KR19980071713A - 측쇄형 아미노산을 정제하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 저렴한 침전제를 사용하여 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 고수율과 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 함유하는 수용액에 반응시켜 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염의 결정을 형성시킨 후 그 염을 분리하고 분해시켜 상기 아미노산을 정제 및 수득하는 과정을 포함한다. p-에틸벤젠 설폰산은 유리산 또는 알칼리 금속염, 암모늄염 등일 수 있다.

Description

측쇄형 아미노산을 정제하는 방법
본 발명은 발린을 정제하기에 적합한 신규한 발린 에틸벤젠 설폰산염 결정 및 상기 염을 이용하여 발린을 정제하는 방법, 루이신을 정제하기에 적합한 신규한 루이신 에틸벤젠 설폰산염 결정 및 상기 염을 이용하여 루이신을 정제하는 방법, 및 이소루이신을 정제하기에 적합한 이소루이신 에틸벤젠 설폰산염 결정 및 상기 염을 이용하여 이소루이신을 정제하는 방법에 관한 것이다.
발린은 약제학적 아미노산 제제를 위한 출발물질로서, 다양한 약제학적 제제를 위한 합성 중간체로서, 및 농약과 같은 화학물질의 중간체로서 유용하다.
루이신은 영양제 등과 같은 약제학적 아미노산 제제를 위한 출발물질로서 및 다양한 약제학적 제제를 위한 합성 중간체로서 매우 유용하다.
이소루이신은 영양제 등과 같은 약제학적 아미노산 제제를 위한 출발물질로서 및 다양한 약제학적 제제를 위한 합성 중간체로서 매우 유용하다.
일반적으로, 발린, 루이신 및 이소루이신은 총칭해서 측쇄형 아미노산이라 부른다.
발린은 콩 단백질 등과 같은 단백질을 가수분해하는 방법 또는 발린을 생산하는 능력을 가진 미생물을 배양하는 방법으로 제조된다. 상기 방법들에 의해 수득되는 단백질 가수분해물, 발효 육즙 등과 같은 발린-함유 수용액으로부터 발린을 동정 및 정제하는 통상적인 방법은 예를 들어:
(1) 이온교환 수지를 처리하여 산성 및 염기성 아미노산으로부터 분리 및 제거해서 회수한 중성 아미노산 분획물을 반복적으로 재결정화하여 발린 이외의 중성 아미노산을 제거하는 방법[참조 문헌: Biochem. J., 48, 313(1951)]; 및
(2) 염산을 발린이 함유된 수용액에 부가한 후 발린 염산염 결정을 반복적으로 형성 및 침전시키는 방법[일본 특허 공개 공보 제16450/81호]을 포함한다. 그러나, 전자의 경우 공정이 매우 난해하고 루이신 및 이소루이신으로부터 발린을 분리하기 어려운 반면에, 후자의 경우 발린 염산염의 결정이 물에 높은 용해성을 갖기 때문에 수율이 낮아진다는 문제점이 있다.
다른 정제 방법은 발린과 선택적으로 부가물(난용성 염)을 형성하는 침전제, 예를 들어 테트라클로로오르토프탈산, 설포이소프탈산, 플라비안산[일본 특허공보 제25059/67호], 또는 p-이소프로필벤젠 설폰산[일본 특허 공개 공보 제333,312/96호]을 발린과 반응시켜 발린을 정제하기 위해서 발린 부가물을 형성시키는 발린 정제 방법을 포함한다. 그러나, 발린 테트라플루오로프탈산염, 설포이소프탈산염, 및 플라비안산염을 제조하기 위해 사용하는 침전제는 비싸고 산업적으로 수득하기 어려우며, 결과로 형성된 부가물의 용해도가 너무 높아 높은 수율로 발린을 수득하기 어렵고 부가물로부터 발린을 동정하는 방법이 용이하지 않다는 문제점이 있다. 한편, p-이소프로필벤젠 설폰산은 발린에 대한 침전제로 매우 효과적이지만, p-이소프로필벤젠 설폰산 그 자체가 활성 슬러지와 함께 분해되지 않아 이의 폐수 처리가 어려우며, 이소루이신과는 난용성 염을 형성하기 어렵기 때문에, 다른 측쇄형 아미노산에 적용할 수 없어서 이의 이용은 제한적이라는 문제점이 있다.
