PT809653E - Anigenio de helicobacter pylori - Google Patents
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Description
86 631 ΕΡ Ο 809 653 / ΡΤ
DESCRICÃO
“Antigénio de HelicobacterpylorF O presente invento refere-se a um novo antigénio de Helicobacter pylori, ou fragmentos antigénicos deste, à utilização do antigénio ou fragmentos deste na detecção de Helicobacter pylori e conjuntos que os compreendem, bem como a vacinas compreendendo o antigénio ou fragmentos deste e um método para isolamento do antigénio.
As infecções do intestino em mamíferos e em particular em humanos, estimulam uma resposta imunitária em secreções mucosas, tais como saliva, através da activação do sistema imunitário mucoso comum. Esta resposta frequentemente acompanha inicialmente uma resposta de anticorpos no soro embora seja geralmente caracterizada pela presença de anticorpos IgA. No entanto, a resposta imunitária em secreções, incluindo saliva, diminui rapidamente após a eliminação do antigénio (e.g. bactérias ou vírus) do corpo. De forma concordante, a presença de anticorpo em secreções mucosas reflecte uma infecção presente, i.e. contemporânea. No caso de uma infecção microbiana, por exemplo, anticorpos em secreções mucosas, daqui em diante referidos como anticorpos de secreções, reflectem o estado presente de colonização do micróbio, tal como no intestino e são assim um monitor útil de infecção contemporânea. Os anticorpos séricos, por outro lado, persistem durante algum tempo após o micróbio ter sido eliminado do corpo. Um teste de anticorpos séricos positivo reflecte, portanto, tanto uma exposição passada como presente ao antigénio, o que é menos útil para o clínico. Por outro lado, um teste de anticorpos de secreções positivo indica uma infecção presente ou contemporânea pelo micróbio. O diagnóstico de infecção por H. pylori pode ser feito através de microscopia, cultura microbiológica ou detecção de urease em biópsias da mucosa gástrica, teste de respiração de ureia ou através da presença de anticorpos específicos em ELISAs do soro. Poderia prever-se que a infecção por H. pylori, sendo uma infecção da mucosa gástrica, desencadearia uma resposta de anticorpos IgA na secreção gástrica. No entanto, foi descoberto que o anticorpo específico para H. pylori nas secreções mucosas é da classe IgG e não IgA tal como se poderia esperar. Pouco anticorpo IgA, se algum, é detectado. Em concordância, AU-A-9067676 dirige-se à detecção de IgG em secreções mucosas específica para antigénio de H. pylori, e proporciona portanto um meio de monitorização de infecção presente, i.e. contemporânea por esse microorganismo em mamíferos. A publicação académica correspondente é Witt et al., Frontiers in Mucosal Immunology, 1, 693-696 (1991). 2 86 631
ΕΡ Ο 809 653/PT A presença de anticorpos IgG na saliva de doentes positivos para Helicobacter pylori recebeu alguma atenção nas actas dos “Annual Meetings of American Gastroenterological Association”. Após a divulgação por Czinn et al. da presença de tais anticorpos na acta de 1989 (Gastroenterology 96(5), parte 2 (Maio 1989)), Larsen et al. concluíram na acta de Maio de 1991 que os níveis salivares de IgG são um marcador prático, não invasivo da resposta terapêutica durante o decurso de terapia com antibióticos (Gastroenterology, 100(5), pp. A107 (Maio de 1991)). Na acta de Abril de 1992, Landes et al. confirmaram observações anteriores e observaram que a medição da IgG salivar para Helicobacter pylori é um teste simples, não invasivo para detecção de doentes positivos para H. pylori, especialmente em populações dispersas ou pediátricas onde outros testes não são práticos (Gastroenterology, 102(4), pp. A 107 (Abril de 1992)).
Em WO-A-9322682 divulga-se um teste in vitro conveniente e de confiança para H. pylori. Este teste utiliza uma preparação de antigénio numa reacção com anticorpo IgG numa secreção mucosa de um animal a ser testado.
