KR19980064209A - 라피노스 신타제 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 라피노스 신타제 유전자가 여러 식물로부터 분리되었다. 이들 라피노스 신타제 유전자는 식물에 있어서 라피노스과 올리고당의 함량을 변화시키는데 유용하다.
Description
본 발명은 라피노스 신타제 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다.
라피노스과 올리고당은 화학식으로서 o-α-D-갈락토피라노실-(1→6)n-o-α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-플룩토푸라노시드로 표현되는, 수크로스의 유도체이며, 이들은 n이 1인 경우 라피노스, n이 2인 경우 스타키오세, n이 1인 경우 베르바스코세, n이 4인 경우 아주고세라 명명된다.
이러한 라피노스과 올리고당의 대부분은 수크로스를 제외하고는 식물에서 발견되며, 소나무과 식물(예, 스프루스)과 같은 겉씨식물 및 콩과 식물(예, 대두, 강낭콩), 평지속 식물(예, 포도), 명아주과 식물(예, 사탕무), 당아욱과 식물(예, 목화) 및 버들과 식물(예, 포플라)와 같은 속씨식물을 포함하는 고등식물 뿐 아니라 녹조류, 클로렐라에 함유되어 있는 것으로 알려져왔다. 따라서, 이들은 수크로스와 유사한 식물계에서 광범위하게 발생된다.
라피노스과 올리고당은 많은 식물의 저장기관 또는 종자에서 당을 보존하거나 또는 일부 식물의 조직들 사이에서 당을 수송하는 역할을 한다.
게다가, 라피노스과 올리고당은 만일 존재한다면 식품에 적합한 양으로 장내세균 식물상의 양호한 조건을 제공하는 효과를 가지는 것으로 알려져왔다. 따라서, 라피노스과 올리고당은 다양한 식물에 첨가하기 위한 기능성 식품 재료로서 사용되고 특정 건강식품 분야에서 이용되어 왔다.
이러한 역할과 유용성을 가지는 라피노스과 올리고당은 많은 식물의 수크로스를 출발물질로 하는 라피노스 올리고당 합성계에 의해 생성된다. 이 생합성계는 보통 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기에 α(1→6) 결합을 통해 갈락토티놀로부터의 갈락토실기의 순차 부가 반응을 포함한다.
이 생합성계의 제1 단계에서, 라피노스 신타제는 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 갈락토티놀로부터의 D-갈락토실기와의 결합에 의한 라피노스 생성 반응과 관련된 효소이다. 이 효소는 상기 합성계의 율속 단계를 이루는 것으로 제안되어 왔으며, 이 효소는 라피노스과 올리고당의 생합성을 조절하는데 있어서 상당히 중요한 것으로 알려져왔다.
식물의 라피노스 신타제의 발현 수준 또는 활성을 조절하므로써, 이들 식물의 라피노스과 올리고당의 함량을 변화시키는 것이 가능하다. 그러나, 이 효소 자체의 존재가 이미 생화학 기술을 사용하여 그의 활성을 측정하므로써 많은 식물에서 확인되었더라도, 라피노스 신타제는 아직까지는 균질 단백질로서 성공적으로 분리되어 정제되지 않았다. 또한, 이 효소의 아미노산 서열은 여전히 미지이며, 이 효소를 암호화하는 유전자를 분리시키기 위한 초기 시도에 대한 보고도 행해져있지 않다.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 잠두로부터 이 효소를 암호화하는 라피노스 신타제 및 유전자를 분리시키기 위해 예의 연구한 결과 마침내 성공을 거두게 되었다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
1) 식물로부터 분리되고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
2) 1) 항목에 있어서, 식물이 쌍떡잎식물인 라피노스 신타제 유전자,
1) 2) 항목에 있어서, 쌍떡잎식물이 콩과식물인 라피노스 신타제 유전자,
4) 1) 항목에 있어서, 콩과식물이 잠두인 라피노스 신타제 유전자,
5) (a) 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열 1의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
6) 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
7) 1) 항목에 있어서, 콩과식물이 대두인 라피노스 신타제 유전자,
8) (a) 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열 1의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
9) 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
10) 2) 항목에 있어서, 쌍떡잎식물이 꿀풀과 식물인 라피노스 신타제 유전자,
11) 10) 항목에 있어서, 꿀풀과 식물이 저패니즈 아티초크인 라피노스 신타제 유전자,
12) 서열 5를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 라피노스 신타제 유전자,
11) 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
14) 1) 항목에 있어서, 식물인 외떡잎식물인 라피노스 신타제 유전자,
15) 14) 항목에 있어서, 외떡잎식물이 벼과식물인 라피노스 신타제 유전자,
16) 15) 항목에 있어서, 벼과식물이 옥수수인 라피노스 신타제 유전자,
17) 서열 7의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
18) 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
19) (a) 서열 1 또는 서열 1의 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고,
수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 라피노스 신타제 단백질,
20) 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자,
21) 1), 2), 3), 4), 7), 10), 11), 14), 15) 또는 16) 항목의 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편,
22) 5), 6), 8), 9), 12), 13), 17) 또는 18) 항목의 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편,
23) 21) 또는 22) 항목에 있어서, 뉴클레오티드의 수가 15 내지 50인 유전자 단편,
24) 생물 유도 게놈 DNA 또는 cDNA 단편에 21), 22) 또는 23) 항목의 표지된 유전자 단편의 프로브를 하이브리드화시키고, 프로브에 특정 결합된 DNA 단편을 검출하는 것을 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 검출 방법,
25) 식물 유도 게놈 DNA 또는 cDNA 단편에 21), 22) 또는 23) 항목의 표지된 유전자 단편의 프로브를 하이브리드화시키고, 프로브에 특정 결합된 DNA 단편을 검출하는 것을 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 검출 방법,
26) 생물 유도 게놈 DNA 또는 cDNA에 21), 22) 또는 23) 항목의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 어니일링시키고, 생성 DNA 단편을 폴리머라제 쇄 반응에 의해 증폭시키는 것을 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 증폭 방법,
27) 식물 유도 게놈 DNA 또는 cDNA에 21), 22) 또는 23) 항목의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 어니일링시키고, 생성 DNA 단편을 폴리머라제 쇄 반응에 의해 증폭시키는 것을 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 증폭 방법,
28) 24), 25), 26) 또는 27) 항목의 방법에 의해 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 함유하는 DNA 단편을 동정하는 단계; 및 동정된 DNA 단편을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자의 수득 방법,
29) 24), 25), 26) 또는 27) 항목의 방법에 의해 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 함유하는 DNA 단편을 동정하고, 동정된 DNA 단편을 분리 및 정제하여 수득된 라피노스 신타제 유전자,
30) 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17), 18) 또는 29) 항목의 라피노스 신타제 유전자, 및 그에 결합된 프로모터를 포함하는 키메라 유전자,
31) 숙주 생물내로 30) 항목의 키메라 유전자를 도입하여 수득된 형질전환체,
32) 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17), 18), 29) 또는 30) 항목의 라피노스 신타제 유전자를 포함하는 플라스미드,
33) 32) 항목의 플라스미드로 형질전환된 숙주 생물, 또는 그의 세포,
34) 32) 항목의 플라스미드로 형질전환된 미생물,
35) 32) 항목의 플라스미드로 형질전환된 식물, 또는 그의 세포,
36) 숙주 생물 또는 그의 세포내로 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17), 18), 29) 또는 30) 항목의 라피노스 신타제 유전자를 도입하여, 숙주 생물 또는 그의 세포내의 라피노스과 올리고당의 함량을 변화시키는 것을 포함하는 대사 조절 방법,
37) 34) 항목의 미생물을 배양하여 수득된 배양액으로부터 라피노스 신타제 단백질을 분리 및 정제시키는 것을 포함하는 라피노스 신타제 단백질의 제조 방법,
38) 19) 또는 20) 항목의 라피노스 신타제 단백질에 결합할 수 있는 항-라피노스 신타제 항체, 및
39) 시험 단백질을 38) 항목의 항-라피노스 신타제 항체로 처리하고; 항체와 라피노스 신타제 단백질 사이의 항원-항체 반응에 의해 라피노스 신타제 단백질을 검출하는 것을 포함하는, 라피노스 신타제 단백질의 검출 방법.
도 1은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli.)의 잠두 라피노스 신타제 유전자의 발현을 확인하는데 사용되는 플라스미드의 구조를 나타낸다. pBluescriptKS-RS는 라피노스 신타제 유전자가 클론된 플라스미드이다. RS는 라피노스 신타제 유전자를 나타내며 도 1의 상단에 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 라피노스 신타제 유전자의 양쪽 말단 부위의 서열이다. 소문자로 나타낸 부분 서열을 벡터 pBluescriptIIKS로부터 유도된 뉴클레오티드 서열이다. 2개의 사각형 내부의 뉴클레오티드 서열은 각각 라피노스 신타제 유전자의 개시 코돈(ATG) 및 종결 코돈 (TGATAA)이다. 수개의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위는 뉴클레오티드 서열 상부에 나타낸다. pGEX-RS 및 pTrc-RS는 이.콜리내 라피노스 신타제 유전자의 발현에 사용된 플라스미드이다. Prac, Ptrc, GST, lacIq및 rrnB는 각각 tac 프로모터, trc 프로모터, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 유전자, 락토즈 리프레서 유전자 및 리보소옴 RNA의 전사용 말단 시그날을 나타낸다.
도 2는 각각 라피노스 신타제 유전자 및 그에 결합된 프로모터를 갖는 키메라 유전자의 식물에서의 발현에 사용되는 발현 벡터의 구성을 나타낸다. 플라스미드 pBluescriptKS-RS에서 클로닝된 라피노스 신타제 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 맵은 이 도면의 저부에 도시되어 있다. pBI221RS 및 pBI221(-)RS는 대두의 형질전환에 사용되는 발현 벡터의 제한 엔도뉴클레아제 맵을 나타낸다. 35S 및 NOS는 각각 꽃양배추 모자이크 바이러스로부터 유도된 35S 프로모터 및 노팔린 신타제 유전자 터미네이터를 나타낸다.
도 3은 각각 라피노스 신타제 유전자 및 그에 결합된 프로모터를 갖는 키메라 유전자의 식물에서의 발현에 사용되는 발현 벡터의 구성을 나타낸다. 플라스미드 pBluescriptKS-RS에서 클로닝된 라피노스 신타제 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 맵은 이 도면의 상부에 도시되어 있다. pBI221RS 및 pBI221(-)RS는 겨자의 형질전환에 사용되는 2성분 벡터의 제한 엔도뉴클레아제 맵을 나타낸다. 2성분 벡터의 경우, 우측 경계와 좌측 경계 사이의 영역만이 도시되어 있다. 35S, NOS 및 NPT는 각각 꽃양배추 모자이크 바이러스로부터 유도된 35S 프로모터, 노팔린 신타제 유전자 터미네이터 및 카나마이신 내성 유전자를 나타낸다.
후술하는 유전자 공학 방법은 예를 들어, 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6; Current Protocols In Molecular Biology (1987), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-11184-8)에 기재되어 있는 바와 같이, 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다.
