KR102695049B1 - 대형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노디스크 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대형 막 구조화 단백질(large membrane scaffold protein)을 포함하는 나노디스크에 관한 것이다. 본 발명에서는 나노디스크의 막 구조화 단백질(membrane scaffold protein)을 대형화하는 것으로 나노디스크의 항바이러스 효능을 향상시킬 수 있었다.

Description

대형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노디스크{Nanodisk with large membrane scffold protein}
본 발명은 대형 막 구조화 단백질(large membrane scaffold protein)을 포함하는 나노디스크에 관한 것이다.
지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘(amantadine) 또는 리만타딘(rimantadine)계열의 M2 이온 채널 억제제(M2 ion channel inhibitor)와 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르(zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고, 이러한 저항성 바이러스는 어린이에게서 빈번히 발생하고 있다고 알려져 있다.
상기와 같은 기존 바이러스 감염증 치료의 문제점이 없는 새로운 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제1334143호에는 폴리갈라 카렌시움(Polygala karensium) 추출물 및 이로부터 분리된 잔톤계 화합물을 함유하는 감기, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 신종플루의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 제제는 항-바이러스 활성이 낮아서, 신종플루에 대한 효과적인 예방 또는 치료효과를 나타내지는 못하고 있다.
최근 나노디스크의 새로운 활용방법으로 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염을 예방하거나 감염된 바이러스의 증식을 억제하는 등의 항바이러스제로서의 가능성에 대해 보고되고 있으며, 상기 나노디스크는 나노천공자(Nano-perforator, NP)라고 부르기도 한다. 상기 바이러스는 지질이중층 외피에 있는 막 결합 단백질을 이용하여 숙주세포에 감염되는데, 나노천공자를 이용하면 상기바이러스의 감염경로를 교란시키거나 바이러스의 표면에 직접적으로 구멍을 내어 바이러스의 증식을 억제할 수 있다. 아만타딘(Amantadine), 오셀타미비르(Oseltamivir, 상품명 타미플루), 자나미비르(Zanamivir, 상품명 리렌자) 등 기존에 개발되어 있는 바이러스 치료제들은 제한된 효과만 나타내며, 바이러스가 내성을 갖게 되거나 저항성 바이러스가 나타나는 등 효과적인 치료에는 제한이 있는 상황이다. 상기 나노천공자는 생체 내에서 특이적 반응을 유발하는 물질을 포함하지 않아 안전하며, 다양한 변종 바이러스에 공통적으로 적용이 가능하다는 장점을 가지고 있어 활발한 연구가 이루어 지고 있다.
이에, 본 발명자들은 나노천공자를 다양하게 변형함으로써 항바이러스 효능을 더욱 향상시키고 열 안정성을 증대시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항 바이러스 효과가 증대된 나노천공자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 나노천공자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 인지질을 사용하여 형성된 납작한 환형의 지질 이중층 (lipid bilayer); 및 상기 지질 이중층의 외주면을 둘러싸는 막 구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP)을 포함하는 나노디스크를 함유하되, 상기 막 구조화 단백질은, 막 구조화 단백질이 복수 개 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 나노디스크는 바람직하게 PEG (polyethylene glycol)가 막 구조화 단백질에 페길화된(pegylation) 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 나노디스크는 바람직하게 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 바이러스는 바람직하게 코로나바이러스 과(Family Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 바이러스인 것이 좋다.
본 발명에서는 막 구조화 단백질을 대형화시키는 것을 통해 나노디스크의 항 바이러스 활성을 향상시킬 수 있었다.
도 1은 환형 막 구조화 단백질(esMSP) 플라스미드의 구조 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 정제된 esMSP 단백질 및 이의 환형 구조를 확인한 도이다.
도 3은 솔테이즈를 이용한 환형 막 구조화 단백질 정제과정과 esMSP 단백질 정제과정을 비교하고, 해당 방법을 통해 생산한 단백질 esMSP을 LAL assay를 통해서 1 mg 당 내독소 농도를 측정한 도이다 (대조군 ApoA-1 또는 MSP1E3D1).
도 4는 esMSP의 열 안정성을 분석한 도이다.
도 5는 eslMSP 단백질의 구조 모식도를 나타낸 도이다.
도 6은 정제된 eslMSP 단백질 및 이의 환형 구조를 확인한 도이다.
도 7은 MSP-CfaN 및 CfaC-MSP의 trans-splicing 결과물을 확인한 도이다:
화살표: MSP-MSP 결합체.
도 8은 항체에 결합 가능한 FcMSP의 구조 모식도를 나타낸 도이다.
도 9는 정제된 MSP 단백질 (좌:32.6 KDa) 및 Fc-결합 도메인을 포함하는 FcMSP (우:35.2 KDa)을 확인한 도이다.
도 10은 Fc-eslMSP 단백질의 구조 모식도를 나타낸 도이다.
도 11은 Fc-eslMSP 단백질의 정제 및 Fc-eslND의 형성을 확인하기 위한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 NP(ND) 및 esNP(esND)의 SEC 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 ND와 eslND의 SEC 및 DLS 결과 및 비교 모식도를 나타낸 도이다.
도 14는 이중 나노천공자(Di-ND 또는 Di-NP)의 형성을 확인하기 위한 SEC, SDS-PAGE 및 DLS 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 FcND의 SEC 및 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 Fc-eslND의 SEC 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 이황화결합된 이중환형나노천공자인 esdND의 형성 조건을 확인하기 위한 DLS 및 SEC 결과를 나타낸 도이다:
esND-TCEP_Di-form: esMSP의 정제와 ND의 형성 도중 환원제를 첨가하지 않은 이황화결합된 이중 나노천공자;
after TCEP treat: 이황화결합된 이중환형나노천공자인 esdND를 환원제인 TCEP을 처리한 후 분석한 DLS 결과;
esND-TCEP single-form: esMSP의 정제와 ND의 형성 도중 환원제인 TCEP을 첨가한 후 형성된 단일 나노천공자; 및
after TCEP treat: 단일 나노천공자인 esND를 환원제인 TCEP을 처리한 후 분석한 DLS 결과.
도 18은 이황화결합된 이중환형나노천공자인 esdND의 형성을 확인하기 위한 도 14의 결과를 요약한 esND (essND로 표기) 및 esdND의 제조 모식도이다.
도 19는 이중환형나노천공자의 향상된 항바이러스 효능을 확인하기 위한 CPE(Cytopathic effect) 억제 효과를 확인한 도이다:
상단: 단일 나노천공자 대비 이황 결합된 이중환형나노천공자 (esdNPTG)의 증대된 항바이러스 효능; 및
하단: 단일 나노천공자 대비 공유결합된 이중환형나노천공자 (Di-NPTG)의 증대된 항바이러스 효능.
도 20은 공유결합된 이중 나노천공자 (Di-NPTG)에 의한 시간에 따른 바이러스 CPE 억제 효과를 광학현미경을 통해 확인한 도이다.
도 21은 대조군인 작은 크기의 NDTG 대비 지름이 커진 eslNDTG에 의한 향상된 항바이러스 CPE 억제 효과를 비교한 도이다.
도 22는 FcND에 의한 Microneutralization assay를 확인한 도이다.
도 23은 Plaque reduction assay에서 항바이러스항체 혹은 항바이러스항체와 각 구조의 나노천공자를 혼합하여 PR/8 H1N1 인플루엔자 감염증이 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 24는 크기배제 크로마토그래피 (SEC)를 통한 ND 및 esdND의 열 내구성을 비교한 도이다.
도 25는 ND, esdND, eslND와 PEG-eslND (혹은 PEGylated eslND)의 트립신 내구성을 비교한 도이다.
도 26은 형광염료를 혼합하여 제조한 나노천공자들을 주입한 뒤, 시간이 지남에 따라 마우스 생체 내에서 남아있는 분포된 나노천공자들의 형광값을 촬영하여 분석한 도이다:
a: 마우스 몸 전체의 나노천공자 형광값을 촬영한 도; 및
b: 주입 후 시간에 따른 마우스의 흉부 형광값을 계산하여 시간에 따른 각 구조의 나노천공자들의 형광값을 비교한 결과.
도 27은 FcND, Fc-eslND 및 PEGylated Fc-eslND의 안정성을 비교한 도이다:
a: FcND와 Fc-eslND의 열 내구성의 비교 결과; 및
b: FcND와 PEGlyated Fc-eslND의 트립신 내구성의 비교 결과.
도 28은 항체와 항체결합 나노천공자의 결합 측정 방법 모식도를 나타낸 도이다.
도 29는 표면플라즈마공명법을 이용한 항체와 FcND의 결합 양상을 분석한 도이다.
도 30은 Dot blot assay를 이용한 FcND 및 Fc-eslND의 항체 결합 양상을 분석한 도이다:
a: Dot blot assay의 실험 과정에 대한 모식도; 및
b: Dot blot assay의 실험 결과.
도 31은 PR/8 H1N1 인플루엔자 감염 후 NPG 또는 esdNPG를 0.5 mg/kg의 농도로 마우스 생체 내로 주입하였을 때, 감염 후 시간에 따른 생존률 및 몸무게 변화를 분석한 도이다.
도 32은 PR/8 H1N1 인플루엔자 감염 후 NPG 또는 PEG-eslNPG를 2.5 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 농도로 마우스 생체 내로 주입하였을 때, 감염 후 시간에 따른 생존률 및 몸무게 변화를 분석한 도이다.
도 33은 PR/8 H1N1 인플루엔자 감염 후 항바이러스 항체 또는 항바이러스 항체와 pFc-eslNP를 혼합하여 마우스 생체 내로 주입하였을 때, 감염 후 시간에 따른 생존률 및 몸무게 변화를 분석한 도이다.
도 34는 본 발명에서 제공하는 다양한 나노천공자들의 시퀀스와 구조를 요약하여 모식화한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다. 또한 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
본 발명은 본 발명의 발명자의 선행특허인 출원번호 제10-2017-0089655호를 참고하고, 이의 서열을 포함한 개시가 본 명세서에 참조로서 편입된다.
일 측면에서, 본 발명은 막 구조화 단백질(membrane scaffold protein)의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합되고 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
일 구현예에서, MSP는 MSP1 또는 MSP2일 수 있다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 인테인의 C-말단 도메인, 링커, 막 구조화 단백질 및 인테인의 N-말단 도메인을 순차적으로 포함할 수 있으며, 이를 암호화하는 염기서열은 도 1의 구조일 수 있고, 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS의 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 반복된 2개 이상의 막 구조화 단백질을 포함할 수 있으며, 인테인의 C-말단 도메인, 2개 이상의 막 구조화 단백질 및 인테인의 N-말단 도메인을 순차적으로 포함할 수 있고, 이를 암호화하는 염기서열은 도 5의 구조일 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드, 또는 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 플라스미드는 두 개의 나노천공자가 공유결합으로 연결된 이중 나노천공자 제작용 플라스미드일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 나노천공자용 막 구조화 단백질에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 플라스미드에 의해 암호화되는 N 말단과 C 말단이 접합된 환형 막 구조화 단백질(end-spliced membrane scaffold protein, esMSP)에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 환형 막 구조화 단백질은 본 발명의 융합 단백질의 인테인의 N-말단 도메인 및 인테인의 C-말단 도메인이 결합하여 형성된 인테인이 제거됨으로써 양 말단이 연결되어 환형을 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 환형 막 구조화 단백질은 말단에 인테인이 융합되어 있는 막 구조화 단백질을 암호화하는 플라스미드를 발현시키고 단백질 정제시 환원제를 처리하여 수득할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 환형 막 구조화 단백질(esMSP)는 선형의 막 구조화 단백질(MSP)보다 더 낮은 내독소 농도를 가지고, 높은 열 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
일 측면에서, 본 발명은 두 개의 환형 막 구조화 단백질이 이황화 결합으로 연결된, 이중 환형 막 구조화 단백질에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 환형 막 구조화 단백질은 말단에 인테인이 융합되어 있는 막 구조화 단백질을 암호화하는 플라스미드를 발현시키고 환원제를 처리하지 않고 단백질을 정제함으로써 수득할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 막 구조화 단백질이 2개 이상 연이어 포함된 대형 환형 막 구조화 단백질에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 대형 환형 막 구조화 단백질은 본 발명의 환형 막 구조화 단백질에 비해 크기가 증가된 것일 수 있으며, 환형 막 구조화 단백질에 비해 직경이 1.2 내지 5배 증가한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 대형 환형 막 구조화 단백질은 본 발명의 반복된 2개 이상의 막 구조화 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현 및 정제함으로써 수득할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 환형 막 구조화 단백질들은 인테인의 N-말단 도메인 및 인테인의 C-말단 도메인이 결합하여 인테인으로 형성된 후 제거되는 트랜스-인테인 스플라이싱(trans-intein splicing)을 통해 양 말단이 공유결합으로 연결되어 (도 3의 초록색 부분) 환형을 이룰 수 있으며, 트랜스-인테인 스플라이싱은 인테인의 N-말단 도메인과 인테인의 C-말단 도메인이 결합되어 완전한 형태의 인테인 결합체가 되면 인테인 결합체는 스플라이싱되어 제거되고, 인테인 결합체 외곽에 있던 익스테인 도메인들 (융합 도메인의 양 말단)을 펩티드 결합으로 연결하는 것을 말한다.
