KR102699320B1 - 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 - Google Patents
수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102699320B1 KR102699320B1 KR1020210132610A KR20210132610A KR102699320B1 KR 102699320 B1 KR102699320 B1 KR 102699320B1 KR 1020210132610 A KR1020210132610 A KR 1020210132610A KR 20210132610 A KR20210132610 A KR 20210132610A KR 102699320 B1 KR102699320 B1 KR 102699320B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ala
- methane monooxygenase
- leu
- glu
- val
- Prior art date
Links
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 title claims description 50
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 title claims description 49
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 title claims description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- 108010009977 methane monooxygenase Proteins 0.000 title abstract description 44
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 20
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 101710162120 Methane monooxygenase component C Proteins 0.000 claims abstract description 66
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 14
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 59
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 241000589354 Methylosinus Species 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 8
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 4
- CVGNCMIULZNYES-WHFBIAKZSA-N Ala-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O CVGNCMIULZNYES-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 4
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 4
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- SUMYEVXWCAYLLJ-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SUMYEVXWCAYLLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 4
- FQNILRVJOJBFFC-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N FQNILRVJOJBFFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N Ala-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 4
- QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 4
- GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 4
- MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N Arg-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 4
- ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- RDLYUKRPEJERMM-XIRDDKMYSA-N Asn-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RDLYUKRPEJERMM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 4
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- KQBVNNAPIURMPD-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KQBVNNAPIURMPD-PEFMBERDSA-N 0.000 description 4
- UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N Asp-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N Cys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- QFXNFFZTMFHPST-DZKIICNBSA-N Gln-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N QFXNFFZTMFHPST-DZKIICNBSA-N 0.000 description 4
- FNAJNWPDTIXYJN-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FNAJNWPDTIXYJN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- CSMHMEATMDCQNY-DZKIICNBSA-N Gln-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CSMHMEATMDCQNY-DZKIICNBSA-N 0.000 description 4
- WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- VPKBCVUDBNINAH-GARJFASQSA-N Glu-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VPKBCVUDBNINAH-GARJFASQSA-N 0.000 description 4
- OBIHEDRRSMRKLU-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Asp Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OBIHEDRRSMRKLU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- ZZIFPJZQHRJERU-WDSKDSINSA-N Glu-Cys-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O ZZIFPJZQHRJERU-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N Glu-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 4
- RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N Glu-Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Cys Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N Gly-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(O)=O OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N 0.000 description 4
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 4
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 4
- CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N His-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- ASCFJMSGKUIRDU-ZPFDUUQYSA-N Ile-Arg-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ASCFJMSGKUIRDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- JRYQSFOFUFXPTB-RWRJDSDZSA-N Ile-Gln-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N JRYQSFOFUFXPTB-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 4
- WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 4
- KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N Ile-Pro-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 4
- GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N Ile-Tyr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 GVEODXUBBFDBPW-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 4
- DLEBSGAVWRPTIX-PEDHHIEDSA-N Ile-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC DLEBSGAVWRPTIX-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 4
- RQZFWBLDTBDEOF-RNJOBUHISA-N Ile-Val-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N RQZFWBLDTBDEOF-RNJOBUHISA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 4
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- GOFJOGXGMPHOGL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C GOFJOGXGMPHOGL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 4
- WQWZXKWOEVSGQM-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN WQWZXKWOEVSGQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- NBEFNGUZUOUGFG-KKUMJFAQSA-N Met-Tyr-Gln Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N NBEFNGUZUOUGFG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- 241000589349 Methylosinus sporium Species 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QMMRHASQEVCJGR-UBHSHLNASA-N Phe-Ala-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QMMRHASQEVCJGR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 4
- LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N Phe-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 4
- MGBRZXXGQBAULP-DRZSPHRISA-N Phe-Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MGBRZXXGQBAULP-DRZSPHRISA-N 0.000 description 4
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 4
- FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N Phe-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 4
- VJLJGKQAOQJXJG-CIUDSAMLSA-N Pro-Asp-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VJLJGKQAOQJXJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- FEVDNIBDCRKMER-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 FEVDNIBDCRKMER-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 4
- MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N Thr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N Thr-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 4
- JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N Thr-Phe-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N 0.000 description 4
- GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N Tyr-Thr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 4
- PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N Tyr-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N 0.000 description 4
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 4
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 4
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- JYVKKBDANPZIAW-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N JYVKKBDANPZIAW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- UZDHNIJRRTUKKC-DLOVCJGASA-N Val-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N UZDHNIJRRTUKKC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 4
- BEGDZYNDCNEGJZ-XVKPBYJWSA-N Val-Gly-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BEGDZYNDCNEGJZ-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 4
- FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Leu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 4
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 4
- 108010084217 alanyl-glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 4
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 4
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 4
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010085059 glutamyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 4
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010089198 phenylalanyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 4
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGGWCAFQPKANMW-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UGGWCAFQPKANMW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N Thr-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JVTHIXKSVYEWNI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 3
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- -1 methane Chemical class 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 3
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091006091 regulatory enzymes Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- XUCHENWTTBFODJ-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XUCHENWTTBFODJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- WVRUKYLYMFGKAN-IHRRRGAJSA-N Tyr-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WVRUKYLYMFGKAN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002366 halogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010071967 protein K Proteins 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체에 관한 것으로, 메틸로시너스(Methylosinus) 속 미생물 유래의 서열번호 1의 아미노산 배열에서 159번째 세린(Serine, S), 161번째 세린, 184번째 세린 중 적어도 어느 하나가 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 메탄 모노옥시게나제 변이체, 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체는 종래의 메탄 모노옥시게나제 환원효소에 비해 효소 활성이 우수하여 보다 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체 구성을 통한 반응성 증대에 관한 것이다.
지구 온난화를 유발하는 온실가스 중 하나인 메탄가스는 온실가스의 대부분을 차지하는 이산화탄소에 비하여 구성 비율은 낮다. 하지만, 메탄가스는 이산화탄소에 비해 약 33배 높은 열용량을 가지고 있어 지구 온난화 현상을 방지하기 위해 메탄가스의 저감 기술 개발의 필요성이 대두되고 있다.