본원에 사용된 라피노스 신타제 유전자라는 용어는 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기와의 결합에 의해 라피노스를 생성할 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자(이하, 간단히 본 발명의 유전자라 일컬음)를 말하며, 이러한 유전자는 예를 들어 식물로부터 제조될 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 유전자는 소나무과 식물(예, 스프루스)과 같은 겉씨식물 및 콩과 식물(예, 잠두, 대두) 및 꿀풀과 식물(예, 저패니즈 아티초크)와 같은 쌍떡잎식물 또는 벼과식물(예, 옥수수)와 같은 외떡잎식물로부터 제조할 수 있다. 구체적인 본 발명의 유전자의 예로는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 서열 1의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 서열 3의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 서열 5의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 및 서열 7의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자가 있다.
본 발명의 유전자는 예를 들어 다음 방법에 의해 수득할 수 있다.
잠두(Vicia faba) 또는 대두(Glycine max)와 같은 콩과식물의 조직을 액체 질소에서 동결시키고 모르타르 또는 다른 수단을 사용하여 미분 조직 파편으로 물리적으로 분쇄시킨다. 조직 파편으로부터, 통상의 방법으로 RNA를 추출한다. 통상 이용가능한 RNA 추출 키트를 추출에 이용할 수 있다. 완전한 RNA를 에탄올 침전에 의해 RNA 추출물로부터 분리한다. 분리된 완전한 RNA로부터, 폴리-A 테일드 RNA를 통상의 방법으로 단편화시킨다. 통상 이용가능한 올리고-dT 칼럼을 단편화에 이용할 수 있다. cDNA를 통상의 방법으로 수득된 단편(즉, 폴리-A 테일드 RNA)로부터 합성한다. 통상 이용가능한 cDNA 합성 키트를 합성에 이용할 수 있다.
본 발명의 유전자로서, 예를 들어, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편을 주형으로서 상기 수득된 잠두 유도된 cDNA 및 하기 서열 목록 1에 예시된 프라이머 1 내지 3을 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 사용된 프라이머는 목적에 따라 서열 2의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 디자인 및 합성할 수 있다. 예를 들어, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자의 개방 판독 프레임 역역을 증폭시키기 위해, 하기 서열 목록 2에 예시된 프라이머 1 내지 4를 디자인 및 합성할 수 있다.
동일한 방법으로, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편을 주형으로서 상기 수득된 대두 유도된 cDNA 및 하기 서열 목록 1에 예시된 프라이머 4 내지 6을 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 사용된 프라이머는 목적에 따라 서열 4의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 디자인 및 합성할 수 있다. 예를 들어, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자의 개방 판독 프레임 영역을 증폭시키기 위하여, 하기 서열 목록 2에 예시된 프라이머 5 내지 8을 디자인 및 합성할 수 있다.
증폭된 DNA 단편은 예를 들어, 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratorty Press; 및 Current Protocols In Molecular Biology (1987), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X)에 기재된 통상의 방법에 따라 서브클로닝할 수 있다. 보다 구체적으로는, 클로닝은 예를 들어 TA 클로닝 키트(Invitrogen) 및 pBluescript II(Stratagene)과 같은 플라스미드 벡터를 사용하여 수행할 수 있다. 클로닝된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 문헌(F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, Proceedings of National Acadeny of Science U.S.A. (1977), 74, pp. 5463-5467)에 기재된 바와 같이, 디데옥시 터미네이팅 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 퍼킨 엘머사로부터 입수가능한 키트(ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
(서열 목록 1)
프라이머 1:
프라이머 2:
프라이머 3:
프라이머 4:
프라이머 5:
프라이머 6:
(서열 목록 2)
프라이머 1:
프라이머 2:
프라이머 3:
프라이머 4:
프라이머 5:
프라이머 6:
프라이머 7:
프라이머 8:
본원에서 사용된 유전자 단편이란 용어는 본 발명의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편(이하, 간단히 본 발명의 유전자 단편이라 일컬음)을 말한다. 예를 들어, 식물로부터 유도되고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기와의 결합에 의해 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편일 수 있다. 본 발명의 유전자 단편의 구체적인 예로는 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편 및 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편, 보다 구체적으로는 하기 서열 목록 3에 예시된 아미노산 서열 중의 임의의 서열을 암호화하는 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편이 있다.
이들 유전자 단편은 하이브리드화 방법에서 프로브로서 또는 PCR 방법에서 프라이머로서 사용될수 있다. PCR 방법에서의 프라이머에 대해서는, 일반적으로 어니일링의 특이성이 보장된다는 관점에서 뉴클레오티드의 수가 많은 것이 바람직하지만, 프라이머 자체가 어니일링 효율의 가능한 열화를 제공하는 고등 구조를 가지기 쉽고, 복잡한 과정이 합성 후 정제에 요구된다는 관점에서 뉴클레오티드의 수는 너무 크지 않는 것도 바람직하다. 통상의 경우, 뉴클레오티드의 수가 15 내지 50인 단일 쇄의 DNA로 구성되는 유전자 단편이 바람직하다.
(서열 목록 3)
본 발명의 유전자 단편은 표지된 후 하이브리드화 방법에서 프로브로서 사용되고, 생물 유도 DNA에 하이브리드화되어, 그에 특이적으로 결합된 프로브를 갖는 DNA 단편이 검출될 수 있다. 따라서, 생물 유도된 유전자 라이브러리로부터, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 효소의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편이 검출될 수 있다(이하, 간단히 본 발명의 검출 방법이라 일컬음).
생물 유도된 DNA로는, 예를 들어 목적 식물의 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리가 사용될 수 있다. 유전자 라이브러리는 예를 들어, 통상의 유전자 라이브러리 또는 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratorty Press; 및 Current Protocols In Molecular Biology (1987), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X)에 기재된 통상의 라이브러리 제조 방법에 따라 제조된 라이브러리일 수도 있다.
하이브리드화 방법으로는, 플라크 하이브리드화 또는 콜로니 하이브리드화를 라이브러리의 제조에 사용된 벡터의 종류에 따라 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 사용되는 라이브러리가 파지 벡터로 작제되는 경우, 적합한 숙주 미생물은 감염성 조건하에 파지와 혼합된 후, 연질 아가 배지와 더욱 혼합되고, 혼합물은 아가 배지상에 플레이트된다. 그 후, 배양액은 적절한 크기의 플라크가 나타날 때까지 37℃에서 성장된다. 사용되는 라이브러리가 플라스미드 벡터로 작제되는 경우, 플라스미드는 적합한 숙주 미생물에서 형질전환되어 형질전환체를 형성한다. 수득된 형질전환체는 적합한 농도로 희석되고, 희석물은 아가 배지상에서 플레이트된 후, 배양물은 적절한 크기의 콜로니가 나타날 때까지 37℃에서 성장된다.
상기 라이브러리 각각의 경우에, 막필터가 배양 후 아가 배지의 표면상에 위치되어, 파지 또는 형질전환체는 막으로 전달된다. 이 막은 알칼리로 변성된 후 중성화되고, 예를 들어 나일론막이 사용되는 경우 막은 자외선으로 조사되어 DNA가 막상에 고정된다. 이어서, 이 막은 프로브로서 통상의 방법에 의해 표지된 본 발명의 유전자 단편으로 하이브리드화된다. 이 방법에 있어서, 예를 들어, 문헌(D.M. Glo9ver ed., DNA cloning, a practical approach IRL PRESS (1985), ISBN 0-947946-18-7)을 참조할 수 있다. 여러 시약 및 온도 조건이 하이브리드화에 사용되며, 예를 들어 예비 하이브리드화는 6 x SSC(0.9 M NaCl, 0.09 M 시트르산), 0.1-1% SDS, 100 μg/ml 변성된 연어 정충 DNA를 첨가하고, 65℃에서 1시간 동안 항온처리함으로써 수행된다. 이어서, 표지된 본 발명의 유전자 단편이 프로브로서 첨가되어 혼합된다. 하이브리드화는 42-68℃에서 4 내지 16시간 동안 수행된다. 막은 2 x SCC, 0.1-1% SDS로 세정되고, 0.2 x SSC, 0-0.1% SDS로 린스된 후, 건조된다. 막은 예를 들어, 방사능사진법 또는 다른 기법에 의해 분석되어 막상의 프로브의 위치가 검출됨으로써 사용된 프로브의 뉴클레오티드 서열과 상사의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA의 위치가 검출된다. 따라서, 본 발명의 유전자 또는 본 발명의 유전자 단편은 검출될 수 있다. 막상에 이와 같이 검출된 DNA의 위치에 대응하는 클론은 원래의 아가 배지상에서 동정되고, 포지티브 클론이 선택되어, DNA를 갖는 클론이 분리될 수 있다. 동일한 검출 과정을 반복하여 DNA를 갖는 클론을 정제한다.
또 다른 방법, 예를 들어 길보 BRL(Gilbo BRL)로부터 입수가능한 키트(GENE TRAPPER cDNA Positive Selection System Kit)을 사용할 수도 있다. 이 방법에서, 단일 쇄의 DNA 라이브러리는 비오틴화된 본 발명의 유전자 단편(즉, 프로브)와 하이브리드화된 후, 스트렙토아비딘 결합 마그네트 비드가 첨가되어 혼합된다. 혼합물로부터, 스트렙토아비딘 결합 마그네트 비드가 마그네트로 수집되어, 본 발명의 유전자 단편, 비오틴 및 스트렙토아비딘을 통해 이들 비드에 결합된, 사용된 프로브와 상사의 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 쇄의 DNA가 수집 및 검출된다. 따라서, 본 발명의유전자 또는 본 발명의 유전자 단편이 검출될 수 있다. 단일 쇄의 수집된 DNA는 프라이머로서 적합한 올리고당을 사용한 적합한 DNA 폴리머라제를 사용한 처리에 의해 이 본쇄의 형태로 변화될 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 식물의 분석에 사용될 수도 있다. 보다 구체적으로는, 식물 게놈 DNA는 통상의 방법에 따라, 예를 들어 문헌(Cloning and Sequence(Plant Biotechnology Experiment Manual) Itaru Watanabe의 감독하에 컴파일, Masahiro Sugiura 편집, Noson Bunka-sha Tokyo 출판(1989))에 기재된 통상의 방법에 따라 제조된다. 식물 게놈 DNA는 여러 종류의 적합한 제한 엔도뉴클레아제에 이어서 전기영동에 의해 촉진되고, 전기영동된 DNA는 통상의 방법에 따라 필터상에 블롯팅된다. 이 필터는 통상의 방법에 의해 본 발명의 유전자 단편으로부터 제조된 프로브와 하이브리드화되고, 프로브가 하이브리드화되는 DNA 단편은 검출된다. 검출된 DNA 단편은 특정 식물 종의 다양한 변종 사이에서 길이가 비교된다. 길이의 차이로 인해, 이들 변종 사이의 라피노스과 올리고당의 발현이 수반된 표현형 특징의 차이를 분석하는 것이 가능하게 된다. 게다가, 상기 방법으로 검출된 DNA 단편이 동일 변종의 유전자 재조합 식물과 비-유전자 재조합 식물 사이에서 길이가 비교될 때, 전자의 식물은 후자의 식물로부터 후자의 식물에 대해서 보다는 전자의 식물에 대해 수효가 많고 농도가 높은 하이브리드화 밴드의 검출에 의해 식별된다. 이 방법은 예를 들어, 문헌(Plant PCR Experiment Protocols Ko Shimamoto and Takuji Sasaki의 감독하에 컴파일, Shujun-sha, Tokyo 출판(1995), ISBN 4-87962-144-7, pp. 90-94)에 기재된 바와 같이 RFLP(제한 단편 길이 다형성) 방법에 따라 수행될수 있다.