Existe portanto uma necessidade de identificar, isolar e assim proporcionar novos antigénios de H. pylori que possam ser utilizados em testes de diagnóstico. Estes antigénios devem ser específicos, purificáveis com confiança e devem caracterizar-se por boa especificidade e ausência de resultados falsos positivos quando utilizados em tais testes. Adicionalmente podem também formar a base de uma vacina útil para o tratamento ou profilaxia de infecção por H. pylori. Várias proteínas derivadas de H. pylori foram isoladas e caracterizadas e exemplos de tais proteínas incluem as divulgadas em Evans et al., Infection and Immunity, 60(5), 2125-2127 (1992), EP-A-0329570 e Kostrynska et al., J. Bacteriol, 173(3), 937-946 (1991). O presente invento refere-se a uma nova proteína antigénica derivada de H. pylori que pode ser utilizada em testes de diagnóstico ou para formar a base de uma vacina.
Assim, num primeiro aspecto, o presente invento proporciona uma proteína que é um antigénio de H. pylori e que possui um peso molecular no intervalo de 55-65 kDa, tal como determinado sob condições desnaturantes e redutoras.
Adequadamente, a proteína antigénica tem, na sua extremidade amino-terminal, a seguinte sequência de aminoácidos:
MVTLINNEDD
Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asii-Asn-Glu-Asp-Asp 3 86 631
ΕΡ Ο 809 653/PT ou uma sequência substancialmente homóloga a esta.
Ao nível dos aminoácidos, uma sequência proteica pode ser considerada como substancialmente homóloga a outra sequência proteica se um número significativo dos aminoácidos constituintes exibirem homologia. Pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mesmo 99%, em ordem crescente de preferência, dos aminoácidos podem ser homólogos.
Verificou-se também que partes da proteína inteira são elas próprias antigénicas. Assim, num segundo aspecto, o presente invento proporciona um fragmento antigénico da proteína do invento.
Numa concretização preferida deste aspecto do presente invento, o fragmento antigénico é um péptido possuindo a sequência:
Μ V T L I N N E
Met-V al-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu O perito na arte apreciará que alguma variação na sequência deste fragmento será possível, mantendo no entanto as suas propriedades antigénicas. Tais variantes fazem também parte do presente invento. A proteína antigénica, ou fragmentos desta, do presente invento podem ser proporcionadas sozinhas, como uma preparação purificada ou isolada, ou como parte de uma mistura com outras proteínas antigénicas de H. pylori.
Num terceiro aspecto, portanto, o presente invento proporciona uma composição de antigénios compreendendo uma proteína do presente invento e ou um ou mais fragmentos antigénicos desta. Tal composição pode ser utilizada para a detecção e/ou diagnóstico de H. pylori. Numa concretização a composição compreende um ou mais antigénios adicionais de H. pylori.
Num quarto aspecto, o presente invento proporciona um método de detecção e/ou diagnóstico de H. pylori, que compreende: (a) por em contacto uma proteína antigénica ou um fragmento antigénico desta ou uma composição de antigénios do presente invento com uma amostra a ser testada; e 4 86 631 ΕΡ Ο 809 653 /ΡΤ (b) detecção da presença de anticorpos para H. pylori.
Em particular, a proteína, fragmento antigénico desta ou composição de antigénios do presente invento podem ser utilizados para detectar anticorpos IgG. Adequadamente, a amostra a ser testada será uma amostra biológica, e.g. uma amostra de sangue ou saliva. Um exemplo de um método adequado para detecção de H. pylori utilizando uma amostra de uma secreção mucosa é o descrito em WO-A-9322682.
Num quinto aspecto, o presente invento proporciona a utilização de uma proteína antigénica, fragmentos antigénicos desta ou composição antigénica do presente invento na detecção e/ou diagnóstico de H. pylori. De preferência, a detecção e/ou diagnóstico são efectuados in vitro.
