얻어졌다. 핵자기 공명 특성 시험으로 하기 분자 기호가 얻어졌다:
C. BAT-BM(N-[2-(N',N'-비스(2-말레이미도에틸)아미노에틸)]-N6,N9-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자노난아미드)의 합성
BAT-BM을 하기와 같이 제조한다. BAT 산(N 9-(t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자논산)(10.03g, 10.89밀리몰) 및 75㎖의 건조 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2)를 자석 교반 막대 및 아르곤 벌룬(balloon)이 구비된 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 부가하였다. 이 용액에 디이소프로필카르보디이미드(3.40㎖, 21.7 밀리몰, 199몰%)를 부가하고, N-히드록시숙신이미드(3.12g, 27.1 밀리몰, 249 몰%)를 부가하였다. 용액이 1시간 이내에 흐려지는 것으로 관찰되었으며, 이후 실온에서 총 4시간 동안 교반하면서 인큐베이팅시켰다. 30㎖의 메틸렌 클로라이드중의 트리스(2-아미노에틸)아민(30㎖, 200밀리몰, 1840 몰%) 용액을 부가하고, 밤새 계속해서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 감압하에서 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(150㎖)와 0.5M 탄산칼륨(K2CO3; 150㎖) 사이에서 분배시켰다. 유기층을 분리시켜 염수로 세척하고, 농축시켜, 포움/오일로서 미정제 생성물N-[2-(N',N'-비스(2-아미노에틸)아미노에틸)]-N 9-(t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자노난아미드를 수득하였다.
상기 미정제 생성물을, 300㎖ THF를 함유하는 자석 교반 막대가 구비된 1000㎖의 둥근 바닥 플라스크에 부가한 후, 30㎖의 포화된 중탄산나트륨(NaHCO3), 100㎖의 물 및 N-메톡시카르보닐말레이미드(6.13g, 39.5밀리몰, 363몰%)를 부가하였다. 이 불균질한 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. THF를 회전식 증발에 의해 혼합물로부터 제거하고, 수성 잔류물을 에틸 아세테이트(2 x 75㎖)로 2회 추출하였다. 이러한 추출의 결합된 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시키고, 중간 프릿(frit)을 통해 여과시키고, 약 12g의 미정제 생성물로 농축시켰다. 액체 크로마토그래피(250g 이산화규소/클로로포름→클로로포름중의 2% 메탄올의 구배로 용리됨)로 정제하여 5.3g의 순수한 생성물 (N-[2-(N',N'-비스(2-말레이미도에틸)아미노에틸)]-N 9-(t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스(2-메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자노난아미드)(수율 40%)과 함께 다시 정제하여 순수한 생성물로 수득될 수 있는 약 5g의 미정제 생성물을 수득하였다. 정제된 생성물이 화학 분석으로 하기와 같이 BAT-BM으로 확인되었다:
D. BAT-컨쥬게이트된(eN) Lys(aN-Fmoc)[N-e-(N 9 -t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난오일)-N-a-Fmoc-리신의 합성
교반 막대 및 아르곤 벌룬이 구비된 100㎖의 가지 하나 달린 둥근 바닥 플라스크에 50㎖의 CH2Cl2중의N 9 -t-(부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난산(BAT 산: 3.29g, 3.57 밀리몰)를 실온에서 충전하였다. 이 플라스크에 디이소프로필카르보디이미드(DIC: 580㎕, 3.70 밀리몰, 104몰%)를 부가한 후, 곧바로 N-히드록시숙신이미드(HOSu: 432㎎, 3.75 밀리몰, 105몰%)을 부가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하는 동안 백색의 침전물이 발생하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 고체 포움으로 농축하였다. 100㎖이 둥근 바닥 플라스크중의 미정제 포움을 디메톡시에탄 및 물의 2: 1 혼합물 75㎖중에 용해시켰다. 이 균질한 용액에N-a-Fmoc-리신 히드로클로라이드(1.52g, 3.75 밀리몰, 105몰%)를 첨가한 후 K2CO3(517㎎, 3.74 밀리몰, 105 몰%)을 첨가하고, 황색 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 이후 용액을 100㎖의 에틸 아세테이트 및 100㎖의 물을 함유하는 250㎖의 에르렌마이어(erlenmeyer) 플라스크에 부었다. 유기층을 분리시키고, 수성층을 50㎖의 에틸 아세테이트로 추가 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(100㎖)로 1회 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 황색 고체로 농축하였다. 이 미정제 생성물을 저압 액체 크로마토그래피(150g SiO2, CHCl3→ CHCl3중의 10% 메탄올로 구배됨)로 정제하였다. 이러한 방식으로 표제 화합물 3.12g을 제조하였다(수율 69%). 정제된 생성물이 화학분석으로 하기와 같이 확인되었다:
FABMS MH+는 1270.6으로 예견되었고, 1272로 실측되었다.
E. BAM(N 1-(t-부톡시카르보닐)-N 1,N 4-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4,10-트리아자데칸의 합성
교반 막대 및 아르곤 벌룬이 구비된 250㎖의 가지 하나 달린 둥근 바닥 플라스크에 50㎖의 CH3CN 및 30㎖의 디옥산중의N 1,N 4-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-에틸렌디아민(BAT-I 산: 10.0g, 14.01 밀리몰)을 충전하였다. 이 플라스크에N-(5-브로모페닐)-프탈이미드(8.04g, 27.1 밀리몰, 194몰%)를 부가한 후, K2CO3(2.95㎎, 21.3 밀리몰, 152몰%)을 부가하였다. 혼합물을 2일 동안 아르곤하에 환류하에서 가열하였다. 이후, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 150㎖의 물과 150㎖의 에틸 아세테이트 사이에서 분배시켰다. 유기층을 분리시키고, 수성층(약 pH 10에서)을 50㎖의 에틸 아세테이트로 추가 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(75㎖)로 1회 세척하고, Na2CO3상에서 건조시키고, 오일로 농축하였다. 저압 액체 크로마토그래피(300g SiO2, CHCl3→ CHCl3중의 2% 메탄올)로 정제하여 황색 포움으로서 9.20g의 9-프탈이미도-N 1,N 4-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4-디아자난을 수득하였다. 이 중간 물질의 정제된 생성물이 화학분석으로 하기와 같이 확인되었다:
FABMS MH+는 935.4로 예견되었고, 936으로 실측되었다.
