KR19980701698A - 헬리코백터 필로리 항원 - Google Patents
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Abstract
에이치. 필로리에서 나온 새로운 항원을 제공하고, 또한 에이치. 필로리 감염을 진단하는데 있어 이의 용도; 이러한 진단방법과 이러한 방법에 사용하는 키트를 기술한다. 더불어, 항원의 항원 단편의 제공은 물론, 항원 아니면 하나 또는 그 이상의 항원 단편을 함유하는 백신을 제공한다.
Description
본 발명은 헬리코백터 필로리의 새로운 항원, 또는 이의 항원 단편, 헬리코백터 필로리를 검출하는 항원 또는 이의 단편의 용도와 이를 함유하는 키트는 물론, 항원 또는 이의 단편을 함유하는 백신과 항원의 단리방법에 관한 것이다.
포유동물, 특히 사람의 장 감염은 보통의 점막 면역계의 활성화를 통하여, 타액과 같은 점막 분비물의 면역반응을 자극한다. 이러한 반응은 일반적으로 IgA 항체의 존재에 의하여 특징을 갖더라도, 처음에는 혈청의 항체반응과 병행한다. 그러나, 타액을 포함한 분비물의 면역반응은 몸체로부터 항원(예를들어 박테리아 또는 바이러스)을 제거함에 따라 급격히 감소한다. 따라서, 점막 분비물에 항체가 존재하면 현재, 즉 동시감염이 나타난다. 세균감염의 경우, 예를들어, 이후부터 분비항체라 칭하는 점막 분비물의 항체는 장에서와 같이 세균정착의 현상태를 나타내므로, 동시감염의 모니터로서 유용하다. 다른 한편으로는 혈청항체는 세균을 몸체에서 제거한 후, 몇시간 동안 지속된다. 그러므로, 양성혈청 항체 시험은 임상의에게 도움을 주지 못하는 항체에 과거와 현재 노출을 나타낸다. 또한, 양성분비 항체 시험은 세균에 의한 현재 또는 동시 감염을 나타낸다.
에이치. 필로리 감염의 진단은 현미경, 미생물 배양 또는 위점막 생검법으로 우레아제 검출, 요소 호흡시험에 의하여 또는 혈청 ELISAs에 특이적 항체의 존재에 의하여 이루어질 수 있다. 위 점막의 감염인 에이취. 필로리 감염은 위 분비물의 IgA 항체 반응을 유도한다. 그러나, 점막 분비물에서 에이치. 필로리-특이적 항체는 IgG류이고 IgA로서는 기대될 수 없음을 알았다. IgA 항체는 거의 검출되지 않는다. 따라서, AU-A-9067676에는 에이치. 필로리 항원에 특이한 점막 분비물에서 IgG를 검출하므로서, 현행, 즉 포유동물에서 미생물에 의한 동시감염을 감시하는 수단을 제공하는 것이 기술되어 있다. 해당하는 학술지로는 위트 등의 Frontiers in Mucosal Immunology 1 693-696(1991)이 있다.
헬리코백터 필로리 양성환자의 타액에 IgG 항체의 존재는 아메리칸 위장병학 협회의 년모임 회보에서 몇가지 주의가 주어졌다. 친 등에 의하여 1989 회보에서 이러한 항체의 존재가 설명된 후, 라르센 등은 타액 IgG 수준이 항생물질 치료과정에서 치료반응의 실제적, 비-침입 마크인 것을 1991. 5월 회보에 결론지었다. 1992. 4월 회보에서, 랜드스 등은 초기 관찰을 확인했고, 헬리코백터 필로리에 대한 타액 IgG의 측정은 특히 다른 시험이 실제가 아닌 널리 보급되어 있거나 소아과적 개체군에서 에이치. 필로리 양성환자를 검출하는 간단하고, 비-침입 시험임을 관찰했다.