본 발명의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 PCR 방법에 의해, 생물 유도된 DNA로부터 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 효소의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자, 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 증폭시키는 것이 가능하게 된다(이하, 간단히 본 발명의 증폭 방법이라 일컬음).
보다 구체적으로는, 예를 들어 3' 말단에서 본 발명의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열에 있어서 15 내지 50개의 뉴클레오티드를 갖는 올리고당은 통상의 합성 방법으로 화학적으로 합성된다. 뉴클레오티드 서열에서 암호화된 아미노산의 대응을 나타내는 하기 코돈 표에 기초하여, 혼합된 프라이머는 프라이머내의 특정 위치의 잔기가 특정 아미노산을 암호화할 수 있는 코돈의 종류에 따라 여러 염기의 혼합물로 변화되도록 합성될 수도 있다.
| Phe | UUU | Ser | UCU | Tyr | UAU | Cys | UGU |
| UUC | UCC | UAC | UGC | ||||
| Leu | UUA | UCA | 정지 코돈 | UAA | 정지 코돈 | UGA | |
| UUG | UCG | UAG | Trp | UGG | |||
| CUU | Pro | CCU | His | CAU | Arg | CGU | |
| CUC | CCC | CAC | CGC | ||||
| CUA | CCA | CAA | CGA | ||||
| Gln | |||||||
| CUG | CCG | CAG | CGG | ||||
| Ile | AUU | Thr | ACU | Asn | AAU | Ser | AGU |
| AUC | ACC | AAC | AGC | ||||
| AUA | ACA | Lys | AAA | Arg | AGA | ||
| Met | AUG | ACG | AAG | AGG | |||
| Val | GUU | Ala | GCU | Asp | GAU | Gly | GGU |
| GUC | GCC | GAC | GCC | ||||
| GUA | GCA | Glu | GAA | GGA | |||
| GUG | GCG | GAG | GGG |
게다가, 이노신과 같은 복수 종의 염기와의 쌍을 형성할 수 있는 염기가 또한 여러 염기의 상술한 혼합물 대신에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열 목록 4에 예시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 이 본쇄의 DNA로 구성되는 본 발명의 유전자의 암호화 쇄와 동일 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고당은 센스 프라이머로서 명명되고, 암호화 쇄와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고당은 안티센스 프라이머로서 명명된다.
증폭되는 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 암호화 쇄의 5'-상류 측상에 존재하는 동일 뉴클레오티드 서열을 갖는 센스 프라이머, 및 이 암호화 쇄의 3'-하류 측상의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 프라이머는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 대해 주형으로서의 유전자 라이브러리, 게놈 DNA 또는 cDNA와 함께 사용된다. 이 때, DNA 단편의 증폭은 전기영동을 사용하여 통상의 방법에 의해 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 단편에 대해, 그의 제한 엔도뉴클레아제 맵이 작제되거나 또는 그의 뉴클레오티드 서열이 통상의 방법에 의해 측정되어, 본 발명의 유전자 또는 본 발명의 유전자 단편이 동정될 수 있다. 본원에 사용되는 유전자 라이브러리로는, 예를 들어 목적 식물의 cDNA 라이브러리 또는 게놈 cDNA 라이브러리가 사용될수 있다. 식물 유전자 라이브러리의 경우, 식물로부터 유도된 통상 이용가능한 라이브러리를 그대로 사용할 수 있거나, 또는 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6; Current Protocols In Molecular Biology (1987), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-11184-8-X)에 기재되어 있는 바와 같이, 통상의 라이브러리 제조 방법에 따라 제조된 라이브러리가 사용될 수도 있다. 본 발명의 증폭 방법에 사용되는 게놈 DNA 또는 cDNA로는, 예를 들어 목적 식물로부터 제조된 cDNA 또는 게놈 cDNA가 사용될수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들어 서열 1의 아미노산 서열상에 디자인된 프라이머를 주형으로서 꿀풀과 식물인 저패니즈 아티초크로부터 유도된 cDNA를 가지고 본 발명의 증폭 방법에 대해 사용하여, 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자 단편을 증폭시킬 수 있다. 게다가, 예를 들어 서열 1의 아미노산 서열상에 디자인된 프라이머를 주형으로서 벼과식물인 옥수수로부터 유도된 cDNA를 가지고 본 발명의 증폭 방법에 대해 사용하여, 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자 단편을 증폭시킬 수 있다.
(서열 목록 4)
본 발명의 증폭 방법은 식물 유전자의 분석에 이용될 수도 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 특정 식물 종의 다양한 변종으로부터 제조된 식물 게놈 DNA를 본 발명의 증폭 방법에 주형으로서 사용하여 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편은 포름알데히드 용액과 혼합되어, 85℃에서 5분간 변성된 후, 얼음으로 급속 냉각된다. 이 시료를 예를 들어 0% 내지 10% 글리세롤을 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 이 전기영동에서, SSCP(단일 쇄 형태 다형성)에 통상 이용가능한 전기영동 장치를 사용할 수 있고, 전기영동을 수행하고, 겔은 항온, 예를 들어 5℃, 25℃ 또는 37℃에 유지시킨다. 전기영동된 겔로부터, DNA 단편은 예를 들어 통상 이용가능한 시약을 사용한 은 염색 방법과 같은 방법에 의해 검출된다.
검출된 DNA 단편의 전기영동에서의 변화의 차이로부터, 라피노스 신타제 유전자의 돌연변이가 검출되고, 라피노스과 올리고당의 발현이 수반된 표현형 특징에서 돌연변이에 의해 유발된 차이에 대한 분석을 수행한다. 이 방법은 예를 들어 문헌(Plant PCR Experiment Protocols Ko Shimamoto and Takuji Sasaki의 감독하에 컴파일, Shujun-sha, Tokyo 출판 (1995), ISBN 4-87962-144-7, pp. 141-146)에 기재된 바와 같이 SSCP 방법에 따라 수행할 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 검출 방법 또는 본 발명의 증폭 방법은 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 동정하고, 동정된 유전자 또는 유전자 단편을 분리 및 정제하여 본 발명의 유전자를 수득하는데 사용될 수도 있다(이하, 본 발명의 유전자 획득 방법이라 간단히 일컬음).
본 발명의 유전자 또는 본 발명의 유전자 단편은 예를 들어, 사용된 프로브와 상사의 뉴클레오티드 서열을 간는 DNA를 동정하기 위해 상술한 본 발명의 검출 방법에 의해 생물 유도된 유전자 라이브러리에서 DNA에 하이브리드화된 본 발명의 유전자 단편으로 구성된 프로브를 검출하고; DNA를 가지는 클론을 정제하고, 클론으로부터 플라스미드 또는 파지 DNA를 분리 및 정제하여 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 DNA가 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우, 프로브로서 DNA를 사용하는 본 발명의 유전자 검출 방법에 의한 유전자 라이브러리의 추가 스크리닝에 의해 본 발명의 유전자가 완전한 길이로 제공된다.
본 발명의 유전자 또는 본 발명의 유전자 단편은 예를 들어, 상술한 본 발명의 증폭 방법에 의해 생물 유도된 DNA로부터 DNA 단편을 증폭시키기 위하여 본 발명의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응을 행하고나서; 제한 엔도뉴클레아제 맵을 작제하거나 증폭된 DNA 단편에 대해 뉴클레오티드 서열을 측정하므로써 동정할 수 있다. 수득된 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 안티센스 프라이머는 5' 말단 서열의 분석을 위해 합성되고, 센스 프라이머는 3' 말단 서열의 분석을 위해 합성된다. 완전한 길이의 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열은 이들 프라이머 및 통상 이용가능한 키트, 예를 들어 클론테크(Clontech)사의 마라톤 키트(Marathon Kit)를 사용하는 RACE 방법에 의해 측정될 수 있다. 완전한 길이의 본 발명의 유전자는 이와 같이 측정된 뉴클레오티드 서열에서 양 말단 서열에 근거한 신규 프라이머를 합성하고, 폴리머라제 쇄 반응을 다시 수행하므로써 수득될 수 있다.
상술한 본 발명의 유전자 획득 방법에 의해, 여러 생물로부터 본 발명의 유전자로서 라피노스 신타제 유전자를 수득하는 것이 가능하게 된다. 예를 들어, 400 이상의 아미노산 길이에 대응하는 영역에서 서열 1의 아미노산 서열과 약 50% 이상의 상동을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 라피노스 신타제를 암호화하는 유전자. 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자는 서열 1의 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머 및 주형으로서 대두 cDNA를 사용하여 본 발명의 증폭 방법에 의해 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 함유하는 DNA 단편을 증폭 및 동정하고; 동정된 DNA 단편을 분리 및 정제한 후 상기 과정에 의해 DNA 단편을 함유하는 완전한 길이의 유전자를 수득하므로써 수득될 수 있다.
본 발명의 유전자 및 그에 결합된 프로모터를 포함하는 키메라 유전자(이하, 간단히 본 발명의 키메라 유전자라 일컬음)을 작제할 수 있다.
사용되는 프로모터는 형질전환되는 숙주 생물에서 기능할 수 있기만 하면 특별히 제한되지 않는다. 프로모터로는 예를 들어, E.coli 락토스 오페론 프로모터, E. coli 트립토판 오페론 프로모터 및 tac 프로모터와 같은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에서 기능가능한 합성 프로모터, 효모 알콜 탈수소효소 유전자(ADH) 프로모터, 아데노바이러스 메이저 레이트(Ad.ML) 프로모터, SV40 얼리 프로모터 및 바쿠로바이러스 프로모터를 들 수 있다.
숙주 생물이 식물 또는 그의 세포인 경우, 프로모터는 예를 들어, 노팔린 합성 유전자(NOP) 프로모터 및 옥토파인 합성 유전자(OCS) 프로모터와 같은 T-DNA 유도 구성 프로모터; 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 유도 19S 및 35S 프로모터와 같은 식물 바이러스 유도 프로모터; 페닐알라닌 암모니아라제(PAL) 유전자 프로모터, 찰콘 신타제(CHS) 유전자 프로모터 및 발병성 단백질(PR) 유전자 프로모터와 같은 유도 프로모터를 들 수 있다. 게다가, 벡터 pSUM-GY1(JP-A 06-189777/1994 참조)를 사용할 수도 있으며, 이는 특정 식물 조직에서 특정 발현을 제공하는 프로모터, 예를 들어 대두 유도 종자 저장 단백질 글리신 유전자의 프로모터를 갖는다. 이러한 프로모터를 갖도록 작제된 키메라 유전자를 사용하므로써 식물의 특정 조직에서 라피노스과 올리고당의 함량을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
이어서, 본 발명의 키메라 유전자는 통상의 유전자 공학 방법에 따라 숙주 생물내로 도입되어 형질전환체를 제공한다. 필요한 경우, 본 발명의 키메라 유전자는 숙주 생물애로 유전자를 도입하기 위한 형질전환 방법에 따라 플라스미드의 형태로 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 키메라 유전자는 터미네이터를 함유할 수 있다. 이 경우에, 일반적으로 키메라 유전자는 라피노스 신타제 유전자의 하류에 터미네이터를 갖도록 작제된다. 사용되는 터미네이터는 형질전환되는 숙주 생물에서 기능가능하기만 하면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 숙주 생물이 식물 또는 그의 세포인 경우, 터미네이터로는 예를 들어 노팔린 합성 유전자(NOP) 터미네이터와 같은 T-DNA 유도 구성 터미네이터; 및 마늘 바이러스 GV1 또는 GV2의 터미네이터와 같은 식물 유도 터미네이터를 들 수 있다.