교반 막대가 구비된 500㎖의 가지 하나 달린 둥근 바닥 플라스크에 75㎖의 CH3CN 및 20㎖의 CH2Cl2중의 9-프탈이미도-N 1,N 4-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4-디아자난(8.83g, 9.43 밀리몰)을 충전하였다. 이 플라스크에 K2CO3(1.30g, 9.41 밀리몰, 100몰%)을 첨가한 후, 디-3차-부틸 디카보네이트(2.15g, 9.85 밀리몰, 100몰%)를 첨가하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 100㎖의 물과 에틸 아세테이트 사이에서 분배시켰다. 유기층을 분리시키고, 수성층을 50㎖의 에틸 아세테이트로 추가 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(75㎖)로 1회 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 농축시켜, 황색 포움으로서 9.69g의 미정제 9-프탈이미도-N 1-(t-부톡시카르보닐)-N1, N4-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4-디아자난을 수득하였다(99% 미정제 수율). 이 미정제 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
교반 막대 및 환류 응축기가 구비된 250㎖의 가지 하나 달린 둥근 바닥 플라스크에 25㎖의 THF중의 9-프탈이미도-N 1 -(t-부톡시카르보닐)-N 1 ,N 4 -비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4-디아자난(5.50g, 5.319밀리몰)을 충전시켰다. 물을 추가하여 출발물질을 용액으로부터 침전시켰다. 히드라진 하이드레이트(1.2㎖, 24.7밀리몰, 466몰%)을 부가하고, 반응물을 2일 동안 환류하에 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 물과 0.25M K2CO3각각 100㎖ 사이에서 분배시켰다. 유기층을 분리시키고, 염수(75㎖)로 1회 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 고체 포움으로 농축시켰다. 미정제 생성물을 저압 크로마토그래피(100g SiO2, CHCl3→ CHCl3중의 5% 메탄올, 칼럼은 CHCl3중의 200㎖의 2% 트리에틸아민으로 전처리함)에 의해 정제하여 황색 포움으로서 3.27g의 순수한N'-(t-부톡시카르보닐)-N 1,N 4-비스[2-(트리페닐메틸티오)프로필]-1,4,10-트리아자데칸을 수득하였다(수율 68%). 정제된 생성물이 화학분석으로 하기와 같이 확인되었다:
FABMS MH+는 905.5로 예견되었고, 906.5로 실측되었다.
F. [BAT]-컨쥬게이트된(S)-Cys(aN-Fmoc)(N(Fmoc)-S-(N 9-t-부톡시카르보닐) -N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난-1-일)시스테인)
a. (N 9-t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난-1-올(BAT-펜타놀)의 합성
아르곤하에서 250㎖의 건조 THF중의 BAT 산(10.4g, 10.89밀리몰)을 함유하는 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 12.1㎖의 1M BH3-THF(12.1 밀리몰)을 5분 동안 서서히 부가하였다. 부가시 포움이 발생하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하면서 인큐베이팅시켰다. 반응물을 과량의 메탄올(50㎖)로 급냉시키고, 추가의 2시간 동안 교반하면서 인큐베이팅시켰다. 용액을 증발에 의해 농축시키고, 잔류물을 200㎖ 에틸 아세테이트, 100㎖의 1M 시트르산 및 100㎖의 1M KH2PO4사이에서 분배시켰다. 유기층을 단리시키고, 각각 100㎖의 물, 포화된 NaHCO3및 염수로 연속적으로 세척하였다. 이후, 세척된 유기층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 증발에 의해 농축시켜 백색 포움으로서 8.82g의 미정제 생성물을 수득하였다(수율 89%). 정제된 생성물이 화학분석으로 하기와 같이 확인되었다:
b. O-메탄술포닐-(N 9-t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난-1-올(BAT-메실레이트)의 합성
아르곤하에서 100㎖의 건조 THF중의 BAT-펜타놀(8.80g, 9.70밀리몰)을 함유하는 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 1.6㎖의 트리에틸아민(11.5밀리몰)을 부가한 후, 0.83㎖의 메탄술포닐 클로라이드(10.7밀리몰)을 교반하면서 부가하였다. 용액이 상기 물질의 부가한지 몇 분 이내에 백색으로 탁하게 되었다. 실온에서 밤새 계속 교반하였다. 이 용액을 증발에 의해 농축시키고, 잔류물을 100㎖ 에틸 아세테이트와 100㎖의 1M KH2PO4사이에서 분배시켰다. 에틸 아세테이트층을 단리시키고, 100㎖의 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 증발시켜 밝은 황색 포움으로 9.61g의 미정제 생성물을 수득하였다(수율 100%).
c. S-(N 9-t-부톡시카르보닐)-N 6,N 9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난-1-일)시스테인(H-Cys(BAT)-OH)의 합성
20㎖ 소결 유리병내에서 시스테인(1.3g, 10.7밀리몰), 4㎖의 5.4M 나트륨 메톡사이드(21.6밀리몰) 및 5㎖ 무수 메탄올을 결합시켰다. 이 불균질한 용액을 80㎖의 무수 디메틸포름아미드(DMF)중의 BAT-메실레이트(9.57g, 9.71밀리몰) 용액에 부가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에서 회전식 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 100㎖ 에틸 아세테이트와 100㎖의 1M KH2PO4사이에서 분배시켰다. 에틸 아세테이트층을 단리시키고, 각각 100㎖의 포화된 NaHCO3및 염수로 연속적으로 세척한 후, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 증발에 의해 농축시켜 백색 포움을 수득하였다. 이 생성물의 특성을 분석하지 않고, 다음 합성 반응에 즉시 사용하였다.