WO-A-9322682에는 편리하고 신뢰할 수 있는 생체외 에이치. 필로리 시험이 기술되어 있다. 이 시험은 시험되는 포유동물에서 나온 점막 분비물의 IgG 항체와의 반응으로 항원제조에 이용할 수 있다. 그러므로, 진단시험에 사용될 수 있는 에이치. 필로리를 확인하고, 단리하여 새로운 항원을 제공하는 것이 필요하다. 이들 항원은 특이하고, 신뢰할 수 있는 정제가 있어야 하고, 이러한 시험에 사용할 때 양호한 특이성과 거짓 양성결과의 결핍의 특성이 있어야 한다. 더불어, 이들은 에이치. 필로리 감염의 치료 또는 예방하는데 있어 백신 사용 ㎕의 기초를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제일 특징은 변성과 감소 조건하에서 측정된 바와 같이, 55∼65 KDa 범위의 분자량을 갖고 에이치. 필로리 항원인 단백질을 제공하는데 있다.
적당하기로는 항원 단백질이 이의 아미노 말단부에 다음 아미노산 서열:
M V T L I N N E D D
Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu-Asp-Asp
또는 이외 실질적으로 동종인 서열을 갖는 것이다.
아미노산 수준에서, 단백질 서열은 상당수의 성분 아미노산이 동종성을 나타내면 다른 단백질 서열과 실질적으로 동종인 것으로 간주된다. 아미노산의 바람직한 증가수가 최소한 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 꼭 99%이면 동종일 수 있다. 또한 전체 단백질의 부분은 그 자체가 항원성 임이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 제이 특징은 본 발명 단백질의 항원 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 이 특징의 한가지 바람직한 구성으로는 항원 단편이 다음 서열을 갖는 펩티드일 때이다:
M V T L I N N E
Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu
전문가는 이 단편의 서열에서 약간의 변이가 가능하고, 이의 항원성이 아직 유지되고 있음을 이해할 것이다. 이와 같은 변이체는 본 발명의 부분을 형성한다.
본 발명의 항원 단백질, 또는 이의 단편은 정제되거나 단리된 제제로서, 또는 다른 에이치. 필로리 항원 단백질과의 혼합물 부분으로서 단독으로 공급할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제3 특징은 본 발명의 단백질 또는 이의 하나 또는 그 이상의 항원 단편을 함유하는 항원 조성물을 제공하는데 있다. 이러한 조성물은 에이치. 필로리를 검출 과/또는 진단하는데 사용할 수 있다. 한가지 구성으로, 조성물이 하나 또는 그 이상의 부가적 에이치. 필로리 항원을 함유하는 것이다.
본 발명의 제5 특징은:
(a) 항원 단백질이나 이의 항원 단편, 또는 본 발명의 항원 조성물을 시험될 시료와 접촉시키고;
(b) 에이치. 필로리에 항체의 존재를 검출하여서 하는
에이치. 필로리를 검출 과/또는 진단하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명의 단백질, 이의 항원 단편 또는 항원 조성물을 사용하여 IgG 항체를 사용할 수 있다. 적당하기로는 시험될 시료가 생물학적 시료, 예를들어 혈액 또는 타액의 시료일 때이다. 점막 분비물의 시료를 사용하여 에이치. 필로리의 적당한 검출방법의 예는 WO-A-9322682에 서술되어 있다.
본 발명의 제5 특징은 에이치. 필로리를 검출 과/또는 진단하는데 본 발명의 항원 단백질, 이의 항원 단편 또는 항원 조성물의 용도를 제공하는데 있다. 바람직하기로는 검출 과/또는 진단을 생체외에서 행하는 것이다.