Num sexto aspecto, o presente invento proporciona um método de isolamento de uma proteína antigénica do presente invento, processo esse que compreende os seguintes passos: (a) preparação de culturas de H. pylori, crescimento das culturas sob condições apropriadas e colheita destas, seguido de lavagem para produzir um pelete celular lavado; (b) ressuspensão das células lavadas num tampão apropriado, seguido de ruptura das células; (c) centrifugação para remoção dos restos celulares e obtenção do sobrenadante contendo as proteínas celulares solúveis; (d) sujeição da solução obtida a cromatografía de permuta iónica com uma eluição em gradiente e ensaio das ffacções assim obtidas quanto à presença de urease; (e) reunião das ffacções contendo urease e sujeição do referido banco a cromatografía de permeação em gel; (f) selecção do pico apropriado; e (g) confirmação da presença da proteína específica possuindo um peso molecular no intervalo de 55-65 kDa no isolado, e isolamento da proteína.
86 631 ΕΡ Ο 809 653/ΡΤ 5 A proteína antigénica, fragmento antigénico desta ou composição de antigénios do presente invento podem ser proporcionados como parte de um estojo para utilização em detecção e/ou diagnóstico in vitro de H. pylori. Assim, num sétimo aspecto, o presente invento proporciona um estojo para utilização na detecção e/ou diagnóstico de H. pylori compreendendo uma proteína antigénica, fragmento antigénico desta ou composição de antigénios do presente invento.
Adicionalmente, a proteína antigénica ou fragmento antigénico desta do presente invento pode ser utilizada para induzir uma resposta imunitária contra H. pylori. Assim, num outro aspecto, o presente invento proporciona uma composição capaz de provocar uma resposta imunitária num sujeito a qual compreende a proteína ou um ou mais fragmentos antigénicos desta do presente invento. Adequadamente, a composição será uma composição de vacina, compreendendo opcionalmente um ou outros adjuvantes adequados. Uma tal composição de vacina pode ser uma composição de vacina profilática ou terapêutica.
As composições de vacina do presente invento podem incluir um ou mais adjuvantes. Exemplos de adjuvantes bem conhecidos na arte incluem geles inorgânicos tais como hidróxido de alumínio ou emulsões de água em óleo tais como o adjuvante incompleto de Freund. Outros adjuvantes úteis serão bem conhecidos do perito.
Ainda noutros aspectos, o presente invento proporciona: (a) a utilização da proteína ou de um ou mais fragmentos antigénicos desta do presente invento na preparação de uma composição imunogénica, de preferência uma vacina; (b) a utilização de uma tal composição antigénica na indução de uma resposta imunitária num sujeito; e (c) um método para o tratamento ou profilaxia de infecção por H. pylori num sujeito, que compreende o passo de administração ao sujeito de uma quantidade eficaz da proteína, pelo menos um fragmento antigénico ou de uma composição de antigénios do presente invento, de preferência como vacina.
As características preferidas de cada aspecto do presente invento são tal como para qualquer outro aspecto mutatis mutandis. 6 86 631
ΕΡ Ο 809 653/PT Ο presente invento será agora descrito com referência aos seguintes exemplos que não devem ser de forma alguma entendidos como limitantes do presente invento.