d. N-플루오르레닐메톡시카르보닐-S-(N9-t-부톡시카르보닐)-N6,N9-비스[2-메틸-2-(트리페닐메틸티오)프로필]-6,9-디아자노난-1-일)시스테인(Fmoc-Cys(BAT)-OH)
상기에서 기술된 바와 같이 제조된 원료 H-Cys(BAT)-OH는 9.71m㏖ 생성물을 구성하리라 추정되었다. 이 원료 생성물을 1L 둥근바닥 플라스크내의 200㎖ THF 및 150㎖ 물중에 전량 용해시켰다. 이 균질 용액에 1.34g K2CO3(9.72m㏖)을 첨가한 후에, 3.28g의 N-플루오르레닐메톡시카르보닐옥시숙신이미드(9.73m㏖)을 첨가하였다. 그런후, 반응 혼합물로부터 대부분의 THF를 회전 증발을 사용하여 제거하고 잔류물을 100㎖ 에틸아세테이트와 100㎖ 1M KH3PO4에 분배시켰다. 에틸아세테이트 층을 분리하여 50㎖의 함염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 농축시켜서 황색의 포움을 수득하였다. 이 원료 생성물을 클로로포름중에서 300g의 실리카겔 및 선형 기울기의 0-3% 메탄올을 사용하는 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 크로마토그래피를 사용하여 10.1g의 순수한 Fmoc-Cys(BAT)-OH(BAT-메실레이트로부터 84% 수율)를 수득하였다. 이의 동일성이 확인된 정제 생성물의 화학적인 분석은 하기와 같다:
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 0.85 (12H, s), 1.23 (4H, br), 1.35 (9H, s), 1.5 (2H, m), 2.0-2.15 (2H, m), 2.15-2.35 (4H, m), 2.51 (2H, t, J=6), 2.85-3.05 (4H, m), 3.15 (2H, br), 4.1-4.2 (1H, m), 4.2-4.4 (3H, m), 7.05-7.4 (22H, m), 7.5-7.65 (14H, m), 7.71 (2H, d, J=7).
실시예 2
고체상 펩티드 합성
어플라이드 바이오시스템 모델 431A 펩티드 씬세사이저(Applied Biosystems Model 431A Peptide Synthesizer), 및 디시클로헥실카르보이미드/히드록시벤조트리아졸 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오르포스페이트/히드록시벤조트리아졸(HBTU/HOBT)와 커플링시켜서 9-플루오르레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 아미노 말단 보호를 사용하고, 카르복실 말단 산에 대해서는 p-히드록시메틸 베녹시메틸-폴리스티렌(HMP) 수지 또는 사스린(Sasrin) 또는 클로로트리틸 수지 또는 카르보닐 말단 아미드에 대해서는 링크(Rink) 아미드를 사용하여 0.25밀리몰(m㏖)의 규모로 고체상 펩티드 합성(SPPS)을 수행하였다.
적합하게는, Fmoc-Cys(BAT) 및 Nα-Fmoc-Nε-(BAT)Lys를 실시예 1에 기술된 바와 같이 합성하였다.
SPPS 동안에 커플링된 마지막 잔기로서 적합한 2-할로산을 사용하거나, 수지에 결합된 N-말단 유리 아미노산을 2-할로산/디이소프로필카르보이미드/N-히드록시숙신이미드/NMP 또는 2-할로산 무수물/디이소프로필에틸아민/NMP로 처리하여 적합하게는, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸 및 2-브로모-3-페닐프로피오닐기를 도입시켰다.
임의로, 0.5-1.0mM EDTA를 함유하는, 0.1-1.0㎎/㎖ 인산염 용액 또는 중탄산염 완충액 또는 희석 수산화암모늄(pH 8.0), 또는 아세토니트릴 또는 THF를 1-48시간 동안 교반시킨 후에, 임으로 아세트산으로 산성화, 동결건조 및 HPLC 정제를 수행함으로써 적합하게는, HPLC-정제된 2-할로아실화된 펩티드를 순환시켰다.
적합하게는, 실온에서 0.5-4시간 동안 pH 10에서 부분을 복합시키면서 티올 함유 펩티드를 클로로아세틸 함유, 티올 보호된 Tc-99m에 반응시킨 후에, 아세트산으로 산성화시키고 용액을 증발시켜서 상응하는 펩티드 황화물 부가 생성물을 수득한다. 기술된 바와 같이 탈보호 및 정제하여 킬레이터-펩티드 컨쥬게이트를 수득한다.
적합하게는, 단일 티올 함유 펩티드(N-메틸모르폴린 또는 N-에틸-모르폴린을 사용하여 pH 7로 완충화된 DMF중에서 5 내지 50㎎/㎖, 또는, 임의로, 0.5mM EDTA 또는 DMF 또는 THF 또는 아세토니트릴을 함유하는 pH 7-8의 50mM 인산나트륨 완충액)를 아세토니트릴중에 미리 용해시킨 0.5몰 등가량의 BMME(비스-말레이미도메틸에테르)와 약 1-18시간 동안 실온에서 반응시켜서 BSME 부가 생성물을 제조한다. 상기 용액을 농축시켜서 생성된 생성물을 HPLC를 사용하여 정제하였다.
적합하게는, 단일 티올 함유 펩티드(N-메틸모르폴린 또는 N-에틸모르폴린을 사용하여 pH 7로 완충화된 DMF중에서 10 내지 100㎎/㎖ 펩티드의 농도에서, 또는, 임의로, 0.5mM EDTA 또는 DMF 또는 THF 또는 아세토니트릴을 함유하는 pH 7-8의 50mM의 인산나트륨중 5 내지 50㎎/㎖ 펩티드 농도에서)를 아세토니트릴 또는 DMF중에 미리 용해시킨 0.33몰 등가량의 TMEA (트리스(2-말레이미도에틸)아민)과 약 1-18시간 동안 실온에서 반응시켜서 TSEA 부가 생성물을 제조한다. 부가 생성물을 함유하는 상기 반응 혼합물을 농축시킨 후에, 부가 생성물을 HPLC를 사용하여 정제한다.
적합하게는, 먼저 DMF, NMP 또는 염화메틸렌중에서 디이소프로필카르보이미드/N-히드록시숙신이미드 또는 HBTU로 펩티드 카르복실레이트를 활성화시킨 후에, 디이소프로필에틸아민의 존재하에 커플링시킴으로써 (BAM) (N1,N4-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-1,4,10-트리아자데칸)을 펩티드에 컨쥬게이션시킨다.
적합하게는, 펩티드 합성 동안에 (본원에서 참조로 인용된 공동 소유의 미국특허출원 일련번호 제 08/ 의 실시예 2에 기술된 바와 같이Nα(Fmoc)-리신과 Nε(N-Boc)-S,S'-비스트리틸-BAT로부터 제조된) (Nα(Fmoc)-Nε(N-Boc)-S,S'-비스트리틸-BAT)리신과 같은 보호된 아미노산 유도체로서, 또는 (상기에서, 실시예 1F에서 기술된 바와 같이 제조된) (N(Fmoc)-S,S'-비스트리틸-BAT)시스테인으로서 (BAT) (N6,N9-비스(2-메르캅토-2-메틸프로필)-6,9-디아자노나논산)을 펩티드중으로 혼입시키고, 그리고나서 합성수지로부터 완결된 펩티드를 분해시킨 후 탈보호시킨다.