본 발명의 제6 특징은 다음 단계:
(a) 에이치. 필로리의 배양물을 제조하고, 배양물을 적당한 조건하에서 성장시키고, 이들을 수확한 다음, 세척하여 세척된 세포펠릿을 얻는단계;
(b) 세척된 세포를 적당한 완충제에서 재현탁시킨 다음, 세포를 분열시키는 단계;
(c) 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 용해성 세포 단백질을 함유하는 상청액을 얻는 단계;
(d) 이온-교환 크로마토그라피로 얻은 용액을 기울기 용리하고, 여기서 얻은 분획을 우레아제의 존재에 대하여 검정하는 단계;
(e) 분획을 함유하는 우레아제를 푸울하고, 이 푸울을 겔 투과 크로마토그라피 하는 단계;
(f) 적당한 피크를 선택하는 단계;
(g) 단리물에서 55∼65 KDa 범위의 분자량을 갖는 특이적 단백질의 존재를 확인하여 단백질을 단리하는 단계
로 이루어지는, 본 발명의 항원 단백질을 단리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 항원 단백질, 이의 항원 단편 또는 항원 조성물은 에이치. 필로리의 생체외 검출 과/또는 진단에 사용하기 위한 키트의 부분으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제7 특징은 본 발명의 항원 단백질, 이의 항원 단편 또는 항원 조성물을 함유하는 에이치. 필로리의 검출 과/또는 진단에 사용하는 키트를 제공하는데 있다.
더불어, 본 발명의 항원 단백질 또는 이의 항원 단편을 사용하여 에이치. 필로리에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 특징은 본 발명의 단백질 또는 이의 하나 또는 그 이상의 항원 단편을 함유하는 주체에서 면역반응을 유도할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다. 적당하기로는, 조성물이 하나 또는 다른 적당한 보조제를 임의로 함유하는 백신 조성물일 때이다. 이러한 백신 조성물은 예방 아니면 치료적 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 본 분야에 잘 알려져 있는 보조제의 예를들면, 수산화 알루미늄과 같은 무기겔 또는 불완전한 프로인드'스 보조제와 같은 오일속물 에멀션이 있다. 다른 유용한 보조제는 전문가에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 특징에서는,
(a) 면역원 조성물, 바람직하기로는 백신을 제조하는데 본 발명의 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 항원 단편의 용도;
(b) 주체의 면역반응을 유도하는 이러한 면역성 조성물의 용도;
(c) 바람직하기로는 백신으로서 유효량의 본 발명의 단백질, 최소한 하나의 항원 단편 또는 항원 조성물을 주체에 투여하는 단계로 이루어지는 주체의 에이치. 필로리 감염의 치료 또는 예방 방법.
을 제공한다.
본 발명의 각 특징중 바람직한 특징은 서로 다른 특징으로서 필요한 변경을 가할 수 있다. 본 발명을 실시예를 들어 다음과 같이 상세히 설명할 것이고, 이는 어떠한 방법에서도 본 발명을 한정시키지는 않는다.
실시예 1
(a) 에이치. 필로리의 배양물을 적당한 조건하에서 성장시키고 세포를 인산 완충염에 수확한다. 이를 반복하여 원심분리하여 세포 찌꺼기와 다른 오염물, 예를들어, 한천을 제거하고, 새로운 PBS를 3회 가하여 세척된 세포 펠릿을 제조하고;
(b) 세척된 세포를 0.1M TRIS-HCl 완충제 pH 7.2에 재현탁시켜서 이온 교환 크로마토그라피 단계에서 사용한다. 세포 현탁액을 충분한 강도와 세포의 분열을 확실히 하는 기간 동안 음파파쇄(30초, 60초 동안 6μ, 100 한천판에서 세포를 함유하는 10㎖ 시료로 25회 반복)를 하고;
(c) 현탁액을 원심분리하여 세포찌꺼기를 제거하여, 용해성 세포 단백질을 함유하는 상청액을 얻고;
(d) 단계 (c)에서 나온 용액을, MonoQ또는 Q-Sepharose(파마시아)를 사용하고, 예정된 방법으로 0∼1.0M의 용리 완충제의 염화나트륨 농도를 증가시키는 것을 근거로한 기울기 용리를 사용하여 이온-교환 크로마토그라피에 의하여 분별한 다음, 분획을 우레아제의 존재하에 검정한다.