현재 공업 분야에서 이용되고 있는 메탄의 산화 공정들은 강하게 결합하고 있는 탄소-수소간 결합(104.9 kcal/mol)을 활성화시키기 위하여 높은 압력과 온도를 필요로 하며, 공정에 발생하는 비용적인 측면과 부수물을 처리하기 위한 추가 공정이 필요하다는 점에서 경제적으로 비효율성을 갖는다. 따라서, 이러한 문제의 대안으로 메탄가스 전환을 위한 생물학적 공정의 적용이 요구되어지며, 효소의 바이오 에너지 전환 및 바이오 전환을 목적으로 한 생물 공학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 생물학적 공정의 경우 상온·대기압 조건에서 반응을 진행할 수 있어 비용적인 측면에서 높은 장점을 갖으며, 반응 부수물이 발생하지 않는다는 장점이 있어 다양한 산업화의 응용이 가능할 것으로 기대된다.
상기와 같이 생물학적 공정을 수행하기 위해 효소는 메탄을 기질로 하여 효소 촉매 회로에 따라 메탄의 히드록실화가 진행되어지며, 메탄가스를 유일한 탄소 에너지원으로 이용하는 메탄균의 경우 세포 내에서 메탄 모노옥시게나제를 이용하여 메탄을 메탄올로 산화시킨다. 메탄 모노옥시게나제는 수용성 메탄 모노옥시게나제와 미립자 메탄 모노옥시게나제의 두 가지 형태로 발현되며, 메탄 균주의 배양에 있어 구리 이온이 배제된 2형 메탄균 상태에서만 수용성 메탄 모노옥시게나제로 발현되는 특징을 갖는다.
수용성 메탄 모노옥시게나제에서 발생하는 기질의 산화에는 세 가지 효소가 관여한다. 활성 부위(이철 부위)를 포함하여 메탄의 산화가 이루어지는 수산화효소(MMOH), 수산화효소에 결합하여 메탄 모노옥시게나제의 반응을 촉진시키는 조절효소(MMOB), 메탄의 지속적인 산화를 위하여 활성 부위에 전자를 공급하고, 이철을 환원된 형태로 전환시키는 환원효소(MMOR)로 구성된다. 수용성 메탄 모노옥시게나제의 경우 메탄을 비롯한 알칸, 알킨, 할로겐 화합물 등 다양한 탄화수소 화합물을 산화시킬 수 있으며, 이에 따라 생물공학적인 방법으로 각 기질의 특성에 따른 알콜 및 산화물을 생성시킬 수 있는 장점이 있다.
수용성 메탄 모노옥시게나제는 생화학적·분자생물학적 접근이 용이하지 않은 효소라는 측면에서 구조적·기능적 연구를 진행하기에 한계가 있었다. 또한 종래에 수용성 메탄 모노옥시게나제의 잠재적 이용 가능성을 파악하기 위해 진행하였던 효소 활성 연구 또한 수용성 메탄 모노옥시게나제의 효소 활성만을 측정할 수 있었으며, 효소 반응으로부터 형성되는 생성물을 정량화하기 어려워 산업적으로 이용하기 불충분하였다.
이에 따라, 수용성 메탄 모노옥시게나제의 산업적 활용을 위하여 구조적·기능적 연구 및 촉매로서의 잠재적 이용 가능성을 파악하기 위한 효소 활성 증대를 위한 연구 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소의 변이체로부터 화학 반응 기작을 파악하고, 이를 이용하여 탄화수소 산화물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 159번째 세린(Serine, S)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환되거나, 161번째 세린(Serine, S)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환되거나, 184번째 세린(Serine, S)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환된 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소(reductase), MMOR 변이체를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 다른 측면은 상기 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터가 수용성세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은 상기 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 통하여 진행한 단백질 간 결합 능력 측정 및 효소 활성 측정 결과로부터 전자전달에 관여하는 잔기를 규명하고, 인 비트로(in vitro)에서의 최적의 활성을 갖는 탄화수소 산화물 생산 방법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 프로필렌(propylene)이 존재하는 환경에서 인 비트로(in vitro)에서의 수용성 메탄 모노옥시게나제에 의하여 형성된 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소의 변이체로부터 수용성 메탄 모노옥시게나제의 전자전달에 관여하는 잔기를 규명하였으며, 이는 생화학적·분자생물학적 촉매 모사 연구에 적용되어 메탄을 포함한 탄화수소 기질로부터 탄화수소 산화물을 생산해 내는데 이용될 수 있다. 또한, 상온·대기압 조건에서 기질로부터 산화물을 생성하는 과정에서 부수물을 형성하지 않으므로 경제적·환경적인 측면에서 유리하게 작용할 수 있다.
본 발명을 통하여 최적의 조건에서 수용성 메탄 모노옥시게나제에 의하여 생성되는 탄화수소 산화물을 정량적으로 수치화하였으며, 이를 통해 수용성 메탄 모노옥시게나제의 촉매로써의 잠재적 가능성을 확인하여 산업 공정에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대한다.
다만 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 본 발명으로부터 기대할 수 있는 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 특성 및 단백질에 포함된 보조인자 함량 파악을 위한 UV-Vis를 측정한 그래프이다.
도 3은 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 포함된 보조인자인 철(Fe)과 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 함량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 프로필렌을 기질로 이용하는 경우에 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 수용성 메탄 모노옥시게나제에 의한 프로필렌옥사이드 화합물의 생성 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 수용성 메탄 모노옥시게나제의 수산화효소(MMOH) 간 결합 특성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 특성 및 단백질에 포함된 보조인자 함량 파악을 위한 UV-Vis를 측정한 그래프이다.