적합하게는, 단일 티올 함유 펩티드(N-메틸모르폴린 또는 N-에틸모르폴린을 사용하여 pH 7로 완충화된 DMF중에서, 또는, 임의로, 0.5mM EDTA 또는 DMF 또는 THF 또는 아세토니트릴을 함유하는 (pH 7-8) 50mM의 인산나트륨중 2 내지 50㎎/㎖ 펩티드 농도에서)를 아세토니트릴 또는 THF중에 미리 용해시킨 0.5몰 등가량의 BAT-BM(N-{2-(N1,N1-비스(2-말레이미도에틸)아미노에틸)}-N9-(t-부톡시카르보닐)-N6, N9-비스(2메틸-2-트리페닐메틸티오프로필)-6,9-디아자노난아미드와 약 1-18시간 동안 실온에서 반응시켜서 BAT-BS (N-{2-(N1,N1-비스(2-숙신이미도에틸)아미노에틸)}-N6,N9-비스(2메틸-2-메르캅토프로필)-6,9-디아자노난아미드 부가 생성물을 제조한다. 그런후, 상기 용액을 증발 건조시키고, 10㎖ TFA와 0.2㎖ 트리에틸실란을 1시간 동안 처리하여 (BAT-BS)-펩티드 컨쥬게이트를 탈보호시킨다. 상기 용액을 농축시키고, 생성인 부가 생성물을 에테르로 침전시킨 후, HPLC를 사용하여 정제한다.
적합하게는, 측쇄 보호된 N-말단 유리 아민 및 C-말단 유리 산을 디페닐포스포릴아지드와 디페닐포스포릴아지드를 반응시킴으로써 펩티드 전구체를 (아미노- 및 카르복실-말단 사이에서) 사이클링시킨다.
디클로로메탄중의 1% TFA 용액을 사용하여 사스린(Sasrin) 수지 결합된 펩티드를 분해하여 보호된 펩티드를 수득한다. 적합하게는, 디페닐포스포릴아지드를 사용하여 측쇄 보호된 아미노 말단 유리 아민과 카르복실 말단 유리 산을 반응시킴으로써 아미노- 와 카르복실 말단 사이에서 보호된 펩티드 전구체를 사이클링시킨다.
HMP 또는 링크(Rink) 아미드 수지 결합된 생성물을 일반적인 방법으로 분해하고, 실온에서 3시간 동안 임의로, 물, 티오아니솔, 에탄디티올 및 트리에틸실란 또는 트리이소프로필실란을 100:5:5:2.5:2의 비로 포함하는, 트리플루오르아세트산(TFA), 또는 TFA와 염화메틸렌으로 이루어진 용액을 사용하여 보호된 사이클링되어진 펩티드를 탈보호시킨다. 적합하게는, 트리페놀메탄올/TFA중에서 생성물을 다시 S-트리틸화시키고, N-Boc 그룹을 (Boc)2O를 사용하여 펩티드중으로 다시 도입시켰다.
워터스 델타 파크 시18(Waters Delta Pak C18) 칼럼을 사용하는 제조 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 및 아세토니트릴로 개질된 물중에서 0.1%의 트리플루오르아세트산(TFA)를 사용하는 기울기 용리로 원료 펩티드를 정제한다. 아세토니트릴을 용리된 분획으로부터 제거한 후에 동결 건조시킨다. 고속 원자 충격 질량 스펙트로스코피(FABMS) 또는 전기분무 질량 스펙트로스코피(ESMS)를 사용하여 각 생성물의 동일성을 확인한다.
본원에서 제시된 바와 같이 합성된 수용체 결합 혈관작용 장 펩티드, 유도체 및 상동물, 및 FABMS에 의해 확인된 상기 합성의 생성물은 하기 표 1에 기재되어 있다.
실시예 3
Tc-99m으로 방사성 동위원소 표지화를 위한 일반적인 방법
실시예 2에서와 같이 제조된 0.1㎎의 펩티드를 0.1㎖ 또는 0.2㎖의 물 또는 0.9% 함염수중에 용해시켰다. 글루코스칸(Glucoscan) 유리병(이.아이 듀퐁 드 느무르, 인코포레이티드, 윌밍톤. 디이(E.I. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington. DE)를 200mCi까지를 함유하는 0.25㎖의 Tc-99m 과테크네늄산나트륨으로 재구성시켜서 실온에서 15분 동안 방치하여 Tc-99m 글루셉테이트를 제조하였다. 그런후, 25㎕의 Tc-99m 글루셉테이트를 펩티드에 첨가하고, 반응을 15 또는 55분 동안 실온 또는 100℃에서 진행시킨 후에 0.2㎕ 필터로 여과하였다.
Tc-99m 표지된 펩티드의 순도를 하기의 조건을 사용하는 역상 HPLC에 의해 결정하였다: 워터스 델타 파크 C-18, 5μ, 3.9mm x 150mm 분석 칼럼을 각 방사성 동위원소 표지된 펩티드로 로딩시키고, 1㎖/분(델타-파크)의 용매 유출 속도로 상기 펩티드를 용리시켰다. 20분 동안 20-50% 용매 B/용매 A(용매 A는 물중의 0.1% CF3COOH이고, 용매 B는 90/10 CH3CN/H2O중에서 0.1% CF3COOH임), 이어서 3분 동안 100%의 B/A의 기울기를 사용하는 기울기 용리를 수행하였다.
적분 기록계에 연결된 직렬 방사계의 검출기를 사용하여 방사성 성분을 검출하였다. Tc-99m 글루셉테이트 및 Tc-99m 과테크네늄산나트륨은 이들 조건하에서 1 내지 4분 동안 용리하지만, Tc-99m 표지된 펩티드는 훨씬 많은 시간 이후에 용리하였다. 220nm에서 직렬 분광광도계의 검출에 의해 펩티드를 검출하였다.