(e) 우레아제 함유 분획을 푸울한 다음, 구상 단백질에 대하여 분리범위의 5×103-5×104Da를 갖는 수지를 사용하여 겔 투과 크로마토그라피 하고;
(f) (ⅰ) 모든 분획의 우레아제 검정을 행하고 우레아제 활성을 함유하는 단백질 피크를 확인하고;
(ⅱ) 우레아제가 양성임을 나타내는 모든 분획과 이들 분획에서 나온 1 마이크로그람의 단백질을 니트로-셀루로오즈 상에 반점을 만들거나 등량으로 건조하여 저분자량 이외의 우레아제 피크에 아주 근접한 피크를 갖는 단백질을 분석한 다음 에이치. 필로리 양성 개체로부터의 혈청 또는 타액 시료에서 에이치. 필로리 특이적 항체와 반응하는 이들의 능력을 측정하여 적합한 피크를 선택하고;
(g) 단리물에서 특이적 단백질의 존재는 이를 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(PAGE)과 웨스턴 블로팅(Western Blotting)으로 처리하고, 에이치. 필로리 양성 개체에서 수집된 인체 혈청으로 제조된 푸울에서 나온 IgG를 사용하여 반점을 분석하므로서 확인한다. PAGE는 변성 조건하에서 행하고, 55∼65 KDa 범위의 분자량을 갖는 것으로 확인된 단백질을 단리한다.
실시예 2
토끼에 펩티드 MVTLNNE를 접종한다. 혈액 시료를 하술한 바와 같이 항체 반응시험으로 검정한다.
검정방법
혈액시료에 혈액의 ㎖당 25㎕의 1% 티오머살 용액(즉, 25 ㎕/㎖ 에이치. 필로리 항원(WO-A-93/22682에 서술되어 있는 항원제제)으로 피복한 판을 사용하여 검정을 행한다.
혈액시료를 CDL 세척 완충제를 사용하여 희석하여서 일정범위의 희석물을 제조한다.
CDL 세척 완충제: 1dm
3
에 대한 양
트리스 12.11g
5M HCl 15㎖
증류수 400㎖
NaCl 87.66g
티오머살 0.1g
투원 80 50g
ⅰ) 트리스를 증류수에 가하고;
ⅱ) 20℃에서 pH 7.80이 될 때까지 5M HCl을 가하고;
ⅲ) 티오머살을 가하고;
ⅳ) NaCl을 가하고;
ⅴ) 투윈 80을 가하고;
ⅵ) 증류수를 최종체적으로 만든다.
기질로서 퍼옥시다아제 시트르산염 완충제로 1/25로 희석된 ABTS(2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린-술포네이트])와의 돼지 항-토끼 고추냉이 퍼옥시다아제 접합체를 사용하여, 결합된 항체, 양성 결과를 나타내는 초록색을 검출한다.
퍼옥시다아제 시트르산염 완충제: 1dm
3
에 대한 양
증류수 700㎖
시트르산 23.0g
NaOH 100㎖
30% H2O2100㎖
pH는 1M NaOH를 4.0으로 조정
검정방법은 다음과 같다:
1) 100㎕의 희석된 시료를 각 웰에 가하고;
2) 30분 동안(흔들면서) 배양하고;
3) CDL 세척 완충제로 ×5 세척하고 판을 건조하고;
4) 100㎕의 돼지 항-토끼 HRP를 각 웰에 가하고;
5) 30분 동안(흔들면서) 배양하고;
6) ×5로 세척하고 판을 건조하고;
7) 100㎕의 ABTS를 각 웰에 가하고;
8) 30분 동안 배양하고;
9) 판을 414㎚에서 판독한다.