Exemplo 1 (a) Foram postas a crescer culturas de H. pylori sob condições apropriadas e as células foram colhidas para solução salina tamponada com fosfato. Isto foi seguido por centrifugação repetida para remover os restos celulares e outros contaminantes, por exemplo agar, e foi adicionado PBS fresco três vezes para produzir um pelete celular lavado; (b) As células lavadas foram ressuspensas em tampão TRIS-HC1 0,1 M pH 7,2 para serem utilizadas no passo de cromatografia de permuta iónica. A suspensão celular foi então sujeita a ultra-sons (6 pm durante 30 segundos, 60 segundos desligado, repetido 25 vezes para uma amostra de 10 ml contendo células de 100 placas de agar) de intensidade e duração suficientes para assegurar a ruptura das células; (c) A suspensão foi então centrifugada para remover os restos celulares e obteve-se o sobrenadante contendo proteínas celulares solúveis; (d) A solução do passo (c) foi então sujeita a fraccionamento por cromatografia de permuta iónica utilizando uma resina de permuta aniónica forte tal como MonoQ ou Q-Sepharose® (Pharmacia), utilizando um gradiente de eluição baseado no aumento da concentração de cloreto de sódio do tampão de eluição, de 0 para 1,0 M num modo predeterminado. As ffacções foram então ensaiadas quanto à presença de urease; (e) As fracções contendo urease foram então reunidas e foram sujeitas a cromatografia de permeação em gel utilizando uma resina com uma variação de separação de 5x103 - 5xl05 Da para proteínas globulares; (f) O pico apropriado foi seleccionado através de: i) realização de um ensaio de urease de todas as fracções e identificação do pico proteico contendo a actividade de urease; e (ii) análise de todas as fracções que mostraram ser positivas para a urease e dos picos contendo proteínas imediatamente adjacentes ao pico de urease, mas de baixo peso molecular, através da colocação de um micrograma de proteína destas fracções em nitrocelulose ou equivalente, secagem e depois
86 631 ΕΡ Ο 809 653 / ΡΤ 7 determinação da sua capacidade para reagir com anticorpos específicos para H. pylori em amostras de soro ou saliva de indivíduos positivos para H. pylori, (g) A presença da proteína específica no isolado foi confirmada através da sua sujeição a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e “Western Blotting'’ e análise da mancha utilizando IgG de um banco preparado a partir de soro humano recolhido de indivíduos positivos para H. pylori. A PAGE foi efectuada sob condições desnaturantes e a proteína identificada como possuindo um peso molecular no intervalo de 55-65 kDa foi isolada.
Exemplo 2
Foram inoculados coelhos com o péptido MVTLINNE. Amostras de sangue foram ensaiadas tal como descrito abaixo para testar quanto à resposta de anticorpos. Método de ensaio Às amostras de sangue foram adicionados 25 μΐ de solução de Tiomersal a 1% por ml de sangue (i.e. uma conc. de 25 μΐ/ml), sendo depois as amostras armazenadas a -40°C antes do teste.
Os ensaios foram efectuados utilizando placas em que cada poço é revestido com 100 μΐ de antigénio de H. pylori a 5 pg/ml (preparação de antigénio tal como descrita em WO-A-93/22682), seguido de 300 μΐ de solução Byco A a 1% como pós-revestimento.
As amostras de sangue foram diluídas utilizando tampão de lavagem CDL para produzir um espectro de diluições.
Tampão de lavagem CDL: quantidades para 1 dm3
Tris 12,11 g HC1 5M 15 ml Água destilada 400 ml
NaCl 87,66 g
Tiomersal 0,1 g
Tween 80 50 g 86 631 ΕΡ Ο 809 653 / ΡΤ 8
i) adicionar Tris a água destilada; ii) adicionar HC1 5M até resultar em pH 7,80 a 20°C; iii) adicionar Tiomersal; iv) adicionar NaCl; v) adicionar Tween 80; vi) perfazer para o volume final com água destilada.
Foi utilizado um conjugado de porco anti-coelho-peroxidase de rábano com ABTS (2,2-azino-di-[3-etil-benztiazolin-sulfonato]) diluído a 1/25 com tampão citrato de peroxidase como substrato para detectar anticorpo ligado, indicando a cor verde um resultado positivo.
Tampão citrato de peroxidase: quantidades para 1 dm3 Água destilada 700 ml Ácido cítrico 23,0 g 100 ml 0,5 ml
NaOH H202 a 30%
Ajustar o pH para 4,0 com NaOH 1M. O protocolo do ensaio foi como se segue: 1) 100 μΐ de amostra diluída adicionados a cada poço; 2) incubar durante 30 min. (com agitação); 3) lavar 5x com tampão de lavagem CDL e secar a placa; 4) 100 μΐ de porco anti-coelho-HRP adicionados a cada poço; 5) incubar durante 30 min. (com agitação); 6) lavar 5x e secar a placa; 7) 100 μΐ de ABTS adicionados a cada poço; 8) incubar durante 30 min.; e 9) ler a placa @ 414 nm.