일 측면에서, 본 발명은 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현 및 정제하여 얻은, 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질, 및 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현 및 정제하여 얻은, 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서, 인테인(intein)은 단백질이 완성된 형태의 모습으로 접히기(folding) 전에, 단백질 전구체의 일부가 제거되는 번역 후 과정인 단백질 스플라이싱(splicing) 과정에서 잘려져 나가는 영역으로, 일부 단백질에서는 번역 후 전구체 단백질이 자가촉매반응에 의해 일부가 잘려나가고 나머지 부분은 재결합하여 성숙 단백질이 되는 것으로 알려져 있다. 이때 잘려진 영역을 인테인(intein), 성숙 단백질로 남는 영역을 익스테인(extein)이라고 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 환형의 막 구조화 단백질은 말단에 인테인의 도메인을 포함하고 있어 환형의 구조로 조립될 수 있으며, 인테인 없이 솔테이즈를 이용하여 환형으로 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 하기의 방법을 이용하여 나노천공자에 포함될 막 구조화 단백질의 단백질 공학적 개선을 도모할 수 있다:
*1) 솔테이즈 A(sortase A)에 의한 단백질 결합: 박테리아 유래의 트랜스펩티데이스(transpeptidase)인 솔테이즈 A에 의한 비가역적 결합 반응으로, 솔테이즈 A가 LPXTG의 특정 아미노산 서열을 인식하여 트레오닌(threonine)과 글라이신(glycine) 사이를 잘라내 세포 표면에 결합시킨다. 이러한 특성은 단백질 공학에서 널리 이용되는 유용한 방법이며, 결합시키고자 하는 두 단백질에 각각 LPXTG 서열과 두 개 이상의 연속된 글라이신 서열을 갖도록 하여 쉽게 원하는 결합을 만들어낼 수 있다. 나노천공자의 단백질 공학에 적용되는 솔테이즈는 Sulfobacillus, Rubrobacter, Peptoniphilus, Shewanella, Faecalibaculum, Colwellia, Staphylococcus, Methylorubrum, Gaiella, Bacillus, Clostridium, Blautia, Enterococcus, Streptococcus, Streptomyces, Lactobacillus, Listeria, Pediococcus 또는 Corynebacterium에서 유래할 수 있으며 이에 한정되지 않는다; 및
2) 트랜스-인테인 스플라이싱(trans-intein splicing): 막 구조화 단백질 C-말단과 N-말단에 연결에 필요한 단백질 도메인 혹은 펩티드 조각을 링커와 함께 추가하였으며, 그 중, 단백질 도메인은 Cfa, Npu, Ssp, Rma, Ppu 등 하기 표 1에 해당하는 DnaE 또는 DnaB 속에 속하는 트랜스-인테인을 적용하였으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 트랜스-인테인들은 발현이 될 시에는 각기 분리된 형태로 발현되나 N-말단의 도메인(Int-C)과 C-말단의 도메인(Int-N)이 만나 결합되어 하나의 완전한 형태의 인테인 결합체가 되면 인테인 결합체는 스플라이싱되어 떨어져 나가게 되고 이 때, 인테인 결합체 외곽에 있던 익스테인(extein)들을 펩티드 결합으로 연결하여 하나의 단백질로 이어지게 된다.
본 발명의 환형 막 구조화 단백질 제작에 상기 두 가지 방법이 모두 사용될 수 있으나, 본 발명에서 하기 실시예들은 트랜스-인테인 스플라이싱 방법을 통해 대장균에서 이미 환형의 MSP 단백질로 만들어져서 나오기 때문에, 솔테이즈를 이용하여 시험관 내에서 별도로 환형 MSP를 만드는 방법에 비해 효소 비용, 수율, 속도 등의 문제를 극복한 장점이 있다 (도 3 참조). 또한, 본 발명의 도 3의 방법으로 재조합 대장균에서 만들어진 esMSP는 MSP의 원형인 아포리포단백질 A1에 비해 1/7, 일반 MSP에 비해 1/2.5의 내독소가 부착되어 있으므로 내독소로 인한 여러 부작용을 미연에 방지할 수 있는 장점이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 환형 막 구조화 단백질(esMSP, end-spliced membrane scaffold protein)을 포함하는 나노천공자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 솔테이즈를 이용하여 막 구조화 단백질의 양 말단을 접합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 페길화될 수 있으며, 이로 인해 구조체의 안정성이 향상되어 분해효소 저항성이 향상될 수 있고, 생체 안정성이 향상될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 지질이중층 나노디스크(lipid bilayer nanodisc)와, 상기 나노디스크의 외주면을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함할 수 있으며, 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 나노천공자는 바이러스의 지질이중층 외피를 천공할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 바이러스는 지질이중층의 외피(또는 막)를 가지는 바이러스일 수 있으며, 코로나바이러스 과(Family Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 바이러스일 수 있고, 인플루엔자 바이러스인 것이 더욱 바람직하다.
일 실시예에서, 나노천공자를 구성하는 막 구조화 단백질의 아미노말단(N-terminus)과 카르복실말단(C-terminus)이 공유결합으로 양말단이 접합되어 환형구조를 이루게 한 상기 막 구조화 단백질을 사용한 나노천공자는 기존 선형 막 구조화 단백질을 이용한 나노천공자보다 열과 고농도에서의 응집으로 인한 구조 손상에 대해 안정적임을 확인하였다. 환형구조로 단백질 양 말단을 연결하기 위한 방법은 상기 트랜스-인테인 스플라이싱을 이용한 방법을 포함한 기타 단백질 조작 기술 또한 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자는 나노천공자가 가지고 있는 항바이러스 효능을 증대할 수 있다. 상기 환형 나노천공자를 구성하는 환형 막 구조화 단백질은 양 말단이 결합되어 있는 상태이기 때문에 기존 나노천공자보다 열에 강하며 안정적이고 일정한 크기와 고농도에서의 응집에 강하므로, 투입한 생체의 온도, 그리고 각종 단백질 분해효소에 의해 분해 또는 응집되는 현상이 기존의 나노천공자보다 보다 덜 발생하며, 그로 인해 항바이러스 효능도 높아진다. 또한, 트랜스 인테인을 이용한 환형 막 구조화 단백질은 기존 선형 막 구조화 단백질 및 아포리포단백질보다 내독소 수치가 낮았으며, 특히 아포리포단백질보다 1/10인 것으로 확인되었다. 이는 고열, 두통, 패혈증의 부작용을 유발하는 내독소가 상기 환형 막 구조화 단백질을 이용한 환형 나노천공자에 오염될 가능성을 현저하게 낮출 수 있다 (도 3).
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 대형 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 페길화될 수 있으며, 이로 인해 구조체의 안정성이 향상되어 분해효소 저항성이 향상될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 나노천공자에 PEG를 부착하면 나노천공자의 열안정성이 획기적으로 증가함과 동시에 단백질분해효소(예, 트립신)에 대한 내성이 극적으로 증대하였다. 트립신 등의 단백질 분해효소는 나노천공자의 구조를 파괴하여 항바이러스 능을 잃어버리게 하는데, 이에 대해 내성을 가지게 된 PEG가 부착된 나노천공자는 뛰어난 항바이러스 활성을 가지게 된다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 지질이중층 나노디스크(lipid bilayer nanodisc)와, 상기 나노디스크의 외주면을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함할 수 있으며, 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 대형 환형 막 구조화 단백질은 둘 이상의 막 구조화 단백질이 융합되어 연결된 환형 막 구조화 단백질일 수 있으며, 이를 포함하는 나노천공자는 직경 15 nm 이상의 표면적이 증대된 나노천공자 (또는, 대형 환형 나노천공자)(end-spliced large ND, eslND)일 수 있다.
일 실시예에서, 둘 이상의 막 구조화 단백질을 환형구조로 연결하여 나노천공자의 면적을 넓히면 바이러스 외피 손상 능력이 향상됨을 확인하였으며, 상기 막 구조 단백질을 이용한 나노천공자의 입자크기들이 일정하고, 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염을 예방, 혹은 감염된 바이러스의 증식을 억제하는 등 항-바이러스 효과가 향상됨을 확인하였다.
본 발명에서 둘 이상의 막 구조화 단백질이 연결되어 크기가 증가된 대형 환형 나노천공자는 바이러스 막과의 융합을 통한 천공 효과가 용이해져 항-바이러스 효과 또한 증가함을 확인하였다. 상기 환형 나노천공자를 위한 플라스미드에 막 구조화 단백질 유전자가 삽입되었으며, 오버랩 클로닝 방법으로 제작되었으나 이에 국한되지 않는다. 또한 본 발명에서 사용된 MSP1E3D1 단백질에 한정되지 않는 다양한 막 구조화 단백질이 적용 가능하다.
일 구현예에서, 상기 환형 나노천공자는 10 내지 100 nm, 더욱 바람직하게는 15 내지 50 nm의 직경을 가질 수 있으나, 트랜스-인테인을 이용한 막 구조화 단백질을 이용한 환형 나노천공자로서의 기능을 할 수 있는 크기라면 이에 한정되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 이중 나노천공자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 이중 나노천공자는 이황화 결합(disulfide bond)으로 두 개의 나노천공자가 연결된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자는 페길화될 수 있으며, 이로 인해 구조체의 안정성이 향상되어 분해효소 저항성이 향상될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자는 지질이중층 나노디스크(lipid bilayer nanodisc)와, 상기 나노디스크의 외주면을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함할 수 있으며, 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수 있고, 두 개의 나노천공자가 각기 다른 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 두 개의 나노천공자가 공유결합으로 연결된 이중 나노천공자에 관한 것으로, 본 발명의 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 포함하는 나노천공자 및 본 발명의 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 포함하는 나노천공자가 공유결합으로 결합된 이중 나노천공자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질과 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질은 공유결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 두 나노천공자의 인테인의 N-말단 도메인 및 인테인의 C-말단 도메인이 결합하여 형성된 인테인이 제거되어 두 나노천공자가 공유결합될 수 있으며, 공유결합은 이황화 결합일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 두 개의 나노천공자의 각각의 막 구조화 단백질은 둘 이상의 막 구조화 단백질이 반복된 막 구조화 단백질을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이중 나노천공자는 이황결합, thioether 결합, 소테이즈에 의한 결합, 인테인에 의한 결합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자는 페길화될 수 있으며, 이로 인해 구조체의 안정성이 향상되어 분해효소 저항성이 향상될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자는 지질이중층 나노디스크(lipid bilayer nanodisc)와, 상기 나노디스크의 외주면을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함할 수 있으며, 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수 있고, 두 개의 나노천공자가 각기 다른 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 두 개의 나노천공자가 연결된 이중 나노천공자 구조를 제공하기 위해 하기 트랜스-인테인 스플라이싱을 이용하였다. 2,3 시알산(sialic acid)을 가진 수용체를 인테인의 N-말단 도메인(Int-N)가 연결된 나노천공자에 삽입하고 2,6 시알산을 가진 수용체를 Int-C가 연결된 나노천공자에 삽입하여 두 개의 다른 수용체를 가진 나노천공자 두 종류를 제작하였다. 수용체와 트랜스-인테인 도메인을 가진 나노천공자의 조합은 이에 한정되지 않는다. 이 두 나노천공자를 트랜스-스플라이싱을 통해 하나의 형태로 연결된 이중 나노천공자 구조체를 제작하였다. CPE 억제 분석을 통해 나노천공자 혹은 이중 나노천공자 구조체가 MDCK 세포에 대한 인플루엔자 바이러스 감염 억제 효능을 확인한 결과, 제작된 이중 나노천공자는 위의 여러 인플루엔자 바이러스에 대해 항-바이러스 효능을 보였고, 그 효능은 단일 나노천공자를 사용했을 때보다 월등하게 높아짐을 알 수 있었다. 두 개의 나노천공자를 연결하는 방법 또한 상기 트랜스 스플라이싱에 한정되지 않으며, 하기 솔테이즈를 이용한 결합, 이황결합, maleimide를 이용한 thioether 결합 등의 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 형질도입된 E. coli를 이용하여 Int-C과 Int-N이 추가된 막 구조화 단백질을 이전에 실시했던 정제방법을 통해 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질들을 이용하여 각각 Int-N과 Int-C 도메인을 포함하는 나노천공자를 제작하였고, 트랜스-스플라이싱 효율을 높이기 위해 2 mM의 TCEP을 처리한 후 두 개의 나노천공자들을 혼합하여 주었다. 이는 트랜스-스플라이싱 과정에서 시스테인 아미노산의 잔기인 티올기가 이황화 결합을 이루지 않고 free-티올기를 유지하는 것이 중요하기 때문이다. 크기배재 크로마도그래피(SEC)을 통해 분석한 결과 단일 나노천공자들을 연결하여 만든 이중 나노천공자 구조체는 단일 나노천공자보다 약 2배의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다. 또한 SDS-PAGE 결과 SEC을 통해 분리된 이중 나노천공자는 두 개의 막 구조화 단백질이 연결된 형태로 이루어져 있는 것이 확인되었다.
일 구현예에서, 나노천공자에 포함된 지질은 인지질을 포함할 수 있고, 막 구조화 단백질은 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 표면 항원은 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA) 또는 뉴라미니다제(Neuraminidase;NA)일 수 있다.
일 구현예에서, 수용체는 시알산을 포함하는 당지질 및 시알산을 포함하는 당단백질일 수 있으며, 시알산을 포함하는 당지질은 강글리오사이드(ganglioside) 또는 폴리시알산(polysialic acid)일 수 있다.
일 구현예에서, 지질이중층 나노디스크에 포함된 지질 및/또는 표면 항원에 대한 수용체와 상기 막구조단백질의 몰비(molar ratio)가 10:1 내지 800:1일 수 있다.
일 실시예에서, 이중 나노천공자 구조체가 여러 종의 바이러스 감염에 대해 억제능력이 있을 뿐만 아니라 기존의 나노천공자가 특정 인플루엔자 바이러스 종에 대해서 보였던 항-바이러스 효능보다 더 향상된 효능을 보이는 것을 확인하였다. 나노천공자에 삽입된 수용체는 인플루엔자 바이러스 맴브레인의 헤마글루티닌 단백질에 대해서 결합력을 띈다. 이러한 결합력에 따라서 인플루엔자 바이러스 감염 기작을 억제하는 특성을 띄는데, 단일 나노천공자 구조체에 비해서 이중 나노천공자 구조체는 한 구조체당 삽입된 수용체의 수가 더 많기 때문에 바이러스에 대한 결합력 또한 증가하게 된다. CPE 억제 분석 결과에서도 동일 수용체 농도에서 단일 나노천공자보다 이중 나노천공자가 2배 이하의 IC50 값을 갖는 것이 확인되었다. 이에 이중 나노천공자가 물리적인 특성으로 인해 나노천공자보다 바이러스에 대한 증가된 결합력을 갖는 것으로 추측되어진다.