결 과
피크 항체 반응은 6개월 후-접종주위에서 일어난다. 다음 표 1은 펩티드로 접종된 두마리 토끼에서 나온 혈액 시료의 시간 이상의 결과를 나타낸다. 데이타는 1/100 희석된 시료에 대한 것이다.
| 흡수도 | ||
| 수개월 후-접종 | 토끼 1 | 토끼 2 |
| 2 | 0.484 | 0.149 |
| 3 | 0.129 | 1.154 |
| 4 | 0.491 | 1.057 |
| 5 | 1.236 | 0.7255 |
| 6 | 1.656 | 0.899 |
| 7 | 0.89 | 0.847 |
| 8 | 0.4095 | 0.7275 |
이들 결과는 도 1에 표시했다.
따라서, 펩티드는 항-에이치. 필로리 항체반응을 유도함을 볼 수 있다.
Claims (19)
- 변성과 감소조건하에서 측정된, 55∼65 KDa 범위의 분자량을 갖고 에이치. 필로리 항원인 단백질.
- 제 1 항에서, 아미노 말단부에서 다음 서열:Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu-Asp-Asp또는 실제로 이와 동종인 서열을 갖는 단백질.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질의 항원 단편.
- 제 3 항에 있어서, 다음 서열:M V T L I N N EMet-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu또는 실제로 이와 동종인 서열을 갖는 항원 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질 또는 제 3 항 이나 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편을 함유하는 항원 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 다른 에이치. 필로리 항원을 더 함유하는 항원 조성물.
- 에이치. 필로리의 검출 과/또는 진단에 사용하는 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 항원 단편 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물.
- (a) 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물을 시험될 시료와 접촉시키고;(b) 에이치. 필로리에 항체의 존재를 검출하여서 하는 에이치. 필로리의 검출 과/또는 진단방법.
- 제 8 항에 있어서, 시료가 타액의 시료인 방법.
- 에이치. 필로리의 검출 과/또는 진단에 있어 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물의 용도.
- 검출 과/또는 진단을 생체외에서 행하는 제 8 항 또는 제 9 항의 방법이나 제 10 항의 용도.
- (a) 에이치. 필로리의 배양물을 제조하고, 적당한 조건하에 배양물을 성장시키고 이들을 수확한 다음 세척하여 세포 펠릿을 제조하고;(b) 세척된 세포를 적당한 완충제에 재현탁시킨 다음, 세포를 분열시키고;(c) 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하여 용해성 세포 단백질을 함유하는 상청액을 얻고;(d) 이온-교환 크로마토그라피로 얻은 용액을 기울기 용리하고 여기서 얻은 분획을 우레아제의 존재에 대하여 검정하고;(e) 분획을 함유하는 우레아제를 푸울하고 이 푸울을 겔 투과 크로마토그라피 하고;(f) 적당한 피크를 선택하고;(g) 단리물에서 55∼65 KDa 범위의 분자량을 갖는 특이적 단백질의 존재를 확인하여 단백질을 단리하는 것으로 이루어지는 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질의 단리방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편, 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물을 함유하는 에이치. 필로리의 검출 과/또는 진단에 사용하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물로 이루어지는 주체의 면역반응을 유도할 수 있는 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 백신 조성물이 하나 또는 그 이상의 보조제를 임의로 더 함유하는 조성물.
- 면역원 조성물, 바람직하기로는 백신의 제조에 있어, 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물의 용도.
- 주체의 면역반응을 유도하는데 있어 제 16 항에 정의된 면역원 조성물의 용도.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 단백질, 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 최소한 하나의 항원 단편, 또는 제 5 항 이나 제 6 항에 정의된 항원 조성물의 유효량을 주체에 투여하는 단계로 이루어지는 주체의 에이치. 필로리 감염의 치료 또는 예방방법.
- 제 18 항에 있어서, 단백질, 하나 또는 그 이상의 항원 단편 또는 항원 조성물을 백신형태로 바람직하기로는 백신으로 투여하는 방법.
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