디메틸포름아미드 또는 아세토니트릴/물중에서 코튼등(Cotton et al)이 문헌[1996, Inorg, Chem.5: 9-16]에서 기술한 바와 같이 제조한, 1몰 등가량의 테트라부틸암모늄 옥소테트라브로모레네이트(+5)를 사용하여 본 발명의 각 펩티드 시약을 공통으로 용해시킴으로써 비방사성 레늄 착물을 제조한 후에, 0.5-5일 동안 교반시켰다. Tc-99m 표지된 펩티드에 대해서 상기에서 기술한 바와 같이 역상 HPLC를 사용하여 레늄 착물을 분리하여 FABMS 또는 ESMS로 특성화시켰다. 220nm에서 직렬 분광광도계 검출에 의해 펩티드로서 비방사성 펩티드를 검출하였다.
적합한 과테크네늄산 염으로부터 Tc-99m 표지화에 대해 동일한 프로토콜을 사용하거나, 펩티드 및 과테크네늄산염의 용액에 환원제를 첨가하거나, 임의로 시트르산과 같은 리간드 전이제를 사용하여 실온 내지 100℃에서 5 내지 60분 동안 상기 반응을 인큐베이션시킴으로써, 예를 들어 Re-186 또는 Re-188를 사용하여, 방사성 레늄 착물을 제조한다.
펩티드, Tc-99m 표지된 펩티드 및 ReO 착화된 펩티드의 HPLC 정제 결과는 표 2에 기재되어 있다.
실시예 4
생물학적인 검정
125I-표지된 VIP를 사용하여 경쟁 결합 검정에서 생물학적인 활성에 대하여 본 발명의 펩티드, 이들의 ReO-착화된 구체예를 검정하였다.
말초 혈액 단구세포 및 혈소판상에서; 및 다양한 사람의 종양 세포주상에서 기니아 피그의 폐로부터 분리한 막을 사용하여 VIP 결합의 표준 검정에서 상기 검정을 수행한다.
이와 같은 방법을 실시함에 있어서, 샤넨(Schanem)등이 문헌[1991, Lancet6: 395-396]에서 기술한 바와 같이, 요오드 발생 방법을 사용하여 VIP를 방사성 요오드화시켰다. 요약하면, 10㎕ 0.5M 인산염 완충액(pH 7.5)중의 50㎍ VIP, 적합한 양의 방사성 동위원소, 및 6㎍ 요오드 발생원을 교반하면서 실온에서 약 30분 동안 인큐베이션시켰다. HPLC 크로마토그래피를 사용하여 방사성 요오드화된 VIP를 혼입되지 않은 방사성 요오드로부터 정제하고, 0.1% 사람의 혈청 알부민과 0.1% 트윈(Tween)-80 세제로 보충된 인산염 완충화된 함염수(PBS)중에 용해시켰다.
분리된 래트 기니아 피그 폐 막을 사용하는 검정에서, 수컷 기니아 피그로부터 폐를 수득하여 본질적으로 카스테어(Carstairs)와 반니스(Barnes)가 본원에 참조로 인용된 문헌[1986, J, Pharmacol. Exp. Ther.239: 249-255]에서 기술한 바와 같이 막을 분리하였다. 본 발명의 다양한 농도의 펩티드, 또는 ReO 착물이 존재 또는 부재시에 0.2㎎의 막 제조물을 0.01nM125I-표지된 VIP로 인큐베이션시켰다. 표지되지 않은 VIP 화합물의 존재 또는 부재시에 결합의 범위를 비교하여,125I-표지된 VIP 결합의 억제에 해당하는 각 화합물에 대하여 농도를 50%까지 결정하였다(IC50으로 명명됨).
이들 방법을 사용하여, 각 시험하려는 화합물에 대한 결과는 표 4에 기재되어 있다. 이들 결과는 본 발명의 펩티드 및 펩티드의 ReO 착물이 VIP 수용체 발현 폐 막에 결합하는 VIP의 잠재적인 억제라는 것을 나타낸다.
보통의 말초적인 사람의 혈소판 및 단일 핵 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다.
이러한 실험을 함에 있어서, 버골리니(Virgolini)등이 문헌[1990, Brit. J.Cancer12: 849-861]에서 기술한 바에 따라 혈소판을 분리한다. 전체 혈액 연막으로부터 피콜(Ficoll) 밀도 형태(ρ=1.077)까지 말초 단일핵 세포(PMNCs)를 분리한다. 검정하기 전에, pH가 7인 50mM 트리스-HCl 완충액을 사용하여 세포를 세척한 후에, 5mM MgCl2, 1mM CaCl2및 0.1M NaCl로 보충된 상기와 동일한 완충액중에서 재현탁시킨다. 검정할 때마다 약 5 x 107세포를 사용한다.
혈소판과 PMNCs를 사용하는 이들 검정의 결과는 표 5에 기재되어 있으며, 본 발명의 펩티드의 ReO 착물이 이들 말초 혈액 세포에서 혈관 작용 장 수용체 결합에 효능성이 있는 길항약임을 입증한다.
상기에서 기술한 결합 경쟁 검정을 사용하여 하기의 종양 세포주를 검정하였다: KU812 세포 (사람의 만성 골수성 백혈병 세포주); COLO320 세포(사람의 결장 선암종 세포주); HT29 세포(사람의 항결장 선암종 세포주); PANC1 세포(사람의 췌장 선암종 세포주); HMC1 세포(사람의 비만 세포). 사람의 말초 혈액 세포에 대하여 본질적으로 상기에서 기술한 바와 같이 각 세포주를 검정한다. 표준 세포 배양 기술[참고문헌: Animal Cell Culture: A Practical Approach. Freshney, ed, IRL Press: Oxford, UK. 1992]을 사용하여 10% 소의 태아 혈청, 글루타민 및 항생물질을 보충한 RPMI 배지 또는 듈베코'스 모디파이드 메디아(Dulbecco's Modified Media)(HMC1 세포)에서 세포를 배양한다.
이들 검정의 결과는 표 6에 기재되어 있으며, 본 발명의 펩티드의 ReO 착물이 이들 사람의 종양 세포에 결합하는 혈관 작용 장의 효능성 억제제임을 입증한다.