본 발명에서 용어 "나노천공자(Nano-perforator, NP) "란，지질이중층 나노디스크(nanodisc)와，상기 지질이중층의 외주면을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함하며, 바이러스 외피를 천공하는 기능을 수행할 수 있는 나노 스케일의 물질을 의미한다. 상기 나노천공자는 원반(disc) 형태를 갖는 단층 (unilameliar)의 지질이중층, 즉 지질이중층 나노디스크를 포함하고，상기 지질이중층의 외주면(outer circumference surface)을 둘 이상의 막 구조화 단백질，예를 들어 2개의 막 구조화 단백질로 둘러싼 형태의 복합체일 수 있다. 본 발명의 용어 "지질이중층 나노디스크(nanodisc)”란 지질이중층을 포함하는 단층(unilamellar)의 원반(disc) 형태 물질을 의미하며，상기 지질이중충의 양 면이 모두 외부에 노출된 열린 계(open system)를 갖는 것을 특징으로 한다. 막 구조화 단백질이란 고밀도 지단백질(High density lipoprotein)의 주요 구성요소인 아포리포단백질 A1 (Apolipoprotein A1, ApoA-1)의 변형된 형태이며, 소수성인 표면은 지질과 맞대고 있고 친수성인 표면은 밖으로 위치하여 안정적인 원판형태를 이룰 수 있도록 해준다. 막 구조화 단백질의 헬릭스 개수에 따라 다양한 크기의 나노디스크를 제작할 수 있으며, 주로 이용되는 막 구조화 단백질에는 MSP1D1, MSP1D1dH5, MSP1E3D1, MSP2N2 등이 있으나 이에 국한되지 않는다. 나노디스크는 다른 계면활성제의 도움 없이도 지질을 안정적으로 수용액에 잘 녹아 들게 할 수 있으며, 이를 이용하여 지질이중층에 막 단백질을 삽입하여 수용액내에서도 막 단백질의 연구가 용이하다는 장점을 가지고 있다. 상기 지질은 예를 들어, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스타티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이중층을 구성할 수 있는 지질이면 이에 한정되지 않는다. 상기 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 DOPC (1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC (1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), C13PC, DDPC (1, 2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC (1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1, 2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1, 2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC (Egg phosphatidylcholine), MSPC (1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PMPC (1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PSPC (1-Palmitoyl-2-strearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SMPC (1-Strearoyl-2-nyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 SPPC (1-Strearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있으며, 상기 포스파티딜글리세롤은 DMPG (1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DPPG (1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DSPG (1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), P0PG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DEPG (1, 2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DLPG (1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DOPG(1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]) 또는 DSPG (1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])일 수 있고, 상기 포스파티딜에탄올아민은，DMPE (1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) ,DPPE (1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycerοl-3-phosphoethanolamine), DSPE(1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE (1, 2-Dioleoyl-sn-glycerο-3-phosphoethanolamine), DEPE (1, 2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1, 2-Dilauroyl-sn-glycerο-3-phosphoethanolamine) 또는 POPE (1-Pa lmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerο-3-phosphoethanolamine), 상기 포스파티딜세린은，DOPS (1，2-Diol eoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DLPS (1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DMPS (1, 2-Di myristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DPPS (1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DSPS (1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine) 또는 POPS 일 수 있다.
본 발명에 따른 나노천공자는 나노디스크에 더하여, 상기 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 나노천공자는 1종 또는 2종 이상의 수용체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 지질이중층을 둘러싼 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자를 나노디스크로도 기재하였다. 즉, 본 발명에서 용어 “나노천공자(Nano-perforator, NP)" 는 "나노디스크(nanodisc, ND)"와 서로 교차 또는 혼용하여 사용하였다. 다만, 나노디스크는 인지질 나노입자의 구조적 측면, 나노천공자는 항바이러스 활성에 대한 기능적 측면에 대해 언급할 때 사용하고자 하였다. 또한, 수용체가 포함되거나 포함되지 않은 경우를 비교하는 실험의 경우, 수용체를 포함하지 않은 것은 NP, 수용체 (예컨대, GD1a, GT1b 및 GM1이 주요하게 포함된 강글리오사이드 집합체인 TG(total ganglioside))를 포함한 것을 NPTG (또는 NDTG)로 표시하였다. 그러나 이같은 구분이 없는 경우는 구조적인 특성만을 강조하기 위한 경우이다.
일 구현예에서, 상기 지질이중층 나노디스크를 구성하는 지질은，상기 인지질에 추가하여，중성지방，예를 들면 트리글리세라이드，콜레스테를(cholesterol) 또는 이의 유도체，및 당지질(saccharolipid), 예를 들어 강글리오사이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "지질이중층의 외피(또는 막)를 가지는 바이러스" 란，바이러스 중에서 지질이중층의 외피를 갖는 바이러스를 의미하는데，상기 지질이중층에는 상기 바이러스의 감염 및 증식에 관여하는 항원 단백질이 막결합 단백질 형태로 포함되어 있다. 상기 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스는 본 발명에서 제공하는 나노천공자가 항-바이러스 활성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나，예를 들어，코로나바이러스 과(Family Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae) 등의 과(family)에 속하는 바이러스가 될 수 있고，다른 예로서, 버니아비리데(Bunyaviridae)에 속하는 시놈브레한타바이러스(Sin Nombre Hantavirus) 등; 코로나비리데(Coronaviridae)에 속하는 다양한 급성 호흡기 증후군에 관여하는 코로나바이러스(Coronavirus) 등; 필로비리데(Filoviridae)에 속하는 에볼라 바이러스(Ebola virus), 마르버그 바이러스 (Marburg virus) 등; 플라비비리데(Flaviviridae)에 속하는 웨스트 닐 바이러스(West Nile virus), 엘로우 피버 바이러스(Yellow Fever virus)，뎅기 피버 바이러스(Dengue Fever virus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus) 등; 헤파드나비리데(Hepadnaviridae)에 속하는 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B)등; 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과에 속하는 헤르페스 심플렉스 1 바이러스 (Herpes Simplex 1 virus), 헤르페스 심플렉스 2바이러스(Herpes Simplex 2 virus) 등; 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 등; 폭스비리데 (Poxviridae)에 속하는 스몰폭스 바이러스(Smallpox virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 몰루스컴 콘타지오섬 바이러스(Molluscumcontagiosumvirus), 멍키폭스 바이러스(Monkeypox virus) 등; 랍도비리데(Rhabdoviridae)에 속하는 라비스 바이러스(Rabies virus) 등; 레트로비리데 (Retroviridae)에 속하는 HIV(Human Immunodeficiency virus) 등; 토가비리데(Togaviridae)에 속하는 치컹구니아 바이러스(Chikungunya virus) 등; 헤르페스비리데(Herpesviridae)에 속하는 수도라비에스 바이러스(Pseudorabies virus), HHV바이러스 등이 될 수 있으며, 또 다른 예로서 오르소믹소비리데에 속하는 인플루엔자 바이러스가 될 수 있다. 예를 들면 상기 바이러스는 나노천공자에 포함되는 수용체 (예를 들어，강글리오사이드)에 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는 바이러스일 수 있다.
본 발명에서 용어 "인플루엔자 바이러스(Influenza virus)"란，오르소믹소비리데에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형，B형，C형 등 3가지로 구분된다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다제 (Neuraminidase; NA)의 종류에 따라 구분되는데，지금까지 144종류 (HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "표면 항원(surface antigen)"이란，세포막항원이라고도 하며，세포의 세포막에 존재하는 항원성을 나타내는 막결합 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서，상기 표면 항원은 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 지질이중층에 결합된 막결합 단백질을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데 상기 표면 항원은 특별히 이에 제한되지 않으나，예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제(Neuraminidase; NA) 등이 될 수 있다. 본 발명의 용어 "헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) "이란, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원의 일종인 막투과 단백질로서，트립신에 의해 절단될 수 있는 HA1 서브유닛과 HA2 서브유닛으로 구성된다. 상기 HA1 서브유닛은 시알산과 결합하고 상기 HA2 서브유닛은 낮은 pH조건에서 세포막융합을 유발시킨다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "표면 항원에 대한 수용체"란，상기 표면 항원과 결합할 수 있는 수용체로서，상기 표면 항원에 대한 항체가 될 수도 있고, 상기 표면 항원이 결합할 수 있는 다른 세포막 결합 단백질이 될 수도 있다.
본 발명에 있어서，상기 표면 항원에 대한 수용체는 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스가 감염될 수 있는 숙주세포의 표면에 존재하고，상기 바이러스의 표면 항원과 결합할 수 있는 수용체를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 수용체와 바이러스의 표면 항원은 수소결합，이온결합 등 다양한 상호작용에 의해 결합될 수 있으며，예를 들어 바이러스의 헤마글루티닌의 HA1 서브유닛의 가장 바깥 면의 수용체결합부위(receptor binding site)와 시알산이 결합할 수 있다. 따라서 본 발명의 수용체는 대상 바이러스，예를 들어, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 포함하는 바이러스에 특이적 또는 친화적으로 결합할 수 있도록 하는 수용체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 표면 항원에 대한 수용체 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나，시알산 또는 시알산 유사 기능을 갖는 작용기 (예를 들어，시알산 모사 펩타이드)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 수용체는 시알릴올리고사카라이드(sialyloligosaccharide), 예를 들어，강글리오사이드(ganglioside), 글리코프로테인(glycoprotein) 및 폴리시알산(polysialic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 시알산을 포함하는 수용체라면 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 작용기는 수용체 자체가 지질이중층에 함입 또는 결합되거나 링커(linker)를 통하여 지질이중층에 함입 또는 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 수용체는 수용체 자체 또는 수용체가 결합된 링커가 나노디스크 지질이중층의 지질과 수소결합，이온결합, 공유결합, 이황화결합 등 다양한 상호작용에 의해 결합된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 수용체의 일 예로서，인플루엔자 바이러스의 표면 항원인 헤마글루티닌과 결합할 수 있는 호흡기 세포의 세포막에 존재하는 시알산으로，예를 들어 상기 시알산을 포함하고 세포막에 결합된 강글리오사이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "강글리오사이드(ganglioside)"란，글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)의 당 사슬 (sugar chain)에 한 개 이상의 시알산이 특정 결합(α-2,3결합 또는 α-2,6결합)을 통해 연결된 형태의 화합물을 의미하며，α-2,3 결합된 시알산을 포함하는 형태와 α-2,6 결합된 시알산을 포함하는 형태를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 강글리오사이드는 하나의 Ν-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid)또는 시알산을 포함하는 GM1, GM2 또는 GM3, 두 개의 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 GD1a, GD1b, GD2 또는 GD3, 세 개의 N-아세틸뉴라민산을 갖는 GT1b 또는 GT3, 네 개의 N-아세틸뉴라민산을 갖는 GQ1일 수 있다.
본 발명에서, α-2,6결합을 갖는 강글리오사이드 중, GD1a는 두 개의 N-아세틸뉴라민산(시알산)을 갖는다. 플라크 감소 분석(plaque forming inhibition assay)와 세포사멸 감소 분석법(CPE inhibition assay)통해 분석한 결과, GD1a를 갖는 나노천공자는 인플루엔자 바이러스 strain들 중 A/PR/8/34, A/Sydney/5/97, A/aquatic bird/Korea/w81/2005에 대해서 강한 항-바이러스 효능을 보이는 것으로 확인되었다. 하지만 GD1a를 가진 나노천공자는 A/X-31 strain에 대해서는 약한 항-바이러스 효능을 보였다. 또한 인공적으로 α-2,6 시알산 형태를 가지고 있는 수용체(2,6SL)는 인플루엔자 바이러스 A/X-31 strain에 대해서 선택적인 강한 항-바이러스 효능을 보이지만 GD1a를 가진 나노천공자가 항-바이러스 효능을 보였던 인플루엔자 바이러스 세 strain에 대해서 보다 약한 감염 억제 효능이 있는 것이 확인되었다. 이를 극복하기 위하여, 각각 GD1a와 2,6SL 수용체를 가진 단일 나노천공자 혼합물을 사용했을 시에는 4 strain에 대해서 항-바이러스 효능이 확인되었지만 단일 나노천공자를 사용했을 때보다 동일농도에서 그 효능이 현저하게 줄어드는 것이 확인되었다. 또한 GD1a와 2,6SL 다른 두가지의 수용체들을 하나의 나노천공자에 삽입하여 사용했을 시에는 상대적으로 외부에 더 노출될 수 있는 2,6SL 수용체 효능만 관찰되었다.
일 구현예에서, 상기 수용체，예를 들어 강글리오사이드는 지질이중층 나노천공자의 지질이중층 나노디스크 부위에 삽입되어，지질이중층의 외피를 갖는 바이러스의 HA와 결합하는 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 나노천공자들은 하기와 같은 특징을 가진다:
환형 나노천공자 (essND 또는 esdND): 막 구조화 단백질의 양 말단에 Cfa 인테인의 C-말단 도메인 및 N-말단 도메인을 각각 부착하여 양 말단이 결합된 환형 막 구조화 단백질 (esMSP)을 포함하는 나노천공자로서 esMSP 정제시 환원제의 처리여부에 따라 단일 환형 나노천공자(essND) (환원제 처리) 또는 이황화결합으로 연결된 이중 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 이중 나노천공자 (esdND) (환원제 무처리)로 제작할 수 있다;
대형 환형 나노천공자 (eslND): esMSP의 헬릭스 길이를 두배로 늘려 (MSP 2 반복) 크기를 확장한 단백질(eslMSP)을 포함하는 나노천공자; 및
이중 나노천공자 (Di-NP): 막 구조화 단백질에 각각 CfaN 및 CfaC 인테인을 부착한 단백질 (CfaC-MSP 및 MSP-CfaN)로 각각 나노천공자를 제작한 후 트랜스-스플라이싱을 통해 공유결합된 이중 나노천공자이다.
상기 나노천공자들은 BM(PEG)3를 부착한 페길화된 나노천공자의 구조 또한 파생하여 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 나노천공자를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 바이러스는 코로나바이러스 과(Family Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 나노천공자, 예를 들어 표면 항원 수용체로서 강글리오사이드를 포함하는 나노천공자를 사용하여 숙주세포에 감염된 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 세포 내 감염경로를 교란시켜서, 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
일반적으로 바이러스의 HA를 구성하는 HA1 서브유닛은 숙주 세포막의 시알산과 결합하여 세포 내 함입 과정을 통해 숙주 세포 내로 침입한다. 한편, 본 발명의 나노천공자, 예를 들어 수용체로서 강글리오사이드를 포함하는 나노천공자를 바이러스가 감염된 세포에 처리하면, 상기 바이러스의 HA가 숙주의 세포막뿐 아니라 나노천공자의 지질이중층 나노디스크 및/또는 수용체에 결합할 수 있으며, 상기 나노천공자의 처리 양을 증가시키면, 상기 나노천공자에 결합되는 바이러스의 비율이 증가되어, 상기 바이러스가 숙주세포에 감염되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 상기 나노천공자는 숙주세포의 수용체를 모사한 '미끼(decoy)'로서 사용하여 바이러스의 세포 내 함입을 억제하는 침입 억제자(entry inhibitor)일 수 있다 (1차 억제).