필요한 경우, 본 발명의 유전자는 플라스미드의 형태로 사용될수 있다. 예를 들어, 숙주 생물이 미생물인 경우, 작제되는 플라스미드는 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press 또는 Current Protocols In Molecular Biology (1987), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X)에 기재되어 있는 바와 같이, 통상의 수단에 의해 미생물내로 도입된다. 이렇게 형질전환된 미생물은 항생 내성 또는 영양요구체와 같은 마커를 가지고 선택된다. 숙주 생물이 식물인 경우, 작제되는 플라스미드는 아그로박테리움을 사용한 감염(JP-B 2-58917/1990 및 JP-A 60-70080/1985 참조), 원생동물내로의 전기포레이션(JP-A 60-251887/1985 및 JP-B 5-68575/1993) 또는 입자 발사(gun) 방법(JP-A 5-508316/1993 및 JP-A 63-258525/1988)과 같은 통상의 수단에 의해 식물 세포내로 도입된다. 플라스미드의 도입에 의해 형질전환된 식물 세포는 카나마이신 또는 하이그로마이신과 같은 항색제로 선택된다. 이렇게 형질전환된 식물 세포로부터, 형질전환된 식물은 예를 들어 문헌(Plant Gene Manipulation Manual(How to Produce Transgenic Plants) Uchimiya 저, 1990, Kodan-sha Scientific(ISBN 4-06-153513-7), pp. 27-55)에 기재된 바와 같은 통상의 식물 세포 배양 방법에 의해 재생될 수 있다. 게다가, 형질전환된 식물로부터의 종자를 수집하므로써 형질전환된 식물을 증식시킬 수 있다. 또한, 수득된 형질전환된 식물과 비-형질전환된 식물 사이의 교배에 의해 형질전환된 식물의 특성을 갖는 자손 식물을 만들 수 있다.
라피노스과 올리고당의 함량은 숙주 생물 또는 그의 세포내로 본 발명의 유전자를 도입하고, 숙주 생물 또는 그의 세포내의 신진대사를 형질전환시키므로써 변화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법으로는, 본 발명의 유전자가 단백질로서 전사, 번역 및 발현에 적합한 원래의 방향으로 프로모터에 결합된 후, 본 발명의 키메라 유전자가 숙주 생물 또는 그의 세포내로 도입되는, 본 발명의 유전자 및 그에 결합된 프로모터를 포함하는 본 발명의 키메라 유전자를 작제하므로써 숙주 생물 또는 그의 세포내의 라피노스과 올리고당의 양을 증가시키기 위한 대사 형질전환 방법; 또는 본 발명의 유전자가 단백질로서 번역 및 발현에 부적합한 역방향으로 프로모터에 결합된 후, 본 발명의 키메라 유전자가 숙주 생물 또는 그의 세포내로 도입되는, 본 발명의 유전자 및 그에 결합된 프로모터를 포함하는 본 발명의 키메라 유전자를 작제하므로써 숙주 생물 또는 그의 세포내의 라피노스과 올리고당의 양을 증가시키기 위한 대사 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 라피노스 신타제 단백질이란 용어는 본 발명의 유전자에 암호화된 단백질(이하, 본 발명의 단백질이라 간단히 일컬음)을 의미한다. 예를 들어, 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환, 변형 또는 첨가되므로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자의 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 효소 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질의 구체적인 예로는 서열 1을 갖는 효소 단백질(799 아미노산; 분자량, 89 kDa) 및 서열 3을 갖는 효소 단백질(781 아미노산; 분자량, 87 kDa)이 있다.
본 발명의 단백질은 비록 잠두(Vicia faba)와 같은 콩과 식물로부터(NH4)2SO4침전, 이온 교환 칼럼, 소수성 칼럼, 수산화인회석 칼럼 또는 겔 여과 칼럼과 같은 통상의 생화학적 방법에 의해 제조될 수 있지만, 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 숙주 생물, 또는 그의 세포로부터 제조될 수도 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 파르마시아사의 GST Gene Fusion Vectors Kit를 사용하여 본 발명의 유전자는 키트에 부착된 발현 벡터 플라스미드에 삽입된다. 생성된 벡터 플라스미드는 통상의 유전자 공학 방법에 따라 이. 콜리와 같은 미생물내로 도입된다. 수득된 형질전환체의 배양은 IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)가 첨가된 배지상에서 성장되어, 본 발명의 단백질은 배양액에서 융합 단백질로서 발현되고 유도될 수 있다. 발현되고 도입된 융합 단백질은 세균 세포의 붕괴, 칼럼 조작 또는 SDS-PAGE 전기영동과 같은 통상의 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 트롬빈 또는 혈액 응고 인자 Xa와 같은 프로테아제를 사용한 융합 단백질의 분해에 의해 본 발명의 단백질이 제공된다. 이는 바람직하게는 문헌(Current Protocols In Protein Science (1985), John Wiley Sons, Inc. ISBN 0-471-11184-8)에 기재되어 있는 방법에 따라 행해질 수 있다. 본 발명의 단백질의 활성은 예를 들어 문헌(L. Lehle 및 W. Tanner, Eur. J. Biochem., 103-110 (1973))에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
라피노스 신타제 단백질에 결합할 수 있는 안티-라피노스 신타제 항체(이하, 간단히 본 발명의 항체라 일컬음)는 항원으로서 상기 제조된 본 발명의 단백질을 사용하는 통상의 면역학적 방법에 의해 제조될수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 항체는 예를 들면 문헌(Ed Harlow 및 David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2)에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있다.
본 발명의 단백질은 본 발명의 항체로 시험 단백질을 처리하고 그에 특이적 결합된 본 발명의 항체를 갖는 단백질을 검출함으로써 검출될 수 있다. 이러한 검출 방법은 예를 들면 문헌(Ed Harlow 및 David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 방법 또는 효소-결합된 면역흡수 검정법(ELISA)와 같은 면역학적 기법에 따라 수행될 수 있다.
웨스턴 블롯 방법은 예를 들면 다음과 같이 수행된다: 단백질은 예를 들면, 문헌(Methods in Enzymology, volume 182, Guide to Protein Purification, pp. 174-193, ISBN 9-12-182083-1)에 기재된 방법에 따라 식물로부터 추출된다. 추출 완충액의 조성은 사용된 식물 조직에 따라 적합하게 변화될 수 있다. 추출된 단백질은 통상의 SDS-PAGE 방법에 따라 전기영동된다. 겔 중 전기영동된 단백질은 통상의 전기적 방법을 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 막으로 전이된다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 겔은 전이 완충액(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 20% 메탄올) 중에 10분간 잠긴 후, 겔과 동일 크기로 절단된 PVDF 막상에 위치된다. 막과 함께 겔은 반건조형의 통상 이용가능한 전이 장치에 셋팅된다. 블롯팅은 0.8 내지 2 mA/cm2의 일정 전류하에 45분 내지 1시간 동안 수행된다. 막으로 전이된 단백질은 제1 항체, 및 알칼리성 포스파타제 또는 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 제2 항체 또는 단백질을 사용하는 웨스턴 블롯 검출을 위한 키트로 면역학적으로 검출될 수 있다. 이 때, 막상의 본 발명의 단백질은 제1 항체로서 본 발명의 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
예를 들어, ELISA 방법에서, 수지로 제조된 96웰의 ELISA 플레이트의 표면에 결합되는 단백질의 특성은 ELISA 플레이트의 표면에 최종적으로 결합된 항원의 면역학적 검출에 대한 원리로서 이용된다. 시험 단백질은 용액으로서 첨가되어 ELISA 플레이트에 결합된 후, 예를 들어 5% 소 혈청 알부민과 같은 단백질을 함유하는 PBS의 첨가에 의해 블록킹된다.
그 후, 웰은 PBS로 세척되고, 여기에 본 발명의 항체를 함유하는 용액이 첨가되어 반응된다. 웰이 세척된 후, 알칼리성 포스파타제 또는 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 제2 항체를 함유하는 용액은 웰에 추가된 후 세척된다. 마지막으로, 검출용 기질액이 웰에 첨가되고, 기질의 생상 전개는 ELISA 판독기에 의해 검출된다.
또 다른 방법으로, 본 발명의 항체는 ELISA 플레이트에 첨가 결합된 후, 예를 들어 5% 소 혈청 알부민과 같은 단백질을 함유하는 PBS의 첨가에 의해 블록킹된다. 이어서, 시험 단백질은 용액으로서 첨가되고, 시험 단백질에 함유된 항원은 플레이트에 결합된 본 발명의 항체에 결합된 후, 세척되며, 본 발명의 항체는 웰에 추가된다. 이 때 사용된 본 발명의 항체는 바람직하게는 최초 사용된 본 발명의 항체의 제조에 사용된 것과는 상이한 동물 종으로부터 제조된 것이다. 이어서, 알칼리성 포스파타제 또는 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 제2 항체를 함유하는 용액은 웰에 첨가된 후, 세척된다. 이 때 사용된 제2 항체는 나중에 첨가되는 본 발명의 항체에 결합하는 특성을 가져야 한다. 마지막으로, 검출용 기질액이 첨가되고, 색상 전개가 ELISA 판독기에 의해 검출된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명될 것이지만, 본 발명이 어떠한 방식으로든 이들 실시예에 국한되지는 않는다.
실시예 1(갈락티놀의 정제)
사탕무 블랙스트랩 당밀 약 250ml를 메탄올로 5배 희석시켰다. 희석액을 실온에서 21,400 x g에서 15분간 원심분리시켜 불용성 물질을 결실하였다. 수득된 상등액을 2리터 어렌마이어 플라스크에 옮기로, 여기에 교반하면서 1/2 부피의 이소프로판올을 적가하였다. 플라스크를 실온에서 한동안 정치시켜 생성 침전물이 플라스크의 벽에 부착되도록 하였다. 이어서, 상등액을 따라 버렸다. 침전물에 에탄올 500ml를 첨가하고, 혼합물을 회전 세이커로 교반하면서 세척하였다. 세척을 여러차례 추가로 반복하였다. 세척된 침전물을 플라스크의 벽으로부터 긁어내고 여지상에서 공기 건조시켰다. 공기 건조된 침전물(건조 분말)을 정제수에 약 40%(w/v)까지 용해시켰다. 이 용액에 BioRad AG501-X8(D)를 첨가한 후 교반하였다. 이 조작을 반복하여 용액의 색상이 거의 없어지게 되도록 하였다. 생성액을 밀리포어의 Sep-Pak QMA 칼럼으로 처히하고, 추가로 밀리포어의 Sep-Pak CM, Sep-Pak C18 및 Sep-Pak 실리카로 예비처리하였다. 생성액을 5ml의 부피로 Wako-gel LP40C18(Wako Pure Chemical Industries, 2.6cm x 8.5cm)의 칼럼상에 적재하고, 정제수로 용출시켰다. 용출물의 당 함량을 휴대용 당 굴절계로 측정하고, 당 조성을 밀리포어의 Sugar-pak Na(7.8mm x 300mm) 칼럼이 구비된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 당의 검출은 워터스사의 모델 410 시차 굴절계를 사용하여 행하였다. 갈락티놀을 함유하는 용출물을 동결건조시키고, 생성된 동결건조된 분말을 정제수 5 ml에 용해시켰다. 용액을 TOYOPEARL HW40(S)(Toso, 2.6cm x 90cm)의 칼럼상에 적재하고, 정제수로 용출시켰다. 용출물을 상기와 동일 방법으로 분석하여, 정제된 갈락티놀을 수득하였다.