이들 결과는 본 발명에 의해 제공된 혈관에 작용하는 장 펩티드 및 이들의 ReO 착물이 다양한 보통의 및 사람의 종양 세포 형태에 따라 표준 생체외 검정에서 혈관 작용 장 수용체에 특이적으로 결합함을 입증한다. 이들 결과는 본 발명의 혈관에 작용하는 장 펩티드가 사람의 종양 부위를 영상화하기 위한 신티그래피 촬영용 이미징 시약으로서 유용성을 지닌다는 것을 나타낸다.
이들 검정은 본 발명에 의해 제공된 바와 같이 효과적인 방사선 치료제를 선택하는데 사용되며, 여기에서 체외 혈관에 작용하는 장 수용체 발현 세포 및 막은 펩티드 합성 동안에 시약에 혼입된 킬레이팅 부분에 공유 결합되는 혈관에 작용하는 장 펩티드를 포함하는 본 발명의 Re-착화된 시약의 혈관 작용 장 수용제 결합을 검출하여 수량화하는데 사용된다. 그런후에, 상기 Re-착화된 시약이 방사성 요오드화된 혈관 작용 장을 사용하는 본원에서 기술한 바와 같은 경쟁 결합 검정에서 평가된다.
이전의 설명이 본 발명의 특정 구체예를 강조하고 있으며, 모든 변화 또는 이에 동등한 대안이 청구범위에서 설명된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범주내에 있음을 이해해야 한다.

Claims (60)

  1. 테크네튬 또는 레늄 방사선 표지를 킬레이트화시킬 수 있는 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 합성 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드인 방사성 약제를 제조하는 시약으로서, 상기 킬레이트화 부분이 시약의 합성 동안에 시약내로 혼입되고, 테크네튬 또는 레튬 표지된 방사성 약제가 방사선 요오드화된 천연 혈관 활성 장 펩티드의 친화도의 약 1/10 이상인 혈관 활성 장 펩티드 수용체 결합 친화도를 갖는 시약.
  2. 테크네튬-99m로 방사선 표지된 제 1 항의 시약을 포함하는 신티그래피 영상화제.
  3. 레늄-186 및 레늄-188로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 파괴 방사성 동위 원소로 방사선 표지된 제 1 항의 시약을 포함하는 방사선 치료제.
  4. 환원제의 존재하에서 제 1 항의 시약과 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188의 반응에 의해 형성된 착물.
  5. 제 4 항에 있어서, 환원제가 제 1 주석 이온인 착물.
  6. 예비 환원된 테크네튬-99m 착물의 리간드 교환에 의해 제 1 항의 시약을 테크네튬-99m로 표지시킴으로써 형성되는 착물.
  7. 예비 환원된 레늄 착물의 리간드 교환에 의해 제 1 항의 시약을 레늄-186 또는 레늄-188로 표지시킴으로써 형성되는 착물.
  8. 제 1 항의 시약과 제 1 주석 이온을 포함하는 조성물.
  9. 시약을 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188로 표지시키기 위해 미리 결정된 양의 제 1 항의 시약과 충분한 양의 환원제가 들어 있는 밀폐병을 포함하는, 방사성 약제를 제조하기 위한 킷.
  10. 환원제의 존재하에서 시약과 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188을 반응시킴을 포함하는, 제 1 항에 따른 시약을 표지시키는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 환원제가 제 1 주석 이온인 방법.
  12. 제 2 항의 시약을 진단학적 유효량으로 투여하는 단계 및 포유류 체내 부위에서 편재된 테크네튬-99m를 검출하는 단계를 포함하는, 포유류 체내의 부위를 영상화시키는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 펩티드가 생체외에서 화학적으로 합성되는 시약.
  14. 제 13 항에 있어서, 펩티드가 고체상 펩티드 합성에 의해 합성되는 시약.
  15. 제 13 항에 있어서, 방사선 표지 결합 부분이 생체외 화학적 합성 동안에 펩티드에 공유적으로 결합되는 시약.
  16. 제 15 항에 있어서, 방사선 표지 결합 부분이 고체상 펩티드 합성 동안에 펩티드에 공유적으로 결합되는 시약.
  17. 킬레이트화 부분이 하기 화학식(I) 내지 (IV)를 갖는 킬레이트화 부분으로 이루어진 군, 하기 화학식(V) 및 (VI)을 갖는 모노아민, 디아미드, 모노티올기로부터 선택된 부분인 시약:
    I
    C(pgp)5-(aa)-C(pgp)5
    (상기식에서, (pgp)5는 수소 또는 티올 보호기이고 (aa)는 1차 α- 또는 β-아미노산임);
    II
    A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X
    (상기식에서,
    A는 H, HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, (아미노산 또는 펩티드)-OOC 또는 R4이고;
    B는 H, SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
    X는 H, SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
    Z는 H 또는 R4이고;
    R1, R2, R3및 R4는 개별적으로 H 또는 저급 직쇄 또는 측쇄 또는 고리형 알킬이고;
    n은 0, 1 또는 2이고;
    (펩티드)는 2 내지 약 10개의 아미노산의 펩티드이며;
    B가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, X는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
    X가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, B는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
    B가 H 또는 R4인 경우에, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이고, X는 SH이며 n은 0 또는 1이고;
    A가 H 또는 R4인 경우, 그리고 B가 SH인 경우에, X는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이고 X가 SH인 경우, B는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이며 n은 1 또는 2이고;
    X가 H 또는 R4인 경우, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이며 B는 SH이고;
    Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이고 B는 SH이며 n이 0이며,
    티올 부분은 환원형으로 존재하고 (아미노산)은 티올기를 함유하지 않는 일차 α- 또는 β-아미노산임);
    III
    (상기식에서,
    각 R은 개별적으로 H, CH3또는 C2H5이고;
    각 (pgp)5는 개별적으로 티올 보호기 또는 H이고;
    m, n 및 p는 개별적으로 2 또는 3이고;
    A는 직선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 이들의 조합체 또는 이의 치환된 유도체임);
    IV
    (상기식에서,
    각 R은 개별적으로 H, CH3또는 C2H5이고;
    m, n 및 p는 개별적으로 2 또는 3이고;
    A는 직선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 이들의 조합체 또는 이의 치환된 유도체이고;
    V는 H 또는 -CO-펩티드이고;
    R'는 H 또는 펩티드이고;
    단 V가 H인 경우에, R'이 펩티드이고 R'가 H인 경우에, V는 -CO-펩티드임)
    상기에서, 각 R은 개별적으로 H, 탄소수가 1 내지 6인 저급 알킬, 페닐, 또는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로 치환된 페닐이고, 각 n은 개별적으로 1 또는 2이고;
    V
    VI
    (상기식에서,
    n, m 및 p는 각각 개별적으로 0 또는 1이고,
    각 R'는 개별적으로 H, 저급 알킬, 히드록시알킬 (C2-C4), 또는 알콕시알킬 (C2-C4)이고;
    각 R은 개별적으로 H 또는 R(여기에서, R는 티올기를 포함하지 않는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐임)이며,
    R 및 R' 중의 하나는 L이고, R'인 L인 경우에, NR'2는 아민이며,
    L은 방사선 표지 결합 부분을 펩티드에 결합시키는 2가 결합기임).