도 3은 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 포함된 보조인자인 철(Fe)과 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 함량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 프로필렌을 기질로 이용하는 경우에 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 수용성 메탄 모노옥시게나제에 의한 프로필렌옥사이드 화합물의 생성 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 수용성 메탄 모노옥시게나제의 수산화효소(MMOH) 간 결합 특성을 나타낸 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 ‘수용성 메탄 모노옥시게나제’는 하기 반응식과 같이 메탄으로부터 메탄올을 생성하는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1.
수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 메틸로시너스(Methylosinus) 속 미생물, 보다 구체적으로는 메틸로시너스 스포리움 5(Methylosinus sporium 5)으로부터 유래한 것으로서 메탄 모노옥시게나제 환원효소의 활성을 갖는 단백질이다.
본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 159번째 세린(serine, S), 161번째 세린, 184번째 세린이 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 중 159번째 세린은 알라닌(alanine, A)으로 치환될 수 있다. 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 중 161번째 세린은 알라닌으로 치환될 수 있으며, 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 중 184번째 세린은 알라닌으로 치환될 수 있으며, 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 변이체들은 기본적으로 메탄 모노옥시게나제로서 환원효소의 활성을 가진다. 따라서 상기 변이체는 메탄을 포함한 저급 탄화수소를 탄화수소 산화물로 변환하고, 상기 저급 탄화수소는 탄소수 1 내지 3, 예를 들어 메탄 또는 프로필렌일 수 있다. 상기 변이체들은 메탄 모노옥시게나제로서의 활성 및 저급 탄화수소의 변환을 위해 기체를 공급할 수 있으며, 예를 들어 산소(oxygen)일 수 있다.
또한, 상기 변이체들은 종래의 메탄 모노옥시게나제 환원효소, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 메탄 모노옥시게나제 환원효소와 기질 친화도가 유사하다. 또한, 상기 변이체들은 종래의 메탄 모노옥시게나제 환원효소, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열이 갖는 메탄 모노옥시게나제 환원효소와 비교하였을 때 메탄 모노옥시게나제의 산화효소 간 결합 특성이 유사하다.
또한, 상기 변이체들은 상기와 같은 기질 친화도와 결합 특성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 추가적으로 변형될 수 있다. 상기와 같은 특성에 영향을 미치지 않는 단백질 또는 펩타이드 수준에서의 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 메틸로시너스 스포리움 5(Methylosinus sporium 5)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열의 159번째 서열을 세린에서 알라닌으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 161번째 세린을 알라닌으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 184번째 세린을 알라닌으로 각각 치환한 3개의 환원효소 변이체(S159A, S161A, S184A)를 제작하였고, 상기 변이체들 모두 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 메탄 모노옥시게나제와 유사한 보조인자 함량, 구체적으로 철과 플라빈 아데닌 다이뉴클레오다이드 함량을 확인하였다(도 3 참고).
아울러, 상기와 같은 3개의 환원효소 변이체를 대상으로 100 μM 수준의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH)를 이용하여 전자전달에 의한 산화물 생성 정도를 확인하였으며, 프로필렌을 기질로 이용하여 반응시킬 때 산소 공급을 제어하여 활성을 증대하고자 하였다. 상기 변이체 중 1개의 환원효소 변이체(S161A)에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 메탄 모노옥시게나제에 비해 유의미한 수준으로 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 4 참고).
추가적으로, 상기와 같은 3개의 환원효소 변이체를 대상으로 메탄 모노옥시게나제의 산화효소 간 결합 친화도를 측정하여 결합 특성을 확인한 결과, 상기 변이체들 모두 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 메탄 모노옥시게나제와 유사한 결합 특성을 갖는 것을 확인하였다(도 5 참고).
2.
수용성 메탄 모노옥시게나제의 유전자, 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 다른 측면은 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자를 제공한다.
예컨대, 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자는 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 그러나, 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 메탄 모노옥시게나제의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), MBP 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 메탄 모노옥시게나제의 유전자를 플라스미드 벡터인 pET30a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET30a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 메탄 모노옥시게나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α 등) 또는 효모 세포(Hansenula 속, Saccharomyces 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환 시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 신규의 환원효소 변이체이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.
3.
수용성 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 메탄 모노옥시게나제의 생산 방법은 1) 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계, 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 3) 상기 단계 2)에서 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 유전자 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 메탄 모노옥시게나제를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 유전자의 N-말단 및 C-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단 위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 정제 또는 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간, 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 정제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 상기와 같이 정제된 3개 환원효소 변이체(S159A, S161A, S184A)에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 메탄 모노옥시게나제와 유사한 보조인자 함량을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4.
탄화수소 산화물의 생산 방법 및 탄화수소 산화물 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 이용하여 탄화수소로부터 탄화수소 산화물을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 탄화수소 산화물의 생산에 이용되는 탄화수소 산화물 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 탄화수소 산화물 생산용 조성물은 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 포함한다.
또한, 본 발명의 탄화수소 산화물의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 탄화수소와 반응시키는 단계 및 2) 상기 단계 1) 에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 탄화수소 산화물을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 탄화수소 산화물의 생산 방법 및 탄화수소 산화물 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 이용하여 그 기질인 탄화수소로부터 탄화수소 산화물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 탄화수소의 종류에 따라 생성되는 탄화수소 산화물의 종류 또한 달라지는 것이고, 저급 탄화수소를 기질로 이용하는 경우 저급 탄화수소 산화물이 생성된다. 예컨대, 기질로 메탄이 이용되는 경우에는 탄화수소 산화물로 메탄올이 생성되고, 기질로 프로필렌이 이용되는 경우에는 탄화수소 산화물로 프로필렌옥사이드가 생성되는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 20°C 내지 55°C의 온도 범위, 바람직하게는 22°C 내지 50°C의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 25°C 내지 45°C의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 5 내지 8의 pH 범위, 바람직하게는 6 내지 7.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 활성을 향상시키기 위해 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체와 기체 형태의 산소 분자가 포함될 수 있다.