수득된 칼락티놀을 80mM 인산염 완충액(pH 6.5), 2mg/ml 갈락티놀 및 8.3U α-갈락토시다제(Boehringer Mannheim, E. coli overproducer 662038)을 함유하는 반응 혼합물에 25℃에서 40분간 유지시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하고, 수층을 HPLC로 분석하였다. 생성된 갈락티놀은 갈락토스 및 미오-이노시톨로 가수분해되는 것으로 확인되었다.
실시예 2(라피노스 신타제 활성의 측정)
라피노스 신타제 활성을 문헌(L. Lehle 및 W. Tanner, Eur. J. Biochem, 38, 103-110 (1973))에 따라 하기 조건으로 측정하였다.
먼저, 활성 측정용 시료 2μl를 100 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM DTT(디티오트레이톨), 0.01% BSA, 200μM 수크로스, 5mM 갈락티놀, 740KBq/ml(31.7μM) [14C] 수크로스를 함유하는 반응 혼합물 18μl에 첨가하였으며, 반응 혼합물을 37℃에서 3 내지 20시간 동안 유지시켰다. 반응 후, 에탄올 30μl를 반응 혼합물에 첨가한 후 교반하고 15,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 박층 크로마토그래피(Merck, 10cm x 20cm)를 위해 셀룰로스의 HPTLC 플레이트상에 5μl 채취하고, n-부탄올:피리딘:물:아세트산 = 60:40:30:3으로 전개시켰다. 전개된 플레이트를 건조시킨 후 화상 분석기(Fuji Photographic Film, FUJIX Bio Imaging Analyzer BAS-2000II)를 사용하여 정량 분석하여 생성된 [14C] 라피노스를 측정하였다.
실시예 3(라피노스 신타제의 정제)
잠두로부터의 라피노스 신타제를 하기와 같이 정제하였다: 각각의 정제된 단백질 용액에 대해, 단백질 용액내에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE(Daiichi Kagaku Yakuhin)에 의해 분석하고, 그의 효소 활성을 실시예 2에 따라 측정하였다.
먼저, -80℃에서 저장된 잠두의 미숙 종자(Nintoku Issum) 300g을 녹인후 박리하였다. 박리 종자를 100mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5 mM DTT(디티오트레이톨), 1mM EDTA, 1mM PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드) 및 1mM 벤즈아미드 600ml에 넣고, 모르타르로 얼음상에서 분쇄하였다. 분쇄물을 21,400 x g에서 4℃에서 50분간 원심분리하였다. 생성 상등액에 10% 폴리에틸렌 이민(pH 8.0)을 1/20 부피로 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 15분간 교반하고, 15,700 x g에서 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 생성 상등액에(NH4)2SO4196g/l를 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 얼음에서 30분간 교반하고, 15,700 x g에서 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 생성 상등액에 (NH4)2SO4142g/l를 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 21,400 x g에서 4℃에서 50분간 원심분리하였다. 생성 상등액에 10% 폴리에틸렌 이민(pH 8.0)을 1/20 부피로 첨가하였다. 혼합물을 얼음에서 30분간 교반하고, 15,700 x g에서 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 생성 침전물을 100mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM DTT(디티오트레이톨) 50ml에 용해시키고, 용액을 20mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM DTT(디티오트레이톨), 1mM EDTA에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석 후, 상등액을 70,000 x g에서 4℃에서 60분간 원심분리하였다. 생성 상등액에 1mM 벤즈아미드·HCl, 5mM ε-아미노-n-카프론산, 1 μg/ml 안티페인, 1μg/ml 류펩틴 및 10mM EGTA를 첨가하고, 2M KCl을 1/40 부피로 적가하였다. 혼합물을 0.05M KCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4), 1mM DTT(디티오트레이톨) 및 1mM EDTA로 평형시킨 DEAE-Sephacel(Pharnacia, 2.5cm x 21.5cm)의 칼럼상에 적재하고, 흡착된 단백직을 0.05 내지 0.5M KCl의 구배로 용출시켰다. 이 단계까지의 정제 단계를 3회 반복하고, 라피노스 신타제 활성을 갖는 분획을 합친 후 다음과 같이 정제하였다.
라피노스 신타제 활성을 갖는 용출된 분획에 포화(NH4)2SO4를 1/4 부피로 적가하였다. 용액을 20% 포화(NH4)2SO4, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4), 1mM DTT(디티오트레이톨), 1mM EDTA로 평형시킨 페닐-세파로스(파르마시아, 2.5 센티미터 x 10.2 센티미터)의 칼럼상에 적재하고, 흡착된 단백질을 20% 내지 0%(NH4)2SO4의 구배로 용출시켰다. 생성 활성 분획을 0.01M 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 2배로 첨가하여 희석시켰다. 희석액을 0.01M 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 및 2mM DTT(디티오트레이톨)로 미리 평형시킨 Econo-Pac 10DG(BioRad, 5ml)의 칼럼상에 적재하고, 흡착된 단백질을 0.01 내지 0.5M 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 및 2mM DTT(디티오트레이톨)의 구배로 용출시켰다. 이 단계에서 수득된 활성 분획은 6500배 이상의 특이 활성까지 정제된 것으로 밝혀졌다. 라피노스 신타제 활성을 갖는 생성된 정제 단백질 용액의 일부를 0.2M KCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4), 1mM DTT(디티오트레이톨) 및 1mM EDTA로 평형시킨 Superdex 200(파르마시아, 1.6 센티미터 x 60 센티미터)의 칼럼상에 적재하였다. 이렇게 분리된 정제 단백질을 SDS-PAGE시키고, 라피노스 신타제 활성을 측정하였다. 라피노스 신타제 활성을 갖는 단백질 밴드는 SDS-PAGE상에 약 90kDa의 분자량을 갖는 것으로 동정되었다.
실시예 4(라피노스 신타제의 부분 아미노산 서열의 분석)
실시예 3에서 Econo-Pac 10DG(BioRad, 5 ml)의 칼럼으로 정제시킨 정제 단백질 용액 약 1ml에 100% TCA를 1/9 부피로 첨가하고, 혼합물을 얼음상에 30분간 정치하였다. 10,000 x g에서 15분간 원심분리한 후, 생성 침전물을 500μl의 차가운 아세톤(-20℃)에 현탁시킨 후, 추가로 원심분리하였다. 이 아세톤 세척을 반복하고, 수집된 침전물을 건조시킨 후 SDS-시료 완충액 200μl에 용해시키고, SDS-PAGE하였다. CBB 염색을 전기영동된 겔에 대해 수행하고, 이로부터 라피노스 신타제 단백질의 밴드를 절단하였다.
이렇게 얻은 겔에 1ml 50% 아세토니트릴 및 0.2M 탄산암모늄(pH 8.9)를 첨가하고, 실온에서 20분간 교반하면서 계속해서 세척하였다. 겔을 동일 방법으로 다시 한번 세척하고, 부피 감소를 제공하는 정도로 감압하에 건조시켰다. 이 겔에 0.02% 트윈-20 및 0.2M 탄산암모늄(pH 8.9) 1ml를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. 용액의 제거 후, 8M 우레아 및 0.4M NH4HCO3400μl를 첨가하고, 여기에 45mM DTT(디티오트레이톨) 45μl를 추가하고, 혼합물을 50℃에서 20분간 방치하였다. 실온으로 완전한 복귀 후, 1M 요오도아세트산 4μl를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분간 암소에서 교반하였다. 용액의 제거 후, 정제수 1ml를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분간 교반한 후 세척하였다. 추가로 2회 세척한 후, 50% 아세토니트릴 및 0.2M 탄산암모늄(pH 8.9) 1ml를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. 동일 처리를 1회 더 반복한 후, 용액을 제거하고, 겔을 부피 감소를 제공하는 정도로 감압하에 건조시켰다.
이 겔에 아크로모박터 프로테아제(Achromobacter Protease) I(Takara, Residue-specific Protease Kit)의 용액을 100μl의 부피로 첨가하였다. 겔이 용액의 표면으로부터 노출되지 않은 정도로 0.02% 트윈-20 및 0.2M 탄산암모늄(pH 8.9)를 추가하고, 혼합물을 37℃에서 42시간 동안 정치하였다. 0.09% TFA 및 70% 아세토니트릴 500μl를 추가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 시료 튜브내에 함유된 생성 혼합물을 초음파조에 부유시킨 후, 5분간 초음파처리(BRANSON, 60W 출력)하였다. 이렇게 처리된 튜브 및 내용물을 원심분리시키고, 생성 추출물을 또 다른 실리콘이 피복된 시료 튜브에 수집하였다. 한편, 0.09% TFA 및 70% 아세토니트릴 500μl를 침전물에 다시 추가한 후, 상기와 동일 방법으로 재추출하였다. 생성 추출물은 합치고, 이어서 200 내지 300μl의 부피로 용액이 남도록 하는 정도로 감압하에 농축시켰다. 농축액에 8M 우레아 및 0.4 M NH4HCO325μl를 첨가하고, 혼합물을 100μl 이하의 부피로 용액이 남게 되는 정도로 농축하였다. 농축액을 약 100μl의 정제수와 혼합한 후, 혼합물을 Ultrafree C3 GV(밀리포어)의 여지를 통해 여과시켰다. 이어서, 수득된 여액을 Aquapore BU-300 C-4(2.1mm x 300mm)의 칼럼을 통해 0.1% TFA/2.1% 내지 68.6% 아세토니트릴의 구배로 용출시켰다. 215nm에서의 흡수를 모니터하여 그의 피크에서의 분획을 수집하였다. 수집된 시료를 감압하에 증발시켜 건조를 완결한 후, ABI의 Protein Sequencer 473A로 분석하여 라피노스 신타제의 부분 아미노산 서열을 측정하였다.
실시예 5(cDNA의 제조)
잠두(Nintoku Issun)의 미숙 종자 약 2g을 액체 질소로 동결시키고나서 모르타르로 분쇄하고, 여기에 Isogen(Nippon Gene) 20ml를 첨가하고, 혼합물을 격렬히 분쇄하였다. 분쇄물을 원심분리 튜브에 옮기고, 여기에 클로로포름 4 ml를 첨가하고, 혼합물을 보텍스 믹서로 교반하고나서 6,500 x g에서 4℃에서 10분간 교반하였다. 수층을 수집하고, 여기에 이소프로판올 10ml를 첨가하고, 혼합물을 교반하고나서 6,500 x g에서 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 생성 침전물을 70% 에탄올 10ml로 세척하고나서 용출 완충액(10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.1% SDS) 1ml로 세척하였다. 용액을 60℃에서 10분간 정치하고나서 10,000 x g에서 1분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 생성 상등액에 동일 부피의 Oligotex-dT30(Takara)를 첨가하고, 혼합물을 교반하고나서 65℃에서 5분간 정치하였다. 혼합물을 얼음상에 위치시키고나서 3분간 정치하고, 여기에 5M NaCl 200μl를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 10분간 정치하였다. 이어서, 혼합물을 10,000 x g에서 4℃에서 3분간 원심분리하였다. 침전물을 수집하고나서, TE 완충액 1ml에 현탁시키고, 상등액을 65℃에서 5분간 정치한 후, 얼음상에 위치시키고나서 3분간 정치한 후, 10,000 x g에서 4℃에서 3분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다.