루이신은 콩 단백질 등과 같은 단백질을 가수분해하는 방법 또는 루이신을 생산하는 능력을 가진 미생물을 배양하는 방법으로 제조된다. 상기 방법들에 의해 수득되는 단백질 가수분해물, 발효 육즙 등과 같은 루이신-함유 수용액으로부터 루이신을 동정 및 정제하는 통상적인 방법은 예를 들어:
(1) 이온교환 수지를 처리하여 산성 및 염기성 아미노산으로부터 분리 및 제거해서 회수된 중성 아미노산 분획물을 반복적으로 재결정화하여 루이신 이외의 중성 아미노산을 제거하는 방법[참조 문헌: Biochem. J., 48, 313(1951)]; 및
(2) 염산을 루이신이 함유된 수용액에 부가한 후 루이신 염산염 결정을 반복적으로 형성 및 침전시키는 방법[참조 문헌: Experimental Chemistry Lecture, Vol. 23, Biochemistry I, 75, 일본 화학학회 편찬 및 Maruzen 출판(1957)]을 포함한다. 그러나, 전자의 경우 공정이 매우 난해하고 발린 및 이소루이신으로부터 루이신을 분리하기 어려운 반면에, 후자의 경우 루이신 염산염의 결정이 물에 높은 용해성을 갖기 때문에 수율이 낮아진다는 문제점이 있다.
다른 정제 방법은 루이신과 선택적으로 부가물(난용성 염)을 형성하는 침전제, 예를 들어 나프탈렌 β-설폰산, 2-브로모톨루엔-5-설폰산[참조 문헌: Experimental Chemistry Lecture, Vol. 23, Biochemistry I, 75, 일본화학학회 편찬 및 Maruzen 출판(1957)], 1,2-디메틸벤젠-4-설폰산[일본 특허 공개 공보 제11373/65호], 벤젠설폰산[일본 특허 공개 공보 제149,222/76호], 또는 p-톨루엔설폰산[일본 특허 공개 공보 제3016/77호]을 루이신과 반응시켜 루이신을 정제하기 위해서 루이신 부가물을 형성시키는 루이신 정제 방법을 포함한다. 그러나, 루이신 나프탈렌 β-설폰산염 및 2-브로모톨엔-5-설폰산염을 제조하기 위해 사용되는 침전제는 비싸고 산업적으로 수득하기 어려우며, 수득된 부가물의 용해도가 높아 고수율로 루이신을 회수하기가 난해하여, 부가물로 부터 루이신을 분리하는 방법이 용이하지 않다는 문제점이 있다. 한편, 1,2-디메틸벤젠-4-설폰산, 벤젠 설폰산 및 p-톨루엔설폰산은 루이신에 대한 침전제로 매우 효과적이지만, 1,2-디메틸벤젠-4-설폰산은 발린 및 이소루이신과는 난용성 염을 형성하지 못하고; 벤젠 설폰산은 이소루이신과는 난용성 염을 형성하지 못하고; p-톨루엔설폰산은 발린과 난용성 염을 형성하지 못하며, 따라서 이의 제한적인 용도는 유익하지 못하다.
이소루이신은 콩 단백질 등과 같은 단백질을 가수분해하는 방법 또는 이소루이신을 생산하는 능력을 가진 미생물을 배양하는 방법으로 제조된다. 상기 방법들에 의해 수득되는 단백질 가수분해물, 발효 육즙 등과 같은 이소루이신-함유 수용액으로부터 이소루이신을 동정 및 정제하는 통상적인 방법은 예를 들어:
(1) 이온교환 수지를 처리하여 산성 및 염기성 아미노산으로부터 분리 및 제거해서 수거한 중성 아미노산 분획물을 반복적으로 재결정화하여 이소루이신 이외의 중성 아미노산을 제거하는 방법[참조 문헌: Biochem. J., 48, 313(1951)]; 및
(2) 염산을 이소루이신이 함유된 수용액에 부가한 후 이소루이신 염산염 결정을 반복적으로 형성 및 침전시키는 방법[참조 문헌: J. Biologc. Chem., 118, 78(1973)]을 포함한다. 그러나, 전자의 경우 공정이 매우 난해하고 발린 및 루이신으로부터 이소루이신을 분리하기 어려운 반면에, 후자의 경우 이소루이신 염산염의 결정이 물에 높은 용해성을 갖기 때문에 수율이 낮아진다는 문제점이 있다.