상기 단계 1)의 반응에서 기질인 상기 탄화수소는 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 탄화수소는 목적하는 탄화수소 산화물의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 상기 탄화수소의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 탄화수소가 연속적으로 주입되는 경우, 상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체에 의하여 탄화수소 산화물을 지속적으로 생성할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
실시예 1
메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 제조
[1-1]
서열번호 4의 염기 서열을 갖는 유전자의 클로닝 및 형질전환
서열번호 1의 아미노산 서열에서, 159번째 세린을 알라닌으로 치환한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 S159A 환원효소 변이체의 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 바와 같은 S159A의 프라이머 쌍과 Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEW ENGLAND BioLabs)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 PCR 산물이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
| 증폭대상 | 프라이머 쌍 | 서열 (5‘->3’) |
| S159A | 정방향 프라이머 | cgcgccgcgcctattccatggcctcg |
| S159A | 역방향 프라이머 | ccatggaataggcgcggcgcgtatgcgtgcc |
상기와 같이 제작된 재조합 발현 벡터를 대상으로 염기 서열 분석(sequencing)(㈜코스모진텍)을 수행한 결과, 상기 서열번호 4의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 BL21(DE3) 균주(Novagen, 미국)에 형질전환 하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 10 mL의 LK 고체 배지(LB 배지+50 μg/mL 카나마이신)에 선접종하고 37°C에서 12시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를 단집락 분리 과정으로 5 mL의 LB 배지와 50 μg/mL 카나마이신이 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37°C의 진탕 배양기로 12시간 이상 종균 배양을 실시하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 15% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2]
서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 200 mL의 LB 배지와 50 μg/mL 카나마이신이 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37°C의 진탕 배양기로 12시간 이상 종균 배양을 실시하였다. 그 후, 상기 종균 배양된 배양액 5 mL를 500 mL의 LK 배지가 포함된 2,000 mL 플라스크에 첨가하여 총 2 L의 본 배양을 실시하였고, 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.5 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37°C가 유지되도록 조정하였고, IPTG 첨가 후에는 교반 속도를 180 rpm으로, 배양 온도를 18°C로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 500 mL의 PP 튜브(PP tube, Hanil Scientific Inc., 한국)에 분주하고, 4°C에서 8,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 분리해 낸 펠렛에 완충 용액 (25 mM MOPS, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.01 μL/mL DNaseⅠ, 0.002 mg/mL, pH 6.5) 50 mL을 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4°C에서 14,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였고, Q sepharose 이온 교환 컬럼(Cytiva, 독일) 및 Superdex 75(Cytiva, 독일)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatpgraphy)(Cytiva, 독일)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 약 37 kDa의 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
[1-3]
서열번호 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 제조
추가적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 161번째 세린을 알라닌으로 치환한 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 S161A 환원효소 변이체, 184번째 세린을 알라닌으로 치환한 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 S184A 환원효소 변이체의 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 6, 8의 염기 서열을 설계하였다. 또한, 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]와 동일한 방법으로 하기 표 2의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 6, 8의 염기 서열을 갖는 유전자를 클로닝하고, 서열번호 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
| 증폭대상 | 프라이머 쌍 | 서열 (5‘->3’) |
| S161A | 정방향 프라이머 | ggtcgcggaggatggtcg |
| S161A | 역방향 프라이머 | gaggccatggcataggagcgg |
| S184A | 정방향 프라이머 | gcgcacgcaggcgagcgt |
| S184A | 역방향 프라이머 | agataattggcgaaagcgccgtccggcag |
[1-4]
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 제조
대조군으로 이용하기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 주형으로 하여 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]와 동일한 방법으로, 하기 표 3의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자를 클로닝하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
| 증폭대상 | 프라이머 쌍 | 서열 (5‘->3’) |
| 서열번호 1 | 정방향 프라이머 | cgcatatgtaccagatcg |
| 서열번호 1 | 역방향 프라이머 | ataagcttcagccgctcg |
실시예 2
메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 보조인자 함량 확인
상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 3개의 단백질 각각, 즉 서열번호 3, 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질을 완충용액(25 mM MOPS, 50 mM NaCl, pH 6.5)에 첨가하고, 첨가한 완충용액에 아스코르브산(ascorbic acid)과 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 각각 1.5 mM, 0.7 M이 되도록 혼합하여 4°C, 4,000 rpm, 25분 동안 원심분리하여 상층액을 분리한다. 상층액에 암모늄아세테이트(ammonium acetate)와 페러진(ferrozine disulfonic acid disodium salt)을 각각 1.3 M, 6.17 mM 첨가한 뒤 UV/Vis spectrophotometer (Cary60, Agilent Technologies Inc., 미국)를 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고(도 2), 측정값을 standard curve를 통해 얻은 추세선에 대입하여 보조인자 함량을 측정하였다.
상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
| 단백질 | Fe 함량 | FAD 함량 |
| 서열번호 1 | 1.9 ± 0.0 | 1.0 ± 0.0 |
| S159A | 1.7 ± 0.1 | 1.6 ± 0.1 |
| S161A | 2.1 ± 0.1 | 2.1 ± 0.1 |
| S184A | 1.7 ± 0.1 | 1.7 ± 0.0 |
그 결과, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 정제 및 분리한 서열번호 3, 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 메탄 모노옥시게나제와 유사한 보조인자 함량을 갖는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3
메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 효소 활성 확인
상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 3개의 단백질 각각, 즉 서열번호 3, 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질 0.04 mg/mL를 메탄 모노옥시게나제 산화효소 및 조절효소와 함께 완충용액(25 mM MOPS, 50 mM NaCl, pH 6.5)에 첨가하고 30°C에서 30초 동안 반응시킨 다음, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 산화물 생성량을 UV/Vis spectrophotomer를 통하여 확인하였다.
상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
| 단백질 | Specific Enzyme Activity (mU/mg) |
| 서열번호 1 | 648.4 ± 22.8 |
| S159A | 462.4 ± 20.9 |
| S161A | 864.6 ± 50.3 |
| S184A | 627.3 ± 7.1 |
그 결과, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 정제 및 분리한 서열번호 3, 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 탄화수소로부터 탄화수소 산화물을 생성하는 메탄 모노옥시게나제로서의 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 3개의 단백질 중 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 환원효소 변이체 S161A는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 메탄 모노옥시게나제에 비해 우수한 활성을 가짐을 확인하였다(도 4).