생성 상등액에 3M 아세트산나트륨 100μl 및 에탄올 2ml를 첨가하고, RNA를 에탄올 침전시키고 수집하였다. 수집된 RNA를 70% 에탄올로 2회 세척하고나서 멸균수 20μl에 용해시키고, 후속 cDNA 합성에 사용하였다. 수득된 RNA의 양은 260nm에서의 흡수도를 측정하여 결정하였다.
cDNA 합성의 경우, RT-PCR용 First Strand Synthesis Kit(Amercham) 및 cDNA Synthesis Kit(Takara)를 사용하고, 모든 조작은 프로토콜에 따라 행하였다.
실시예 6(cDNA로부터의 라피노스 신타제 유전자의 뉴클레오티드 서열 분석)
실시예 4에서 수득된 아미노산 서열에 기초하여, 하기 서열 목록 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 혼합된 합성 DNA 프라이머를 합성하였다. PCR 방법은 클론테크(Clontech)의 Advantage KlenTaq cDNA Kit를 사용하여 퍼킨-엘머의 Gene Amp PCR Systems 2400 및 DNA Thermal Cycler Model 480으로 행하였다. 폴리머라제 쇄 반응은 상기 프라이머를 가지로 94℃에서 1분간, 50℃에서 3분간, 72℃에서 3분간 행하고, 이 반응을 40회 반복하였다. 그 결과, 하기 서열 목록 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는, 프라이머 8.2 및 13.3RV, 프라이머 13.4 및 10.3RV, 및 프라이머 7.4 및 10.3RV의 조합은 각각 1.2 kb, 0.5 kb 및 1.2 kb의 증폭을 제공하였다. 이들 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)으로 클로닝한 후, 퍼킨-엘머의 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하여 서열 반응하고, ABI의 373S DNA 시퀀서로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 그 결과, 이들 DNA 단편은 서열 2의 뉴클레오티드 서열에서 각각 염기 813 내지 염기 1915, 염기 1936 내지 염기 2413, 및 염기 1226 내지 염기 2413으로 연장되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 하기 서열 목록 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가지는 합성 DNA 프라이머를 제조하고, cDNA의 양 말단 영역의 뉴클레오티드 서열을 클론테크의 Marathon cDNA Amplification Kit로 분석하였다. 그 결과, 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 최종적으로 결정하였다.
(서열 목록 5)
(서열 목록 6)
실시예 7(잠두 cDNA로부터의 라피노스 신타제 유전자의 클로닝)
서열 1의 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머, 즉 하기 서열 목록 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 합성하였다. 주형으로서 실시예 5에서 수득한 cDNA 및 이들 프라이머를 사용하여, 개방 판독 프레임 영역의 DNA 단편을 실시예 6의 조건하에 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 그의 인식 서열이 사용된 프라이머에 함유된 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI 및 Xba I로 분해시켰다. Ligation Kit(Takara)를 사용하여, 이렇게 분해된 DNA 단편을 Bam HI 및 Xba I로 미리 분해시킨 플라스미드 pBluescriptII KS-(Stratagene)으로 클로닝시켰다. 클로닝된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 퍼킨-엘머의 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit로 확인하였다. 이렇게 수득된 클론에서, 서열 2의 뉴클레오티드 서열 중 위치 1591의 염기는 티미딘(T)에서 시토신(C)으로 변화되었다는 것을 발견하였다. 그러나, 이는 아미노산의 변화가 없는 무의미한 돌연변이체였으므로, 이 클론을 pBluescriptII KS-RS로 명명하고, 후속 실험에 사용하였다.
(서열 목록 7)
실시예 8(이. 콜리 중 잠두 라피노스 신타제 유전자의 발현)
실시예 7에서 수득된 잠두 라피노스 신타제 유전자를 갖는 플라스미드 pBluescriptKS-RS를 Bam HI 및 Not I로 분해시키고, Bam HI 및 Not I로 분해시킨 플라스미드 pGEX-4T3(파르마시아) 중에 클로닝시켜 도 1에 도시된 플라스미드 pGEX-RS를 얻었다.
이 플라스미드 pBluescriptKS-RS를 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 NcoI 및 XbaI으로 분해된 플라스미드 pTrc99A(파르마시아)내에 클로닝시켜 도 1에 도시된 플라스미드 pTrc-RS를 수득하였다.
이들 플라스미드를 이. 콜리 균주 HB101로 도입하고, 생성 형질전환체를 라피노스 신타제 발현을 확인하는데 사용하였다. 형질전환체의 배양액들을 밤새 각각 LB 배지 100ml 중에서 1 ml의 부피로 항온처리하고, 37℃에서 약 3시간 동안 항온처리한 후, IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)를 첨가하여 1mM의 최종 농도로 만들고, 5시간 동안 추가 항온처리시켰다. 배양액을 21,400 x g에서 10분간 원심분리시키고, 세균 세포를 수집하였다. 수집된 세균 세포를 -80℃에서 저장하였다. 동결 세균 세포에 100mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM DTT(디티오트레이톨), 1mM EDTA, 1mM PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드) 및 1mM 벤즈아미드의 10배 부피를 첨가하고, 세균 세포를 녹이고 현탁시켰다. 이들 현탁액을 초음파 분쇄기(Branson)으로 처리하여 세균 세포를 분쇄하였다. 수득된 분쇄 세포 혼합물을 16,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 가용성 단백질 용액을 수집하였다.
이와 같이 수득된 단백질 용액을 각각 상기 방법에 따라 라피노스 신타제 활성의 측정에 대해 4μl의 부피로 사용하였다. 반응을 37℃에서 64시간 동안 행하였다. 대조군으로는, 벡터들 중의 하나인 pGEX-4T3으로 형질전환시킨 E. coli 균주 HB101을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 라피노스의 합성은 형질전환체 HB101(pGEX-RS) 및 HB101(pTrc-RS)로부터의 시료에서 검출되었다.
| 형질 전환체 | 생성된 라피노스의 양(pmol) |
| HB101(pGEX4T-3) | 0.56 |
| HB101(pGEX-RS) | 10.50 |
| HB101(pTrc-RS) | 11.10 |
실시예 9(대두 cDNA로부터의 라피노스 신타제 유전자의 클로닝)
실시예 5와 동일 방법으로, cDNA를 대두(Glycine max) Willians 82의 미숙 종자로부터 수득하였다. 주형으로서의 이 cDNA 및 서열 1의 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머, 즉 하기 서열 목록 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 실시예 6에 나타낸 조건하에 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)으로 클로닝한 후, 퍼킨-엘머의 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하여 서열 반응하고, ABI의 373S DNA 시퀀서로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 이 서열에 기초하여, 하기 서열 목록 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머를 합성하였다. cDNA의 합성은 대두 Williams 82의 잎으로부터 실시예 5와 동일 방법으로 수득한 mRNA를 사용하여 클론테크의 Marathon Kit로 행하였다. 수득한 cDNA를 리가제를 사용하여 이 키트에 함유된 어댑터에 연결시켰다. 이 조작은 첨부된 프로토콜에 따라 행하였다. 이렇게 제조된 어댑터-연결된 cDNA를 사용하여, 폴리머라제 쇄 반응을 하기 서열 목록 9에 나타낸 프라이머로 행하였다. 유전자의 양 말단 영역의 뉴클레오티드 서열을 클론테크의 Marathon Kit에 첨부된 프로토콜에 따라 분석하였다. 그 결과, 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다.
(서열 목록 8)
1-F 프라이머 35머
2-RV 프라이머 45머
5-F 프라이머 41머
6-RV 프라이머 32머
(서열 목록 9)
실시예 10(저패니즈 아티초크 cDNA로부터의 라피노스 신타제 유전자의 획득)
실시예 5와 동일 방법으로, cDNA를 저패니즈 아티초크(Stachys sieboldii)의 잎으로부터 수득하였다. 주형으로서의 이 cDNA 및 서열 1의 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머, 즉 하기 서열 목록 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 실시예 6에 나타낸 조건하에 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)으로 클로닝한 후, 퍼킨-엘머의 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하여 서열 반응하고, ABI의 373S DNA 시퀀서로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 그 결과, 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다.
이 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 합성된 DNA 프라이머를 제조하고, 실시예 9와 동일 방법으로 유전자의 양 말단 영역의 뉴클레오티드 서열을 클론테크의 마라톤 키트(Marathon Kit)로 분석하였다.
(서열 목록 10)
1-F 프라이머 35머
4-RV 프라이머 37머
2-F 프라이머 44머
6-RV 프라이머 32머
실시예 11(옥수수 cDNA로부터의 라피노스 신타제 유전자의 획득)
실시예 5와 동일 방법으로, cDNA를 옥수수(Zea mays L.) Pioneer 3358의 잎으로부터 수득하였다. 주형으로서의 이 cDNA 및 서열 1의 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머, 즉 하기 서열 목록 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 실시예 6에 나타낸 조건하에 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)으로 클로닝한 후, 퍼킨-엘머의 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하여 서열 반응하고, ABI의 373S DNA 시퀀서로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 이 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 하기 서열 목록 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 합성하였다. 실시예 5와 동일 방법으로, 옥수수(Zea mays L.) Pioneer 3358의 잎으로부터 수득한 mRNA를 리가제를 사용하여 이 키트에 함유된 어댑터에 연결시켰다. 이 조작은 첨부된 프로토콜에 따라 행하였다. 이렇게 제조된 어댑터-연결된 cDNA를 사용하여, 폴리머라제 쇄 반응을 하기 서열 목록 12에 나타낸 프라이머로 행하였다. 그 결과, 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다.
이와 같이 수득된 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 합성된 DNA 프라이머를 제조하고, 실시예 9와 동일 방법으로 유전자의 5' 말단 영역의 뉴클레오티드 서열을 클론테크의 마라톤 키트를 사용하여 분석하였다.
(서열 목록 11)
5-F 프라이머 41머
6-RV 프라이머 32머
(서열 목록 12)
M-10 프라이머 25머
M-11 프라이머 25머
실시예 12(키메라 유전자, 35S-잠두 라피노스 신타제 유전자에 대한 식물의 발현 벡터의 작제)
실시예 7에서 수득한 잠두 라피노스 신타제 유전자를 가지는 플라스미드 pBulescriptKS-RS를 Bam HI 및 Sac I로 분해시켰다. Ligation Kit(Takara)를 사용하여, 이와 같이 분해된 DNA 단편을 Bam HI 및 Sac I로 미리 분해시킨 바이너리 벡터 pBI121(클론테크) 중에 클로닝시켰다. 이와같이 수득된 벡터를 pBI121-RS라 명명하였다.