다른 정제 방법은 이소루이신과 선택적으로 부가물(난용성 염)을 형성하는 침전제, 예를 들어 4-니트로-4'-메틸디페닐아민-2-설폰산[참조 문헌: J. Biologc. Chem., 143, 121 (1942)], 2-나프톨-6-설폰산[일본 특허 공개 공보 제13515/73호], 또는 1,5-나프탈렌디설폰산[일본 특허 공개 공보 제109,953/79호]을 이소루이신과 반응시켜 이소루이신을 정제하기 위해서 부가물을 형성시키는 이소루이신 정제 방법을 포함한다. 그러나, 사용되는 침전제가 비싸고 산업적으로 수득하기 어려우며, 부가물로 부터 이소루이신을 분리하기가 용이하지 않으며, 이소루이신 이외의 다른 아미노산과 염을 형성하기 어렵기 때문에 이의 용도가 제한적이며, 침전제 자체의 독성이 높다는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 저렴한 침전제를 사용해 발린, 루이신 및 이소루이신을 손쉽게 고수율 및 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 또다른 목적은 유사한 화학적 특성을 갖고 있어서 상호간에 분리 및 정제가 어려운 발린, 루이신 및 이소루이신중 어느 것에도 공통적으로 적용할 수 있고, 활성 슬러지등과 동화할 수 있으며, 산업적으로 쉽게 사용할 수 있는 침전제를 개발하는데 있다.
도 1은 참조 실시예 1에서 수득된 p-에틸벤젠 설폰산염 나트륨에 대한1H-NMR 분광 분석(D2O) 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 L-발린 p-에틸벤젠 설폰산염의 결정 분말에 대한 X-선 회절 패턴이다.
도 3은 실시예 5에서 수득된 L-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염의 결정 분말에 대한 X-선 회절 패턴이다.
도 4는 실시예 9에서 수득된 L-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염의 결정 분말에 대한 X-선 회절 분석 패턴이다.
이런 상황하에 열성적인 연구 결과, 본 발명의 발명자들은 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 수용액에 p-에틸벤젠 설폰산을 부가한 후, 이를 반응 및 냉각시키면 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염 결정이 선택적으로 침전된다는 것을 발견했다. 이로써 본 발명자들은 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은;
(1) 발린 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰을 포함하는 신규한 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정, 및
(2) p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 발린을 함유하는 수용액에 부가하여 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시킨 후 이 염을 분리 및 분해하여 발린을 수득하는 것을 포함하여, 발린을 정제하는 방법.
(3) 루이신 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰을 포함하는 신규한 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정, 및
(4) p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 루이신을 함유하는 수용액에 부가하여 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시킨 후 이 염을 분리 및 분해하여 루이신을 수득하는 것을 포함하여, 루이신을 정제하는 방법.
(5) 이소루이신 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰을 포함하는 신규한 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정, 및
(6) p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 이소루이신을 함유하는 수용액에 부가하여 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시킨 후 이 염을 분리 및 분해하여 이소루이신을 수득하는 것을 포함하여, 이소루이신을 정제하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 발린, 루이신 및 이소루이신은 광학적으로 활성 이성질체, 라세미체, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 발린, 루이신 및 이소루이신을 함유하는 수용액은 콩 단백질같은 단백질들이 가수분해된 가수분해물로 부터 염기성 아미노산을 분리 및 제거하여 수득되는 아미노산 혼합물 수용액, 발린, 루이신 및 이소루이신을 생산 및 축적하는 능력을 가진 미생물을 배양하여 수득된 발효 육즙, 또는 발효액으로부터 미생물을 제거하여 수득되는 액체, 또는 이온교환 수지 또는 흡착 수지로 처리하여 수득되는 액체, 또는 화학 합성 방법으로 예를 들어 히단토인 유도체 등을 통해 수득되는 순수하지 않은 D, L-발린, D, L-루이신, 또는 D, L-이소루이신 수용액과 같이 광범위하게 다양한 수용액을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 p-에틸벤젠 설폰산은 에틸 벤젠 및 1.5몰 초과량의 농황산을 유리 용기에 넣고 혼합물을 130℃에서 1 내지 2시간동안 가열하여 쉽게 제조할 수 있으며, 결과적으로 산업적으로 저렴하게 수득될 수 있다. p-에틸벤젠 설폰산은 유리산으로서 또는 이의 수용성 염의 형태, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염 등과 같은 알칼리 토금속염, 또는 암모늄염 등의 형태로 사용될 수 있다. 사용되는 p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염의 양은 수용액 중에 포함된 발린, 루이신 및 이소루이신에 대해 등몰량 또는 그이상, 바람직하게 1.0 내지 1.1배 몰 과량이며, 특히 많은 과량의 사용은 필요치 않다.