Resultados O pico de resposta de anticorpos ocorreu por volta de seis meses após a inoculação. A Tabela 1 mostra os resultados ao longo do tempo para amostras de sangue de dois coelhos inoculados com o péptido. Os dados são para amostras diluídas 1/100. 9 86 631 ΕΡ Ο 809 653 / ΡΤ
Tabela 1 ABSORVÂNCIA Meses após inoculação Coelho 1 Coelho 2 2 0,484 0,149 3 0,129 1,154 4 0,491 1,057 5 1,236 0,7255 6 1,656 0,899 7 0,89 0,847 8 0,4095 0,7275
Estes resultados são mostrados na Figura 1.
Pode ser claramente observado que o péptido provoca uma resposta de anticorpos anti-//. pylori.
Lisboa, !d. DEZ. Zu-J
Por PROVALIS UK LIMITED 0AsEna®<r-
Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA
Ag. Of. Pr. Ind.
Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA
Claims (15)
- 86 631 ΕΡ Ο 809 653/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína sendo um autigénio de H. pylori e possuindo uni peso molecular no intervalo de 55-65 kDa, tal como determinado sob condições desnaturantes e redutoras, a qual tem, na sua extremidade amino-terminal, a sequência: Met-Val-Thr-Leu-Ue-Asn-Asn-Glu-Asp-Asp; ou uma sequência substancialmente homóloga a esta.
- 2. Fragmento antigénico de uma proteína, de acordo com a reivindicação 1.
- 3. Fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2, o qual possui a sequência: Μ V T L I N N E Met-Val-Thr-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu ou uma sequência substancialmente homóloga a esta.
- 4. Composição de antigénios que compreende uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou pelo menos um fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3.
- 5. Composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4, que compreende ainda um ou mais outros antigénios de H. pylori.
- 6. Proteína de acordo com a reivindicação 1, fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, para utilização na detecção e/ou diagnóstico de H. pylori.
- 7. Método de detecção e/ou diagnóstico de H. pylori que compreende: (a) por em contacto uma proteína de acordo com a reivindicação 1, pelo menos um fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou uma composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, com uma amostra a ser testada; e (b) detecção da presença de anticorpos para H. pylori. 86 631 . ΕΡ Ο 809 653 / ΡΤ 2/3
- 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a amostra é uma amostra de saliva.
- 9. Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 1, pelo menos um fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou uma composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, na detecção e/ou diagnóstico de H. pylori.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, ou utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a detecção e/ou diagnóstico é efectuado in vitro.
- 11. Método para isolamento de uma proteína de acordo com a reivindicação 1 que compreende: (a) preparação de culturas de H. pylori, crescimento das culturas sob condições apropriadas e colheita destas, seguido de lavagem para produzir um pelete celular lavado; (b) ressuspensão das células lavadas num tampão apropriado, seguido de ruptura das células; (c) centrifugação para remoção dos restos celulares e obtenção do sobrenadante contendo as proteínas celulares solúveis; (d) sujeição da solução obtida a cromatografia de permuta tónica com um gradiente de eluição e ensaio das fracções assim obtidas quanto à presença de urease; (e) reunião das fracções contendo urease e sujeição do referido banco a cromatografia de permeação em gel; (f) selecção do pico apropriado; e (g) confirmação da presença da proteína específica possuindo um peso molecular no intervalo de 55-65 kDa no isolado, e isolamento da proteína.
- 12. Estojo para utilização na detecção e/ou diagnóstico de H. pylori compreendendo uma proteína de acordo com a reivindicação 1, pelo menos um fragmento antigénico de 86 631 ΕΡ Ο 809 653 /ΡΤ 3/3 acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou uma composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5.
- 13. Composição capaz de provocar uma resposta imunitária num sujeito, a qual compreende uma proteína de acordo com a reivindicação 1, pelo menos um fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou uma composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5.
- 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, a qual é uma composição de vacina, compreendendo ainda opcionalmente um ou mais adjuvantes.
- 15. Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 1, pelo menos um fragmento antigénico de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, ou uma composição de antigénios de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, na preparação de uma composição imunogénica, de preferência uma vacina.Por PROVALIS UK LIMITED - O AGENTE OFICIAL - O ADJUNTOEr»g.° ANTÓNIO JOÃC DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74--4.° 1200-195 LISBOA
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