안티센스 실험을 위해, Bam HI 및 Sac I로 미리 분해시킨 플라스미드 pBI121(클론테크)를 하기 서열 목록 13에 나타낸 링커로 연결시켜 pBI121(-)를 얻었다. 이 pBI121(-)를 사용하여 상기 pBI121-RS의 제조와 동일 방법으로 pBI121-RS(-)를 제조하였다.
유사 벡터를 pBI221을 사용하여 제조하였다. 실시예 7에서 수득한 플라스미드 pBluescriptKS-RS를 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI 및 Sac I로 분해시켰다. Ligation Kit(Takara)를 사용하여, 이렇게 분해된 DNA 단편을 Bam HI 및 Sac I로 미리 분해시킨 벡터 pBI221(클론테크)로 클로닝시켰다. 이와 같이 수득된 벡터를 pBI221-RS라 명명하였다.
안티센스 실험을 위해, Bam HI 및 Sac I로 미리 분해시킨 플라스미드 pBI221(클론테크)를 하기 서열 목록 13에 나타낸 링커로 연결시켜 pBI221(-)를 얻었다. 이 pBI221(-)를 사용하여 상기 pBI221-RS의 제조와 동일 방법으로 pBI221-RS(-)를 제조하였다.
이들 발현 벡터의 구성이 도 2 및 3에 나타나있다.
(서열 목록 13)
BamSac-(+) 링커 25머
BamSac-(-) 링커
실시예 13(잠두 라피노스 신타제 유전자를 사용한 겨자의 형질전환)
실시예 12에서 수득된 벡터 pBI121-RS 및 pBI121(-)-RS를 Bam 아그로박테리움 감염 방법에 의해 겨자(Brassica juncia)의 형질전환에 사용하였다.
염화칼슘 처리에 의해 자격이 갖춰진 상태로 미리 만들어진 아크로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(균주 C58C1, 리팜피신 내성)를 독립적으로 실시예 12에서 제조된 2개의 플라스미드 pBI121-RS 및 pBI121(-)-RS로 형질전환시켰다. 형질전환체에 대한 선택은 도입된 플라스미드의 카나마이신 내성 유전자(네오마이신 포스포트란스퍼라제, NPTII)에 의해 제공된 카나마이신 내성의 특성을 이용함으로써 50μg/ml 리팜피신 및 25μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지상에서 수행하였다.
수득된 형질전환체 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens(균주 C58, 리팜피신 내성)을 하루 밤낮으로 50μg/ml 리팜피신 및 25μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지상에서 배양하고, 배양액을 후술하는 방법으로 겨자의 형질전환에 사용하였다.
겨자 종자를 무균적으로 1/2 MS 배지, 2% 수크로스, 0.7% 아가상에 파종하였다. 1주일 후, 싹트는 식물의 자옆 및 잎자루를 외과용 가위로 절단하고, MS 배지, 3% 수크로스, 0.7% 아가, 4.5μM BA, 0.05μM 2.4-D, 3.3μM AgNO3로 옮기고, 1일 동안 예비 배양하였다. 예비배양된 자옆 및 잎자루를 아그로박테리움 배양액의 1000배 희석액에 옮겨 5분간 감염시켰다. 감염된 자옆 및 잎자루를 다시 예비배양에 사용된 동일 배지로 옮기로 3 내지 4일간 배양하였다. 배양된 자옆 및 잎자루를 MS 배지, 3% 수크로스, 4.5μM BA, 0.05μM 2.4-D, 3.3μM AgNO3, 500mg/l 세포탁심으로 옮기고, 1일 동안 세이킹하면서 멸균하였다. 멸균된 자옆 및 잎자루를 MS 배지, 3% 수크로스, 0.7% 아가, 4.5μM BA, 0.05μM 2.4-D, 3.3μM AgNO3, 100mg/l 세포탁심, 20mg/l 카나마이신으로 옮기고, 3 내지 4주 동안 배양하였다. 자옆 및 잎자루를 MS 배지, 3% 수크로스, 0.7% 아가, 4.5μM BA, 0.05μM 2.4-D, 100mg/l 세포탁심, 20mg/l 카나마이신으로 옮기고, 배양하였다. 이 배지상의배양은 3 내지 4주의 간격으로 계속해서 서브배양하였다. 발아의 재생이 발생하기 시작하였을 때, 이들 발아를 MS 배지, 3% 수크로스, 0.7% 아가, 20mg/l 카나마이신상에서 서브배양하고, 3 내지 4주간 배양하였다. 뿌리박는 식물을 질석 : 피트모스 = 1 : 1로 옮기고 21℃ 내지 22℃에서 낮/밤 = 12시간/12시간의 사이클로 컨디셔닝시켰다. 식물 묘목의 성장이 진행됨에 따라서, 식물을 배양토를 사용하여 적합하게 생장시켰다. 재생된 식물의 잎으로부터, 게놈 DNA를 상술한 방법에 따라 추출하고, 식물 게놈으로 유전자가 삽입된 것을 하기 서열 목록 14에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.
(서열 목록 14)
실시예 14(잠두 라피노스 신타제 유전자를 사용한 대두 체세포 배아의 형질전환)
대두 Fayette 체세포 배아의 배양된 세포(400 내지 500mg FW)를 6cm 아가 플레이트의 중심부상에 직경이 20mm인 원내에 한층으로 배치하였다. 실시예 12에서 잠두 라피노스 신타제 유전자 및 35S 프로모터로부터 제조된 키메라 유전자들을 갖는 2개의 플라스미드 pBI221-RS 및 pBI221(-)-RS를 일본 특허 출원 제3-291501/1991호의 개시에 따라 대두 체세포 배아로 도입하였다. 즉, 이들 플라스미드를 문헌(Soshiki Baiyo, 20, 323-327(1994))에 기재된 선택을 위해 β-글루쿠로니다제(GUS)/히그로마이신-내성 유전자(HPT) 공-발현 벡터 pSUM-GH:NotI와 혼합하였다. 이들 혼합된 플라스미드를 입자 건(800mg/코팅 골드 입자 200μg/발포; 발사 마개-시료 거리, 100mm)을 사용하여 대두 체세포 배아내로 유전자를 도입하는데 사용하였다. 도입 후, 선회운동을 하는 배양액을 25℃에서 16시간 동안 조명하에 25 내지 50μg/ml 히그로마이신을 함유하는 MS 변성된 성장 액상 배지(Sigma)에서 성장시키고, 형질전환된 체세포 배아를 선택하였다.
약 3달 후에 선택된, 황색 및 성장력을 갖는 히그로마이신-내성 대두 체세포 배아에 대해, 중합 쇄 반응을 상기 서열 목록 14에 나타낸 프라이머로 행하여 잠두 라피노스 신타제 유전자 영역이 증폭되었는지의 여부를 결정하였다. 이로부터, 잠두 라피노스 신타제 유전자가 대두 게놈내로 삽입되었다는 것을 확인하였다.
게다가, 수득된 체세포 배아를 식물의 재생에 사용하여 잠두 라피노스 신타제 유전자를 갖는 형질전환체 대두를 얻었다.
배지 조성
상기 실시예들에서 사용된 LB 및 MS 배지는 각각 다음 조성을 갖는다.
(LB 배지)
박토-트립톤 10g
박토-이스트 추출물 5g
NaCl 10g/1리터 H2O(pH 7.0)
(MS 배지)
KNO32022mg/l
NH4NO31650mg/l
NH4Cl 2140mg/l
KH2PO4170mg/l
MgSO4·7H2O 370mg/l
CaCl2·2H2O 440mg/l
MnSO4·7H2O 22.3mg/l
ZnSO4·5H2O 8.6mg/l
CuSO4·5H2O0.025mg/l
KI 0.83mg/l
CoCl2·6H2O 0.025mg/l
H3BO36.2mg/l
NaMoO4·2H2O 0.25mg/l
FeSO4·7H2O 27.8mg/l
Na2EDTA 37.3mg/l
니코틴산 0.5mg/l
티아민 HCl 1mg/l
피리독신 HCl 0.5mg/l
이노시톨 100mg/l
글리신 2mg/l
서열의 간략한 설명
1. 서열 1:
서열 1의 서열은 잠두로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자에 암호화된 라피노스 신타제 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
2. 서열 2:
서열 2의 서열은 잠두로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
3. 서열 3:
서열 3의 서열은 대두로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자에 암호화된 라피노스 신타제 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
4. 서열 4:
서열 4의 서열은 대두로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
5. 서열 5:
서열 5의 서열은 저패니즈 아티초크로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자에 암호화된 라피노스 신타제 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
6. 서열 6:
서열 6의 서열은 저패니즈 아티초크로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
7. 서열 7:
서열 7의 서열은 옥수수로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자에 암호화된 라피노스 신타제 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
8. 서열 8:
서열 8의 서열은 옥수수로부터 수득된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
9. 서열 목록 1:
서열 목록 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편의 증폭에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 이들 서열은 모두 유전자의 비암호화 영역의 뉴클레오티드 서열에 기초한다. 프라이머 1은 잠두-유도된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편의 5' 말단에 대응하는 센스 프라이머이다. 프라이머 2 및 3은 잠두-유도된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편의 3' 말단에 대응하는 안티센스 프라이머이다. 프라이머 4는 대두-유도된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편의 5' 말단에 대응하는 센스 프라이머이다. 프라이머 5 및 6은 대두-유도된 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 단편의 3' 말단에 대응하는 안티센스 프라이머이다. 목적에 따라, 적합한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 적절한 방법으로 이들 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 첨가할 수 있다.
10. 서열 목록 2:
서열 목록 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 서열 중 라피노스 신타제 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 개방 판독 프레임의 증폭에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 프라이머 1 및 2는 잠두-유도된 라피노스 신타제 단백질의 N 말단에 대응하는 센스 프라이머이다. 프라이머 3 및 4는 잠두-유도된 라피노스 신타제 단백질의 C 말단에 대응하는 안티센스 프라이머이다. 프라이머 5 및 6은 대두-유도된 라피노스 신타제 단백질의 N 말단에 대응하는 센스 프라이머이다. 프라이머 7 및 8은 대두-유도된 라피노스 신타제 단백질의 C 말단에 대응하는 안티센스 프라이머이다. 목적에 따라, 적합한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 적절한 방법으로 이들 서열의 5' 말단에 첨가할 수 있다.
11. 서열 목록 3:
서열 목록 3에 나타낸 아미노산 서열은 라피노스 신타제 단백질의 부분 아미노산 서열이다.
#1은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 110으로부터 아미노산 129까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#2는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 234로부터 아미노산 247까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#3은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 265로부터 아미노산 279까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#4는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 296으로부터 아미노산 312까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#5는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 346으로부터 아미노산 361까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#6은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 383으로부터 아미노산 402까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#7은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 411로부터 아미노산 433까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#8은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 440으로부터 아미노산 453까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#9는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 457로부터 아미노산 468까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#10은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 471로부터 아미노산 516까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#11은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 517로부터 아미노산 559까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#12는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 574로부터 아미노산 582까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#13은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 586으로부터 아미노산 609까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#14는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 615로부터 아미노산 627까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
#15는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 716으로부터 아미노산 724까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
12. 서열 목록 4:
서열 목록 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서열 목록 3에 나타낸 아미노산 서열 일부상에 합성된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 F는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 센스 서열을 가진다는 것을 의미한다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다. 프라이머 1은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 119로부터 아미노산 129까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다. 프라이머 2는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 234로부터 아미노산 247까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다. 프라이머 3은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 265로부터 아미노산 279까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다. 프라이머 4는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 458로부터 아미노산 468까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다. 프라이머 5는 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 522로부터 아미노산 534까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다. 프라이머 6은 서열 1의 아미노산 서열 중 아미노산 716으로부터 아미노산 724까지 전개되는 부분 아미노산 서열에 상당한다.