바람직한 화합물, 발린 p-에틸벤젠 설폰산염은 p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의수용성 염을 60 g/L 이상의 발린을 함유하는 수용액에 부가하고 pH를 1.5로 조정하여 쉽게 형성 및 침전시킬 수 있다. 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시키기에 적합한 용액의 pH는 0.1 내지 2.3, 바람직하게 1.0 내지 1.7이다. pH를 조정하기 위해 사용되는 산은 염산, 황산 등과 같은 무기산이다. 필요하다면, p-에틸벤젠 설폰산염의 모결정을 발린 및 p-에틸벤젠 설폰산 혼합물에 부가하여 결정을 효율적으로 침전시킬 수 있다. 희석 용액이 발린의 수용액으로 사용되는 경우, 이는 상기 염의 결정을 침전시키도록 농축될 수 있다. 이런 경우, p-에틸벤젠 설폰산은 농축 전후의 어느 단계에서든 부가될 수 있다. 중성에서 발린 수용액을 농축하면 유리 발린의 결정이 침전되기는 하지만, 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 적정량의 p-에틸벤젠 설폰산을 부가하고 pH를 약 1.5로 조정하여 쉽게 형성시킬 수 있다. 대체안으로, 조정량의 p-에틸벤젠 설폰산의 공존하에 pH를 약 2로 조정한 후 발린 희석 용액을 농축하여 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킬 수 있다.
침전된 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 분리 및 수득하기 위해, 고체-액체 분리를 위한 통상적인 방법, 예를 들어, 여과, 원심분리 등의 방법을 사용할 수 있다. 분리된 결정이 고순도라 할지라도, 세정 재결정화 등과 같은 통상적인 정제 방법으로 추가로 정제할 수 있다.
결과로 수득된 발린 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰로 구성되는 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 하기 물리적 특성을 갖는 신규한 물질이다:
백색 판상 결정: 물과 에탄올에 가용성
물에 대한 용해도: 14.5 중량% (pH 1.4, 5℃)
결정 구조: 사방정계
결정 밀도: 1.31 g/cm3
원소 분석: 실측치: C, 51.6%; H, 6.9%; N, 4.5%; S, 10.5%. (계산치: C, 51.5%; H, 6.9%; N, 4.6%; S, 10.6%)
발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정으로부터 유리 발린을 분리하기 위해, 결정을 과량의 온수에 녹이고, 용액을 약염기성 이온교환 수지(OH 형)와 접촉시키거나, 수산화나트륨같은 알칼리를 상기 용액에 부가할 수 있다. 이온교환 수지를 사용하는 경우, p-에틸벤젠 설폰산은 수지에 흡착되고 유리 발린은 용출 용액으로 수득된다. 농축에 의한 결정화 같은 통상적인 방법을 사용해 발린 결정을 수득한다. 수지에 흡착된 침전제(p-에틸벤젠 설폰산)은 수산화나트륨 용액 등과 같은 알칼리 용액으로 수지를 재생할 때 알칼리 염으로 용출된다.
알칼리를 부가하는 방법의 경우, 수산화나트륨 등과 같은 알칼리를 그 자체로 또는 이의 수용액으로 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정 수성 현탁액에 부가한 후, pH를 5 내지 8 정도, 바람직하게 6 또는 7로 조정하면, 이에 따라 p-에틸벤젠 설폰산은 알칼리 염으로서 용액중에 용해되는 반면 유리 발린은 침전되고, 침전된 발린은 용액으로부터 분리한다.