실시예 4
메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 결합 특성 분석
상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 3개의 단백질 각각, 즉 서열번호 3, 5, 7의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질을 메탄 모노옥시게나제 산화효소 0.8 mg/mL이 포함된 완충용액(25 mM MOPS, 50 mM NaCl, pH 6.5)에 적정하였다. Spectrofluorometer (FP-8300, JASCO Inc., 일본)를 이용한 형광 강도 측정을 수행하여, 메탄 모노옥시게나제 산화요소와 환원효소 변이체 간 결합친화도 및 결합 특성을 확인하였다.
상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 진행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
| 단백질 | K d1 (μM) | K d2 (μM) |
| 서열번호 1 | 0.38 ± 0.04 | 6.72 ± 0.16 |
| S159A | 0.24 ± 0.05 | 6.51 ± 0.94 |
| S161A | 0.15 ± 0.02 | 9.94 ± 0.26 |
| S184A | 0.34 ± 0.02 | 7.78 ± 0.32 |
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 메탄 모노옥시게나제 환원효소와 산화효소 간 결합친화도와, 상기 3종의 환원효소 변이체들(S159A, S161A, S184A)의 결합친화도가 유사함을 확인하였으며 이를 통해 결합 특성 또한 유사함을 확인하였다(도 5).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체들은 기질, 구체적으로 탄화수소가 존재하는 환경에서 효소 반응을 일으킬 수 있을 정도로 기질 친화도 및 결합 특성이 유사함을 확인하였다. 또한, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 환원효소 변이체 S161A의 경우 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 메탄 모노옥시게나제에 비해 효소 활성이 증가함을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Reductase variant of soluble methane monooxygenase and method for
producing hydrocarbon oxide using the same
<130> DHP21-409
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 343
<212> PRT
<213> Methylosinus sporium 5
<400> 1
Met Tyr Gln Ile Val Ile Glu Thr Glu Asp Gly Glu Thr Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Cys Gly Pro Ser Glu Asp Val Ile Ser Ala Gly Leu Arg Gln Ser
20 25 30
Val Ile Leu Leu Ala Ser Cys Arg Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Lys
35 40 45
Ala Asp Cys Thr Asp Gly Glu Tyr Glu Leu Ile Asp Val Lys Val Gln
50 55 60
Ala Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Asp Gly Lys Val Leu Leu Cys Arg
65 70 75 80
Thr Phe Pro Arg Ser Asp Leu His Leu Ile Val Pro Tyr Thr Tyr Asp
85 90 95
Arg Ile Ser Phe Glu Ala Ile Gln Thr Asn Trp Leu Ala Glu Ile Val
100 105 110
Glu Cys Asp Arg Val Ser Ser Asn Val Val Arg Leu Leu Leu Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Ala Asp Gly Ala Ala Pro Ile Ser Leu Asn Phe Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Phe Val Asp Ile Glu Ile Pro Gly Thr His Thr Arg Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Met Ala Ser Val Ala Glu Asp Gly Arg Leu Glu Phe Phe Ile Arg
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Gly Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Arg Thr Gln Ala Ser
180 185 190
Val Gly Gln Arg Val Ala Leu Arg Gly Pro Ala Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
His Lys Ser Glu Arg Pro Arg Phe Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Leu
210 215 220
Ser Pro Val Leu Ser Met Ile Arg Gln Leu Lys Lys Glu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Gln Pro Ala Thr Leu Phe Phe Gly Val Thr Asn Tyr Glu Glu Leu Phe
245 250 255
Tyr Val Glu Glu Leu Arg Ala Leu Gln Lys Ala Met Pro Ser Leu Asp
260 265 270
Val Gln Val Ala Val Val Asn Ala Thr Glu Ala Asn Gly Val Ala Lys
275 280 285
Gly Thr Val Ile Asp Leu Met Arg Ala Glu Leu Glu Lys Leu Arg Gly
290 295 300
Ala Pro Asp Ile Tyr Leu Cys Gly Pro Pro Gly Met Ile Glu Ala Ala
305 310 315 320
Phe Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gly Val Pro Lys Glu Gln Val Tyr Leu
325 330 335
Glu Lys Phe Leu Ala Ser Gly
340
<210> 2
<211> 1032
<212> DNA
<213> Methylosinus sporium 5
<400> 2
atgtaccaga tcgtcatcga aactgaggac ggagaaacct gttcgttcga atgcggaccg 60
agcgaggacg tcatttccgc ggggcttcgt cagagcgtca ttctgctcgc ctcctgccgc 120
gccggcggct gcgcgacctg caaggccgat tgcacggatg gcgaatacga gctcatcgac 180
gtcaaggttc aggctctgcc gccggacgag gaggaggacg gaaaggttct gctgtgccgc 240
acctttccgc gcagcgacct tcatctcatc gtgccctaca cctatgatcg catctccttc 300
gaggcgatcc agaccaattg gctcgccgag atcgtcgaat gcgatcgcgt gtcgtccaat 360
gtcgtgcggc tcctgctgca gcccctcacc gcagatggcg cagcgcccat ctcgttgaac 420
ttcgctcccg ggcaattcgt cgacatcgaa attcccggca cgcatacgcg ccgctcctat 480
tccatggcct cggtcgcgga ggatggtcgg ctcgaattct tcatccgcct gctgccggac 540
ggcgctttct ccaattatct gcgcacgcag gcgagcgtcg gccagcgcgt cgcgctgcgc 600
gggccggccg gctccttctt tctgcacaag agcgagcggc cgcgcttctt cgtcgccggc 660
ggcacgggcc tctcacccgt tctgtcgatg attcggcaat tgaaaaagga agccgatccg 720
caaccggcga ccttgttctt cggcgtcacc aattatgagg agctcttcta tgtcgaggag 780
ctgagggcgc tgcagaaggc catgccgagc ctcgatgtgc aggtggcggt cgtcaatgcg 840
acggaggcga atggcgtcgc caagggaacg gtcatcgatc tcatgcgcgc cgagctcgag 900
aagctgcgcg gcgcgccgga catctacctt tgcggtccgc ccggcatgat cgaggccgcc 960
ttcgacgccg cagcgacggc cggcgttccc aaggagcagg tctatctcga gaaattcctg 1020
gcgagcggct ga 1032