13. 서열 목록 5:
서열 목록 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 정제된 잠두 라피노스 신타제 단백질의 부분 아미노산 서열상에 합성된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 괄호안에 나타낸 염기는 이들 염기의 혼합물이 합성에 사용되었다는 것을 의미한다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
14. 서열 목록 6:
서열 목록 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 RACE 방법에 의해 잠두 라피노스 신타제 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 양 말단 영역의 분석에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
15. 서열 목록 7:
서열 목록 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 잠두 라피노스 신타제 유전자의 클로닝에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. RS-N은 개방 판독 프레임의 N 말단에 상당하고 5' 말단측상에서 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI 및 Nco I에 대한 2개의 인지 부위를 함유한다. RS-C는 개방 판독 프레임의 C 말단에 상당하는 안티센스 프라이머이고 5' 말단측상에서 제한 엔도뉴클레아제 Xba I에 대한 인지 부위를 함유한다.
16. 서열 목록 8:
서열 목록 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 대두 라피노스 신타제 유전자 단편의 클로닝에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 기호 T로 표시되는 염기는 합성에 사용된 이노신이다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
17. 서열 목록 9:
서열 목록 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 대두 라피노스 신타제 유전자 단편의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
뉴클레오티드 서열의 분석은 SN-1 및 SC-3RV를 사용하여 중합 쇄 반응에 의해 수행하였다. SC-5 및 SC-6은 3' 말단 영역에서 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용하고, SN-3RV 및 SN-4RV는 5' 말단 영역에서 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용하였다.
18. 서열 목록 10:
서열 목록 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 저패니즈 아티초크 라피노스 신타제 유전자 단편의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 기호 I로 표시된 염기는 합성에 사용된 이노신이었다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
19. 서열 목록 11:
서열 목록 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 옥수수 라피노스 신타제 유전자 단편의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 기호 I로 표시된 염기는 합성에 사용된 이노신이었다. 프라이머 번호 뒤에 사용된 기호 RV는 이 기호에 의해 의미되는 프라이머가 안티센스 서열을 가진다는 것을 의미한다.
20. 서열 목록 12:
서열 목록 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 옥수수 라피노스 신타제 유전자 단편의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. M-10 및 M-11은 3' 말단 영역에서 뉴클레오티드 서열의 분석에 사용되었다.
21. 서열 목록 13:
서열 목록 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 안티센스 실험을 위한 벡터의 구성에 사용된 전형적인 어돕터의 뉴클레오티드 서열이다. 이들 합성 DNA 단편은 이들이 상보적 쇄이기 때문에 함께 혼합될 때 이 본쇄 형을 가진다. 이 이 본쇄 DNA 단편은 양 말단상에 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI 및 Sac I에 대한 분할 사이트의 밀착 말단을 가지며, 이 본쇄 영역에서 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI 및 Sac I에 대한 제한 사이트를 가진다.
22. 서열 목록 14:
서열 목록 14에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 재조합 식물의 게놈으로의 유전자 도입을 확인하기 위해 PCR 실험에 사용된 전형적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 35S는 35S 프로모터 사이트에서 하향 영역으로의 프라이머이고, NOS는 NOS 터미네이터 사이트에서 상향 영역으로의 프라이머이다. RS-F는 잠두 라피노스 신타제 유전자의 센스 프라이머이고, RS-RV는 잠두 라피노스 신타제 유전자의 안티센스 프라이머이다.
본 발명에 의해 기능성 식품 재료, 특히 특정 건강식품 분야에서 이용되고 있는 라피노스와 올리고당을 생산하기 위한 라피노스 신타제를 암호화하는 유전자 및 라피노스 신타제 단백질 및 이의 제조방법 등이 제공된다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 스미토모 가가쿠 고교 가부시키가이샤
(ii) 발명의 명칭: 라피노스 신타제 유전자 및 이의 용도
(iii) 서열 수: 8
(iv) 연락처:
(A) 수신자명:
(B) 번지:
(C) 시:
(D) 주:
(E) 나라:
(F) 우편번호:
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 파텐트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류: C12N 9/00, C12N 15/52
(vii) 우선 출원일:
(A) 출원 번호: JP-338673/1996
(B) 출원일: 1996. 12. 18
(viii) 변리사/대리 정보:
(A) 성명:
(B) 등록 번호:
(C) 참고/문서 번호:
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호:(703) 205-8000
(B) 팩스번호:(703) 205-8050
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 799 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 원 출처:
(A) 생물: 브로드 바안(broad baan(Vicia faba))
(B) 균주: 니또꾸 이쓴(Nintoku Issun)
(F) 조직 형: 종자
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 2746 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 일 본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 101 내지 2500
(C) 확인 방법: 실험
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 781 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 원 출처:
(A) 생물: 대두(Glycine max)
(B) 균주: 윌리암스 82(Williams 82)
(F) 조직 형: 종자 및 잎
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 2598 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 일 본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 62 내지 2407
(C) 확인 방법: 실험
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 587 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 원 출처:
(A) 생물: 저패니즈 아티초크(Stachys sieboldii)
(F) 조직 형: 잎
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1762 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 일 본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 2 내지 1762
(C) 확인 방법: 실험
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 271 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 원 출처:
(A) 생물: 옥수수(Zea mays L.)
(B) 균주: 선구식물(Pioneer) 3358
(F) 조직 형: 잎
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 996 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄형: 일 본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 2 내지 817
(C) 확인 방법: 실험
(xi) 서열 기술:
Claims (39)
- 식물로부터 분리되고 수크로스 분자내 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜 라피노스를 생성할 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 제1항에 있어서, 식물이 쌍떡잎식물인 라피노스 신타제 유전자.
- 제2항에 있어서, 쌍떡잎식물이 콩과식물인 라피노스 신타제 유전자.
- 제3항에 있어서, 콩과식물이 잠두인 라피노스 신타제 유전자.
- (a) 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는(b) 서열 1의 아미노산 서열중에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자내 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 제3항에 있어서, 콩과식물이 대두인 라피노스 신타제 유전자.
- (a) 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는(b) 서열 3의 아미노산 서열중에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고, 수크로스 분자내 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 제2항에 있어서, 쌍떡잎식물이 꿀풀과 식물(lamiaceous plant)인 라피노스 신타제 유전자.
- 제10항에 있어서, 꿀풀과 식물이 저패니즈 아티초크(Japanese artichoke)인 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 5의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 제1항에 있어서, 식물이 외떡잎식물인 라피노스 신타제 유전자.
- 제14항에 있어서, 외떡잎식물이 벼과식물(gramineous plant)인 라피노스 신타제 유전자.
- 제15항에 있어서, 벼과식물이 옥수수인 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 7의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 라피노스 신타제 유전자.
- (a) 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열 또는(b) 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열중에서 1개 이상의 아미노산을 결실, 치환, 변형 또는 첨가함으로써 유도된 아미노산 서열을 갖고,수크로스 분자내 D-글루코스 잔기의 6위치의 탄소 원자에 부착된 히드록실기와 α(1→6) 결합을 통해 D-갈락토실기를 결합시켜서 라피노스를 생성할 수 있는 라피노스 신타제 단백질.
- 서열 1 또는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 라피노스 신타제 단백질.
- 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제7항, 제10항, 제11항, 제14항, 제15항 또는 제16항의 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편.
- 제5항, 제6항, 제8항, 제9항, 제12항, 제13항, 제17항 또는 제18항의 라피노스 신타제 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 뉴클레오티드의 수가 15 내지 50 범위인 유전자 단편.
- 유기체에서 기원한 게놈성 DNA 또는 cDNA 단편에 제21항, 제22항 또는 제23항의 표지된 유전자 단편의 프로브를 하이브리드화시키는 단계 및 프로브에 특이적으로 결합된 DNA 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 이의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 검출 방법.
- 식물에서 기원한 게놈성 DNA 또는 cDNA 단편에 제21항, 제22항 또는 제23항의 표지된 유전자 단편의 프로브를 하이브리드화시키는 단계 및 프로브에 특이적으로 결합된 DNA 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 이의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 검출 방법.
- 유기체에서 기원한 게놈성 DNA 또는 cDNA에 제21항, 제22항 또는 제23항의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 어니일링시키는 단계 및 수득되는 DNA 단편을 폴리머라제 쇄 반응에 의해 증폭시키는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 이의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 증폭 방법.
- 식물에서 기원한 게놈성 DNA 또는 cDNA에 제21항, 제22항 또는 제23항의 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 어니일링시키는 단계 및 수득되는 DNA 단편을 폴리머라제 쇄 반응에 의해 증폭시키는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자 또는 그의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편의 증폭 방법.
- 제24항, 제25항, 제26항 또는 제27항의 방법에 의해 라피노스 신타제 유전자 또는 이의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 포함하는 DNA 단편을 동정하는 단계; 및 동정된 DNA 단편을 분리하여 정제하는 단계를 포함하는, 라피노스 신타제 유전자의 수득 방법.
- 제24항, 제25항, 제26항 또는 제27항의 방법에 의해 라피노스 신타제 유전자 또는 이의 부분 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 함유하는 DNA 단편을 동정하는 단계 및 동정된 DNA 단편을 분리하여 정제하는 단계에 의해 수득된 라피노스 신타제 유전자.
- 제1항 내지 제18항 또는 29항중 어느 한 항의 라피노스 신타제 유전자 및 이에 연결된 프로모터를 포함하는 키메라 유전자.
- 숙주 생물내로 제30항의 키메라 유전자를 도입함으로써 수득된 형질전환체.
- 제1항 내지 제18항, 제29항 또는 30항중 어느 한 항의 라피노스 신타제 유전자를 포함하는 플라스미드.
- 제32항의 플라스미드로 형질전환된 숙주 유기체, 또는 이의 세포.
- 제32항의 플라스미드로 형질전환된 미생물.
- 제32항의 플라스미드로 형질전환된 식물, 또는 이의 세포.
- 숙주 유기체 또는 이의 세포내로 제1항 내지 제18항, 제29항 또는 30항의 라피노스 신타제 유전자를 도입하여, 숙주 유기체 또는 그의 세포내의 라피노스과 올리고당의 함량을 변화시킴을 포함하는 대사 변형 방법.
- 제34항의 미생물을 배양하여 수득된 배양물로부터 라피노스 신타제 단백질을 분리 및 정제함을 포함하는 라피노스 신타제 단백질의 제조 방법.
- 제19항 또는 제20항의 라피노스 신타제 단백질에 결합할 수 있는 항-라피노스 신타제 항체.
- 시험 단백질을 제38항의 항-라피노스 신타제 항체로 처리하는 단계 및 항체와 라피노스 신타제 단백질 사이의 항원-항체 반응에 의해 라피노스 신타제 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 라피노스 신타제 단백질의 검출 방법.
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