알칼리염으로서 분리 및 회수된 침전제(p-에틸벤젠 설폰산)자체는 다음 공정에서 침전제로 재사용할 수 있다.
바람직한 화합물, 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염은 p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 30 g/L이상의 루이신을 포함하는 수용액에 부가하고 pH를 1.5로 조정하여 쉽게 형성 및 침전시킬 수 있다. 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시키기에 적합한 용액의 pH는 0.1 내지 2.3, 바람직하게 1.0 내지 1.7이다. pH를 조정하기 위해 사용되는 산은 염산, 황산 등과 같은 무기산이다. 필요하면, 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염의 모결정을 p-에틸벤젠 설폰산의 혼합물에 부가하여 결정을 효과적으로 침전시킬 수 있다. 루이신 수용액으로서 희석 용액이 사용되는 경우, 농축하여 상기 염의 결정을 침전시킬 수 있다. 이런 경우, p-에틸벤젠 설폰산은 농축 전후의 어느 단계에서든 부가할 수 있다. 중성에서 루이신 수용액을 농축할 경우 유리 루이신 결정이 침전되기는 하지만, 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 조정량의 p-에틸벤젠 설폰산을 부가하고 pH를 약 1.5로 조정하여 쉽게 형성할 수 있다. 대체안으로, 조정량의 p-에틸벤젠 설폰산의 공존하에 pH를 약 2로 조정한 후 루이신 희석 용액을 농축하여 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킬 수 있다.
침전된 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 분리 및 수득하기 위해, 고체-액체 분리를 위한 통상적인 방법, 예를 들어, 여과, 원심분리 등의 방법을 사용할 수 있다. 분리된 결정이 고순도라 할지라도, 세정 재결정화 등과 같은 통상적으로 사용되는 정제 방법으로 추가로 정제할 수 있다.
결과로 수득된 루이신 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰로 구성되는 루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 하기 물리적 특성을 갖는 신규한 물질이다:
백색 판상 결정: 물과 에탄올에 가용성
물에 대한 용해도: 7.1 중량% (pH 1.6, 5℃)
결정 구조: 단사계
결정 밀도: 1.32 g/cm3
원소 분석: 실측치: C, 53.1%; H, 7.3%; N, 4.3%; S, 9.9%. (계산치: C, 53.0%; H, 7.3%; N, 4.4%; S, 10.1%)
루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정으로부터 유리 루이신을 분리하는데 있어, 상기 기술된 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정으로부터 유리 발린을 분리하는 방법을 따른다.
알칼리 염으로서 분리 및 회수된 침전제(p-에틸벤젠 설폰산) 자체는 다음공정에서 침전제로 재사용될 수 있다.
바람직한 화합물, 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염은 p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 50 g/L이상의 이소루이신을 함유하는 수용액에 부가하고 pH를 1.5로 조정하여 손쉽게 형성 및 침전시킬 수 있다. 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 형성 및 침전시키기에 적합한 용액의 pH는 0.1 내지 2.3, 바람직하게 1.0 내지 1.7이다. pH를 조정하기 위해 사용되는 산은 염산, 황산 등과 같은 무기산이다. 필요하면, 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염의 모결정을 이소루이신 및 p-에틸벤젠 설폰산 혼합물에 부가하여 결정을 효과적으로 침전시킬 수 있다. 이소루이신 수용액으로서 희석 용액이 사용되는 경우, 농축하여 그 염의 결정을 침전시킬 수 있다. 이런 경우, p-에틸벤젠 설폰산은 농축 전후의 어느 단계에서든 부가될 수 있다. 이소루이신 수용액을 중성에서 농축하는 경우 유리 이소루이신의 결정이 침전되기는 하지만, 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 조정량의 p-에틸벤젠 설폰산을 부가하고 pH를 약 1.5로 조정하여 손쉽게 형성시킬 수 있다. 대체안으로, 적정량의 p-에틸벤젠 설폰산의 공존하에 pH를 약 2로 조정한 후 이소루이신 희석 용액을 농축하여 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킬 수 있다.