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S159A
<400> 3
Met Tyr Gln Ile Val Ile Glu Thr Glu Asp Gly Glu Thr Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Cys Gly Pro Ser Glu Asp Val Ile Ser Ala Gly Leu Arg Gln Ser
20 25 30
Val Ile Leu Leu Ala Ser Cys Arg Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Lys
35 40 45
Ala Asp Cys Thr Asp Gly Glu Tyr Glu Leu Ile Asp Val Lys Val Gln
50 55 60
Ala Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Asp Gly Lys Val Leu Leu Cys Arg
65 70 75 80
Thr Phe Pro Arg Ser Asp Leu His Leu Ile Val Pro Tyr Thr Tyr Asp
85 90 95
Arg Ile Ser Phe Glu Ala Ile Gln Thr Asn Trp Leu Ala Glu Ile Val
100 105 110
Glu Cys Asp Arg Val Ser Ser Asn Val Val Arg Leu Leu Leu Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Ala Asp Gly Ala Ala Pro Ile Ser Leu Asn Phe Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Phe Val Asp Ile Glu Ile Pro Gly Thr His Thr Arg Arg Ala Tyr
145 150 155 160
Ser Met Ala Ser Val Ala Glu Asp Gly Arg Leu Glu Phe Phe Ile Arg
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Gly Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Arg Thr Gln Ala Ser
180 185 190
Val Gly Gln Arg Val Ala Leu Arg Gly Pro Ala Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
His Lys Ser Glu Arg Pro Arg Phe Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Leu
210 215 220
Ser Pro Val Leu Ser Met Ile Arg Gln Leu Lys Lys Glu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Gln Pro Ala Thr Leu Phe Phe Gly Val Thr Asn Tyr Glu Glu Leu Phe
245 250 255
Tyr Val Glu Glu Leu Arg Ala Leu Gln Lys Ala Met Pro Ser Leu Asp
260 265 270
Val Gln Val Ala Val Val Asn Ala Thr Glu Ala Asn Gly Val Ala Lys
275 280 285
Gly Thr Val Ile Asp Leu Met Arg Ala Glu Leu Glu Lys Leu Arg Gly
290 295 300
Ala Pro Asp Ile Tyr Leu Cys Gly Pro Pro Gly Met Ile Glu Ala Ala
305 310 315 320
Phe Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gly Val Pro Lys Glu Gln Val Tyr Leu
325 330 335
Glu Lys Phe Leu Ala Ser Gly
340
<210> 4
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S159A
<400> 4
atgtaccaga tcgtcatcga aactgaggac ggagaaacct gttcgttcga atgcggaccg 60
agcgaggacg tcatttccgc ggggcttcgt cagagcgtca ttctgctcgc ctcctgccgc 120
gccggcggct gcgcgacctg caaggccgat tgcacggatg gcgaatacga gctcatcgac 180
gtcaaggttc aggctctgcc gccggacgag gaggaggacg gaaaggttct gctgtgccgc 240
acctttccgc gcagcgacct tcatctcatc gtgccctaca cctatgatcg catctccttc 300
gaggcgatcc agaccaattg gctcgccgag atcgtcgaat gcgatcgcgt gtcgtccaat 360
gtcgtgcggc tcctgctgca gcccctcacc gcagatggcg cagcgcccat ctcgttgaac 420
ttcgctcccg ggcaattcgt cgacatcgaa attcccggca cgcatacgcg ccgcgcctat 480
tccatggcct cggtcgcgga ggatggtcgg ctcgaattct tcatccgcct gctgccggac 540
ggcgctttct ccaattatct gcgcacgcag gcgagcgtcg gccagcgcgt cgcgctgcgc 600
gggccggccg gctccttctt tctgcacaag agcgagcggc cgcgcttctt cgtcgccggc 660
ggcacgggcc tctcacccgt tctgtcgatg attcggcaat tgaaaaagga agccgatccg 720
caaccggcga ccttgttctt cggcgtcacc aattatgagg agctcttcta tgtcgaggag 780
ctgagggcgc tgcagaaggc catgccgagc ctcgatgtgc aggtggcggt cgtcaatgcg 840
acggaggcga atggcgtcgc caagggaacg gtcatcgatc tcatgcgcgc cgagctcgag 900
aagctgcgcg gcgcgccgga catctacctt tgcggtccgc ccggcatgat cgaggccgcc 960
ttcgacgccg cagcgacggc cggcgttccc aaggagcagg tctatctcga gaaattcctg 1020
gcgagcggct ga 1032
<210> 5
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S161A
<400> 5
Met Tyr Gln Ile Val Ile Glu Thr Glu Asp Gly Glu Thr Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Cys Gly Pro Ser Glu Asp Val Ile Ser Ala Gly Leu Arg Gln Ser
20 25 30
Val Ile Leu Leu Ala Ser Cys Arg Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Lys
35 40 45
Ala Asp Cys Thr Asp Gly Glu Tyr Glu Leu Ile Asp Val Lys Val Gln
50 55 60
Ala Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Asp Gly Lys Val Leu Leu Cys Arg
65 70 75 80
Thr Phe Pro Arg Ser Asp Leu His Leu Ile Val Pro Tyr Thr Tyr Asp
85 90 95
Arg Ile Ser Phe Glu Ala Ile Gln Thr Asn Trp Leu Ala Glu Ile Val
100 105 110
Glu Cys Asp Arg Val Ser Ser Asn Val Val Arg Leu Leu Leu Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Ala Asp Gly Ala Ala Pro Ile Ser Leu Asn Phe Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Phe Val Asp Ile Glu Ile Pro Gly Thr His Thr Arg Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ala Ser Val Ala Glu Asp Gly Arg Leu Glu Phe Phe Ile Arg
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Gly Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Arg Thr Gln Ala Ser
180 185 190
Val Gly Gln Arg Val Ala Leu Arg Gly Pro Ala Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
His Lys Ser Glu Arg Pro Arg Phe Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Leu
210 215 220