  18. 제 17 항에 있어서, 화학식 C(pgp)5-(aa)-C(pgp)5을 갖는 킬레이트화 부분의 시스테인이 화학식 -CH2-NH-CO-R(여기에서, R은 탄소수가 1 내지 6인 저급 알킬기, 2-,3-,4-피리딜, 페닐, 또는 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 또는 저급 알콕시카르보닐로 치환된 페닐임)의 티올 보호기를 갖는 시약.
  19. 제 18 항에 있어서, 킬레이트화 부분 C(pgp)5-(aa)-C(pgp)5이 하기 화학식을 갖는 시약:
  20. 제 17 항에 있어서, 단일 티올 킬레이트화 부분이 하기 화학식의 킬레이트화 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약:
    IIa. -(아미노산)1-(아미노산)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X},
    IIb. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(아미노산)1-(아미노산)2,
    IIc. -(일차 α,β- 또는 β,γ-디아미노산)-(아미노산)1-{A-CZ(B)-
    {C(R1R2)n}-X}, 및
    IId. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(아미노산)1-(일차 α,β- 또는 β,γ-디아미노산)
    상기식에서,
    (아미노산)1및 (아미노산)2은 각각 개별적으로 티올기를 함유하지 않는 자연발생, 수정, 치환 또는 변형된 α- 또는 β-아미노산이고;
    A는 H, HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, (아미노산 또는 펩티드)-OOC 또는 R4이고;
    B는 H, SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
    X는 SH 또는 -NHR3, -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드) 또는 R4이고;
    Z는 H 또는 R4이고;
    R1, R2, R3및 R4는 개별적으로 H 또는 직쇄 또는 측쇄 또는 고리형 저급 알킬이고;
    (펩티드)는 2 내지 약 10개의 아미노산의 펩티드이고;
    n은 0, 1 또는 2인 정수이며;
    B가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, X는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
    X가 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)인 경우에, B는 SH이며 n은 1 또는 2이고;
    B가 H 또는 R4인 경우에, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이고, X는 SH이며 n은 0 또는 1이고;
    A가 H 또는 R4인 경우, 그리고 B가 SH인 경우에, X는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이고 X가 SH인 경우, B는 -NHR3또는 -N(R3)-(아미노산 또는 펩티드)이며 n은 1 또는 2이고;
    X가 H 또는 R4인 경우, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (아미노산 또는 펩티드)-OOC이며 B는 SH이고;
    Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H2NOC, (아미노산 또는 펩티드)-NHOC, 또는 (펩티드)-OOC이고 B는 SH이고 n이 0이며, 티올 부분은 환원된 형태이다.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 시약을 포함하는 모노아민, 디아미드, 모노티올 킬레이트화 부분이 하기 화학식(VII)을 갖는 시약:
    VII
    상기식에서,
    R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 히드록시알킬 (C2-C4), 또는 알콕시알킬 (C2-C4)이고;
    R3, R4, R5및 R6는 개별적으로 H, 티올기를 포함하지 않는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
    R7및 R8은 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 저급 히드록시알킬 또는 저급 알콕시알킬이고;
    L은 2가 결합 부분이며
    Z는 펩티드이다.
  22. 제 17 항에 있어서, 상기 시약을 포함하는 모노아민, 디아미드, 모노티올 킬레이트화 부분이 하기 화학식(VIII)를 갖는 시약:
    VIII
    상기식에서,
    R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 히드록시알킬 (C2-C4), 또는 알콕시알킬 (C2-C4)이고;
    R3, R4, R5및 R6는 개별적으로 H, 티올기를 포함하지 않는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
    R3, R4, R5및 R6중의 하나는 Z-L-(CR2)n-(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이고 각 R은 개별적으로 H, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬임)이고;
    R7및 R8은 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 저급 히드록시알킬 또는 저급 알콕시알킬이고;
    L은 2가 결합 부분이고;
    Z는 펩티드이며;
    X는 -NH2, -NR1R2, 또는 -NR1-Y(여기에서, Y는 아미노산, 아미노산 아미드, 또는 2 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드임)이다.
  23. 제 17 항에 있어서, 상기 시약을 포함하는 모노아민, 디아미드, 모노티올 킬레이트화 부분이 하기 화학식(IX)를 갖는 시약:
    IX
    상기식에서,
    R1및 R2는 각각 개별적으로 H, 저급 알킬, 히드록시알킬 (C2-C4), 또는 알콕시알킬 (C2-C4)이고;
    R3및 R4는 개별적으로 H, 티올기를 포함하지 않는 치환되거나 비치환된 저급 알킬 또는 페닐이고;
    n은 1 내지 6의 정수이고;
    L은 2가 결합 부분이며
    Z는 펩티드이다.
  24. 제 17 항에 있어서, 상기 시약을 포함하는 모노아민, 디아미드, 모노티올 킬레이트화 부분이 하기 화학식(X)를 갖는 시약:
    X
    상기식에서,
    L은 결합기이며
    Z는 펩티드이다.
  25. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약:
    (아미노산)1-(아미노산)2-시스테인-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-이소시스테인-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-호모시스테인-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-페니실아민-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토에틸아민-
    (아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토프로필아민-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-2-메르캅토-2-메틸프로필아민-,
    (아미노산)1-(아미노산)2-3-메르캅토프로필아민-,
    (상기에서, (아미노산)은 티올기를 포함하지 않는 일차 α- 또는 β-아미노산이고, 상기 킬레이트화 부분은 공유 결합을 통해 킬레이트화 부분의 카르복실 말단 또는 킬레이트화 부분을 포함하는 아미노산기 중 하나상의 측쇄와 함께 펩티드에 결합됨).