침전된 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 분리 및 수득하기 위해, 고체-액체 분리를 위한 통상적인 방법, 예를 들어, 여과, 원심분리 등을 사용할 수 있다. 분리된 결정이 고순도라 할지라도, 세정 재결정화 같은 통상적으로 사용되는 정제 방법으로 추가로 정제할 수 있다.
결과로 수득된 이소루이신 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰로 구성된 이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 하기 물리적 특성을 갖는 신규한 물질이다:
백색 판상 결정: 물과 에탄올에 가용성
물에 대한 용해도: 11.6 중량% (pH 1.5, 5℃)
결정 구조: 단사계
결정 밀도: 1.27 g/cm3
원소 분석: 실측치: C, 53.1%; H, 7.3%; N, 4.3%; S, 9.8%.(계산치: C, 53.0%; H, 7.3%; N, 4.4%; S, 10.1%)
이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정으로부터 유리 이소루이신을 분리하기 위해서, 상기 기술된 바와 같이 발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정으로부터 유리 발린을 분리하는 방법에 따른다.
알칼리 염으로서 분리 및 회수된 침전제(p-에틸벤젠 설폰산) 자체는 다음공정에서 침전제로 다시 사용될 수 있다.
실시예
하기에서, 본 발명은 실시예를 참조로 보다 상세히 기술한다. 루이신, 이소루이신, 발린 및 다른 아미노산에 대한 정량화는 히타치 L-8500 아미노산 분석기를 사용해 수행된다.
참조 실시예 1(p-에틸벤젠 설폰산의 제조 및 동화능)
농황산 33ml(0.6몰)을 에틸 벤젠 62ml(0.5몰)에 부가하고, 그 혼합물을 120 내지 130℃에서 가열하며 1.5시간동안 교반시킨다. 반응하지 않은 에틸 벤젠이 잔류하면 층 분리가 일어나며, 따라서 층 분리가 완전히 없어진 후 반응을 종결시키면, 주요 성분으로서 p-에틸벤젠 설폰산을 함유하는 용액이 수득된다. 이 용액을 물 150ml에 붓고 탄산수소나트륨을 사용해 부분적으로 중화시키면, 설폰산이 염화나트륨과 함께 나트륨 염으로 전환되어 나트륨 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 결과로 수득된 결정은 여과로 분리하여 진공 건조시킨다. 이와 같은 p-에틸벤젠 설폰산염나트륨은 매우 수용성이고 에탄올에 난용성이다. 수득된 결정의1H-NMR 분광 분석은 도 1에 나타낸다.
p-에틸벤젠 설폰산의 활성 슬러지에 의한 동화 능력에 있어서, 25℃, pH 7.0에서 2주동안 100mg/L의 p-에틸벤젠 설폰산의 약 80%가 동화된다 [참조 문헌: Yukagaku (Oil Chemistry), 28(5), 354(1979)].
실시예 1
물 400ml을 L-발린 100g 및 p-에틸벤젠 설폰산 159g에 부가하고, 용액 온도를 40℃로 가온하여 고체를 용해시킨다. 그 후, 상기 용액을 5℃로 냉각시켜 L-발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시키고, 침전된 결정은 여과 분리하고 진공 건조시킨다. 결과로 수득된 L-발린 p-에틸벤젠 설폰산염은 1.31 g/cm3의 결정 밀도를 갖는 사방정계 구조의 미세한 백색 결정이다. 결정 분말의 X-선 회절 패턴은 도 2에 나타낸다. X-선 회절은 방사원으로 Cu-Kα선을 사용하여 결정한다. 원소 분석 결과는 C, 51.6%; H, 7.0%; N, 4.5%; S, 10.5%이다.
비교 실시예 1
물 400ml을 L-발린 100g 및 p-에틸벤젠 설폰산 147g에 부가하고, 용액 온도를 40℃로 가온하여 용해시킨다. 그 후, 용액을 5℃로 냉각시켜도, 어떠한 결정도 수득할 수 없다.