상기 바이러스의 세포 내 함입과정 중 후기 엔도좀 단계에서 유발되는 막 융합단계에서, 본 발명의 나노천공자와 결합된 바이러스는 바이러스의 외피와 숙주세포의 세포막 사이에서 막 융합이 나타나지 않고, 바이러스의 외피와 나노천공자의 지질이중층 사이에서 나타날 수 있다. 이러한 세포막 융합은 확률적으로 나타나게 되는데, 하나의 바이러스에 하나의 숙주세포막과 다수의 나노천공자가 결합된 경우, 바이러스의 외피와 숙주세포의 세포막 사이에서 막융합이 일어나기 보다는 바이러스의 외피와 나노천공자의 지질이중층 사이에서 막융합이 일어날 수 있다. 이처럼 엔도좀 내에서 바이러스의 외피와 나노천공자의 지질이중층 사이에서 막융합이 유발되면, 상기 막융합 부위를 통하여 바이러스의 내부에 존재하는 RNA가 엔도좀 내부로 방출되고, 엔도좀 내부의 낮은 pH로 인하여 방출된 RNA가 불활성화되어 최종적으로는 분해되는 결과를 초래한다. 따라서, 본 발명의 나노천공자는 바이러스 엔도좀 단계의 막 융합 단계에서 바이러스 외피를 천공하는 천공자(perforator)일 수 있다 (2차 억제).
즉, 상기 나노천공자는 바이러스 외피에 결합하여 바이러스가 세포 내 함입되어 엔도좀을 형성하는 것을 저해하고 (1차 억제), 세포 내 바이러스가 함입되더라도, 함입된 바이러스의 외피에 구멍을 뚫는 '천공자(perforator)'로서 작용하여 (2차 억제), 바이러스 감염을 2차적으로 억제하는 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 표면 항원 수용체, 예를 들면 강글리오사이드를 포함하는 나노천공자를 상기 지질이중층의 외피를 갖는 바이러스가 감염된 세포에 처리하면, 상기 바이러스의 감염경로를 교란시켜서, 바이러스의 감염을 억제하게 되므로, 결과적으로는 바이러스의 증식을 억제하게 되고, 이로 인하여 바이러스의 감염에 의해 유발된 질환이 치료되는 효과를 나타내게 된다.
상기 설명한 바를 요약하면, 본 발명에서 제공하는 나노천공자는 지질이중층의 외피를 갖는 바이러스가 숙주세포에 감염되는 것을 억제하거나, 감염된 후에 증식되는 것을 원천적으로 억제하여, 바이러스의 감염에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서 제공하는 강글리오사이드를 포함하는 지질이중층 나노천공자는 숙주세포의 시알산을 매개로 숙주세포에 결합할 수 있는 바이러스라면, 변이여부에 상관없이 동일한 효과를 나타낼 수 있고, 상기 바이러스의 초기 감염을 억제할 수 있으며, 숙주에 바이러스가 감염된 후에도, 상기 바이러스의 증식을 원천적으로 억제할 수 있다는 장점을 나타냄을 알 수 있다.
따라서 본 발명의 나노천공자는 바이러스 변이에 독립적인 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 상기 나노천공자는 생체 내에서 특이적인 반응을 유발하는 물질을 포함하지 않기 때문에 안전성을 확보할 수 있다는 점에서도 장점이 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 히스티딘(His), 금(Au), 형광 리피드, 및 바이오틴/아비딘(biotin/avidin), 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 결합하여 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노천공자에 포함된 지질 이중층을 구성하는 지질 및 표면 항원 수용체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상과 상기 막구조단백질의 몰비(molar ratio) ([(지질이중층 나노디스크 지질의 몰 수) + (표면 항원에 대한수용체의 몰 수)] : 막구조단백질의 몰 수)가 10:1내지 800:1, 바람직하게는 50:1 내지 500:1，더욱 바람직하게는 50:1 내지 150:1，예를 들어 65:1또는 125:1가 되도록 포함될 수 있다. 예를 들어，상기 몰비는 나노디스크의 지질과 막구조단백질의 몰비 또는 나노디스크의 지질 및 표면 항원 수용체 몰비의 합과 막구조단백질의 몰비일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자에 포함되는 표면 항원 수용체，예를 들면 강글리오사이드는，나노디스크의 합계 몰수(예를 들어，지질의 몰수 및 수용체 몰 수의 합) 100%를 기준으로，0.01 내지 99몰%，바람직하게는 1내지 90몰%，더욱 바람직하게는 15몰% 이상 또는 10 내지 50몰%로 포함될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 나노천공자들은 막 구조화 단백질 (Membrane Scaffold Protein)의 특성을 변형시켜 기존의 나노천공자보다 향상된 바이러스 예방 및 치료 효과를 기대할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 나노천공자는 바이러스 감염과 관련되거나 바이러스 감염으로부터 기인한 1 이상의 증상의 치료, 예방, 개선 또는 발병의 지연용 약학 조성물 또는 바이러스 감염과 관련되거나 바이러스 감염으로부터 기인한 1 이상의 증상의 치료, 예방, 개선 또는 발병의 지연 용도에 동일하게 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 하기 도 28의 (A), (B), (C) 및 (D)로 표기되는 각각의 구조체로 이루어진 복합체가 항-바이러스 병증 치료/개선용 조성물로 이용될 수 있다. 일 실시예에서, 나노천공자에 항체의 Fc 부분에 결합 가능한 단백질 서열을 도입함으로써, 항-바이러스 항체의 효과를 극대화할 수 있음을 확인하였으며, 항체에 결합 가능한 나노천공자(FcND)를 항체와 결합한 구조체를 형성했을 때, 단일 항체가 나타내는 효과 뿐만 아니라 항체와 나노천공자의 혼합물이 나타내는 효과보다 훨씬 더 증진된 항-바이러스 효과를 보이는 것을 확인하였다. 또한 광범위 중화항체(broad neutralizing antibody: bnAb)에 위 발명을 도입하면, bnAb가 억제할 수 있는 인플루엔자 바이러스 strain 전체에 항체의 항-바이러스 효과 향상이 가능한 것이 확인되었다.
일 실시예에서, 항체에 나노천공자를 결합하기 위해서 막구조화 단백질의 N-말단에 결합에 필요한 단백질 도메인을 링커와 함께 추가하였다. 그 중 단백질 도메인은 하기 표 2에 속한 Fcbp(Fc region binding peptide)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 Fcbp는 정제 후에 추가적인 화학적, 생물학적 처리 없이 항체에 결합할 수 있다. Fcbp 다음에 위치한 링커는 항체와 나노천공자 사이의 결합시에 나노천공자가 바이러스에 유효하게 접근할 수 있도록 유효한 거리와 유연성을 제공하는 역할을 갖는다.
본 발명의 나노천공자는 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염경로를 교란시키거나 또는 감염된 바이러스의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 나노천공자는 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염에 의하여 유발되는 다양한 감염증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물은, 바이러스 변이에 독립적으로 적용될 수 있으며, 상기 나노천공자는 생체 내에서 특이적인 반응을 유발하는 물질을 포함하지 않기 때문에 안전성을 확보할 수 있다는 점에서도 장점이 있다.
본 발명에서 용어 "바이러스 감염증"이란, 상기 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 질환을 의미하는데, 일 예로서, 버니아비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 신증후근성출혈열(유행성출혈열); 코로나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 코감기 등 호흡기 질환; 플라비비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 C형 간염; 헤파드나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 B형 간염; 헤르페스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 대상포진; 오스소믹소비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증; 폭스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 천연두; 랍도비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 광견병 또는 수포성 구내염; 레트로비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 후천성 면역결핍증 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 오스소믹소비리데 과에 속하는 인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증이 될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 나노천공자는 1종 또는 2종 이상의 표면 항원 수용체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 수용체가 하나의 나노천공자에 포함될 수 있다. 또한 상기 조성물은 1종 이상의 상이한 수용체를 포함하는 2종 이상의 나노천공자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “치료(treat)”란 바이러스 감염에 의한 감염증의 증상을 개선시키거나 호의적으로 변화시키는 활성을 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명에서 용어 “예방(prevention)”이란 질환 또는 장애, 또는 질환/장애에 의해 발생하는 1 이상의 증상의 발병, 재발 또는 전염의 예방을 의미하며, 잠재적 후보자에 대한 예방적 치료(prophylactic treatment)를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 형태로 제조될 수 있고, 상기 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 약학적 조성물에 포함될 수 있는 다양한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어지는 군에서 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 나노천공자의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%, 다른 예로서 0.01 내지 3 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 말라리아의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 나노천공자가 변성 또는 파괴될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 나노천공자(nano-perforator)를 포함하는, 바이러스 증식 억제용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 바이러스 증식 억제는 나노천공자가 바이러스 외피와 결합하여 바이러스 외피를 천공하는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 약학조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염에 의한 바이러스 감염증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "개체"란 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염에 의하여 바이러스 감염증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 사람, 마우스, 가축 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 플라스미드를 발현 및 정제하여 환형 막 구조화 단백질을 수득하며; 및 자가조립과정으로 나노천공자를 제조하는 것을 포함하는, 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 essND를 제조하는 방법은:
본 발명의 막 구조화 단백질(membrane scaffold protein)의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합되고 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현시키는 단계; 환원제를 처리하여 환형 막 구조화 단백질(esMSP)을 정제하는 단계; 및 자가조립과정으로 나노천공자를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 환원제는 TCEP일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 eslND를 제조하는 방법은:
인테인의 C-말단 도메인, 2개 이상의 막 구조화 단백질 및 인테인의 N-말단 도메인을 순차적으로 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현시키는 단계; 대형 환형 막 구조화 단백질(eslMSP)을 정제하는 단계; 및 자가조립과정으로 나노천공자를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 플라스미드는 반복된 2개 이상의 막 구조화 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 구성될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 이중 나노천공자를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자 esdND를 제조하는 방법은:
본 발명의 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합되고 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현시키는 단계; 환원제를 배제하여 두 개의 환형 막 구조화 단백질이 이황화 결합으로 연결된 이중 환형 막 구조화 단백질(esdMSP)을 정제하는 단계; 및 자가조립과정으로 나노천공자를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 나노천공자 Di-ND를 제조하는 방법은:
막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현 및 정제하여 막 구조화 단백질의 N-말단에 인테인의 C-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 얻는 단계; 자가조립과정으로 제 1 나노천공자를 제조하는 단계; 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드를 발현 및 정제하여 막 구조화 단백질의 C-말단에 인테인의 N-말단 도메인이 융합된 융합 단백질을 얻는 단계; 자가조립과정으로 제 2 나노천공자를 제조하는 단계; 및 제 1 나노천공자 및 제 2 나노천공자를 공유결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자 esNP 제작
1-1. Cfa 인테인(intein)을 이용한 환형 막 구조화 단백질 esMSP(end-spliced membrane scaffold protein) 생산용 플라스미드 제조
CfaN과 CfaC에 대한 DNA 서열 정보는 Stevens AJ, et al., 2016, Design of a Split Intein with Exceptional Protein Splicing Activity, J Am Chem Soc에서 발췌하였다. 또한, CfaC-링커(linker)의 링커 시퀀스는 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하였으며, CfaN-His-tag에는 히스티딘 서열 7개가 반복된 His-tag을 사용하였다. CfaC-linker와 CfaN-His-tag사이에 MSP1E3D1 유전자 서열이 배열되어 최종적으로 유전자 구성은 CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN (이하 esMSP; end-spliced membrane scaffold protein)으로 구성하였다 (도 1). Gene 합성과 클로닝, 시퀀싱은 업체(코스모진텍, 한국)에 의뢰하였으며 의뢰한 CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN (esMSP)의 DNA 서열 (서열번호 1)은 하기 표 3에 나타냈다.
CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN (esMSP) 5'-gtcaagatcattagtcgtaagagtctgggcactcaaaacgtctacgatattggagtagaaaaagatcataattttttgctgaagaatgggctggtggcctctaactgcttcaacggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgtctaccttcagtaaacttcgcgaacaactgggccccgtgacgcaggaattctgggacaacctggaaaaagaaaccgagggactgcgtcaggaaatgtccaaagatttagaagaggtgaaggccaaggttcagccatatctcgatgactttcagaaaaaatggcaggaagagatggaattatatcgtcaaaaggtggaaccgctgcgtgcggaactgcaagagggggcacgccaaaaactccatgagctccaagagaagctcagcccattaggcgaagaaatgcgcgatcgcgcccgtgcacatgttgatgcactccggactcatttggcgccatatctcgatgactttcagaaaaaatggcaggaagagatggaattatatcgtcaaaaggtggaaccgctgcgtgcggaactgcaagagggggcacgccaaaaactccatgagctccaagagaagctcagcccattaggcgaagaaatgcgcgatcgcgcccgtgcacatgttgatgcactccggactcatttggcgccgtattcggatgaacttcgccagcgtttggccgcacgtctcgaggcgctgaaagaaaacgggggtgcccgcttggctgagtaccacgcgaaagcgacagaacacctgagcaccttgagcgaaaaagcgaaaccggcgctggaagatctacgccagggcttattgcctgttcttgagagctttaaagtcagttttctgtcagctctggaagaatatactaaaaagctgaatacccagcatcatcatcatcatcatcactgcctgtcttacgacacagagattctgaccgttgaatatggattccttcctatcggtaagatcgtggaggaacggattgaatgcacagtctatacggtagataaaaatggctttgtgtatacacaacctattgctcagtggcataaccggggagaacaggaagttttcgaatactgcttagaagacggttcgattatccgtgcaacgaaagatcacaaatttatgacgaccgacggtcagatgttaccgattgatgagattttcgaacgggggttagacctgaaacaagttgatggtttgccgtaa-3'
1-2. esMSP의 정제
상기 제작된 각 플라스미드들은 단백질의 정제를 위해 BL21(DE3) 수용성 세포에 열충격 방법을 통해 형질전환되었다. 50 μg/ml의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 고체 배지에서 자란 콜로니를 10 ml의 카나마이신이 포함된 액체 배지(LB broth miller)에 접종하였으며, 37℃ 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 16시간 배양 후 600 ml의 동일 액체 배지에 2차 접종하였다. OD600이 0.5~0.8까지 대장균이 자랐을 때 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 단백질 발현을 진행하였다. 37℃, 150 rpm에서 3시간 발현한 후 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포만 얻어내었다. 1% Triton X-100가 포함된 tris 완충액을 사용하여 세포를 재부유(resuspension)시키고, 초음파를 이용해 세포를 파쇄하였다. 원심분리를 통해 세포기질만 분리한 후 Ni-NTA 아가로스비드를 처리하였다. Triton X-100, 소듐 콜레이트(sodium cholate) 및 저농도의 이미다졸(imidazole)이 각각 포함된 완충액을 이용하여 비드에 결합하지 못한 물질들을 제거하였고, 정제하려는 단백질을 고농도의 이미다졸을 이용해 얻었다. 참고로, 상기 정제 과정에서 2 mM TCEP이 포함되지 않은 완충액으로 진행하였다. 이 과정에서 esMSP 단백질이 환형화를 이루기 위한 Cfa 인테인 트랜스-스플라이싱 과정에서 시스테인 아미노산의 잔기인 티올(thiol)기는 반응성이 높아 서로 반응하여 이황화 결합을 이루게 되므로 TCEP을 처리한 것과 처리하지 않은 esMSP 단백질 및, R(reducing), NR(non-reducing)을 SDS-PAGE 젤에 전기영동하여 쿠마시 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 2의 상단에 나타난 바와 같이, TCEP을 처리하지 않은 esMSP 단백질은 대부분 두 개의 esMSP 단백질이 이황화 결합(disulfide bond)으로 연결된 형태로 정제되며, 이 형태 또한 TCEP의 유무에 따라 자유롭게 조절 가능한 것을 확인하였다. 또한, 단백질의 N-말단 His-tag 제거에 사용되는 DAPase를 정제된 단백질에 처리하여 확인한 결과, 대조군인 MSP1E3D1 단백질은 DAPase에 의해 N-말단 His-tag이 제거되어 크기가 감소한 반면, esMSP는 DAPase에 의해 반응이 일어나지 않아 크기 변화가 없음을 확인함으로써 esMSP의 환형 구조를 확인하였다 (도 2 하단).