  26. 제 25 항에 있어서, (아미노산)1이 α,β- 또는 β,γ-디아미노산(여기에서, α- 또는 β-아민은 유리 아미임)인 시약.
  27. 제 17 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약:
    -시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    -이소시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    -호모시스테인-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    -페니실아민-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    2-메르캅토아세트산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    2- 또는 3-메르캅토프로피온산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    2-메르캅토-2-메틸프로피온산-(아미노산)-(α,β- 또는 β,γ-디아미노산);
    (상기에서, (아미노산)은 티올기를 포함하지 않는 일차 α- 또는 β-아미노산이고, 상기 킬레이트화 부분은 공유 결합을 통해 킬레이트화 부분의 아미노 말단 또는 킬레이트화 부분을 포함하는 아미노산기 중의 하나상의 측쇄와 함께 펩티드에 결합됨).
  28. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 갖는 시약:
    Gly-Gly-Cys-
    Arg-Gly-Cys-
    -(ε-Lys)-Gly-Cys-
    -(δ-Orn)-Gly-Cys-
    -(γ-Dab)-Gly-Cys-
    -(β-Dap)-Gly-Cys-
    -(β-Dap)-Lys-Cys- 및
    -Cys(BAT).
  29. 테크네튬-99m으로 방사선 표지된 제 17 항의 시약인 신티그래피 영상화제.
  30. 레늄-186 및 레늄-188로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 파괴 방사성 동위 원소로 방사선 표지된 제 29 항의 시약을 포함하는 방사선 치료제.
  31. 환원제의 존재하에서 제 17 항의 시약과 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188의 반응에 의해 형성된 착물.
  32. 제 31 항에 있어서, 환원제가 제 1 주석 이온인 착물.
  33. 예비 환원된 테크네튬-99m 착물의 리간드 교환에 의해 제 17 항의 시약을 테크네튬-99m로 표지시킴으로써 형성된 착물.
  34. 예비 환원된 레늄 착물의 리간드 교환에 의해 제 17 항의 시약을 레늄-186 또는 레늄-188로 표지시킴으로써 형성된 착물.
  35. 제 17 항의 시약과 제 1 주석 이온을 포함하는 조성물.
  36. 방사성 약제를 제조하는 킷으로서, 시약을 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188로 표지시키기 위해 미리 결정된 양의 제 17 항의 시약과 충분한 양의 환원제가 들어 있는 밀폐병을 포함하는 킷.
  37. 환원제의 존재하에서 시약과 테크네튬-99m, 레늄-186 또는 레늄-188을 반응시킴을 포함하는, 제 17항에 따른 시약을 표지시키는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 환원제가 제 1 주석 이온인 착물.
  39. 포유류 체내의 부위를 영상화시키기 위한 의약품을 제조하기 위해 제 29 항의 시약을 사용하는 방법으로서, 시약을 포함하는 의약품이 포유류 체내의 부위에서 편재된 테크네튬-99m를 진단학적 유효량으로 투여되는 방법.
  40. 혈관 활성 장 펩티드 관련 질환으로 고생하는 동물에게 치료적으로 유효한 의약품을 제조하기 위해 제 30 항의 시약을 사용하는 방법.
  41. 제 17 항에 있어서, 펩티드가 생체외에서 화학적으로 합성되는 되는 시약.
  42. 제 41 항에 있어서, 펩티드가 고체상 펩티드 합성에 의해 합성되는 되는 시약.
  43. 제 41 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 생체외 화학적 합성 동안에 펩티드에 공유적으로 결합되는 시약.
  44. 제 43 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 고체상 펩티드 합성 동안에 펩티드에 공유적으로 결합되는 시약.
  45. 제 1 항의 시약을 제조하는 방법으로서, 킬레이트화 부분이 상기 시약을 포함하는 혈관 활성 장 수용체 결합 펩티드의 아미노산 서열중의 공지된 위치에서 시약의 합성 동안에 시약내로 혼입되는 방법.
  46. 제 1 항에 있어서, 다중 다가 혈관 활성 장 수용체 결합 시약을 제조하기 위한 시약을 포함하도록 시약이 다수의 혈관 활성 장 수용체 결합 펩티드에 공유적으로 결합되고 다수의 킬레이트화 부분에 공유적으로 결합되는 다가 결합 부분을 더 포함하는 시약으로서, 상기 다중 다가 혈관 활성 장 수용체 결합 시약의 분자량이 약 20,000 달톤 미만인 시약.
  47. HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.(β-Dap)KCK.아미드).아미드
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.GGCK.아미드).아미드
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.(δ-Orn)GCK.아미드).아미드
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(BAT).아미드
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGGC.아미드
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.GGCE.아미드).아미드 및
    HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(ε-K)GC.아미드)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질의 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, Tc-99m로 표지된 물질의 조성물.
  49. 제 47 항에 있어서, 레늄-186 또는 레늄-188로 표지된 물질의 조성물.
  50. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 아미노산 포함 펩티드의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -SDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드.
  51. 제 17 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 아미노산의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -SDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드.
  52. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 아미노산의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드.
  53. 제 17 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 아미노산의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.아미드.
  54. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 아미노산의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -KQMAVKKYLNSILN.아미드.
  55. 제 17 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 아미노산의 측쇄내의 부위에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내에 혼입되며, 여기에서 아미노산이 펩티드의 하기 서열 중의 천연 또는 대용 아미노산이거나, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 펩티드내에 혼입되는 시약:
    -KQMAVKKYLNSILN.아미드.
  56. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내로 혼입되는 시약.
  57. 제 17 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 카르복실 말단에서 합성 혈관 활성 장 펩티드내로 혼입되는 시약.
  58. 제 1 항에 따른 시약을 표지시키는 방법으로서, 예비 환원된 테크네튬-99m 착물의 리간드 교환에 의해 상기 시약과 테크네튬-99m을 반응시킴을 포함하는 방법.
  59. 제 1 항에 따른 시약을 표지시키는 방법으로서, 예비 환원된 레늄 착물의 리간드 교환에 의해 상기 시약과 레늄-186 또는 레늄-188을 반응시킴을 포함하는 방법.
  60. 제 1 항에 있어서, 킬레이트화 부분이 펩티드의 티올기를 통해 수용체 결합 혈관 활성 장 펩티드에 공유적으로 결합되는 시약.
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