Ser Pro Val Leu Ser Met Ile Arg Gln Leu Lys Lys Glu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Gln Pro Ala Thr Leu Phe Phe Gly Val Thr Asn Tyr Glu Glu Leu Phe
245 250 255
Tyr Val Glu Glu Leu Arg Ala Leu Gln Lys Ala Met Pro Ser Leu Asp
260 265 270
Val Gln Val Ala Val Val Asn Ala Thr Glu Ala Asn Gly Val Ala Lys
275 280 285
Gly Thr Val Ile Asp Leu Met Arg Ala Glu Leu Glu Lys Leu Arg Gly
290 295 300
Ala Pro Asp Ile Tyr Leu Cys Gly Pro Pro Gly Met Ile Glu Ala Ala
305 310 315 320
Phe Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gly Val Pro Lys Glu Gln Val Tyr Leu
325 330 335
Glu Lys Phe Leu Ala Ser Gly
340
<210> 6
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S161A
<400> 6
atgtaccaga tcgtcatcga aactgaggac ggagaaacct gttcgttcga atgcggaccg 60
agcgaggacg tcatttccgc ggggcttcgt cagagcgtca ttctgctcgc ctcctgccgc 120
gccggcggct gcgcgacctg caaggccgat tgcacggatg gcgaatacga gctcatcgac 180
gtcaaggttc aggctctgcc gccggacgag gaggaggacg gaaaggttct gctgtgccgc 240
acctttccgc gcagcgacct tcatctcatc gtgccctaca cctatgatcg catctccttc 300
gaggcgatcc agaccaattg gctcgccgag atcgtcgaat gcgatcgcgt gtcgtccaat 360
gtcgtgcggc tcctgctgca gcccctcacc gcagatggcg cagcgcccat ctcgttgaac 420
ttcgctcccg ggcaattcgt cgacatcgaa attcccggca cgcatacgcg ccgctcctat 480
gccatggcct cggtcgcgga ggatggtcgg ctcgaattct tcatccgcct gctgccggac 540
ggcgctttct ccaattatct gcgcacgcag gcgagcgtcg gccagcgcgt cgcgctgcgc 600
gggccggccg gctccttctt tctgcacaag agcgagcggc cgcgcttctt cgtcgccggc 660
ggcacgggcc tctcacccgt tctgtcgatg attcggcaat tgaaaaagga agccgatccg 720
caaccggcga ccttgttctt cggcgtcacc aattatgagg agctcttcta tgtcgaggag 780
ctgagggcgc tgcagaaggc catgccgagc ctcgatgtgc aggtggcggt cgtcaatgcg 840
acggaggcga atggcgtcgc caagggaacg gtcatcgatc tcatgcgcgc cgagctcgag 900
aagctgcgcg gcgcgccgga catctacctt tgcggtccgc ccggcatgat cgaggccgcc 960
ttcgacgccg cagcgacggc cggcgttccc aaggagcagg tctatctcga gaaattcctg 1020
gcgagcggct ga 1032
<210> 7
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S184A
<400> 7
Met Tyr Gln Ile Val Ile Glu Thr Glu Asp Gly Glu Thr Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Cys Gly Pro Ser Glu Asp Val Ile Ser Ala Gly Leu Arg Gln Ser
20 25 30
Val Ile Leu Leu Ala Ser Cys Arg Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Lys
35 40 45
Ala Asp Cys Thr Asp Gly Glu Tyr Glu Leu Ile Asp Val Lys Val Gln
50 55 60
Ala Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Asp Gly Lys Val Leu Leu Cys Arg
65 70 75 80
Thr Phe Pro Arg Ser Asp Leu His Leu Ile Val Pro Tyr Thr Tyr Asp
85 90 95
Arg Ile Ser Phe Glu Ala Ile Gln Thr Asn Trp Leu Ala Glu Ile Val
100 105 110
Glu Cys Asp Arg Val Ser Ser Asn Val Val Arg Leu Leu Leu Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Ala Asp Gly Ala Ala Pro Ile Ser Leu Asn Phe Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Phe Val Asp Ile Glu Ile Pro Gly Thr His Thr Arg Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Met Ala Ser Val Ala Glu Asp Gly Arg Leu Glu Phe Phe Ile Arg
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Gly Ala Phe Ala Asn Tyr Leu Arg Thr Gln Ala Ser
180 185 190
Val Gly Gln Arg Val Ala Leu Arg Gly Pro Ala Gly Ser Phe Phe Leu
195 200 205
His Lys Ser Glu Arg Pro Arg Phe Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Leu
210 215 220
Ser Pro Val Leu Ser Met Ile Arg Gln Leu Lys Lys Glu Ala Asp Pro
225 230 235 240
Gln Pro Ala Thr Leu Phe Phe Gly Val Thr Asn Tyr Glu Glu Leu Phe
245 250 255
Tyr Val Glu Glu Leu Arg Ala Leu Gln Lys Ala Met Pro Ser Leu Asp
260 265 270
Val Gln Val Ala Val Val Asn Ala Thr Glu Ala Asn Gly Val Ala Lys
275 280 285
Gly Thr Val Ile Asp Leu Met Arg Ala Glu Leu Glu Lys Leu Arg Gly
290 295 300
Ala Pro Asp Ile Tyr Leu Cys Gly Pro Pro Gly Met Ile Glu Ala Ala
305 310 315 320
Phe Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gly Val Pro Lys Glu Gln Val Tyr Leu
325 330 335
Glu Lys Phe Leu Ala Ser Gly
340
<210> 8
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S184A
<400> 8
atgtaccaga tcgtcatcga aactgaggac ggagaaacct gttcgttcga atgcggaccg 60
agcgaggacg tcatttccgc ggggcttcgt cagagcgtca ttctgctcgc ctcctgccgc 120
gccggcggct gcgcgacctg caaggccgat tgcacggatg gcgaatacga gctcatcgac 180
gtcaaggttc aggctctgcc gccggacgag gaggaggacg gaaaggttct gctgtgccgc 240
acctttccgc gcagcgacct tcatctcatc gtgccctaca cctatgatcg catctccttc 300
gaggcgatcc agaccaattg gctcgccgag atcgtcgaat gcgatcgcgt gtcgtccaat 360
gtcgtgcggc tcctgctgca gcccctcacc gcagatggcg cagcgcccat ctcgttgaac 420
ttcgctcccg ggcaattcgt cgacatcgaa attcccggca cgcatacgcg ccgctcctat 480
tccatggcct cggtcgcgga ggatggtcgg ctcgaattct tcatccgcct gctgccggac 540
ggcgctttcg ccaattatct gcgcacgcag gcgagcgtcg gccagcgcgt cgcgctgcgc 600
gggccggccg gctccttctt tctgcacaag agcgagcggc cgcgcttctt cgtcgccggc 660