실시예 2
L-발린 35g 및 L-루이신, L-이소루이신 각각 3.5g을 물 125ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 55.6g(발린과 등몰량)을 부가하여 가열 용해시키고, pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 상기 용액을 냉각시켜 L-발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정을 원심분리로 회수하고, 다량의 온수에 용해시키고 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거한다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-발린 결정 21g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 발린 침전율이 63%, 유리 L-발린의 순도는 92%, 및 기타 아미노산 함량은 8% 미만이고 결정화 이전 불순물의 76%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 3
L-발린 35g 및 L-루이신 및 L-이소루이신 각각 1.1g을 물 100ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 55.6g(발린과 등몰량)을 부가하여 가열 용해시키고, pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 상기 용액을 냉각시켜 L-발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정을 원심분리로 회수하고, 다량의 온수에 용해시키고 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거한다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-발린 결정 27g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 발린 침전율이 80%, 유리 L-발린의 순도는 97%, 및 기타 아미노산 함량은 3% 미만이고 결정화 이전 불순물의 67%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 4
D-발린 10g 및 D-루이신 및 D-이소루이신 각각 0.3g을 물 30ml에 부가하고, p-에틸벤젠 설폰산 15.8g(발린과 등몰량)을 부가하여 pH를 1.1로 조정하고, 가열 용해시킨다. 그 후, 상기 용액을 냉각시켜 D-발린 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정을 원심분리로 회수하고 다량의 온수에 용해시키고 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거한다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 D-발린 결정 7.5g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 발린 침전율이 80%, 유리 D-발린의 순도가 97%, 및 기타 아미노산 함량이 3% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 67%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 5
물 400ml을 L-루이신 100g 및 p-에틸벤젠 설폰산 142g에 부가하고 용액의 온도를 40℃로 가온하여 고체를 용해시킨다. 그 후, 용액을 5℃로 냉각시켜 L-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시키고, 침전된 결정을 여과를 통해 분리하고 진공 건조시킨다. 결과로 수득된 L-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염은 1.32 g/cm3의 결정 밀도를 갖는 단사계 구조의 미세한 백색 결정이다. 결정 분말의 X-선 회절 패턴은 도 3에 나타낸다. X-선 회절은 방사원으로 Cu-Kα선을 이용하여 결정한다. 원소 분석 결과는 C, 53.0%; H, 7.4%; N, 4.3%; S, 9.8%이다.
실시예 6
L-루이신 35g 및 L-발린 및 L-이소루이신 각각 3.5g을 물 300ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 49.7g(루이신과 등몰량)을 부가하여 가열 용해시키고, pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 용액을 냉각시켜 L-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심분리로 회수하고, 다량의 온수에 용해시켜, 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거시킨다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-루이신 결정 25g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 루이신 침전율이 73%, 유리 L-루이신의 순도가 99%, 및 기타 아미노산 함량이 1% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 96%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 7
L-루이신 35g 및 L-발린 및 L-이소루이신 각각 1.1g을 물 220ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 49.7g(루이신과 등몰량)을 부가하여 가열 용해시키고, pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 용액을 냉각시켜 L-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심분리를 통해 회수하고, 다량의 온수에 용해시켜 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거시킨다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-루이신 결정 27g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 루이신의 침전율이 80%, 유리 L-루이신의 순도가 99%, 및 기타 아미노산의 함량이 1% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 88%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 8
D-루이신 10g 및 D-발린 및 D-이소루이신 각각 0.3g을 물 65ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 14.2g(루이신과 등몰량)을 부가하여 pH를 1.1로 조정하고, 가열 용해시킨다. 그 후, 용액을 냉각하여 D-루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심분리를 통해 회수하고, 다량의 온수에 용해시켜 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거한다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 D-루이신 결정 7.5g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 루이신의 침전율이 80%, 유리 D-루이신의 순도가 99%, 및 기타 아미노산 함량이 1% 미만이고 결정화 이전 불순물의 88%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 9
물 400ml을 L-이소루이신 100g 및 p-에틸벤젠 설폰산 142g에 부가하고, 온도를 40℃로 가온하여 고체를 용해시킨다. 그 후, 5℃로 냉각하여 L-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시키고, 침전된 결정을 여과 분리하고 진공 건조시킨다. 결과로 수득된 L-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염은 1.27 g/cm3의 결정 밀도를 갖는 단사계 구조의 미세한 백색 결정이다. 결정분말의 X-선 회절 패턴을 도 4에 나타낸다. X-선 회절 패턴은 방사원으로서 Cu-Kα선을 사용해 결정한다. 원소 분석 결과는 C, 53.1%; H, 7.3%; N, 4.3%; S, 9.9%이다.
비교 실시예 2
물 400ml을 L-이소루이신 100g 및 p-에틸벤젠 설폰산 152g에 부가하고, 온도를 40℃로 가온하여 고체를 용해시킨다. 그 후, 용액을 5℃로 냉각시켜도, 어떠한 결정도 수득할 수 없다.
실시예 10
L-이소루이신 35g 및 L-발린 및 L-루이신 각각 3.5g을 물 125ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 49.7g을 부가하고, 가온하여 용해시키고 pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 용액을 냉각시켜 L-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심분리를 통해 회수하고, 다량의 온수에 용해시켜 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거시킨다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-이소루이신 결정 25g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 이소루이신의 침전율이 68%, 유리 L-이소루이신의 순도가 96%, 및 기타 아미노산 함량이 4% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 86%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 11
L-이소루이신 35g 및 L-발린 및 L-루이신 각각 1.1g을 물 100ml에 분산시키고, p-에틸벤젠 설폰산 49.7g(이소루이신과 등몰량)을 부가하고 가온하여 용해시키고, pH를 1.1로 조정한다. 그 후, 용액을 냉각하여 L-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심 분리하여 회수하고, 다량의 온수에 용해시켜 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거시킨다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 L-이소루이신 결정 28g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 이소루이신의 침전율이 85%, 유리 L-이소루이신의 순도가 98%, 및 기타 아미노산 함량이 2% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 75%가 제거됨을 나타낸다.
실시예 12
D-이소루이신 10g 및 D-발린 및 D-루이신 각각 0.3g을 물 30 ml에 부가하고, p-에틸벤젠 설폰산 14.2g(이소루이신과 등몰량)을 부가하고 pH를 1.1로 조정하여, 가열 용해시킨다. 그 후, 용액을 냉각하여 D-이소루이신 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 침전시킨다. 침전된 결정은 원심 분리하여 회수하고 다량의 온수에 용해시켜 약염기성 이온교환 수지(OH 형)를 통해 통과시켜 p-에틸벤젠 설폰산을 제거시킨다. 용출액을 농축하여 결정화시키면 유리 D-이소루이신 결정 8g을 수득하게 된다. 모액 분석 결과는 이소루이신의 침전율이 84%, 유리 D-이소루이신의 순도가 98%, 및 기타 아미노산 함량이 2% 미만이고, 결정화 이전 불순물의 73%가 제거됨을 나타낸다.
상기 기술된 바와 같이, 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 및 p-에틸벤젠 설폰산으로 이루어진 본 발명에 의해 수득된 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염 결정은 저렴하고 손쉽게 고순도의 상기 아미노산을 제공해 주며 따라서 매우 유용하다. 즉, 상기 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염 결정을 제조하고 상기 아미노산을 정제하는 공정은 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어떠한 아미노산에도 적용될 수 있으면서도 다른 아미노산으로부터 상기 아미노산들을 분리하는 효과는 상기 염의 특이성으로 인해 유효하다. 추가로, p-에틸벤젠 설폰산은 값싼 에틸벤젠을 술폰화하여 산업적으로 쉽게 제조 및 수득할 수 있고, 또한 미생물과 동화할 수 있어서, 이의 폐수는 활성 슬러지로 처리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 저렴하고 쉽게 산업에 응용할 수 있다. 추가로, 상기 염으로부터 상기 아미노산을 분리 및 수득하기 쉽고 상기 염으로부터 나온 p-에틸벤젠 설폰산을 재사용하기 쉽다.

Claims (3)

  1. 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 1몰 및 p-에틸벤젠 설폰산 1몰을 포함하는 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염 결정.
  2. p-에틸벤젠 설폰산 또는 이의 수용성 염을 발린, 루이신 및 이소루이신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 함유하는 수용액에 반응시켜 아미노산 p-에틸벤젠 설폰산염의 결정을 형성시킨 후 상기 염을 분리 및 분해시켜 상기 아미노산을 수득함을 포함하는, 아미노산의 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, p-에틸벤젠 설폰산의 수용성 염이 알칼리 금속 염인 방법.
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