또한, 기존에 나노디스크 제작하기 위해 사용하였던 단백질인 ApoA-1 및 MSP1E3D1 대비 esMSP의 내독소 량 측정하기 위하여. LAL 분석을 실시하였다. 비슷한 농도의 세 단백질을 각각 2000, 4000 및 8000배로 각각 희석하여 내독소(endotoxin) 농도를 측정하였고, 내독소 농도가 알려진 표준 내독소를 이용하여 1 ml당 EU(endotoxin unit) 값을 측정하였으며, 단백질 농도를 적용하여 단백질 1 mg 당 내독소량을 계산하였다. 그 결과, ApoA-1은 가장 높은 171.64 EU/mg이 계산되었고 MSP1E3D1은 53.28 EU/mg의 내독소 농도가 측정되었다. 그러나, esMSP는 그보다 더 낮은 내독소 농도인 24.62 EU/mg의 내독소 농도가 측정되었다. 이를 통해서 같은 조건의 정제과정을 통해 얻어진 막 구조화 단백질 중에, 환형 구조인 esMSP가 다른 선형의 막 구조화 단백질 보다 내독소에 더 낮은 결합력을 보이며, 더 낮은 내독소 농도를 가지는 것이 확인되었다 (도 3 하단).
1-3. esMSP의 열 안정성 확인
상기 정제된 esMSP와 대조군인 MSP1E3D1 단백질을 40 uM의 농도로 200㎕씩 처리할 온도별로 시료를 준비하였다. 준비된 시료를 온도별로 30분씩 인큐베이션한 후 20,000g로 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였고, 가라앉은 침전물을 200㎕의 100mM NaCl, 40mM Tris-Cl 및 pH 7.4 완충액으로 충분히 풀어주었다. 각각의 시료에 6X SDS 완충액을 섞고 95℃의 물에서 10분간 끓여 준 후 15%, 10 well 및 0.75mm의 SDS-PAGE 젤에 전기영동하였다. 이후 얻어낸 젤을 GelAnalyzer를 통해 불용성 부분(insoluble fraction)과 가용성 부분(soluble fraction)의 비율을 계산하였다. 그 결과, 대조군인 MSP1E3D1 단백질은 온도가 높아질수록 가용성 부분은 감소하면서 불용성 부분이 증가하는 것이 확인된 반면, esMSP 단백질은 고온에서도 상당부분 가용성(soluble)의 형태로 존재하는 것을 확인하였다 (도 4). 또한 gel analyzer로 분석한 결과에서도 MSP1E3D1 단백질은 불용성 부분으로 넘어가는 단백질이 점차 증가하다 전체의 70% 정도가 변성되는 반면, esMSP 단백질은 80℃에서도 30% 안팎으로 밖에 변성되지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해 양 말단이 연결된 esMSP 단백질은 선형 MSP 단백질보다 열에 2배 이상 안정적인 것을 알 수 있었다.
1-4. esMSP 포함 나노천공자 esNP(end-spliced NP) 제조
지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 용해시켜 25 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 400 ml의 소듐 콜레이트가 첨가된 NP 완충액 (40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 7.4)으로 녹였을 때 지질의 농도가 10 mM이 되도록 25 mg/ml POPC 용액의 121.616 ㎕를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간동안 방치하여 용매를 제거하여, 리피드 필름(lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 상기 NP 완충액 0.4 ml을 이용하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 막 구조화 단백질로서 Ca-circularized MSP (분자량 32 kDa)을 단백질 대비 지질의 몰 비율이 120이 되도록 처리한 뒤, 전체 혼합액의 양에 맞게 2mM TCEP을 처리 또는 무처리한 후 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 처리 (4℃, 4시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 Cfa-circularized MSP 단백질을 포함하는 나노천공자(NP)를 제조하였다.
실시예 2. 크기가 확대된 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 나노천공자 eslNP 제작
2-1. 크기가 확대된 환형 eslMSP(end-spliced large membrane scaffold protein) 생산용 플라스미드 제조
두 개의 MSP1E3D1 단백질이 환형으로 결합되어 크기가 증가된 환형 MSP를 제조하기 위하여, 상기 환형 막 구조화 단백질을 발현하는 플라스미드를 제조하였다. MSP1E3D1 유전자 서열과 7개의 히스티딘(histidine) 사이에 MSP1E3D1의 서열을 삽입하였다. 유전자 클로닝은 오버랩 클로닝을 통해 진행하였으며, 실험에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 4에 기재하였고, 최종적인 단백질 CfaC-linker-MSP1E3D1-MSP1E3D1-HisX7-CfaN (eslMSP)의 구조를 도 5에 나타냈으며, 이의 DNA 서열은 서열번호 2로 표기하였다.
인서트 forward 프라이머 AAGCTGAATACCCAGACCTTCAGTAAACTTCGCGAACAACTGG
reverse 프라이머 ATGATGATGATGATGCTGGGTATTCAGCTTTTTAGTATATTCTTCCAGAG
벡터 forward 프라이머 CATCATCATCATCATCATCACTGCCTGTCTTA
reverse 프라이머 CTGGGTATTCAGCTTTTTAGTATATTCTTCCAGAG
2-2. eslMSP의 정제
상기 제작된 플라스미드를 단백질의 정제를 위해 BL21(DE3) 수용성 세포에 열충격 방법을 통해 형질전환하였다. 50 μg/ml의 카나마이신 (kanamycin)가 포함된 고체 배지에서 자란 콜로니를 10 ml의 카나마이신이 포함된 액체 배지(LB broth miller)에 접종하였으며, 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 16시간 배양 후 600 ml의 동일 액체 배지에 2차 접종하였다. OD600이 0.5~0.8까지 대장균이 자랐을 때 0.5 mM의 IPTG를 처리하여 단백질 발현을 진행하였다. 37℃, 150 rpm에서 3시간 발현한 후 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포만 얻어내었다. 1% Triton X-100와 2 mM TCEP이 포함된 tris 완충액을 사용하여 세포를 재부유시키고, 초음파를 이용해 세포를 파쇄하였다. 원심분리를 통해 세포기질만 분리한 후 Ni-NTA 아가로스 비드를 처리하였다. Triton X-100, 소듐 콜레이트 및 저농도의 이미다졸이 각각 포함된 완충액을 이용하여 비드에 결합하지 못한 물질들을 제거하였고, 정제하려는 단백질을 고농도의 이미다졸을 이용해 얻어내었다. 또한, 단백질의 N-말단 His-tag 제거에 사용되는 DAPase를 정제된 단백질에 처리하여 확인한 결과, 대조군인 MSP1E3D1 단백질은 cleavage 반응에 의해 His-tag이 제거된 것이 확인되는 반면, eslMSP은 DAPase에 의한 반응이 일어나지 않아 (도 6), eslMSP의 환형 구조를 확인할 수 있었다.
2-3. eslMSP 포함 나노천공자 eslNP(end-spliced large NP) 제조
지질로서，POPC (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 용해시켜 25 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 400 ml의 소듐 콜레이트가 첨가된 40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 7.4 NP buffer로 녹였을 때 지질의 농도가 10 mM이 되도록 25 mg/ml POPC 용액의 121.616 ㎕를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간동안 방치하여 용매를 제거하여, 리피드 필름(lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 상기 NP buffer 0.4 ml을 이용하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 막 구조화 단백질로서 상기 eslMSP (분자량 62 kDa)을 단백질 대비 지질의 몰 비율이 480이 되도록 처리한 뒤, 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 처리 (4℃, 3시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 크기가 확대된 나노천공자(eslNP)을 제조하였다.
실시예 3. 이중 나노천공자 Di-NP 제작
3-1. Linker-CfaN과 CfaC-linker가 각각 삽입된 MSP1E3D1 생산용 플라스미드 제조
CfaN과 CfaC에 대한 DNA 서열 정보는 Stevens AJ, et al., 2016, Design of a Split Intein with Exceptional Protein Splicing Activity, J Am Chem Soc에서 발췌하였으며 링커 시퀀스는 일반적으로 사용되는 링커 중 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하였다. Gene 합성은 업체(코스모진텍, 한국)에 의뢰하였으며 의뢰한 DNA 서열은 표 5와 같다. 최초의 PCR은 MSP1E3D1이 삽입되어 있는 pET28a 플라스미드에서 linker-CfaN는 종료코돈을 제외한 MSP1E3D1 유전자의 3' 말단과 그 뒤쪽 종료코돈을 포함한 pET28a 벡터 5'말단에, CfaC-linker는 MSP1E3D1 유전자 5' 말단과 그 앞쪽 pET28a 벡터 3'말단에 각각 15 bp가 상호간 상보적으로(complementary) 디자인된 프라이머들을 이용해 수행되었다. PCR 완료 후 self-ligation 방지를 위해 37℃에서 1시간 동안 Dpn1 용액을 처리하였고, DNA 외의 PCR 산물이 제거되었다. 이렇게 생성된 pET28a와 인서트(insert)들을 라이게이션(ligation)하기 위해 overlap cloner (ELPIS, 한국)를 넣고 37℃에서 1시간 반응하여 pET28a와 인서트들 간의 안정적인 수소결합을 유도하였다. 상기 클로닝과정을 통해 얻어진 DNA용액 7 ㎕를 competent E.coli TOP10 용액 100 ㎕에 넣고 얼음에서 30분 배양 후 42℃에서 45초간 열처리해 주었다. 상기 반응 액에 LB(Luria-Bertani) 액체배지 900 ㎕를 넣어 배양(37℃, 1시간) 후 원심분리(13,000 rpm, 10분)를 통해 세포를 수집하였다. 수집된 세포용액 (0.1 ml)을 카나마이신 LB 고체배지에 도말/배양 (37℃)한 후 형성된 콜로니 중 하나를 0.1% 카나마이신이 함유된 10 ml LB 액체배지에 넣어 18시간 (37℃)배양하였고, 배양액을 초음파 처리 및 정제하여 결과물로서의 MSP1E3D1-linker-CfaN의 염기서열 (서열번호 3)을 포함하는 플라스미드와 CfaC-linker-MSP1E3D1의 염기서열 (서열번호 4)을 포함하는 플라스미드를 얻었다. 상기의 플라스미드의 시퀀스는 업체 (코스모진텍, 한국)를 통해 확인하였다. 상기 과정에서 사용된 프라이머의 서열 및 자세한 조성과 반응 조건은 표 6과 같다.
linker-CfaN
(pUCIDT 벡터)		 5'-ggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgtgcctgtcttacgacacagagattctgaccgttgaatatggattccttcctatcggtaagatcgtggaggaacggattgaatgcacagtctatacggtagataaaaatggctttgtgtatacacaacctattgctcagtggcataaccggggagaacaggaagttttcgaatactgcttagaagacggttcgattatccgtgcaacgaaagatcacaaatttatgacgaccgacggtcagatgttaccgattgatgagattttcgaacgggggttagacctgaaacaagttgatggtttgccg-3'
linker 5'-ggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcg-3'
CfaN 5'-tgcctgtcttacgacacagagattctgaccgttgaatatggattccttcctatcggtaagatcgtggaggaacggattgaatgcacagtctatacggtagataaaaatggctttgtgtatacacaacctattgctcagtggcataaccggggagaacaggaagttttcgaatactgcttagaagacggttcgattatccgtgcaacgaaagatcacaaatttatgacgaccgacggtcagatgttaccgattgatgagattttcgaacgggggttagacctgaaacaagttgatggtttgccg-3'
CfaC-linker
(pUCSMART 벡터)		 5'-atggtcaagatcattagtcgtaagagtctgggcactcaaaacgtctacgatattggagtagaaaaagatcataattttttgctgaagaatgggctggtggcctctaactgcttcaacggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcg-3'
CfaC 5'-atggtcaagatcattagtcgtaagagtctgggcactcaaaacgtctacgatattggagtagaaaaagatcataattttttgctgaagaatgggctggtggcctctaactgcttcaac-3'
linker 5'-ggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcg-3'
프라이머 CfaN-linker-MSP1E3D1 벡터(MSP1E3D1-pET28a, 6400bp) Forward 5'-GCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCA-3'
reverse 5'-CTGGGTATTCAGCTTTTTAGTATATTCTTCCAGAGCTGACAGAAAACTG-3'
CfaC-linker-MSP1E3D1 Forward 5'-TAGAAATAATTTTGTATGGTCAAGATCATTAGTCGTAAGAGTCTGGG-3'
reverse 5'-CCTTCTTAAAGTTAACGACCCTCCGCCTCC-3'
PCR 조성 각 프라이머 1 ㎕씩, 벡터 3 ㎕, dNTP 4 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, Hipi DNA polymerase 0.5 ㎕ 및 증류수 35.5 ㎕
벡터 PCR 조건 최초 denaturation(95℃, 3분)
30회 반복: denaturation(95℃, 5초) →annealing(62℃, 5초) →extension(72℃,6분)
마지막 extension(72℃, 3분)
인서트 PCR 조건 최초 denaturation(95℃, 3분)
30회 반복: denaturation(95℃, 3초) →annealing(62℃, 3초) →extension(72℃, 1분)
마지막 extension(72℃, 3분)
Dpn1 처리조건 5 ㎕(10X reaction buffer4) + 44 ㎕ (벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 1 ㎕ (Dpn1 용액), 37℃로 1시간
Overlap cloner ligase 처리 4 ㎕ (벡터 용액) + 4 ㎕ (insert 용액) + 1 ㎕ (10X reaction buffer) + 1 ㎕ (overlap cloner 용액)
3-2. Cfa 인테인 도메인이 결합된 두 종류의 단백질 정제 및 공유결합 확인
MSP1E3D1-linker-CfaN (MSP-CfaN) 및 CfaC-linker-MSP1E3D1 (CfaC-MSP)의 두 종류의 단백질을 정제하였다. 구체적으로, MSP-CfaN은 상기 실시예에서 서술한 과정에 동일하게 단백질을 발현 및 정제하였으나 desalting 후 최종적으로 splicing용 완충액(100 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.2)에 담겨 얻어졌다. CfaC-MSP의 경우에는, 상기 제작된 플라스미드를 단백질의 정제를 위해 BL21 (DE3) 수용성 세포에 열충격 방법을 통해 형질전환되었다. 50 μg/ml의 카나마이신(kanamycin)가 포함된 고체 배지에서 자란 콜로니를 10 ml의 카나마이신이 포함된 액체 배지(LB broth miller)에 접종하였으며, 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 16시간 배양 후 600 ml의 동일 액체 배지에 2차 접종하였다. OD600이 0.5~0.8까지 대장균이 자랐을 때 0.5 mM의 IPTG를 처리하여 단백질 발현을 진행하였다. 이후, 16 ℃, 120 rpm에서 16 시간 발현한 후 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포만 얻어내었다. 2M의 urea가 포함된 1% Triton X-100와 2 mM TCEP이 포함된 tris 완충액을 사용하여 세포를 재부유시키고, 초음파를 이용해 세포를 파쇄하였다. 원심분리를 통해 세포기질만 분리한 후 Ni-NTA 아가로스 비드를 처리하였다. 이후, 2M의 urea가 포함된 Triton X-100, 소듐 콜레이트 및 저농도의 이미다졸이 각각 포함된 완충액을 이용하여 비드에 결합하지 못한 물질들을 제거하였고, 정제하려는 단백질을 2M의 urea가 포함된 고농도의 이미다졸을 이용해 얻어내었다. 고농도의 이미다졸을 통해 Ni-NTA 아가로스 비드에서 떨어져 얻어진 CfaC-MSP는 단백질 용액에 존재하는 고농도의 urea를 제거하기 위해, 투석을 통해 스플라이싱용 완충액에 urea를 제거하여 사용하였다. 이렇게 얻어진 MSP-CfaN 및 CfaC-MSP가 공유결합을 이루는지 확인하기 위해, 각각 1:1.3의 몰비율이 되도록 희석한 후, 2 mM TCEP를 처리하여 25 ℃에 15분간 반응시켰다. 이후, 동부피의 단백질을 30 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 결과 시간이 지남에 따라 trans-splicing되어 고분자량을 가진 MSP-MSP 결합체가 생성됨을 확인하였다 (도 7의 화살표).
3-3. 공유결합으로 연결된 이중 나노천공자 Di-NP 제조
PTS(protein trans-splicing) 이중 나노천공자(Di-NP)를 제조하기 위하여, 상기에서 제조한 MSP-CfaN 및 CfaC-MSP를 각각 따로 이용하여 상기 실시예 1-4에 명시된 과정 중에서 TCEP을 처리한 과정을 제외한 방법으로 각각 CfaN과 CfaC를 가진 나노천공자 (각각 NP-CfaN 및 CfaC-NP)를 제조하였다. 이렇게 제조된 나노천공자를 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 통해 순수 나노천공자들만을 splicing용 완충액(100 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.2)에 분리하였다. 그 이후, NP-CfaN과 CfaC-NP를 1:1.3 몰 비율로 준비한 뒤, 2 mM TCEP을 처리하여 25℃에 15분간 반응시켰다. 그 이후, 동부피의 NP-CfaN과 CfaC-NP 용액을 섞은 뒤, 33℃에서 1 시간동안 반응시켜 두개의 NP가 공유결합으로 연결된 형태의 Di-NP를 제조하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 통해 서로 결합된 이중 나노천공자가 단일 나노천공자보다 약 2배의 분자량을 가진 이중 나노천공자가 만들어진 것을 확인하였고 크기 배제 크로마토그래피를 통해 이중 나노천공자만을 분리하였다
실시예 4. 항체 결합 나노천공자 FcNP 제작
4-1. 항체에 결합 가능한 막 구조단백질 FcMSP 생산용 플라스미드 제조
Fc 영역 결합 펩타이드(Fc region binding peptide, Fcbp)에 대한 DNA 서열 정보는 Weonu Choe, et al., 2016, Fc-결합 Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides, Materials (Basel)에서 발췌하였으며, 링커 시퀀스는 일반적으로 사용되는 링커 중 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하였다. Gene 합성은 업체 (코스모진텍, 한국)에 의뢰하였으며 의뢰한 DNA 서열은 하기 표 7에 기재하였고, 이의 구조 모식도는 도 8에 나타냈다. 최초의 PCR은 MSP1E3D1이 삽입되어 있는 pET28a 플라스미드의 7XHIS 서열 앞에서 벡터 linearization을 진행하고, 합성된 인서트 유전자의 5' 및 3' 각 양 말단에 벡터와 15bp씩 오버랩(overlap)되도록 디자인된 프라이머들을 이용해 수행되었다. PCR 완료 후 self-ligation 방지를 위해 37℃에서 1시간 동안 Dpn1 용액을 처리하였고, DNA 외의 PCR 산물이 제거되었다. 이렇게 생성된 pET28a와 인서트들을 라이게이션하기 위해 overlap cloner (ELPIS, 한국)를 넣고 37℃에서 1시간 반응하여 pET28a와 인서트들 간의 안정적인 수소결합을 유도하였다. 상기 클로닝 과정을 통해 얻어진 DNA용액 7 ㎕를 competent E.coli TOP10 용액 100 ㎕에 넣고 얼음에서 30분 배양 후 42℃에서 45초간 열처리해 주었다. 상기 반응 액에 LB (Luria-Bertani) 액체배지 900 ㎕를 넣어 배양(37℃, 1시간) 후 원심분리(13,000 rpm, 10분)를 통해 세포를 수집하였다. 수집된 세포용액 (0.1 ml)을 카나마이신 LB 고체배지에 도말/배양 (37℃)한 후 형성된 콜로니 중 하나를 0.1% 카나마이신이 함유된 10 ml LB 액체배지에 넣어 18시간 (37℃) 동안 배양하였고, 배양액을 초음파 처리 및 정제하여 결과물로서의 플라스미드를 얻었다. 상기의 플라스미드의 시퀀스는 업체 (코스모진텍, 한국)를 통해 확인하였다. 상기 과정에서 사용된 프라이머의 서열은 표 7에 기재하였으며, 자세한 조성과 반응 조건은 표 8에 기재하였다.
Fcbp-linker
(pET28a 벡터)		 5'-gactgtgcatggcacctgggagaactggtctggtgcaccggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggt-3'
인서트 forward 프라이머 5'- AGGAGATATACCATGGACTGTGCATGGCACC-3'
reverse 프라이머 5'- GATGATGATGATGACCGCTACCGCCACCGCC-3'
벡터 forward 프라이머 5'-CATCATCATCATCATCATCACCGA-3'
reverse 프라이머 5'-CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3'
PCR 조성 각 프라이머 1 ㎕씩, 벡터 3 ㎕, dNTP 4 ㎕, 10X reaction buffer 5 ㎕, Hipi DNA polymerase 0.5 ㎕ 및 증류수 35.5 ㎕
벡터 PCR 조건 최초 denaturation(95℃, 3분)
30회 반복: denaturation(95℃, 5초) →annealing(62℃, 5초) →extension(72℃,6분)
마지막 extension(72℃, 3분)
인서트 PCR 조건 최초 denaturation(95℃, 3분)
30회 반복: denaturation(95℃, 3초) →annealing(62℃, 3초) →extension(72℃, 1분)
마지막 extension(72℃, 3분)
Dpn1 처리조건 5 ㎕(10X reaction buffer4) + 44 ㎕ (벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 1 ㎕ (Dpn1 용액), 37℃로 1시간
Overlap cloner ligase 처리 4 ㎕ (벡터 용액) + 4 ㎕ (insert 용액) + 1 ㎕ (10X reaction buffer) + 1 ㎕ (overlap cloner 용액)
4-2. FcMSP의 정제
상기 실시예2-2의 eslMSP와 동일한 방법으로 FcMSP를 정제하고 이를 SDS-PAGE 젤로 확인한 결과, Fc-결합 도메인을 포함하는 MSP가 정상적으로 정제된 것을 알 수 있었다 (도 9).
4-3. FcMSP를 포함하는 나노천공자 FcNP 제조
지질로서，POPC (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 용해시켜 25 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 400 ml의 소듐 콜레이트가 첨가된 NP 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 7.4)으로 녹였을 때 지질의 농도가 10 mM이 되도록 25 mg/ml POPC 용액의 121.616 ㎕를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간 동안 방치하여 용매를 제거하여, 리피드 필름(lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 상기 NP 완충액 0.4 ml을 이용하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 막 구조화 단백질로서 상기 Fc-MSP (분자량 35.2 kDa)을 단백질 대비 지질의 몰 비율이 120이 되도록 처리하였다. 이 후 전제 혼합액의 부피를 기준으로하여 환원제 (TCEP)가 2mM이 되도록 처리하였다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 처리 (4℃, 3시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 Fc-결합 도메인을 포함하는 나노천공자(FcNP)를 제조하였다.
실시예 5. 크기가 확대된 환형 막 구조화 단백질을 포함하는 항체 결합 나노천공자 Fc-eslNP 제작
5-1. 항체에 결합 가능한 막 구조단백질 Fc-eslMSP 생산용 플라스미드 제조
Fc 영역 결합 펩타이드(Fc region binding peptide, Fcbp)에 대한 DNA 서열 정보는 Weonu Choe, et al., 2016, Fc-결합 Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides, Materials (Basel)에서 발췌하였으며, 링커 시퀀스는 일반적으로 사용되는 링커 중 GGGGS 링커를 사용하였다. Gene 합성은 업체 (코스모진텍, 한국)에 의뢰하였으며, 의뢰한 DNA 서열은 하기 표 9에 기재하였고, 이의 구조 모식도는 도 10에 나타냈다. PCR은 eslMSP가 삽입되어 있는 pET28a 플라스미드의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커 중 두 번째 GGGGS 서열을 제거하고 Fcbp를 해당 위치에 삽입 할 수 있는 프라이머를 디자인하였다. PCR은 위치 특이적 돌연변이 (Site-directed mutagenesis)를 이용해 수행되었다. PCR이 완료된 후 메틸화된 기존의 플라스미드를 삭제하기 위해 37℃에서 1시간 동안 Dpn1 용액을 처리하였다. 이후 남아있는 PCR 산물을 PCR purification kit (ELPIS, 한국)를 이용하여 추가적으로 정제하였다. 상기 클로닝 과정을 통해 얻어진 DNA 용액 7 ㎕를 competent E.coli TOP10 용액 100 ㎕에 넣고 얼음에서 30분 배양 후 42℃에서 45초간 열처리해 주었다. 상기 반응 액에 LB (Luria-Bertani) 액체배지 900 ㎕를 넣어 배양 (37℃, 1시간) 후 원심분리 (13,000 rpm, 10분)를 통해 세포를 수집하였다. 수집된 세포용액 (0.1 ml)을 카나마이신 LB 고체배지에 도말/배양한 (37℃) 후 형성된 콜로니 중 하나를 0.1% 카나마이신이 함유된 10 ml LB 액체배지에 넣어 18시간 (37℃) 동안 배양하였고, 배양액을 초음파 처리 및 정제하여 결과물로서의 플라스미드를 얻었다. 상기의 플라스미드의 시퀀스는 업체 (코스모진텍, 한국)를 통해 확인하였다. 상기 과정에서 사용된 프라이머의 서열은 표 9에 기재하였으며, 자세한 조성과 반응 조건은 표 10에 기재하였다.
Fcbp
(pET28a 벡터)		 5'-gactgtgcatggcacctgggagaactggtctggtgcacc-3'
인서트 forward 프라이머 5'-GACTGTGCATGGCACCTGGGAGAACTGGTCTGGTGCACC GGAGGCGGAGGGTCGTCTAC-3'
reverse 프라이머 5'- AGAGCCTCCTCCACCGTTGAAGC -3'
PCR 조성 각 프라이머 2.5 ㎕씩, 벡터 3 ㎕, dNTP 1 ㎕, 5X phusion HF buffer 10 ㎕, Phusion polymerase 0.5 ㎕ 및 증류수 30.5 ㎕
인서트 PCR 조건 최초 denaturation(95℃, 3분)
25회 반복: denaturation(95℃, 30초) →annealing(59℃, 30초) →extension(72℃, 3분 30초)
마지막 extension(72℃, 10분)
Dpn1 처리조건 5.5 ㎕(10X reaction buffer 4) + 50 ㎕ (벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 2 ㎕ (Dpn1 용액), 37℃로 1시간
5-2. Fc-eslMSP의 정제
상기 실시예 2-2의 eslMSP와 동일한 방법으로 Fc-eslMSP를 정제하고 이를 SDS-PAGE 젤로 확인한 결과, Fc-결합 도메인을 포함하는 Fc-eslMSP가 정상적으로 정제된 것을 알 수 있었다 (도 11).
5-3. Fc-eslMSP를 포함하는 나노천공자 Fc-eslNP 제조
지질로서，POPC (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 용해시켜 25 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 400 ml의 소듐 콜레이트가 첨가된 ND 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 7.4)으로 녹였을 때 지질의 농도가 10 mM이 되도록 25 mg/ml POPC 용액의 121.616 ㎕를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간 동안 방치하여 용매를 제거하여, 리피드 필름(lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 상기 ND 완충액 0.4 ml을 이용하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 막 구조화 단백질로서 상기 Fc-eslMSP (분자량 63.2 kDa)을 단백질 대비 지질의 몰 비율이 480이 되도록 처리하였다. 이후 전체 혼합액의 부피를 기준으로 하여 환원제 (TCEP)가 2 mM가 되도록 처리하였다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 처리 (4℃, 3시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 Fc-결합 도메인을 포함하는 나노천공자(Fc-eslND)를 제조하였다.
실시예 6. PEG 부착 나노천공자 제작
구조체의 안정성 향상을 위해, 상기 실시예 2-3 및 5-3에서 제조한 eslNP 및 Fc-eslNP에 Thermo Fisher사의 BM(PEG)3 (1,11-bismaleimido-triethyleneglycol)를 연결하였다. 구체적으로, 상기에서 제조된 eslNP 및 Fc-eslNP에 5 mM TCEP를 상온에서 30분 처리한 후, desalting 또는 농축을 통해 TCEP을 제거하였다. eslNP 및 Fc-eslNP의 막단백질 몰수의 두 배가 되도록 BM(PEG)2 또는 BM(PEG)3를 처리한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후, 반응 종료를 위해 10 mM의 DTT를 상온에서 15분간 처리하여 eslNP 및 Fc-eslNP에 PEG를 부착한 PEG-eslND 및 PEGylated Fc-eslND를 제작하였다.
실험예 1. 나노천공자들의 구조 확인
1-1. esND의 구조 확인
상기 실시예 1-4에서 제조된 esND의 크기와 형태를 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC), 동적빛산란(dynamic light scattering; DLS) 및 전자현미경을 통해 확인하였다. 구체적으로, 상기 제조된 esNP를 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하였다. TCEP을 첨가하지 않은 상태로 esND를 제조하면 ND 및 esND의 두개의 main peak가 관찰되었다 (도 12).
1-2. eslND의 구조 확인
상기 실시예 2-3에서 제조된 eslND를 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한 결과, MSP1E3D1으로 제조한 ND와 비교했을 때 증가된 분자량에 따른 peak의 위치 변화를 확인하였다 (도 13 좌측). 또한, 각 나노천공자의 직경을 동적빛산란(DLS) 분석을 통해 측정한 결과, ND가 12.37 nm의 직경을 갖는 반면 eslND은 약 두 배 (25.70 nm)의 직경을 갖는 것을 확인하였고 (도 13 우측), 이는 단백질 설계 시 예상한 수치와 일치하였다. 또한, 도 13의 하단에 크기가 확대된 나노천공자의 구조를 모식화하였으며, 초록색으로 표시된 부분은 intein trans-splicing에 의해 공유결합으로 연결된 부분을 나타낸다.
1-3. Di-ND의 구조 확인
상기 실시예 3-3에서 제조된 Di-ND를 크기 배제 크로마토그래피를 통해 각각의 나노천공자과 비교하여 약 2배의 분자량을 갖는 것을 확인하였고 (도 14a), SDS-PAGE를 통하여 이렇게 분리된 Di-ND가 기존의 단백질인 MSP1E3D1 두개가 결합된 분자량을 갖는 것을 확인하였다 (도 14b). 또한, 동적광산란법을 통해 분석한 결과, 기존의 나노천공자는 약 12 nm의 직경을 갖는 것에 비해 Di-ND는 약 20 nm의 직경을 갖는 것으로 분석되었다 (도 14c). 타환형의 구조체를 측정할 때, 동적광산란법은 장축과 단축의 길이의 평균값을 측정하는 측정법을 고려하면, Di-ND는 확실히 두개의 나노천공자가 결합된 형태로 확인되어진다.
1-4. FcND의 구조 확인
상기 실시예 4-3에서 제조된 FcND를 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하였다. 정제과정 상에 환원제인 TCEP을 추가함으로써 약 8.5 ml과 10.5 ml의 elution volume에서 관찰되는 aggregate 및 dimer form의 FcND가 줄어들고, 항체의 Fc 영역에 결합가능한 mono cyclic FcND의 수율이 높아지는 것을 확인하였다 (도 15a). Elution을 상기 SEC결과와 같이 3개로 나누어 SDS-PAGE로 분석한 결과 TCEP을 처리함으로써 mono cyclic FcND의 수율이 높아지는 것을 다시 한 번 확인하였다 (도 15b). 여기서, 도 15b에서 붉은색으로 표시된 부분은 링커 구조를 모식화한 것이며, 노란색으로 표시된 부분은 Fc 결합 도메인을 표현한 것이다.
1-5. Fc-eslND의 구조 확인
상기 실시예 5-3에서 제조된 Fc-eslND를 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 eslND와 비교한 결과, 유사한 분자량을 갖는 것을 확인하였다 (도 16). 또한 상기 과정을 통해 얻어진 9.88 mL의 Peak를 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과 (도 11), Fc-eslMSP와 동일한 분자량을 갖는 것을 미루어 보아 Fc-eslND가 형성되었음을 알 수 있었다.
1-6. TCEP 유무에 따라 제작된 esNP 및 esdNP의 구조 비교
상기 1-2에서 TCEP을 첨가하여 정제한 esMSP로 제작한 esNP인 essND와, TCEP을 첨가하지 않고 정제한 esMSP로 제작한 esNP인 esdNP (esNP가 이황화 결합으로 결합된 형태)를 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하였다. TCEP을 첨가하지 않은 상태로 esNP를 제조하면 두개의 main peak가 관찰되며 먼저 나오는 peak는 esdNP, 이후에 나오는 peak는 esNP로 확인하였다 (도 17). 이를 동적빛산란(DLS)으로 측정한 결과, esdNP의 크기는 esNP (약 12nm)의 약 두배인 25nm로 측정되었으며, 이황화 결합으로 연결된 esdNP의 경우 DLS 측정 후 TCEP을 처리하고 다시 DLS를 측정했을 때 이황화 결합이 끊어져 크기가 감소하는 결과를 보여 esdNP의 구조를 보다 정확히 파악할 수 있었다 (도 17). 또한, 나노디스크 제작과정에서 TCEP을 처리하면 esNP를 얻을 수 있으며, 이렇게 얻어진 esNP는 TCEP을 처리하더라도 크기 변화가 없음을 DLS로 확인함으로써 TCEP의 처리 여부에 따라 두 가지 형태의 NP를 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다 (도 18).
실험예 2. 나노천공자의 항-바이러스 효과 확인
2-1. esNP
NP 및 esdNP 제작 과정 초반의 지질 필름 제작 시 지질 조성을 POPC 100% 대신 POPC 70% 및 TG 30%의 혼합물로 변형하여 각각 제작한 NPTG 및 esdNPTG (수용체로서 TG를 포함하는 NP 및 esdNP)의 항 바이러스 효과를 확인하기 위해, MDCK 세포에 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 strain를 감염시킨 후, NPTG 또는 esdNPTG를 함께 처리하고 바이러스 감염저해에 따른 세포변병효과 저하를 측정하였다. 구체적으로, MDCK 세포를 3 X 105 cell/ml 200 ㎕씩 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포에서 배지를 걷어내고, PBS를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하고 제거하여 세척하는 것을 2회 반복하였다. 인플루엔자 바이러스를 MOI(multiplicity of infectionmultiplicity of infection)=0.01로 희석하여 다양한 농도의 esNP (1μM부터 2-배 희석)에 맞추어 혼합해 주었다. 이 후, 3 X 105 pfu/ml 100 ㎕를 준비하여 각 웰에 처리한 후 37℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 이후, 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 PBS 세척이 끝난 세포에 처리하였다. 18시간 동안 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후에 배지를 제거하고, 4% 포름알데하이드를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 고정을 진행하였다. 고정 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액을 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 염색하였다. 그 후, 크리스탈 바이올렛 용액을 제거하고 각 웰당 100 ㎕의 메탄올을 처리하여 건조된 크리스탈 바이올렛을 용해시키고 분광광도계에서 570 nm의 파장 대의 흡수도를 측정하여 세포병변감소 효과를 측정하였다. 이 때, 항-바이러스제 없이 바이러스와 MDCK 세포만 배양한 것을 음성 대조군으로 정하고, 바이러스 감염없이 MDCK 세포만을 배양한 것을 양성 대조군으로 정하고, 기존 end-spliced 되지 않은 MSP1E3D1으로 제조된 NP를 대조군으로 정해서 항-바이러스 제제에 의한 바이러스 세포병변효과 감소를 측정하였다. 또한, 처리된 시료의 농도는 DC assay (detergent-compatible protein concentration determination)로 측정한 단백질 농도를 기준으로 하여 동일한 몰수의 NDTG와 esdNPTG에 의한 항바이러스 효과를 분석하였다.
상기 실시예 1-4에서 제조한 각 말단이 end-spliced된 형태의 esdNPTG에 의한 CPE 억제 분석 결과, 도 19 상단에 나타난 바와 같이 esdNPTG가 NPTG에 비해 증가한 효과를 보였으며, 최고 농도 (1 uM)에서의 항바이러스능이 기존의 NPTG에 비해 약 70% 가까이 향상된 것을 확인하였다.
2-2. Di-NP
상기 실험예 2-1에서와 같은 방법으로 상기 실시예에서 제조한 이중 나노천공자 (두 개의 나노천공자가 공유결합된 형태)에 의한 CPE inhibition assay을 확인하였으며 그래프로 나타냈다. 여기에서, Di-NPTG와 기존 NPTG를 비교하였다. 또한, 처리된 시료의 농도는 DC assay (detergent-compatible protein concentration determination)로 측정한 단백질 농도를 기준으로 하였고 이중 나노천공자는 두개의 나노천공자가 연결된 형태이기 때문에 1/2의 몰수로 계산하였다.
그 결과, Di-NPTG가 NPTG에 비해 최고 농도에서는 항-바이러스 효능이 2.5배 이상 증가한 현저한 효과를 보였다 (도 19 하단). 또한, 광학현미경을 통한 세포병변 감소효능을 비교해보았을 때, PR8 인플루엔자 바이러스가 감염된 후에 시간이 지날수록 NPTG에서는 최고 농도에서도 음성대조군과 같이 MDCK 세포가 사멸해 떠오르고 빈 공간 생기는 것이 관찰되었다 (도 20a). 그러나, Di-NPTG는 저농도에서는 비교적 항-바이러스 효능이 적게 관찰되었으나, 최고 농도에서는 감염 후 48시까지 시간이 지나도 양성대조군과 같이 대부분의 세포가 건강히 잘 부착되어있는 것을 확인하였다 (도 20b).
2-3. eslNP
상기 실험예 2-1에서와 같은 방법으로 상기 실시예 2-3에서 제조한 약 25 nm 직경의 eslNP에 의한 CPE inhibition assay을 확인하였다. 여기에서 대조군은 기존 13 nm 직경의 NP를 사용하였다.
그 결과, 대조군인 NDTG가 최대 약 20% 내외의 바이러스 억제능을 보이는 반면, eslNDTG는 80%에 육박하는 향상된 억제능을 보였으며, 수용체가 포함되지 않은 ND와 eslND의 경우 어떠한 효과도 보이지 않았다 (도 21).
2-4. FcNP
상기 실시예에서 4-3에서 제조한 FcNP에 의한 미세중화분석법(icroneutralization assay)을 확인하여 그래프로 나타내었다. 구체적으로, 먼저 NP 또는 FcNP를 2배씩 희석하여 96 웰 플레이트에 웰당 50 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 A/PR/8/34 바이러스를 MOI (multiplicity of infectionmultiplicity of infection)=0.01 농도로 50 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 100 ㎕의 MDCK 세포를 2x105 cells/ml의 농도로 각 웰에 첨가해준 후 37℃ 5% CO2 습윤배양기에서 18시간 반응시켰다. 형광으로 표지된 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid를 500 μM의 농도로 각 웰에 50 ㎕ 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 형광 플레이트 리더기를 이용해 Excitatin 355 nm/ Emission 460 nm를 측정하였다. 또한, 처리된 시료의 농도는 DC assay (detergent-compatible protein concentration determination)로 측정한 단백질 농도를 기준으로 하였기 때문에 동일한 몰수의 NP와 FcNP에 의한 항바이러스 효과를 분석하였다고 볼 수 있다.
그 결과, FcNP가 NP에 비해 상된 항-바이러스 효능을 보였으며 항체만 처리하였을 때 보다 증가된 바이러스 중화 효능을 나타냈다 (도 22).
2-5. Fc-eslNP
상기 실시예 5-3에서 제조한 Fc-eslNP에 의한 플라크감소시험(Plaque reduction assay)을 확인하여 그래프로 나타내었다. 구체적으로, 먼저 항바이러스중화항체(Antibody, Abs) 또는 Abs와 Fc-eslNP를 혼합하여 5배씩 희석하여 100 PFU농도의 A/PR/8/34 바이러스 1 mL과 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 6 웰 플레이트에 90% 정도의 밀도로 배양된 MDCK 세포에 상기 반응액을 웰당 1 mL씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 반응액을 PBS로 씻어준 후 DMEM, 1% Agar 및 2 ug/mL의 TPCK-트립신이 포함된 배지를 2 mL 처리하였다. 이 후 37℃ 5% CO2 습윤배양기에서 72시간 반응시킨 뒤, 3.65% 포름알데히드를 각 웰당 1 mL 넣어 MDCK 세포를 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 해당 세포를 염색하여 플라크를 확인하였다. 그 결과, 항바이러스 중화항체만 사용했을 때에 비해 Fc-eslNP 및 해당 항체를 혼합하였을 때 향상된 항-바이러스 효능을 보였다. 이 때, 지질로서 POPC(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 이용하여 제작한 Fc-eslNP인 Fc-eslNPpopc보다 지질로서 fusion 조성 (POPC 55%, DOPS 15% 및 cholesterol 30%)을 이용하여 제작한 eslNP인 Fc-eslNPfusion이 그 효과가 더 큰 것으로 나타났다 (도 23). 이는 항바이러스 중화항체에 결합한 Fc-eslNPfusion 구조가 세포안에서 바이러스를 천공시킬 수 있는 것을 나타낸다
실험예 3. 나노천공자의 안정성 확인
3-1, esdNP의 열 내구성 및 응집저항력 확인
상기 실시예 1-4에서 제조한 100 μM의 esdND 300 ㎕를 37 ℃에 넣고 24시간 동안 인큐베이션한 이후 크기배제 크로마토그래피 (SEC)을 통해 void peak의 변화를 확인하였다. 여기에서 ND를 대조군으로 이용하였다.
그 결과, esdND의 경우 SEC의 형태가 거의 변화하지 않았으나 ND는 void peak이 증가한 것을 확인하여 esdND가 대조군인 ND에 비해 온도에 저항력을 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 24).
3-2. PEG 부착 eslND의 안정성 확인
상기 실시예 6에서 eslND에 PEG를 부착하여 제작된 PEG-eslND의 안정성 및 분해효소 저항성을 확인하기 위해, 0.4 mg/ml의 PEGylation된 나노디스크에 100 nM의 트립신을 처리한 후 37℃에서 반응시키면서 0, 1, 2, 3, 4, 24, 48, 72 및 96시간차에 구조 분해 여부를 확인 및 비교하였다.
그 결과, 트립신에 의한 구조의 분해가 PEG이 결합된 구조에서 명확히 감소함을 확인하였다. 기존의 eslND의 경우 100 nM의 트립신에 24시간 이상 노출될 경우 모든 단백질이 분해되는 반면, PEG-eslND는 최대 96시간까지도 50% 이상 분해되지 않고 남아있는 것을 확인하였다 (도 25). 나노디스크 구조를 이루지 않은 단백질의 경우 트립신에 의해 빠른 시간안에 모두 분해되는 것으로 알려져 있는 것을 고려하면, 이러한 현상은 나노디스크 구조 자체가 트립신의 분해에 저항성을 획득하였다고 판단할 수 있다.
3-3. 형광염료가 삽입된 나노천공자를 이용한 생체 내 안정성 분포 양상 및 증가 확인
기존의 나노천공자(ND)의 제조방법과 상기 실시예 1-4, 2-3 및 6의 방법에서 지질 구성물로서 DiR 형광염료를 0.5 mol%로 혼합하여 형광을 띄는 ND, esdND, eslND 및 PEG-eslND를 각각 제조하였다. 그 후, 각 구조의 나노천공자들을 5 mg/kg 농도로 PBS에 희석하여 마우스의 생채 내로 복강내 주사로 100 μl 주입하였다 (n=3). 주입 직후, 3일 및 6일에 마취 후 마우스 표면에 측정되는 형광 값을 IVIS imaging system을 이용해 촬영하였다 (도 26a). 모든 실험군에서 사료에 포함된 알팔파(alfalfa) 건초로 인해 복부쪽에서 지속적인 형광값이 측정되는 것이 확인되었다. 그러나 흉부의 형광값을 비교해보았을 때, 대조군인 PBS 주입 군에서는 주입 직후, 주입 72시간 후 및 144시간 후에도 흉부에는 형광값의 변화가 보이지 않은 반면, 나노천공자들을 주입한 군에서는 주입 후 72시간이 지났을 때, 흉부에서 형광이 관찰되었다. 흉부의 형광값을 측정하여 그 값을 비교할 수 있었다 (도 26b). ND 실험군과 eslND 실험군의 경우, 주입 후 144시간이 지난 후에는 72시간에 비하여 형광값이 각각 75%, 50% 수준으로 감소하는 것이 확인되었다. 반면, esdND 실험군과 PEG-eslND 실험군은 형광값이 거의 감소하지 않는 것이 확인되었다. 즉, ND와 eslND는 비슷한 생체내 안정성을 보였으나 그에 비해 esdND는 144시간이 지났음에도 ND에 비해 월등히 증가된 형광값 유지을 보였고, 이는 esdND의 환형구조로 인해 ND보다 증가된 안정성에 의한 것으로 유추된다. 또한, pegylation을 통한 체내 안정성을 확인한 결과, 72시간과 144시간의 형광값을 비교하였을 때 PEG-eslND는 eslND와는 대조적으로 esdND와 유사할 만큼 흉부 형광값이 감소하지 않는 것을 확인되어, eslND가 pegylation을 통해 체내에서도 안정성이 개선되는 것이 확인되었다. 이와 같이, eslND가 esdND와 같이 환형구조를 가지지만 ND보다 증가된 지름을 가지기 때문에 esdND보다는 낮은 생채 안정성을 가지나, 이러한 불안정성은 pegylation을 통해 (PEG-eslND) 안정성을 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.
3-4. Fc-eslND의 열 내구성 확인
상기 실시예 4-3에서 제조한 FcND 및 5-3에서 제조한 Fc-eslND를 0.5 mg/ml의 농도로 360 ㎕ 준비하였다. 이 후 37℃에서 반응시키면서 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 60 및 72 시간차에 구조 분해 여부를 SDS-PAGE를 이용하여 확인 및 비교하였다.
그 결과, 60 시간까지는 유의미한 차이를 나타내지 않았지만 72 시간에서는 FcND가 완전히 분해되어 없어졌다. 반면 Fc-eslND는 60% 이상 남아있음을 확인 할 수 있었고 (도 27a), 이를 통하여 나노디스크의 환형화를 통하여 열 내구성이 부여됐다고 유추할 수 있다.
3-5. PEG 부착 Fc-eslND의 안정성 확인
상기 실시예 6에서 Fc-eslND에 PEG를 부착하여 제작된 PEGylated Fc-eslND의 안정성 및 분해효소 저항성을 확인하기 위해, 0.4 mg/ml의 PEGylated Fc-eslND에 100 nM의 트립신을 처리한 후 37℃에서 반응시키면서 0, 2, 4, 8, 16, 24 및 48시간차에 구조 분해 여부를 확인 및 비교하였다.
그 결과, 기존의 FcND의 경우 100 nM의 트립신에 3시간 노출된 경우 50% 이상 분해되는 반면, PEGylated Fc-eslND는 30시간 이상 노출되어야 50% 이상 분해되는 것을 확인하여 (도 27b), 트립신에 의한 구조의 분해가 PEG이 결합된 경우 명확히 감소함을 확인하였다. 나노디스크 구조를 이루지 않은 단백질의 경우 트립신에 의해 빠른 시간안에 모두 분해되는 것으로 알려져 있는 것을 고려하면, 이러한 현상은 나노디스크 구조 자체가 트립신의 분해에 저항성을 획득하였다고 판단할 수 있다. 나아가, PEG이 결합된 구조인 PEGylated Fc-eslND가 그렇지 않은 FcND보다 더 나은 트립신 내구성을 가진다는 결론을 내릴 수 있었다.
실험예 4. FcND 및 Fc-eslND의 항체 결합 양상 분석
4-1. FcND에서의 항체결합양상 분석
Fcbp(Fc region binding peptide)는 서열 내에 존재하는 한 쌍의 시스테인 아미노산이 이황화 결합을 이루어 환형(cyclic) 구조를 형성해야만 항체의 Fc 부분에 결합 가능하므로 (도 28), FcND에 도입된 Fcbp가 항체에 대해 결합하는 성질을 유지하는지 확인하기 위해 표면플라즈마공명법(Surface plasmin resonance: SPR)을 이용하여 항체와 나노천공자의 결합을 측정하였다. 구체적으로, CM5 gold 칩 표면에 1 μM 항체를 고정시키고 1 M 에탄올아민으로 블로킹함으로써 항체만 노출시킨 뒤, ND 및 FcND를 각각 칩 표면에 7 ㎕/min으로 흘려주면서 항체와의 결합에 따른 항체의 미세한 흔들림이 나타내는 금 입자의 전반사각 변화를 측정하였다.
그 결과, FcND는 항체에 결합 가능한 구조이기에 ND에 비해서 높은 결합력을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (도 29).
4-2. Fc-eslND에서의 항체결합양상 분석
Fc-eslND에 도입된 Fcbp가 항체에 대해 결합하는 성질을 유지하는지 확인하기 위해 닷 블롯 분석(Dot blot assay)을 진행하였다. 구체적으로, 도 30a에 나타낸 바와 같이, 니트로셀룰로오스 막 (NC membrance)에 5 μg/ml의 A/PR/8/34 바이러스 3 ㎕로 점을 찍은 뒤, 1시간 동안 상온에서 건조시켰다. 이후 TBST 버퍼에 탈지분유를 5%로 녹여 (w/v) 1시간 동안 NC 멤브레인 블로킹을 진행하였다. A/PR/8/34 바이러스에 대한 마우스 유래 1차 항체를 1μg/ml의 농도로 TBST에 녹인 후 NC 멤브레인에 1시간 동안 처리하였다. TBST로 10분간 세척을 진행하며 이는 3회 반복하였다. 이 후 마우스 유래 1차 항체를 잡을 수 있고 화학발광을 일으킬 수 있는 2차 항체를 1:1000의 비율로 TBST 버퍼에 녹인 후 1시간 동안 NC 멤브레인에 처리하였다. 이 후 TBST로 10분간 세척을 진행하는 과정을 3회 반복하였다. 그 후 ECL을 통하여 화학발광반응을 일으켜 필름을 감광하여 고정하였다.
그 결과, Fc-eslND는 항체에 결합 가능한 구조이기에 화학발광을 일으킬 수 있는 2차 항체가 1차 항체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하여 필름이 감광되지 않음을 확인할 수 있었다. 반면에 동일한 크기를 가진 eslND은 대조군과 같이 필름이 감광된 것을 확인하였다 (도 30b). 따라서 Fc-eslND에 도입된 Fcbp는 항체에 결합할 수 있는 성질을 유지했음을 확인할 수 있다.
실험예　５．나노천공자의 in vivo 바이러스 감염 억제능 확인
5-1. esdNP의 향상된 in vivo 바이러스 감염 억제능
POPC 70% 및 GD1a 수용체 30%의 혼합물을 사용하여 지질 필름을 제작한 뒤, 상기 실시예 1-4의 방법으로 각각 제작한 NDG(GD1a 수용체 포함 ND) 및 esdNDG(GD1a 수용체 포함 esdND)의 PR8 바이러스 감염 억제능을 마우스 모델에서 확인하였다. 구체적으로, 일주일간 실험 환경에서 적응시킨 6주령의 암컷 Balb/c 마우스를 100 μL의 마취제(Alfaxan:xylazene:PBS=2:1:2)로 IP 주사한 후, 4 MLD50의 PR8 바이러스로 공격접종하였다. 접종 1시간 뒤 NPG 또는 esdNPG를 0.5 mg/kg의 용량으로 최초 IP 투여하였으며 (n=10), 이후 격일로 2회 추가 투여를 진행하였다. 13일간 체중 변화와 생존률을 관찰 및 기록하여 비교하였다. 그 결과, 기존의 NPG가 10% 생존률을 보인 반면, esdNPG는 동일 농도에서 3배 높은 생존률을 보임으로써 구조 개선을 통한 항바이러스 효능 증가가 가능함을 증명하였다 (도 31).
*5-2. PEGylated eslNP의 향상된 in vivo 바이러스 감염 억제능
상기 실험예 5-1과 동일한 방법으로 마우스 모델에서 PEGylated eslNP의 PR8 바이러스의 감염성 억제 효과를 실험하였다. 이를 위해, NPG 및 PEGylated eslNPG (이하 PEG-eslNPG)를 2.5 mg/kg 또는 0.5 mg/kg으로 4일간 3회 각각 투여한 후 생존률과 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과, NDG 그룹과 달리, PEG-eslNPG 투여 그룹은 두 농도 모두에서 감염된 마우스 모두를 생존시켰으며, 체중 변화 또한 미감염 그룹과 비슷한 수준으로 미비하였다 (도 32). 이는 트립신 저항성 실험에서 확인하였듯, 체내의 단백질 제한효소 등에 대한 안정성이 PEG-eslNPG이 월등하기 때문인 것으로 유추된다. 또한, 상기 실험예 5-1의 esdNPG 실험 결과와 비교해 보면, 제한효소에 대한 안정성이 향상되지 않은 esdNPG의 경우는 in vivo에서 30%의 생존률을 보이는데 그쳤으나 PEG-eslNPG는 100% 생존률을 나타내, 나노천공자의 면적 증가와 더불어 체내 안정성이 그 효능에 매우 중요함을 알 수 있다.
5-3．PEGylated Fc-eslNP의 향상된 in vivo 바이러스 감염 억제능
상기 실험예 5-1과 동일한 방법으로 마우스 모델에서 PEGylated Fc-eslNP (pFc-eslNP)의 PR8 바이러스의 감염성 억제 효과를 실험하였다. 이를 위해, 5 mg/kg(mpk), 2.5 mpk 또는 0.5 mpk의 Abs(중화항체) 단독 또는 상기 농도의 Abs와 10 mpk, 5 mpk, 1 mpk의 PEGylated Fc-eslNP를 혼합하여 1회 정맥을 통하여 투여한 후 생존률과 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과, Abs 2.5 mpk 단독 처리군에서는 생존율이 40%로 나타난 반면, Abs 2.5 mpk + pFc-eslNP 5 mpk 처리군에서는 생존율이 100%로 나타나 (도 33), pFc-eslNP가 중화항체의 항바이러스 효과를 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.
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Claims (5)

  1. 인지질을 사용하여 형성된 납작한 환형의 지질 이중층 (lipid bilayer); 및
    상기 지질 이중층의 외주면을 둘러싸는 막 구조화 단백질(membrane scaffold protein, MSP)을 포함하는 나노디스크를 함유하되,
    상기 막 구조화 단백질은,
    복수개의 막 구조화 단백질이 펩타이드 결합으로 연결되어 길이가 신장된 막 구조화 단백질이며,
    상기 나노디스크는,
    바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노디스크는,
    PEG (polyethylene glycol)가 막 구조화 단백질에 페길화된(pegylation) 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 막 구조화 단백질은,
    N-말단과 C-말단이 상호 접합되어 형성된 환형의 막 구조화 단백질인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스는,
    코로나바이러스 과(Family Coronaviridae), 버니아바이러스 과(Bunyaviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과(Retroviridae) 및 토가바이러스 과(Togaviridae)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 바이러스인, 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 환형의 막 구조화 단백질은,
    트랜스-인테인 스플라이싱(trans-intein splicing) 방법에 의해 막 구조화 단백질의 N-말단과 C-말단이 상호 접합된 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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