ggcacgggcc tctcacccgt tctgtcgatg attcggcaat tgaaaaagga agccgatccg 720
caaccggcga ccttgttctt cggcgtcacc aattatgagg agctcttcta tgtcgaggag 780
ctgagggcgc tgcagaaggc catgccgagc ctcgatgtgc aggtggcggt cgtcaatgcg 840
acggaggcga atggcgtcgc caagggaacg gtcatcgatc tcatgcgcgc cgagctcgag 900
aagctgcgcg gcgcgccgga catctacctt tgcggtccgc ccggcatgat cgaggccgcc 960
ttcgacgccg cagcgacggc cggcgttccc aaggagcagg tctatctcga gaaattcctg 1020
gcgagcggct ga 1032
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 161번째 세린(Serine, S)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환된 것을 특징으로 하는 메탄 모노옥시게나제 환원효소(methane monooxygenase reductase) 변이체.
- 제1항에 있어서,
상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체는 탄화수소에 대한 효소 활성이 있으며, 상기 탄화수소는 탄소수 1 내지 3인 것을 특징으로 하는 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체. - 제2항에 있어서,
상기 탄화수소는 메탄 또는 프로필렌인 것을 특징으로 하는 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제4항의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
- 제5항의 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제6항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 형질전환체의 배양물로부터 메탄 모노옥시게나제 환원효소를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체의 생산 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탄화수소 산화물 생산용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체를 탄화수소와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 탄화수소 산화물의 생산 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 메탄 모노옥시게나제 환원효소 변이체와 탄화수소의 반응 생성물로부터 탄화수소 산화물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 탄화수소 산화물의 생산 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210132610A KR102699320B1 (ko) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210132610A KR102699320B1 (ko) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230049441A KR20230049441A (ko) | 2023-04-13 |
| KR102699320B1 true KR102699320B1 (ko) | 2024-08-30 |
Family
ID=85978937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210132610A KR102699320B1 (ko) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102699320B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150104854A1 (en) * | 2013-10-15 | 2015-04-16 | Mogene Lc | Metabolically engineered methanotrophic, phototrophic microorganisms |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003027301A (ja) * | 2001-07-17 | 2003-01-29 | Takanao Koyama | 肌の密着をふせぎ吸汗性をよくしたパンツ |
-
2021
- 2021-10-06 KR KR1020210132610A patent/KR102699320B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150104854A1 (en) * | 2013-10-15 | 2015-04-16 | Mogene Lc | Metabolically engineered methanotrophic, phototrophic microorganisms |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPWO2003027301 A1 |
| NCBI Reference Sequence WP_218805996.1(2021.07.22.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230049441A (ko) | 2023-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101814588B1 (ko) | 변이 효소 및 그 용도 | |
| JP5908729B2 (ja) | 安定性が向上したｎａｄｈオキシダーゼ変異体とその利用法 | |
| Morales‐Ríos et al. | A novel 11‐kDa inhibitory subunit in the F1FO ATP synthase of Paracoccus denitrificans and related α‐proteobacteria | |
| MXPA03011813A (es) | Metodo para la modificacion de enzimas y variantes de oxido reductasa. | |
| KR102699320B1 (ko) | 수용성 메탄 모노옥시게나제의 환원효소 변이체 및 이를 이용한 탄화수소의 산화물 생산 방법 | |
| CN115074338B (zh) | 突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法 | |
| CN113774039B (zh) | 重组型dna聚合酶及其应用 | |
| CN106318917B (zh) | 天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用 | |
| KR20200045978A (ko) | 신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 | |
| CN116426546A (zh) | 重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用 | |
| WO2019230614A1 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼの改良 | |
| CN108624568B (zh) | 变异黄嘌呤脱氢酶及其应用 | |
| CN112851750B (zh) | 连接肽、含有连接肽的融合蛋白及其应用 | |
| CN112680425B (zh) | 一种醇脱氢酶突变体及其应用 | |
| JP6514849B2 (ja) | 低温における酵素活性を向上させた好熱菌由来酵素の改変体の取得方法、及び低温における酵素活性が向上しているサーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体 | |
| EP4438732A1 (en) | Novel promoter variant for constitutive expression and use thereof | |
| KR102424603B1 (ko) | 알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 | |
| EP1231266A1 (en) | Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene | |
| JPWO2006043555A1 (ja) | 生体高分子生成のための還元酵素変異体 | |
| EP4257689A1 (en) | Novel promoter variant for constitutive expression and use thereof | |
| CN112055751B (zh) | 修饰型酯酶和其用途 | |
| KR20230100925A (ko) | 항시발현용 신규 프로모터 변이체 및 이의 용도 | |
| JP4182206B2 (ja) | 高活性グリセロール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ及び高活性グリセロールデヒドロゲナーゼ | |
| CN107531763B (zh) | 一种用于生物合成异戊二烯和异戊烯的酶及其突变体 | |
| CN117230031A (zh) | 羰基还原酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |