CN114667293A - 抗病毒活性增强的纳米穿孔器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过纳米穿孔器的结构修饰或改善来提高病毒感染预防及治疗功效的纳米穿孔器，本发明的纳米穿孔器的结构、面积、形状及膜支架蛋白的特异性被修饰，因此具有提高的热稳定性，并且，通过增加穿孔作用的效率、增强纳米穿孔器的稳定性及赋予病毒特异性来使抗病毒活性最大化，因此可有效用作用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。

Description

抗病毒活性增强的纳米穿孔器

技术领域

本发明涉及通过纳米穿孔器的结构修饰或改善来提高病毒感染预防及治疗功效的纳米穿孔器。

背景技术

迄今为止开发的病毒感染治疗剂包括金刚烷胺(amantadine)或金刚乙胺(rimantadine)类M2离子通道抑制剂、奥司他韦(oseltamivir，商品名为达菲)或扎那米韦(zanamivir，商品名为瑞乐砂)类神经氨糖酸苷酶(neuraminidase)抑制剂，但这些治疗剂存在有效性有限的问题。即，金刚烷胺或金刚乙胺类衍生化合物快速产生耐药性变异病毒，已知部分地区检测到的H5N1型流感病毒对金刚烷胺或金刚乙胺类化合物具有耐药性，乙型流感病毒对金刚烷胺衍生物不敏感。并且，已知对奥司他韦或扎那米韦类衍生化合物产生耐药性的病毒也会增加，并且这些耐药性病毒在儿童中经常发生。

正在积极进行研究以开发一种新的治疗剂，它不存在治疗如上所述的现有病毒感染的问题。例如，韩国专利第1334143号公开了一种包含远志(Polygala karensium)提取物和从中分离的呫吨酮类化合物的用于预防或治疗感冒、禽流感、猪流感或甲型流感的组合物。然而，这些制剂的抗病毒活性较低，因此对甲型流感没有有效的预防或治疗效果。

最近，作为纳米圆盘的一种新应用方法，有报道称其具有作为抗病毒剂的潜力，例如防止具有脂质双层包膜的病毒感染或抑制受感染病毒的增殖等，上述纳米圆盘也称为纳米穿孔器(Nano-perforator，NP)。上述病毒利用脂质双层包膜中的膜结合蛋白感染宿主细胞，利用纳米穿孔器打断上述病毒的感染途径或直接刺破病毒表面，从而可抑制病毒的增殖。金刚烷胺、奥司他韦(商品名为达菲)、扎那米韦(商品名为瑞乐砂)等已开发的病毒治疗剂的效果有限，有效治疗存在局限性，例如病毒变得耐药或出现耐药性病毒等。上述纳米穿孔器不含在体内诱导特异性反应的物质，因此安全，并且具有可以普遍应用于各种变异病毒的优点，因此正在进行积极的研究。

因此，本发明人通过对纳米穿孔器进行各种修饰，进一步提高抗病毒功效和增加热稳定性，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供抗病毒效果增强的纳米穿孔器。

并且，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。

并且，本发明的目的在于，提供纳米穿孔器的制备方法。

解决问题的方案

为了解决上述问题，本发明提供包含环状膜支架蛋白的纳米穿孔器。

并且，本发明提供由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器。

并且，本发明提供用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，包含抗病毒效果增强的纳米穿孔器。

并且，本发明提供本发明的纳米穿孔器的制备方法。

发明的效果

本发明的纳米穿孔器的结构、面积、形状及膜支架蛋白的特异性被修饰，因此具有提高的热稳定性，并且，通过增加穿孔作用的效率、增强纳米穿孔器的稳定性及赋予病毒特异性来使抗病毒活性最大化，因此可有效用作用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。

附图说明

图1为环状膜支架蛋白(esMSP)质粒的结构示意图。

图2为确认经纯化的esMSP蛋白及其环状结构的图。

图3为使用分选酶比较环状膜支架蛋白的纯化过程和esMSP蛋白的纯化过程并通过LAL检测(LAL assay)对通过该方法生产的每mg蛋白esMSP的内毒素浓度进行测定的图(对照组ApoA-1或MSP1E3D1)。

图4为分析esMSP的热稳定性的图。

图5为eslMSP蛋白的结构示意图。

图6为确认经纯化的eslMSP蛋白及其环状结构的图。

图7为确认MSP-CfaN及CfaC-MSP的反式剪接(trans-splicing)产物的图(箭头：MSP-MSP结合物)。

图8为能够与抗体结合的FcMSP的结构示意图。

图9为确认经纯化的MSP蛋白(左：32.6KDa)及包含Fc结合结构域的FcMSP(右：35.2KDa)的图。

图10为Fc-eslMSP蛋白的结构示意图。

图11为示出用于确认Fc-eslMSP蛋白的纯化及Fc-eslND的形成的SDS-PAGE结果的图。

图12为示出NP(ND)及esNP(esND)的SEC结果的图。

图13为ND与eslND的SEC及DLS结果和比较示意图。

图14为示出用于确认双纳米穿孔器(Di-ND或Di-NP)的形成的SEC、SDS-PAGE及DLS结果的图。

图15为示出FcND的SEC及SDS-PAGE结果的图。

图16为示出Fc-eslND的SEC结果的图。

图17为示出用于确认通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND的形成条件的DLS及SEC结果的图：

esND-TCEP_Di-form：在esMSP的纯化和ND的形成过程中未添加还原剂的通过二硫键结合的双纳米穿孔器；

after TCEP treat：对通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND处理还原剂TCEP后分析的DLS结果；

esND-TCEP single-form：esMSP的纯化和ND的形成过程中添加还原剂TCEP后形成的单纳米穿孔器；以及

after TCEP treat：对单纳米穿孔器esND处理还原剂TCEP后分析的DLS结果。

图18为将用于确认通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND的形成的图14的结果简要示出的esND(用essND标记)及esdND的制备示意图。

图19为对用于确认双环状纳米穿孔器的增强的抗病毒功效的致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)抑制效果进行确认的图：

上端：通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器(esdNPTG)与单纳米穿孔器相比增强的抗病毒功效；以及

下端：通过共价键结合的双环状纳米穿孔器(Di-NPTG)与单纳米穿孔器相比增强的抗病毒功效。

图20通过光学显微镜确认通过共价键结合的双纳米穿孔器(Di-NPTG)对病毒CPE抑制效果随时间变化的图。

图21为对作为对照组的小尺寸NDTG与具有较大直径的eslNDTG的增强的抗病毒CPE抑制效果进行比较的图。

图22为通过FcND确认微量中和试验(Microneutralization assay)的图。

图23为对在空斑减数试验(Plaque reduction assay)中通过抗病毒抗体或者通过混合抗病毒抗体与各结构纳米穿孔器来减少PR/8H1N1流感感染进行确认的图。

图24为通过尺寸排阻色谱法(SEC)比较ND和esdND的热耐久性的图。

图25为比较ND、esdND、eslND和PEG-eslND(或者PEGylated eslND)的胰蛋白酶耐久性的图。

图26为注入混合荧光染料制成的纳米穿孔器后，随时间对残留在小鼠体内的所分布的纳米穿孔器的荧光值进行拍摄并分析的图：

a：拍摄小鼠全身的纳米穿孔器的荧光值的图；以及

b：注入后，随时间计算小鼠胸部的荧光值，随时间比较各结构纳米穿孔器的荧光值的结果。

图27为比较FcND、Fc-eslND和PEGylated Fc-eslND的稳定性的图：

a：FcND和Fc-eslND的热耐久性的比较结果；以及

b：FcND和PEGlyated Fc-eslND的胰蛋白酶耐久性的比较结果。

图28为抗体与抗体结合纳米穿孔器的结合测定方法示意图。

图29为利用表面等离子体共振法分析抗体与FcND的结合形式的图。

图30为利用斑点印迹法(Dot blot assay)分析FcND及Fc-eslND的抗体结合形式的图：

a：斑点印迹法的实验过程的示意图；以及

b：斑点印迹法的实验结果。

图31为在PR/8H1N1流感感染后以0.5mg/kg的浓度向小鼠体内注入NPG或esdNPG时，分析感染后存活率和体重随时间的变化的图。

图32为在PR/8H1N1流感感染后以2.5mg/kg或0.5mg/kg的浓度向小鼠体内注入NPG或PEG-eslNPG时，分析感染后存活率和体重随时间的变化的图。

图33为在PR/8H1N1流感感染后向小鼠体内注入抗病毒抗体或者混合抗病毒抗体与pFc-eslNP来注入时，分析感染后存活率和体重随时间的变化的图。

图34为将本发明提供的多种纳米穿孔器的序列和结构简要示出的示意图。

具体实施方式

以下，参照附图通过本发明的实例详细地说明本发明。但是，以下实例仅为了例示本发明而提供，当判断为对本领域技术人员已知的公知技术或结构的详细描述可能不必要地混淆本发明的主旨时，该详细描述可能省略，本发明不限于此。本发明的各种变形和应用在后述的发明要求保护范围的记载及由此解释的等同的范围内是可行的。

并且，本说明书中所使用的术语(terminology)是为了适当地表达本发明优选实施例而使用的术语，其可以根据用户、操作者的意图或本发明所属领域的惯例等而变化。因此，这些术语的定义应基于整个说明书的内容。在整个说明书中，当一个部分“包括”某个结构要素时，除非另有说明，否则意味着可以进一步包括其他结构要素，而不是排除其他结构要素。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以在实践中用于测试本发明，但本文描述了优选的材料和方法。作为参考文献记载在本说明书中的所有出版物的内容也并入本文。

本发明参考本发明的发明人的在先专利申请第10-2017-0089655号，包括其序列在内的公开内容并入本文作为参考。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白(membrane scaffold protein)的C-末端融合且内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成。

在一实例中，MSP可以为MSP1或MSP2。

在一实例中，融合蛋白可以依次包含内含肽的C-末端结构域、接头、膜支架蛋白及内含肽的N-末端结构域，编码该融合蛋白的碱基序列可以为如图1所示的结构，并且可以包含序列1的碱基序列。

在一实例中，上述接头可以由包含GGGGSGGGGSGGGGS的序列的核酸编码。

在一实例中，融合蛋白可以包含两个以上重复的膜支架蛋白，并且可以依次包含内含肽的C-末端结构域、两个以上膜支架蛋白及内含肽的N-末端结构域，编码该融合蛋白的碱基序列可以为如图5所示的结构，且可以包含序列2的碱基序列。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成，或者涉及一种质粒，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成。

在一实例中，上述质粒可以为由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器制备用质粒。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码Fc区结合肽(Fc region bindingpeptide，Fcbp)及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列。

在一实例中，内含肽的N-末端结构域可与上述融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域可与上述融合蛋白的N-末端融合，上述融合蛋白可以依次包含内含肽的C-末端结构域、接头、Fc区结合肽、接头、膜支架蛋白及内含肽的N-末端结构域。

在一实例中，MSP可以为MSP1或MSP2。

在一实例中，上述接头可以由包含GGGGSGGGGSGGGGS的序列的核酸编码。

在一实例中，上述质粒可以包含如图8所示的结构，并且可以包含FcBP部分由N表示的序列5的碱基序列。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码Fc区结合肽及两个以上重复的膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N-末端结构域与上述大融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与上述大融合蛋白的N-末端融合。

在一实例中，上述融合蛋白可以依次包含内含肽的C-末端结构域、Fc区结合肽、两个以上膜支架蛋白及内含肽的N-末端结构域。

在一实例中，上述质粒可以包含如图10所示的结构，并且可以包含FcBP部分由N表示的序列6的碱基序列。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的C-末端结构域与上述融合蛋白的N-末端融合。

根据一方面，本发明涉及一种质粒，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N-末端结构域与上述融合蛋白的C-末端融合。

在一实例中，上述质粒可以为由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器制备用质粒。

根据一方面，本发明涉及纳米穿孔器用膜支架蛋白。

根据一方面，本发明涉及一种由本发明的质粒编码的环状膜支架蛋白(end-spliced membrane scaffold protein，esMSP)，上述环状膜支架蛋白的N-末端与C-末端剪接。

在一实例中，本发明的环状膜支架蛋白通过去除内含肽来使两末端连接从而可以形成环状，上述内含肽由本发明的融合蛋白的内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而成。

在一实例中，本发明的环状膜支架蛋白可通过表达质粒并在蛋白质纯化时经还原剂处理来获得，上述质粒编码在末端融合有内含肽的膜支架蛋白。

在一实施例中，经确认，本发明的环状膜支架蛋白(esMSP)与线性膜支架蛋白(MSP)相比具有更低的内毒素浓度和更高的热稳定性。

根据一方面，本发明涉及一种双环状膜支架蛋白，由两个环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成。

在一实例中，本发明的双环状膜支架蛋白可通过表达质粒并未经还原剂处理而纯化蛋白质来获得，上述质粒编码在末端融合有内含肽的膜支架蛋白。

根据一方面，本发明涉及一种大环状膜支架蛋白，连续包含两个以上膜支架蛋白。

在一实例中，上述大环状膜支架蛋白的大小可大于本发明的环状膜支架蛋白的大小，并且可以具有环状膜支架蛋白的1.2倍至5倍的直径。

在一实例中，上述大环状膜支架蛋白可通过表达并纯化质粒来获得，上述质粒包含编码本发明的两个以上重复的膜支架蛋白的碱基序列。

在一实例中，本发明的环状膜支架蛋白可通过由内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而形成内含肽后被去除的内含肽反式剪接(trans-intein splicing)来使两末端通过共价键连接(图3的绿色部分)从而形成环状，内含肽反式剪接是指当由内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而形成完整形态的内含肽结合物时，内含肽结合物被剪接去除，并通过肽键连接位于内含肽结合物外围的外显肽结构域(融合结构域的两末端)。

根据一方面，本发明涉及一种融合蛋白，通过表达并纯化质粒来获得，上述质粒包含编码由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白的碱基序列，并且，本发明涉及一种融合蛋白，通过表达并纯化质粒来获得，上述质粒包含编码由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白的碱基序列。

根据一方面，本发明涉及一种通过表达并纯化本发明的质粒来获得的能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)。

在一实例中，上述能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)可以为通过融合蛋白的N-末端与C-末端剪接而形成环状的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白，其中，内含肽的N-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的N-末端融合。

在一实例中，上述能够与抗体结合的环状膜支架蛋白也可以称为能够与抗体结合的环状融合蛋白(esFcBP-MSP)。

在一实例中，本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白通过去除内含肽来使两末端连接从而可以形成环状，上述内含肽由Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的两末端的内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而成。

在一实施例中，本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白与线性膜支架蛋白(FcBP-MSP)相比可具有更低的内毒素浓度和更高的热稳定性。

在一实例中，本发明的能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)可以通过还原剂处理和纯化来获得。

根据一方面，本发明涉及一种能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白，由两个能够与抗体结合的环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成。

在一实例中，上述能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白可通过表达质粒并在蛋白质纯化时未经还原剂处理而纯化蛋白质来获得，上述质粒包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，其中，内含肽的N-末端结构域与本发明的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与本发明的N-末端融合。

根据一方面，本发明涉及一种大小大于能够与抗体结合的环状膜支架蛋白的能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白(Fc-eslMSP)，其由包含编码Fc区结合肽及两个以上重复的膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列的质粒编码，其中，内含肽的N-末端结构域与能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白的N-末端融合。

在一实例中，上述能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白(Fc-eslMSP)的大小可大于本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白(Fc-esMSP)的大小，并且可以具有能够与抗体结合的环状膜支架蛋白(Fc-esMSP)的1.2倍至5倍的直径。

在一实例中，上述能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白可通过表达并纯化质粒来获得，上述质粒包含编码本发明的两个以上重复的膜支架蛋白的碱基序列。

根据一方面，本发明涉及一种Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，由本发明的包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列且由内含肽的C-末端结构域与上述融合蛋白的N-末端融合而成的质粒编码，其中，内含肽的C-末端结构域与融合蛋白的N-末端融合。

根据一方面，本发明涉及一种Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，由本发明的编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列且由内含肽的N-末端结构域与上述融合蛋白的C-末端融合而成的质粒编码，其中，内含肽的N-末端结构域与融合蛋白的C-末端融合。

在一实例中，本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白可通过由融合蛋白的内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而形成内含肽后被去除的内含肽反式剪接来使两末端通过共价键连接(图3的绿色部分)从而形成环状，内含肽反式剪接是指当由内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而形成完整形态的内含肽结合物时，内含肽结合物被剪接去除，并通过肽键连接位于内含肽结合物外围的外显肽结构域(融合结构域的两末端)。

在本发明中，内含肽(intein)是在蛋白质剪接(folding)过程中被切断的区域，这种蛋白质剪接过程是一种一部分蛋白质前体在蛋白质折叠成完整形态之前被去除的翻译后过程，众所周知，在某些蛋白质中，在翻译后，一部分前体蛋白质通过自催化反应被切断，剩余部分重组成为成熟蛋白质。此时，将被切断的区域称为内含肽，将保留为成熟蛋白质的区域称为外显肽(extein)。

在一实例中，本发明的环状膜支架蛋白在末端包含内含肽的结构域，因此可以组装成环状结构，并且可以在没有内含肽的情况下使用分选酶来制成环状。

在一实例中，本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋在末端包含内含肽的结构域，因此可以组装成环状结构，并且可以在没有内含肽的情况下使用分选酶来制成环状。

在一实例中，可通过使用以下方法改进要包含在纳米穿孔器中的膜支架蛋白或融合有Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的蛋白质工程化：

1)通过分选酶A(sortase A)的蛋白质结合：是一种通过作为源自病毒的转肽酶(transpeptidase)的分选酶A的不可逆结合反应，分选酶A识别LPXTG的特定氨基酸序列并切割苏氨酸(threonine)与甘氨酸(glycine)之间来将其结合到细胞表面。这种特性是广泛用于蛋白质工程的有用方法，通过使要结合的两个蛋白质各自具有LPXTG序列和两个以上连续的甘氨酸序列，从而可以容易地产生所需的结合。应用于纳米穿孔器的蛋白质工程的分选酶可以源自硫化杆菌属(Sulfobacillus)、红色杆菌属(Rubrobacter)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、粪杆菌属(Faecalibaculum)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、Methylorubrum、Gaiella、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、布劳氏菌属(Blautia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、片球菌属(Pediococcus)或棒状杆菌属(Corynebacterium)，但并不限定于此；以及

2)内含肽反式剪接：将连接融合蛋白的C-末端与N-末端所必需的蛋白质结构域或肽片段与接头一起添加，其中，至于蛋白质结构域，应用属于下述表1中的DnaE或DnaB属的反式内含肽，但并不限定于此。这些反式内含肽在表达时以各自分离的形式表达，但是，若N-末端的结构域(Int-C)和C-末端的结构域(Int-N)相遇并结合形成一个完整形态的内含肽结合物，则内含肽结合物被剪去除，此时，位于内含肽结合物外围的外显肽通过肽键连接成一个蛋白质。

表1

虽然可通过使用上述两种方法制备本发明的环状膜支架蛋白或能够与抗体结合的环状膜支架蛋白，但在本发明的下述实施例中，通过内含肽反式剪接方法已经在大肠杆菌中制备出环状MSP蛋白，因此，与使用分选酶在体外单独制备环状MSP的方法相比，具有克服酶成本、收率、速度等问题的优点(参照图3)。通过本发明的图3的方法在重组大肠杆菌中制备的esMSP与作为MSP的原型的载脂蛋白A1相比附着有1/7的内毒素，且与普通MSP相比附着有1/2.5的内毒素，因此，具有可以提前防止内毒素引起的各种副作用的优点。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的环状膜支架蛋白的纳米穿孔器。

在一实例中，可以使用分选酶剪接膜支架蛋白的两末端。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性，提高生物稳定性。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘(lipid bilayernanodisc)及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体。

在一实例中，纳米穿孔器可以穿孔病毒的脂质双层包膜。

在一实例中，上述病毒可以为具有脂质双层包膜(或膜)的病毒，可以为选自由冠状病毒科(Family Coronaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、反转录病毒科(Retroviridae)及披膜病毒科(Togaviridae)组成的组中的一种以上病毒，更优选为流感病毒。

在一实施例中，经确认，构成纳米穿孔器的膜支架蛋白的氨基末端(N-terminus)与羧基末端(C-terminus)这两末端通过共价键剪接而形成环状结构，使用形成这种环状结构的上述膜支架蛋白的纳米穿孔器与现有的使用线性膜支架蛋白的纳米穿孔器相比，对于在热和高浓度下凝聚引起的结构损伤具有稳定性。使用环状结构连接蛋白质的两末端的方法还可以包括其他蛋白质工程技术，包括使用上述内含肽反式剪接的方法。

在本发明中，包含上述环状膜支架蛋白的纳米穿孔器可以增强纳米穿孔器所具有的抗病毒功效。构成上述环状纳米穿孔器的环状膜支架蛋白的两末端处于结合状态，因此，与现有的纳米穿孔器相比，更耐热、更稳定，并且在规定尺寸和高浓度下具有很强的凝聚抗性，因此，与现有的纳米穿孔器相比，由被施用的生物体的温度及各种蛋白酶引起的裂解或凝聚现象的发生较少，抗病毒功效也随之提高。并且，经确认，使用反式内含肽的环状膜支架蛋白的内毒素水平低于现有的线性膜支架蛋白及载脂蛋白，特别是为载脂蛋白的1/10。这可以显着降低引起高烧、头痛和败血症等副作用的内毒素被使用上述环状膜支架蛋白的环状纳米穿孔器污染的可能性(图3)。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的大环状膜支架蛋白的纳米穿孔器。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性。

在一实施例中，若在本发明的纳米穿孔器附着PEG，则纳米穿孔器的热稳定性显着提高，同时对蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的耐性显着增加。胰蛋白酶等蛋白酶破坏纳米穿孔器的结构使其失去抗病毒活性，而附着有对此具有耐性的PEG的纳米穿孔器具有优异的抗病毒活性。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体。

在一实例中，大环状膜支架蛋白可以为由两个以上膜支架蛋白融合而连接的环状膜支架蛋白，包含其的纳米穿孔器可以为表面积增加的纳米穿孔器(或者，大环状纳米穿孔器)(end-spliced large ND，eslND)，该表面积的直径为15nm以上。

在一实施例中，经确认，若使用环状结构连接两个以上膜支架蛋白来扩大纳米穿孔器的面积，则提高病毒包膜损伤能力，使用上述膜结构的蛋白质的纳米穿孔器具有规定的粒子大小，并且具有脂质双层包膜的病毒的抗病毒效果得到提高，例如，防止感染或抑制受感染病毒的增殖。

在本发明中，经确认，通过连接两个以上膜支架蛋白而大小增大的大环状纳米穿孔器通过与病毒膜的融合使得穿孔效果变得容易，抗病毒效果也随之增加。在用于上述环状纳米穿孔器的质粒中插入膜支架蛋白基因，并通过重叠克隆方法制备，但并不限定于此。并且，可以应用不限于在本发明中所使用的MSP1E3D1蛋白的多种膜支架蛋白。

在一实例中，上述环状纳米穿孔器的直径可以为10nm至100nm，更优选地，可以为15nm至50nm，只要其具有能够用作使用利用反式内含肽的膜支架蛋白的环状纳米穿孔器的尺寸即可。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的双环状膜支架蛋白的双纳米穿孔器。

在一实例中，上述双纳米穿孔器可以由两个纳米穿孔器通过二硫键(disulfidebond)连接而成。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体，两个纳米穿孔器可分别包含不同的病毒表面抗原受体。

根据一方面，本发明涉及一种由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器，其中一个纳米穿孔器包含由内含肽的C-末端结构域与本发明的膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白，另一个纳米穿孔器包含由内含肽的N-末端结构域与本发明的膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白。

在一实例中，由内含肽的C-末端结构域与上述膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白和由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白可通过共价键连接。

在一实例中，可通过去除由上述两个纳米穿孔器的内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而成的内含肽来使两个纳米穿孔器通过共价键连接，共价键可以为二硫键。

在一实例中，上述两个纳米穿孔器的各个膜支架蛋白可以包含两个以上膜支架蛋白重复的膜支架蛋白。

在一实例中，上述双纳米穿孔器可以通过利用二硫键的结合、利用硫醚(thioether)键的结合、利用分选酶的结合、利用内含肽的结合等方法制备。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体，两个纳米穿孔器可分别包含不同的病毒表面抗原受体。

在一实施例中，为了提供由两个纳米穿孔器连接而成的双纳米穿孔器结构，使用了以下内含肽反式剪接。将具有2,3-唾液酸(sialic acid)的受体插入与内含肽的N-末端结构域(Int-N)连接的纳米穿孔器中，将具有2,6-唾液酸的受体插入与Int-C连接的纳米穿孔器中，从而制备两种具有两个不同受体的纳米穿孔器。受体和具有反式内含肽结构域的纳米穿孔器的组合并不限定于此。通过反式剪接将此两个纳米穿孔器连接成一个双纳米穿孔器结构体，由此制备双纳米穿孔器结构体。通过CPE抑制分析确认纳米穿孔器或双纳米穿孔器结构体对MDCK细胞的流感病毒感染抑制功效，结果表明，所制备的双纳米穿孔器对上述几种流感病毒具有抗病毒功效，而且这种功效明显高于使用单纳米穿孔器时的功效。连接两个纳米穿孔器的方法也不限定于反式剪接，可以通过利用下述分选酶的结合、利用二硫键的结合、利用使用马来酰亚胺(maleimide)的硫醚键的结合等方法制备。并且，在本发明中，利用转导的E.coli并通过之前实施过的添加有Int-C和Int-N的膜支架蛋白的纯化方法来纯化蛋白质。利用经纯化的蛋白质制备分别包含Int-N和Int-C结构域的纳米穿孔器，为了提高反式剪接效率，处理2mM的TCEP后混合两个纳米穿孔器。这是因为在反式剪接过程中作为半胱氨酸氨基酸残基的巯基不形成二硫键并保持游离巯基是较为重要的。通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析，通过结果确认，连接单纳米穿孔器制备的双纳米穿孔器结构体的分子量约为单纳米穿孔器的两倍。并且，通过SDS-PAGE结果确认，通过SEC分离的双纳米穿孔器形成由两个膜支架蛋白连接的形态。

在一实例中，纳米穿孔器中所包含的脂质可以包括磷脂，膜支架蛋白可以为具有螺旋(helix)结构的两亲性蛋白。

在一实例中，表面抗原可以为血凝素(Hemagglutinin；HA)或神经氨酸酶(Neuraminidase；NA)。

在一实例中，受体可以为包含唾液酸的糖脂及包含唾液酸的糖蛋白，包含唾液酸的糖脂可以为神经节苷脂(ganglioside)或聚唾液酸(polysialic acid)。

在一实例中，脂质双层纳米圆盘中所包含的脂质和/或表面抗原受体与上述膜支架蛋白的摩尔比(molar ratio)可以为10：1至800：1。

在一实施例中，经确认，双纳米穿孔器结构体不仅对各种类型的病毒感染具有抑制能力，而且对特定流感病毒种类的抗病毒功效也比现有的纳米穿孔器的抗病毒功效有所提高。插入纳米穿孔器中的受体与流感病毒膜的血凝素蛋白具有结合力。根据这种结合力，它具有抑制流感病毒感染机制的特性，与单纳米穿孔器结构体相比，双纳米穿孔器结构体在每个结构体中插入的受体数量更多，因此对病毒的结合力也有所增加。在CPE抑制测定结果中确认到，双纳米穿孔器在相同受体浓度下的IC50值为单纳米穿孔器的两倍以下。由此可以推测，与纳米穿孔器相比，双纳米穿孔器对病毒的结合力由于其物理特性而有所增加。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)的纳米穿孔器。

在一实例中，上述纳米穿孔器可以包含能够与抗体结合的环状膜支架蛋白，上述能够与抗体结合的环状膜支架蛋白通过如下方式形成环状：内含肽的N-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的N-末端融合，从而使融合蛋白的N-末端与C-末端剪接。

在一实例中，可通过使用分选酶剪接由Fc区结合肽与膜支架蛋白融合而成的融合蛋白的两末端来制备能够与抗体结合的环状膜支架蛋白。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性，提高生物稳定性。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可与抗体或微型抗体结合。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体。

在一实例中，纳米穿孔器可以穿孔病毒的脂质双层包膜。

在一实例中，上述病毒可以为具有脂质双层包膜(或膜)的病毒，可以为选自由冠状病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、痘病毒科、弹状病毒科、反转录病毒科及披膜病毒科组成的组中的一种以上病毒，更优选为流感病毒。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白(Fc-eslMSP)的纳米穿孔器。

在一实例中，能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白可以包含融合蛋白，该融合蛋白通过由两个以上膜支架蛋白剪接而连接的大环状膜支架蛋白与Fc区结合肽融合而成，包含其的纳米穿孔器可以为表面积增加的纳米穿孔器(或者，大环状纳米穿孔器)，该表面积的直径为15nm以上。

在一实例中，可通过使用分选酶剪接由Fc区结合肽与两个以上膜支架蛋白融合而成的融合蛋白的两末端来制备能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白(FcBP-eslMSP)。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性，提高生物稳定性。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可与抗体或微型抗体结合。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体。

在一实施例中，经确认，若使用环状结构连接两个以上膜支架蛋白来扩大纳米穿孔器的面积，则提高病毒包膜损伤能力，使用上述膜结构的蛋白质的纳米穿孔器具有规定的粒子大小，并且具有脂质双层包膜的病毒的抗病毒效果得到提高，例如，防止感染或抑制受感染病毒的增殖。

在本发明中，经确认，通过连接两个以上膜支架蛋白而大小增大的大环状纳米穿孔器通过与病毒膜的融合使得穿孔效果变得容易，抗病毒效果也随之增加。在用于上述环状纳米穿孔器的质粒中插入膜支架蛋白基因，并通过重叠克隆方法制备，但并不限定于此。并且，可以应用不限于在本发明中所使用的MSP1E3D1蛋白的多种膜支架蛋白。

在一实例中，上述纳米穿孔器的直径可以为10nm至100nm，更优选地，可以为15nm至50nm，只要其具有能够用作使用利用反式内含肽的膜支架蛋白的纳米穿孔器的尺寸即可。

在一实施例中，经确认，构成纳米穿孔器的由Fc区结合肽与膜支架蛋白融合而成的融合蛋白的氨基末端与羧基末端这两末端通过共价键剪接而形成环状结构，使用形成这种环状结构的上述融合蛋白的纳米穿孔器与现有的使用线性膜支架蛋白的纳米穿孔器相比，对于在热和高浓度下凝聚引起的结构损伤具有稳定性。使用环状结构连接蛋白质的两末端的方法还可以包括其他蛋白质工程技术，包括使用上述内含肽反式剪接的方法。

在本发明中，包含由上述Fc区结合肽与膜支架蛋白融合而成的融合蛋白的纳米穿孔器可以增强纳米穿孔器所具有的抗病毒功效。构成上述纳米穿孔器的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白的两末端处于结合状态，因此，与现有的纳米穿孔器相比，更耐热、更稳定，并且在规定尺寸和高浓度下具有很强的凝聚抗性，因此，与现有的纳米穿孔器相比，由被施用的生物体的温度及各种蛋白酶引起的裂解或凝聚现象的较少发生，抗病毒功效也随之提高。并且，经确认，使用反式内含肽的环状膜支架蛋白的内毒素水平低于现有的线性膜支架蛋白及载脂蛋白，特别是为载脂蛋白的1/10。这可以显着降低引起高烧、头痛和败血症等副作用的内毒素被使用上述环状膜支架蛋白的环状纳米穿孔器污染的可能性(图3)。

在一实施例中，若在本发明的纳米穿孔器附着PEG，则纳米穿孔器的热稳定性显着提高，同时对蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的耐性显着增加。胰蛋白酶等蛋白酶破坏纳米穿孔器的结构使其失去抗病毒活性，而附着有对此具有耐性的PEG的纳米穿孔器具有优异的抗病毒活性。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白(FcBP-esdMSP)的双纳米穿孔器。

在一实例中，上述双纳米穿孔器可以由两个纳米穿孔器通过二硫键连接而成。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可与抗体或微型抗体结合，两个纳米穿孔器可与相同的抗体或微型抗体或者不同的抗体或微型抗体结合。

本发明的融合蛋白中所包含的FcBP以高选择性(selectivity)和特异性(specificity)与待结合抗体的Fc区结合。并且，由于上述FcBP与Fc区而非抗体的抗原结合位点结合，因此不影响抗体的抗原结合力。而且，上述FcBP可以作为抗体亲和配体固定在普通树脂等固体上。

在一实施例中，为了将纳米穿孔器与抗体结合，将结合膜支架蛋白的N-末端所必需的蛋白质结构域与接头一起添加。其中，蛋白质结构域包含属于下述表2的Fcbp，但并不限定于此。这些Fcbp可以在纯化后与抗体结合，无需进一步的化学或生物处理。位于Fcbp之后的接头具有提供有效距离和柔韧性的作用，使得纳米穿孔器在抗体与纳米穿孔器结合后能够有效地接近病毒。

表2

名称	序列
		Fc-3	TCWVLEGLHWACD
Fc-3-4c	CTCWVLEGLHWACDC
		TWKTSRISIF	TWKTSRISIF
FGRLVSSIRY	FGRLVSSIRY
		EPIHRSTLTALL	EPIHRSTLTALL
HWRGWV	HWRGWV
		HYFKFD	HYFKFD
HFRRHL	HFRRHL
		HWCitGWV	HWCitGWV
NKFRGKYK	NKFRGKYK
		NARKFYKG	NARKFYKG
FYWHCLDE(1)	FYWHCLDE
		FYCHWALE(2)	FYCHWALE
FYCHTIDE(3)	FYCHTIDE
		KHRFNKD	KHRFNKD
RRGW	RRGW

在本发明中，术语“抗体”为本领域公知的术语，是指针对抗原位点的特异性蛋白质分子。

可以使用公知的方法制备上述抗体。这里还可以包括可以由上述蛋白制成的部分肽。本发明的抗体的形式不受特别限制，若是多克隆抗体、单克隆抗体或具有抗原结合性的抗体，则其一部分也包括在本发明的抗体中，并且包括所有免疫球蛋白抗体。进一步地，本发明的抗体还可以包括人源化抗体等特殊抗体。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体，两个纳米穿孔器可分别包含不同的病毒表面抗原受体。

根据一方面，本发明涉及一种由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器，其中一个纳米穿孔器包含本发明的Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，另一个纳米穿孔器包含本发明的Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白。

在一实例中，由上述两个纳米穿孔器的内含肽的N-末端结构域与内含肽的C-末端结构域结合而形成的内含肽被去除，从而两个纳米穿孔器可以通过共价键连接。

在一实例中，上述两个纳米穿孔器的各个膜支架蛋白可以包含两个以上膜支架蛋白重复的膜支架蛋白。

在一实例中，上述双纳米穿孔器可以通过利用二硫键的结合、利用硫醚键的结合、利用分选酶的结合、利用内含肽的结合等方法制备。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可与抗体或微型抗结合，两个纳米穿孔器可与相同的抗体或微型抗体或者不同的抗体或微型抗体结合。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以被聚乙二醇化，从而可提高结构体的稳定性，提高裂解酶抗性。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器可以包含脂质双层纳米圆盘及围绕上述纳米圆盘外周表面的膜支架蛋白，还可以包含病毒表面抗原受体，两个纳米穿孔器可分别包含不同的病毒表面抗原受体。

在一实例中，纳米穿孔器中所包含的脂质可以包括磷脂，膜支架蛋白可以为具有螺旋(helix)结构的两亲性蛋白。

在一实例中，表面抗原可以为血凝素或神经氨酸酶。

在一实例中，受体可以为包含唾液酸的糖脂及包含唾液酸的糖蛋白，包含唾液酸的糖脂可以为神经节苷脂或聚唾液酸。

在一实例中，脂质双层纳米圆盘中所包含的脂质和/或表面抗原受体与上述膜支架蛋白的摩尔比可以为10：1至800：1。

在本发明中，术语“纳米穿孔器”是指包含脂质双层纳米圆盘(nanodisc)及围绕上述脂质双层外周表面的膜支架蛋白且可以执行穿孔病毒包膜功能的纳米级物质。上述纳米穿孔器包含具有圆盘(disc)形态的单层(unilamellar)的脂质双层，即，脂质双层纳米圆盘，可以为上述脂质双层的外周表面(outer circumference surface)被两个以上膜支架蛋白，例如两个膜支架蛋白包围的形式的复合物。本发明的术语“脂质双层纳米圆盘”是指包含脂质双层的单层的圆盘形态的物质，其特征在于，上述脂质双层的两面都有一个暴露在外面的开放系统(open system)。膜支架蛋白是指作为高密度脂蛋白(High densitylipoprotein)的主要成分的载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，ApoA-1)的修饰形式，其疏水表面面向脂质，亲水表面向外定位以形成稳定的圆盘形态。可以根据膜支架蛋白的螺旋数制备多种尺寸的纳米圆盘，主要使用的膜支架蛋白包括MSP1D1、MSP1D1dH5、MSP1E3D1、MSP2N2等，但并不限定于此。纳米圆盘的优点在于，无需其他表面活性剂即可使脂质稳定地溶解在水溶液中，利用这一点，膜蛋白被插入到脂质双层中，即使在水溶液中也可以轻松研究膜蛋白。例如，上述脂质可以为选自由磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)及胆固醇组成的组中的一种以上，但只要是能够构成双层的脂质就不限定于此。上述磷脂酰胆碱可以为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DMPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，POPC)、C13PC、1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DDPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DEPC)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DLOPC)、蛋磷脂酰胆碱(Egg phosphatidylcholine，EPC)、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，MSPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Palmitoyl-2-strearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PSPC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Strearoyl-2-nyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，SMPC)或1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-Strearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，SPPC)，上述磷脂酰甘油可以为二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DSPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，POPG)、二芥酰磷脂酰甘油(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DEPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DLPG)、二油酰磷脂酰甘油(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DOPG)或二硬脂酰磷脂酰甘油(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]，DSPG)，上述磷脂酰乙醇胺可以为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DMPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine，DPPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DEPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DLPE)或1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，POPE)，上述磷脂酰丝氨酸可以为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine，DOPS)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine，DLPS)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine，DMPS)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine，DPPS)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine，DSPS)或POPS。

本发明的纳米穿孔器除了纳米穿孔器之外还可以包括具有上述脂质双层包膜的病毒表面抗原受体。本发明的纳米穿孔器可以包括一种或两种以上受体。

在本发明一实施例中，包含围绕脂质双层的膜支架蛋白的纳米穿孔器也被描述为纳米圆盘。即，在本发明中，术语“纳米穿孔器”与“纳米圆盘(nanodisc，ND)”可互换使用。但是，当提及到磷脂纳米颗粒的结构方面时，使用纳米圆盘，而当提及到针对抗病毒活性的功能方面时，使用纳米穿孔器。并且，在比较有受体和无受体情况的实验中，将不含受体的用NP表示，将含有受体(例如，主要包含GD1a、GT1b及GM1的神经节苷脂聚集体TG(totalganglioside))的用NPTG(或NDTG)表示。但是，如果没有这种区别，那就是只强调结构特征的情况。

在一实例中，构成上述脂质双层纳米圆盘的脂质除了上述磷脂之外还可以包含选自由如甘油三酯、胆固醇(cholesterol)或其衍生物等中性脂肪以及如神经节苷脂等糖脂(saccharolipid)组成的组中的一种以上。

在本发明中，术语“具有脂质双层包膜(或膜)的病毒”是指病毒中具有脂质双层包膜的病毒，参与上述病毒的感染及增殖的抗原蛋白以膜结合蛋白形式包含在上述脂质双层中。具有上述脂质双层包膜的病毒只要是在本发明中提供的纳米穿孔器具有抗病毒活性就不受特别限制，但是，例如，可以为属于冠状病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、痘病毒科、弹状病毒科、反转录病毒科及披膜病毒科等的科(family)的病毒，作为再一例，可以为属于布尼亚病毒科的辛诺柏病毒(SinNombre Hantavirus)等；属于冠状病毒科的参与各种急性呼吸系统综合征的冠状病毒(Coronavirus)等；属于丝状病毒科的埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburgvirus)等；属于黄病毒科的西尼罗病毒(West Nile virus)、黄热病毒(Yellow Fevervirus)、登革热病毒(Dengue Fever virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)等；属于嗜肝DNA病毒科的乙肝病毒(Hepatitis B)等；属于疱疹病毒科的单纯疱疹病毒1型(HerpesSimplex 1virus)、单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex 2virus)等；属于正粘病毒科的流感病毒(Influenza virus)等；属于痘病毒科的天花病毒(Smallpox virus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、传染性软疣病毒(Molluscumcontagiosumvirus)、猴痘病毒(Monkeypoxvirus)等；属于弹状病毒科的狂犬病病毒(Rabies virus)等；属于反转录病毒科的人体免疫缺损病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)等；属于披膜病毒科的基孔肯亚病毒(Chikungunya virus)等；属于疱疹病毒科的假狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、HHV病毒等，作为另一例，可以为属于正粘病毒科的流感病毒。例如，上述病毒可以为具有对包含在纳米穿孔器中的受体(例如，神经节苷脂)具有亲和力的特征的病毒。

在本发明中，术语“流感病毒”是指属于正粘病毒科的RNA病毒，血清型分为A型、B型和C型三种。A型流感病毒的血清型根据病毒表面血凝素和神经氨酸酶两种蛋白的类型进行分类，已知目前共有144种(HA蛋白16种和NA蛋白9种)

在本发明中，术语“表面抗原(surface antigen)”也称为细胞膜抗原，是指存在于细胞的细胞膜中的具有抗原性的膜结合蛋白。在本发明中，上述表面抗原可以解释为与具有脂质双层包膜的病毒的脂质双层结合的膜结合蛋白，上述表面抗原不特别限于此，例如，流感病毒的表面抗原可以是血凝素(Hemagglutinin；HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase；NA)等。本发明的术语“血凝素”是跨膜蛋白，是流感病毒表面抗原的一种，由可被胰蛋白酶切割的HA1亚基和HA2亚基组成。已知上述HA1亚基与唾液酸结合，上述HA2亚基在低pH条件下诱导细胞膜融合。

在本发明中，术语“表面抗原受体”是指能够与上述表面抗原结合的受体，并且可以是针对上述表面抗原的抗体，或者可以是上述表面抗原可以结合的另一种细胞膜结合蛋白。

在本发明中，上述表面抗原受体存在于可被具有脂质双层包膜的病毒感染宿主细胞表面，可以解释为能够与上述病毒的表面抗原结合的受体。上述受体与病毒表面抗原可以通过氢键、离子键等多种相互作用结合，例如，病毒的血凝素的HA1亚基最外表面的受体结合位点(receptor binding site)与唾液酸结合。因此，本发明的受体可以是能够特异性或亲和性结合靶病毒的受体，例如，包含血凝素或神经氨酸酶的病毒。

在一实例中，上述表面抗原受体的类型不特别限于此，但可以包含唾液酸或具有类似于唾液酸的功能的官能团(例如，唾液酸模拟肽)。上述受体可以是选自由如神经节苷脂、糖蛋白(glycoprotein)聚唾液酸等唾液酸寡糖(sialyloligosaccharide)组成的组中的一种以上，但如果是含有唾液酸的受体，则不限于此。

在一实例中，上述官能团可以通过受体本身陷入或结合至脂质双层，或通过接头(linker)陷入或结合至脂质双层。

在一实例中，上述受体可以是受体本身或受体所结合的接头通过如氢键、离子键、共价键、二硫键等各种相互作用与纳米圆盘脂质双层的脂质结合的受体。

在一实例中，作为上述受体的一个例子，存在于呼吸细胞的细胞膜中的唾液酸可以与作为流感病毒的表面抗原的血凝素结合，例如，可以包含上述唾液酸和与细胞膜结合的神经节苷脂。

在本发明中，术语“神经节苷脂”是指一种或多种唾液酸与鞘糖脂(glycosphingolipid)的糖链(sugar chain)通过特定键(α-2,3-键或α-2,6-键)连接的形式的化合物，可以包括含有通过α-2,3-键连接的唾液酸的形式和含有通过α-2,6-键连接的唾液酸的形式。例如，本发明的神经节苷脂可以为包含一个Ν-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid)或唾液酸的GM1、GM2或GM3；包含两个N-乙酰神经氨酸的GD1a、GD1b、GD2或GD3；具有三个N-乙酰神经氨酸的GT1b或GT3；具有四个N-乙酰神经氨酸的GQ1。

在本发明中，在具有α-2,6键的神经节苷脂中，GD1a具有两个N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。通过噬斑形成抑制试验(plaque forming inhibition assay)和细胞病变抑制试验(CPE inhibition assay)进行分析，结果确认，具有GD1a的纳米穿孔器在流感病毒株(strain)中分别对A/PR/8/34、A/Sydney/5/97、A/aquatic bird/Korea/w81/2005显示出强大的抗病毒功效。然而，具有GD1a的纳米穿孔器对A/X-31株显示出较弱的抗病毒功效。并且，经确认，具有人工α-2,6唾液酸形式的受体(2,6SL)对流感病毒A/X-31株显示出选择性强的抗病毒功效，但具有GD1a的纳米穿孔器对具有抗病毒功效的三种流感病毒株具有较弱的感染抑制功效。为了克服这一点，当使用具有GD1a和2,6SL受体的单个纳米穿孔器的混合物时，确认了4株(strain)的抗病毒功效，但在相同浓度下，功效显着低于使用单个单纳米穿孔器时的效果。并且，将其他两种受体GD1a和2,6SL插入单个纳米穿孔器时，仅观察到可以暴露在外部的2,6SL受体功效。

在一实例中，上述受体，例如神经节苷脂，被插入到脂质双层纳米穿孔器的脂质双层纳米圆盘区域中，并且可以起到与具有脂质双层包膜的病毒的HA结合的作用。

在本发明中提供的纳米穿孔器具有如下特征：

环状纳米穿孔器(essND或esdND)：包含在膜支架蛋白的两末端分别附着内含肽的C-末端结构域及N-末端结构域来使两末端结合的环状膜支架蛋白(esMSP)的纳米穿孔器，作为这种纳米穿孔器，在esMSP纯化时可根据还原剂的处理与否制备包含单环状纳米穿孔器(essND)(处理还原剂)或通过二硫键连接的双环状膜支架蛋白的双纳米穿孔器(esdND)(未处理还原剂)；

大环状纳米穿孔器(eslND)：包含通过esMSP的螺旋长度加倍(MSP 2重复)而大小增大的蛋白(eslMSP)的纳米穿孔器；

双纳米穿孔器(Di-NP)：使用通过在膜支架蛋白分别附着CfaN及CfaC内含肽而成的蛋白(CfaC-MSP及MSP-CfaN)分别制备纳米穿孔器后，通过反式剪接由共价键结合的双纳米穿孔器；

抗体结合环状纳米穿孔器(Fc-essND或Fc-esdND)：包含在由Fc区结合肽与膜支架蛋白融合而成的融合蛋白的两末端分别附着Cfa内含肽的C-末端结构域及N-末端结构域来使两末端结合的环状融合蛋白(Fc-esMSP)(能够与抗体结合的环状膜支架蛋白)的纳米穿孔器，作为这种纳米穿孔器，在Fc-esMSP纯化时可根据还原剂的处理与否制备包含单环状纳米穿孔器(Fc-essND)(处理还原剂)或通过二硫键连接的环状融合蛋白的双纳米穿孔器(Fc-esdND)(未处理还原剂)；

抗体结合大纳米穿孔器(Fc-eslND)：包含通过MSP的螺旋长度加倍(MSP 2重复)而大小增大的融合蛋白(Fc-eslMSP)的纳米穿孔器；以及

抗体结合双纳米穿孔器(Di-NP)：使用通过在由Fc区结合肽与膜支架蛋白融合而成的融合蛋白分别附着CfaN及CfaC内含肽而成的蛋白(CfaC-FcMSP及FcMSP-CfaN)分别制备纳米穿孔器后，通过反式剪接由共价键结合的双纳米穿孔器。

上述纳米穿孔器也可以衍生附着有BM(PEG)₃的聚乙二醇化的纳米穿孔器的结构来提供。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的纳米穿孔器的用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。

在一实例中，病毒可以为选自由冠状病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、痘病毒科、弹状病毒科、反转录病毒科及披膜病毒科组成的组中的一种以上病毒，但并不限定于此。

在一实施例中，已经发现，若本发明的纳米穿孔器附着在抗体，则显著提高抗体的功效。此时，能够与纳米穿孔器结合的抗体可以靶向构成病毒的蛋白质，例如作为流感病毒的表面抗原的血凝素、神经氨酸酶、M2离子通道蛋白等。并且，与上述表面抗原结合的其他蛋白质或肽也包括在膜支架蛋白的结构改进中，可以代替抗体使用。

在一实例中，由在图28中以(A)、(B)、(C)及(D)表示的各个结构体构成的复合物可用作用于治疗/改善抗病毒病症的组合物。在一实施例中，经确认，纳米穿孔器中导入能够与抗体的Fc部分结合的蛋白序列，从而可最大化抗病毒抗体的下效果，并且确认，当形成由能够与抗体结合的纳米穿孔器(FcND)和抗体结合而成的结构体时，不仅单一抗体的效果，而且抗病毒效果也比抗体和纳米穿孔器的混合物的效果增强得多。并且，经确认，若将上述发明引入广谱中和抗体(broad neutralizing antibody：bnAb)，则可以提高抗体对bnAb可以抑制的所有流感病毒株的抗病毒效果。

通过使用本发明的纳米穿孔器，例如包含神经节苷脂作为表面抗原受体的纳米穿孔器，破坏感染宿主细胞的病毒，例如打断流感病毒的细胞内感染途径，从而可以抑制病毒的增殖。

通常，构成病毒HA的HA1亚基通过与宿主细胞膜中的唾液酸结合而通过内吞作用侵入宿主细胞内。另一方面，若对病毒感染的细胞处理如包含神经节苷脂作为受体的纳米穿孔器等本发明的纳米穿孔器，则上述病毒的HA不仅存在于宿主细胞膜中，而且可与纳米穿孔器的脂质双层纳米圆盘和/或受体结合，并且，若增加纳米穿孔器的处理量，则病毒与上述纳米穿孔器结合的比例增加，从而防止上述病毒感染宿主细胞。因此，上述纳米穿孔器可能是一种将其用作模拟宿主细胞受体的“诱饵(decoy)”来抑制病毒侵入细胞内的侵入抑制剂(entry inhibitor)(一次抑制)。

在上述病毒侵入细胞内的过程中的晚期内体阶段诱导的膜融合阶段中，与本发明的纳米穿孔器结合的病毒没有表现出病毒包膜与宿主细胞的细胞膜之间的膜融合，而可以表现出病毒包膜与纳米穿孔器的脂质双层之间的融合。这种细胞膜融合的出现是概率性的，当一个宿主细胞膜和多个纳米穿孔器与一种病毒结合时，在病毒包膜与宿主细胞的细胞膜之间不会发生膜融合，而是可在病毒包膜与纳米穿孔器的脂质双层之间发生膜融合。像这样，若在内体中的病毒包膜与纳米穿孔器的脂质双层之间发生膜融合，则存在于病毒内部的RNA通过上述膜融合部位释放到内体内部，由于内体内部的低pH值，释放的RNA被灭活，导致最终分解。因此，本发明的纳米穿孔器可以是在病毒内体阶段的膜融合阶段对病毒包膜进行穿孔的穿孔器(perforator)(二次抑制)。

即，上述纳米穿孔器与病毒包膜结合，抑制病毒侵入细胞内而形成内体(一次抑制)，即使病毒侵入细胞内，纳米穿孔器也会充当穿孔侵入的病毒包膜的“穿孔器”(二次抑制)，它可以表现出对病毒感染的二次抑效果。因此，当表面抗原受体，例如对感染了具有上述脂质双层包膜的病毒的细胞处理包含神经节苷脂的纳米穿孔器时，上述病毒的感染途径被打断，从而抑制了病毒的感染，最终抑制病毒的增殖，从而表现出治疗由病毒感染引起的疾病效果。

综上所述，在本发明提供中的纳米穿孔器可抑制具有脂质双层包膜的病毒感染宿主细胞，或从根本上抑制感染后的增殖，从而可以表现出预防或治疗病毒感染引起的疾病的效果。由此可知，只要是以宿主细胞的唾液酸为媒介与宿主细胞结合的病毒，无论是否发生变异，在本发明提供中的包含神经节苷脂的脂质双层纳米穿孔器都可以表现出相同的效果，并且具有可以抑制上述病毒的初期感染，甚至病毒在宿主体内感染后，也从根本上抑制上述病毒增殖的优点。

因此，本发明的纳米穿孔器的特征可以为不依赖于病毒变异。特别是，上述纳米穿孔器的优点在于，可以确保安全，因为它不包含在体内诱导特异性反应的物质。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可以通过结合选自由组氨酸(His)、金(Au)、荧光脂质及生物素/抗生物素蛋白(biotin/avidin)、荧光物质组成的组中的一种以上的标志物来使用。

在一实例中，选自由构成上述纳米穿孔器中所包含的脂质双层的脂质及表面抗原受体组成的组中的一种以上与上述膜支架蛋白的摩尔比([(脂质双层纳米圆盘脂质的摩尔数)+(表面抗原受体的摩尔数)]：膜支架蛋白的摩尔数)为10：1至800：1，优选为50：1至500：1，更优选为50：1至150：1，例如，可以为65：1或125：1。例如，上述摩尔比可以为纳米圆盘的脂质与膜支架蛋白的摩尔比或者纳米圆盘的脂质及表面抗原受体摩尔比之和与膜支架蛋白的摩尔比。

在一实例中，以纳米圆盘的总摩尔数(例如，脂质的摩尔数及受体摩尔数之和)100％为基准，本发明的纳米穿孔器中所包含的表面抗原受体的含量可以为0.01摩尔百分比至99摩尔百分比，优选地，可以为为1摩尔百分比至90摩尔百分比，更优选地，可以为15摩尔百分比以上或10摩尔百分比至50摩尔百分比。

在本发明中提供的纳米穿孔器由于改变膜支架蛋白(Membrane ScaffoldProtein)的特性，有望比现有的纳米穿孔器具有更好的病毒预防及治疗效果。

在一实例中，本发明的纳米穿孔器可同样应用于用于治疗、预防、改善或延迟与病毒感染相关或由病毒感染引起的一种以上症状的发展的药物组合物或者用于治疗、预防、改善或延迟与病毒感染相关或由病毒感染引起的一种以上症状的发展的用途。

由于本发明的纳米穿孔器可以打断具有脂质双层包膜的病毒的感染途径或抑制被感染病毒的增殖，因此上述纳米穿孔器可以用于预防或治疗由具有脂质双层包膜的病毒感染引起的各种感染。本发明的用于预防或治疗病毒感染的组合物的优点在于，可单独地应用于病毒变异中，上述纳米穿孔器不含在体内诱导特异性反应的物质，因此可确保安全性。

在本发明中，术语“病毒感染”是指由具有上述脂质双层包膜的病毒感染引起的疾病，作为一例，可以为由布尼亚病毒科的病毒感染引起的肾病综合征出血热(流行性出血热)；由冠状病毒科的病毒感染引起的呼吸道疾病，如感冒；由黄病毒科的病毒感染引起的丙型肝炎；由嗜肝DNA病毒科的病毒感染引起的乙型肝炎；由疱疹病毒科的病毒感染引起的带状疱疹；由正粘病毒科的病毒感染引起的流行性感冒或流感病毒感染；由痘病毒科的病毒感染引起的天花；由弹状病毒科的病毒感染引起的狂犬病或水泡性口炎；由反转录病毒科的病毒感染引起的获得性免疫缺陷等，作为另一例，可以为属于正粘病毒科的流感病毒感染引起的流行性感冒或流感病毒感染。

本发明的组合物中所包含的纳米穿孔器可以包含一种或两种以上表面抗原受体。例如，两种以上受体可包含在纳米穿孔器中。并且，上述组合物可以包含含有一种以上不同的受体的两种以上纳米穿孔器。

在本发明中，术语“治疗(treat)”是指改善或有利地改变由病毒感染引起的感染症状的活性。本发明所属领域的普通技术人员参考大韩医学会等提供的资料，知道本申请的组合物对其有效的疾病的确切标准，并且可以判断改善、提高及治疗的程度。

在本发明中，术语“预防(prevention)”是指预防由疾病或障碍或者由疾病/障碍引起的一种以上症状的发展、复发或传播，并且可以包括对潜在候选者的预防性治疗(prophylactic treatment)。

上述本发明的组合物可以制备成还包含通常用于制备药物组合物的适当载体、赋形剂或稀释剂的用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物的形式，上述载体可以是非天然载体。具体地，上述药物组合物可按照常规方法分别制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型，外用剂、栓剂及无菌注射液等形式来使用。在本发明中，可包含由药物组合物中可包含的各种载体、赋形剂及稀释剂组成的组中的一种以上。

本发明的药物组合物中所包含的上述纳米穿孔器的含量不特别限定，作为一例，以最终组合物的总重量为基准，其含量可以为0.0001重量百分比至10重量百分比，作为另一例，含量可以为0.01重量百分比至3重量百分比。

本发明的组合物的治疗有效量可以根据多种因素而变化，例如给药方法、靶部位、患者的状况等。因此，在人体内使用时，应考虑安全性和有效性，应将给药量确定为适量。也可以从通过动物实验确定的有效量来估计人体中使用的量。例如，确定有效量时需要考虑的事项在Hardman and Limbird,eds.,Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics,10th ed.(2001),Pergamon Press；

E.W.Martin ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990),Mack Publishing Co.中描述。

本发明的药物组合物以药学有效量给药。在本发明中所使用的术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病且不引起副作用的量，有效剂量水平取决于患者的健康状况、疟疾的类型和严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药方法、给药时间、给药途径和排泄率、治疗时间、药物联合或并用等因素以及医学领域熟知的其他因素。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合施用，可以与现有的治疗剂按顺序或同时施用，并且可以单独或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是给予能够以最小量获得最大效果且没有副作用的量，这对于本领域技术人员来说是容易确定的。

本发明的组合物还可以包括通常用于生物制剂中的载体、稀释剂、赋形剂或其两种以上的组合。药学上可接受的载体没有特别限制，只要它适合于组合物的体内递送即可，例如，可以使用Merck Index,13th ed.,Merck&Co.Inc.中记载的化合物、盐水、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及中的一种成分或者可以混合它们中的一种以上成分来使用，根据需要，可以添加其他常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂及抑菌剂等。并且，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂以配制成如水溶液、混悬剂、乳剂等可注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。进一步地，可以使用本领域中的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中公开的方法，根据每种疾病或成分优选地对其进行配制。

在本发明中所使用的术语“药学上可接受的”是指表现出对暴露于上述组合物的细胞或人无毒性的特性。

本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂，此时，作为药学上可接受的添加剂，可使用淀粉、糊化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇，麦芽糖，阿拉伯胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石等。相对于上述组合物，本发明的药学上可接受的添加剂的含量优选为0.1重量份至90重量份，但并不限定于此。

在本发明中所使用的术语“给药”是指通过任何合适的方法向患者提供规定物质，根据所需的方法，可以使用肠胃外给药(例如，静脉内、皮下、腹腔内或局部注射制剂)或口服给药，剂量范围可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度而不同。

本发明的药物组合物的剂量可由本领域技术人员考虑使用目的、疾病成瘾程度、年龄、体重、性别、病史或用作有效成分的物质的类型等来确定。例如，本发明的药物组合物可以以每名成人约0.1ng至约100mg/kg，优选1ng至约10mg/kg的量施用，并且本发明的组合物的施用频率没有特别限定，但可以一天给药一次，也可以分次给药数次。上述剂量不以任何方式限制本发明的范围。

本发明的用于治疗病毒感染的药物组合物的给药途径可以通过任何一般途径给药，只要其能够到达靶组织即可。本发明的药物组合物没有特别限定，根据目的，可以通过腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、鼻内给药、肺内给药、直肠给药等途径给药。然而，当口服给药时，由于上述纳米穿孔器可能被胃酸变性或破坏，口服用组合物应配制成包被活性剂或防止其在胃中分解。并且，上述组合物可以通过能够将活性物质转运至靶细胞的任何装置来施用。

根据一方面，本发明涉及一种包含本发明的纳米穿孔器的用于抑制病毒增殖的组合物。

在一实例中，上述抑制病毒增殖的纳米穿孔器可与病毒包膜结合来穿孔病毒包膜。

根据一方面，本发明涉及一种病毒感染的治疗方法，包括：将上述药物组合物以药物有效量施用于可能发展或患有由具有脂质双层包膜的病毒感染引起的病毒感染的个体。

在本发明中，术语“个体”可以包括因感染具有脂质双层包膜的病毒而可能发展或患有病毒感染的包括人类、小鼠、家畜等在内的哺乳动物、养殖鱼类等，但并不限定于此。

根据一方面，本发明涉及一种包含环状膜支架蛋白的纳米穿孔器的制备方法，包括如下步骤：通过表达并纯化本发明的质粒来获得环状膜支架蛋白；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，本发明的essND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码融合蛋白的碱基序列的质粒，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与本发明的膜支架蛋白的C-末端融合且内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成，内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合；经还原剂处理来纯化环状膜支架蛋白(esMSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，上述还原剂可以为TCEP。

在一实例中，本发明的eslND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码融合蛋白的碱基序列的质粒，上述融合蛋白依次包含内含肽的C-末端结构域、两个以上膜支架蛋白及内含肽的N-末端结构域；纯化大环状膜支架蛋白(eslMSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，上述质粒可以表达包含两个以上重复的膜支架蛋白的融合蛋白。

根据一方面，本发明涉及一种双纳米穿孔器的提供方法。

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器esdND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码融合蛋白的碱基序列的质粒，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与本发明的膜支架蛋白的C-末端融合且内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成，内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合；通过排除还原剂来纯化由两个环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成的双环状膜支架蛋白(esdMSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器

在一实例中，本发明的双纳米穿孔器Di-ND的制备方法可包括如下步骤：

通过表达并纯化包含编码由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白的碱基序列的质粒来获得由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白；通过自组装过程制备第一纳米穿孔器；通过表达并纯化包含编码由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白的碱基序列的质粒来获得由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白；通过自组装过程制备第二纳米穿孔器；以及使第一纳米穿孔器与第二纳米穿孔器通过共价键结合。

根据一方面，本发明一种纳米穿孔器的制备方法，包括如下步骤：通过表达并纯化本发明的质粒来获得能够与抗体结合的融合蛋白；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，本发明的Fc-essND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码本发明的能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)的碱基序列的质粒；经还原剂处理来纯化能够与抗体结合的膜支架蛋白(FcBP-MSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，上述还原剂可以为TCEP。

在一实例中，本发明的Fc-eslND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码本发明的能够与抗体结合的大膜支架蛋白(FcBP-eslMSP)的碱基序列的质粒；纯化包含两个以上重复的膜支架蛋白的能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白(Fc-eslMSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，上述质粒可表达由Fc区结合肽与两个以上膜支架蛋白剪接而形成环状的融合蛋白。

根据一方面，本发明涉及一种双纳米穿孔器的提供方法。

在一实例中，本发明的Fc-esdND的制备方法可包括如下步骤：

表达包含编码本发明的能够与抗体结合的环状膜支架蛋白的碱基序列的质粒；通过排除还原剂来纯化由两个环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成的能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白(FcBP-esdMSP)；以及通过自组装过程制备纳米穿孔器。

在一实例中，本发明的Fc-Di-ND的制备方法可包括如下步骤：

通过表达并纯化包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列的质粒来获得Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，内含肽的C-末端结构域与融合蛋白的N-末端融合；通过自组装过程制备第一纳米穿孔器；通过表达并纯化包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列的质粒来获得Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，内含肽的N-末端结构域与融合蛋白的C-末端融合；通过自组装过程制备第二纳米穿孔器；以及使第一纳米穿孔器与第二纳米穿孔器通过共价键结合。

根据一方面，本发明涉及一种纳米穿孔器的抗病毒剂用途。

根据一方面，本发明涉及一种使用本发明的纳米穿孔器的病毒感染的治疗方法。

发明的实施方式

通过以下实施例更详细地说明本发明。但是，以下实施例仅用于具体化本发明的内容，而本发明并不限定于此。

实施例1.包含环状膜支架蛋白的纳米穿孔器esNP的制备

1-1.使用Cfa内含肽的环状膜支架蛋白esMSP生产用质粒的制备

CfaN和CfaC的DNA序列信息提取自Stevens AJ,et al.,2016,Design of a SplitIntein with Exceptional Protein Splicing Activity,J Am Chem Soc。并且，将GGGGSGGGGSGGGGS接头用作CfaC-接头的接头序列，将7个组氨酸序列重复的His-tag用作CfaN-His-tag。MSP1E3D1基因序列排列在CfaC-linker与CfaN-His-tag之间，最终的基因结构为CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN(以下，简称esMSP)(图1)。基因(Gene)的合成、克隆及测序委托给了公司(Cosmogene Tech，韩国)，委托的CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN(esMSP)的DNA序列(序列1)如下述表3所示。

表3

1-2.esMSP的纯化

将上述制备的各质粒通过热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中以进行蛋白质纯化。将在含有50μg/ml的卡那霉素(kanamycin)的固体培养基中生长的菌落接种到含有10ml的卡那霉素的液体培养基(LB broth miller)中，在37℃的振荡培养箱(shakingincubator)中培养16小时后，在600ml的相同液体培养基中进行第二次接种。当大肠杆菌生长至OD600为0.5～0.8时，通过用0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)处理来进行蛋白质表达。在37℃和150rpm的条件下表达3小时后，以6000rpm的速度离心分离10分钟以去除培养基，仅获得细胞。使用含有1％TritonX-100的tris缓冲液重悬(resuspension)细胞，并使用超声波破坏细胞。通过离心分离仅分离细胞底物后，处理Ni-NTA琼脂糖珠。使用分别含有Triton X-100、胆酸钠(sodiumcholate)及低浓度咪唑(imidazole)的缓冲液去除不能与微珠结合的物质，使用高浓度咪唑得到待纯化的蛋白质。作为参考，在上述纯化过程中，使用了不含2mM的TCEP的缓冲溶液。在这个过程中，在用于esMSP蛋白环化的Cfa内含肽反式剪接过程中，作为半胱氨酸氨基酸残基的巯基(thiol)由于高反应性相互反应形成二硫键，因此，用TCEP处理和未处理的esMSP蛋白、R(还原(reducing))和NR(非还原(non-reducing))在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并通过考马斯亮蓝染色确认。结果，如图2的上端所示，大部分未用TCEP处理的esMSP蛋白纯化为由两个esMSP蛋白通过二硫键连接而成的形式，并且确认到该形式也可以根据TCEP的有无自由调节。并且，对经纯化的蛋白质处理用于去除蛋白质的N-末端His-tag的DAPase，结果确认，作为对照组的MSP1E3D1蛋白因DAPase去除N-末端His-tag而尺寸减小，而esMSP没有被DAPase引起反应，因此大小没有变化，从而确认了esMSP的环状结构(图2的下端)。

并且，为了测量相比于以前用于制备纳米圆盘的蛋白质ApoA-1及MSP1E3D1的esMSP的内毒素量，进行了LAL分析。通过将三种浓度相近的蛋白质分别稀释2000、4000及8000倍来测量内毒素(endotoxin)浓度，使用已知内毒素浓度的标准内毒素测量每毫升的内毒素单位(endotoxin uni，EU)值，通过应用蛋白质浓度计算每毫克蛋白质的内毒素量。结果，计算出的ApoA-1的内毒素浓度最高，为171.64EU/mg，测得的MSP1E3D1的内毒素浓度为53.28EU/mg。然而，测得的esMSP的内毒素浓度为24.62EU/mg，这是较低的内毒素浓度。由此确认，在通过相同条件的纯化过程获得的膜支架蛋白中，环状结构的esMSP对内毒素的结合力低于其他线性膜支架蛋白，内毒素浓度也较低(图3的下端)。

1-3.esMSP的热稳定性的确认

将上述经纯化的esMSP和作为对照组的MSP1E3D1蛋白在待处理的不同温度下以40μM的浓度分别准备200μl。将准备好的试样在不同温度下分别培养30分钟后，以20000g离心分离1小时来分离上清液，使用200μl的100mM的NaCl、40mM的Tris-Cl及pH7.4缓冲液充分溶解沉降的沉淀物。每个样品与6X SDS缓冲液混合，在95℃的水中煮沸10分钟，然后在15％、10孔(well)和0.75mm的SDS-PAGE凝胶上进行电泳。之后，通过GelAnalyzer计算得到的凝胶的不溶性部分(insoluble fraction)与可溶性部分(soluble fraction)的比例。结果确认，随着温度升高，作为对照组的MSP1E3D1蛋白增加了不溶性部分，同时降低了可溶性部分，而确认了esMSP蛋白即使在高温下很大程度上也以可溶(soluble)形式存在(图4)。并且，在凝胶分析仪(gel analyzer)分析的结果中，确认MSP1E3D1蛋白中变为不溶性部分的蛋白量逐渐增加后变性至总蛋白的约70％，而esMSP蛋白即使在80℃下仅变性至约30％。由此可知，两末端连接的esMSP蛋白的热稳定性是线性MSP蛋白的两倍以上。

1-4.包含esMSP的纳米穿孔器esNP(end-spliced NP)的制备

作为脂质，将POPC溶解于氯仿中来准备浓度为25mg/ml的脂质溶液。然后，将121.616μl的25mg/ml的POPC溶液转移到玻璃管中，以使使用添加了400ml的胆酸钠的NP缓冲液(40mM的Tris-Cl、300mM的NaCl、0.5mM的EDTA、pH7.4)溶解时脂质的浓度成为10mM。之后，加入氮气，在真空状态下放置至少4小时，除去溶剂，得到脂质膜(lipid film)。在所得的上述脂质膜中使用添加了胆酸钠的0.4ml上述NP缓冲液以使上述脂质膜水合，在55℃下超声波处理15分钟，获得脂质膜被粉碎的含有脂质膜的悬浮液。对得到的上述悬浮液处理作为膜支架蛋白的Ca环化MSP(Ca-circularized MSP)(分子量为32kDa)，以使蛋白质与脂质的摩尔比为120，然后根据混合液的总量用或不用2mM的TCEP处理后，处理(4℃，4小时)等量的生物珠(bio-beads)，从而通过自组装过程制备出包含Cfa环化MSP(Cfa-circularizedMSP)蛋白的纳米穿孔器(NP)。

实施例2.包含大小增大的环状膜支架蛋白的纳米穿孔器eslNP的制备

2-1.大小增大的环状eslMSP(end-spliced large membrane scaffold protein)生产用质粒的制备

为了制备由两个MSP1E3D1蛋白形成环状而大小增大的环状MSP，制备了表达上述环状膜支架蛋白的质粒。将MSP1E3D1的序列插入MSP1E3D1基因序列与7个组氨酸(histidine)之间。通过重叠克隆进行基因克隆，实验中所用的引物的序列如下述表4所示，最终蛋白CfaC-linker-MSP1E3D1-MSP1E3D1-HisX7-CfaN(eslMSP)的结构如图5所示，其DNA序列由序列2表示。

表4

2-2.eslMSP的纯化

将上述制备的质粒通过热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中以进行蛋白质纯化。将在含有50μg/ml的卡那霉素的固体培养基中生长的菌落接种到含有10ml的卡那霉素的液体培养基(LB broth miller)中，在37℃的振荡培养箱中培养16小时后，在600ml的相同液体培养基中进行第二次接种。当大肠杆菌生长至OD600为0.5～0.8时，通过用0.5mM的IPTG处理来进行蛋白质表达。在37℃和150rpm的条件下表达3小时后，以6000rpm的速度离心分离10分钟以去除培养基，仅获得细胞。使用含有1％Triton X-100和2mM的TCEP的tris缓冲液重悬细胞，并使用超声波破坏细胞。通过离心分离仅分离细胞底物后，处理Ni-NTA琼脂糖珠。使用分别含有Triton X-100、胆酸钠及低浓度咪唑的缓冲液去除不能与微珠结合的物质，使用高浓度咪唑得到待纯化的蛋白质。并且，对经纯化的蛋白质处理用于去除蛋白质的N-末端His-tag的DAPase，结果确认，作为对照组的MSP1E3D1蛋白因cleavage反应而His-tag被去除，而eslMSP没有被DAPase引起反应(图6)，从而可以确认eslMSP的环状结构。

2-3.包含eslMSP的纳米穿孔器eslNP(end-spliced large NP)的制备

作为脂质，将POPC溶解于氯仿中来准备浓度为25mg/ml的脂质溶液。然后，将121.616μl的25mg/ml的POPC溶液转移到玻璃管中，以使使用添加了400ml的胆酸钠的40mM的Tris-Cl、300mM的NaCl、0.5mM的EDTA、pH7.4的NP缓冲液(NP buffer)溶解时脂质的浓度成为10mM。之后，加入氮气，在真空状态下放置至少4小时，除去溶剂，得到脂质膜。在上述所得脂质膜中使用添加了胆酸钠的0.4ml上述NP缓冲液以使上述脂质膜水合，在55℃下超声波处理15分钟，获得脂质膜被粉碎的含有脂质膜的悬浮液。对上述得到的悬浮液处理作为膜支架蛋白的上述eslMSP(分子量为62kDa)，以使蛋白质与脂质的摩尔比为480，然后处理(4℃，3小时)与混合液的总量等量的生物珠，从而通过自组装过程制备出大小增大的纳米穿孔器(eslNP)。

实施例3.双纳米穿孔器Di-NP的制备

3-1.分别插入Linker-CfaN和CfaC-linker的MSP1E3D1生产用质粒的制备

CfaN和CfaC的DNA序列信息提取自Stevens AJ,et al.,2016,Design of a SplitIntein with Exceptional Protein Splicing Activity,J Am Chem Soc。并且，将通常所使用的接头中的GGGGSGGGGSGGGGS接头用作接头序列。基因的合成委托给了公司(Cosmogene Tech，韩国)，委托的DNA序列如表5所示。在最初PCR中，在插入了MSP1E3D1的pET28a质粒中，linker-CfaN位于除了终止密码子的MSP1E3D1基因的3'末端和包含其后的末端密码子的pET28a载体的5'末端，并且CfaC-linker位于MSP1E3D1基因的5'末端和其前的pET28a载体的3'末端，使用每个15bp批次互补(complementary)设计的引物来进行PCR。PCR完成后，将Dpn1溶液在37℃处理1小时以防止自连接(self-ligation)，除去DNA以外的PCR产物。为了连接(ligation)所生成的pET28a与插入物(insert)，添加重叠克隆(overlapcloner，ELPIS，韩国)并在37℃下反应1小时以诱导pET28a与插入物之间的稳定氢键。将通过上述克隆过程获得的7μl的DNA溶液加入100μl的competent E.coli TOP10溶液中，并在冰上培养30分钟后，在42℃下热处理45秒钟。在上述反应液中加入900μl的LB(Luria-Bertani)液体培养基，培养(37℃，1小时)后，通过离心分离(13000rpm，10分钟)收集细胞。将收集的细胞溶液(0.1ml)铺板/培养(37℃)在卡那霉素LB固体培养基中后，将所形成的菌落中的一种加入含有0.1％卡那霉素的10ml的LB液体培养基中，培养18小时(37℃)，超声波处理并纯化培养液来获得作为产物的包含MSP1E3D1-linker-CfaN的碱基序列(序列3)的质粒和包含CfaC-linker-MSP1E3D1的碱基序列(序列4)的质粒。通过公司(Cosmogene Tech，韩国)确认上述质粒的序列。在上述过程中所使用的引物的序列详细组成和反应条件如表6所示。

表5

表6

3-2.与Cfa内含肽结构域结合的两种蛋白质的纯化及共价键的确认

纯化了MSP1E3D1-linker-CfaN(MSP-CfaN)及CfaC-linker-MSP1E3D1(CfaC-MSP)这两种蛋白质。具体地，MSP-CfaN的表达和纯化过程与在上述实施例中描述的过程相同，但脱盐(desalting)后，最终通过浸入剪接(splicing)用缓冲液(100mM的磷酸钠(sodiumphosphate)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、pH7.2)中获得。在CfaC-MSP的情况下，将上述制备的质粒通过热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞中以进行蛋白质纯化。将在含有50μg/ml的卡那霉素的固体培养基中生长的菌落接种到含有10ml的卡那霉素的液体培养基(LB brothmiller)中，在37℃的振荡培养箱中培养16小时后，在600ml的相同液体培养基中进行第二次接种。当大肠杆菌生长至OD600为0.5～0.8时，通过用0.5mM的IPTG处理来进行蛋白质表达。在16℃和120rpm的条件下表达16小时后，以6000rpm的速度离心分离10分钟以去除培养基，仅获得细胞。使用含有包含2M的尿素(urea)的1％Triton X-100和2mM的TCEP的tris缓冲液重悬细胞，并使用超声波破坏细胞。通过离心分离仅分离细胞底物后，处理Ni-NTA琼脂糖珠。之后，使用分别含有包含2M的尿素的Triton X-100、胆酸钠及低浓度咪唑的缓冲液去除不能与微珠结合的物质，使用包含2M的尿素的高浓度咪唑得到待纯化的蛋白质。通过高浓度咪唑从Ni-NTA琼脂糖珠中分离获得的CfaC-MSP为了去除蛋白质溶液中存在的高浓度尿素，通过透析从剪接用缓冲液中去除尿素来使用。由此获得的MSP-CfaN及CfaC-MSP为了形成共价键，分别以1：1.3的摩尔比稀释后，处理2mM的TCEP来在25℃下反应15分钟。之后，将等体积的蛋白质在30℃反应1小时，结果确认，随着时间的经过，通过反式剪接产生具有高分子量的MSP-MSP结合物(图7的箭头)。

3-3.通过共价键连接的双纳米穿孔器Di-NP的制备

为了制备PTS(protein trans-splicing)双纳米穿孔器(Di-NP)，分别使用上述制备的MSP-CfaN及CfaC-MSP并通过在上述实施例1-4中示出的过程中除TCEP处理过程之外的方法制备分别具有CfaN和CfaC的纳米穿孔器(分别为NP-CfaN及CfaC-NP)。如此制备的纳米穿孔器在剪接用缓冲液(100mM的磷酸钠、150mM的NaCl、1mM的EDTA、pH7.2)中通过尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography)仅分离纯纳米穿孔器。然后，将NP-CfaN与CfaC-NP以1：1.3的摩尔比准备后，处理2mM的TCEP来在25℃下反应15分钟。之后，将等体积的NP-CfaN与CfaC-NP溶液混合后，在33℃反应1小时，由此制备由两个NP通过共价键连接而成的形式的Di-NP。通过尺寸排阻色谱法确认相互结合的双纳米穿孔器使双纳米穿孔器的分子量约为单纳米穿孔器的两倍，并且尺寸排阻色谱法仅分离了双纳米穿孔器。

实施例4.抗体结合纳米穿孔器FcNP的制备

4-1.能够与抗体结合的膜支架蛋白FcMSP生产用质粒的制备

Fc区结合肽的DNA序列信息提取自Weonu Choe,et al.,2016,Fc-结合Ligands ofImmunoglobulin G:An Overview of High Affinity Proteins and Peptides,Materials(Basel)，将通常所使用的接头中的GGGGSGGGGSGGGGS接头用作接头序列。基因的合成委托给了公司(Cosmogene Tech，韩国)，委托的DNA序列如下述表7所示，其结构示意图如图8所示。在最初PCR中，在插入了MSP1E3D1的pET28a质粒的7XHIS序列之前进行载体线性化(linearization)，对合成的插入物基因的5'及3'的两末端利用载体与每15bp重叠(overlap)的方式设计的引物进行PCR。PCR完成后，将Dpn1溶液在37℃处理1小时以防止自连接，除去DNA以外的PCR产物。为了连接所生成的pET28a与插入物，添加重叠克隆(ELPIS，韩国)并在37℃下反应1小时以诱导pET28a与插入物之间的稳定氢键。将通过上述克隆过程获得的7μl的DNA溶液加入100μl的competent E.coli TOP10溶液中，并在冰上培养30分钟后，在42℃下热处理45秒钟。在上述反应液中加入900μl的LB(Luria-Bertani)液体培养基，培养(37℃，1小时)后，通过离心分离(13000rpm，10分钟)收集细胞。将收集的细胞溶液(0.1ml)铺板/培养(37℃)在卡那霉素LB固体培养基中后，将所形成的菌落中的一种加入含有0.1％卡那霉素的10ml的LB液体培养基中，培养18小时(37℃)，超声波处理并纯化培养液来获得作为产物质粒。通过公司(Cosmogene Tech，韩国)确认上述质粒的序列。在上述过程中所使用的引物的序列如表7所示，详细的组成和反应条件如图8所示。

表7

表8

4-2.FcMSP的纯化

以与上述实施例2-2的eslMSP相同的方法纯化FcMSP，通过用SDS-PAGE凝胶确认的结果可知，包含Fc结合结构域的MSP被正常纯化(图9)。

4-3.包含FcMSP的纳米穿孔器FcNP的制备

作为脂质，将POPC溶解于氯仿中来准备浓度为25mg/ml的脂质溶液。然后，将121.616μl的25mg/ml的POPC溶液转移到玻璃管中，以使使用添加了400ml的胆酸钠的NP缓冲液(40mM的Tris-Cl、300mM的NaCl、0.5mM的EDTA、pH7.4)溶解时脂质的浓度成为10mM。之后，加入氮气，在真空状态下放置至少4小时，除去溶剂，得到脂质膜。在上述所得脂质膜中使用添加了胆酸钠的0.4ml上述NP缓冲液以使上述脂质膜水合，在55℃下超声波处理15分钟，获得脂质膜被粉碎的含有脂质膜的悬浮液。对上述得到的悬浮液处理作为膜支架蛋白的上述Fc-MSP(分子量为35.2kDa)，以使蛋白质与脂质的摩尔比为120。然后，以混合液的总体积为基准，处理还原剂(TCEP)以使浓度成为2mM。然后处理(4℃，3小时)与混合液的总量等量的生物珠，从而通过自组装过程制备出包含Fc结合结构域的纳米穿孔器(FcNP)。

实施例5.包含大小增大的环状膜支架蛋白的抗体结合纳米穿孔器Fc-eslNP的制备

5-1.能够与抗体结合的膜支架蛋白Fc-eslMSP生产用质粒的制备

Fc区结合肽的DNA序列信息提取自Weonu Choe,et al.,2016,Fc-结合Ligands ofImmunoglobulin G:An Overview of High Affinity Proteins and Peptides,Materials(Basel)，将通常所使用的接头中的GGGGS接头用作接头序列。基因的合成委托给了公司(Cosmogene Tech，韩国)，委托的DNA序列如下述表9所示，其结构示意图如图10所示。PCR去除了插入eslMSP的pET28a质粒的GGGGSGGGGSGGGGS接头中的第二个GGGGS序列，并设计了能够将Fcbp插入相应位置的引物。使用定点突变(Site-directed mutagenesis)进行PCR。PCR完成后，将Dpn1溶液在37℃下处理1小时以删除现有的甲基化的质粒。之后，使用PCR纯化试剂盒(PCR purification kit，ELPIS，韩国)进一步纯化剩余的PCR产物。将通过上述克隆过程获得的7μl的DNA溶液加入100μl的competent E.coli TOP10溶液中，并在冰上培养30分钟后，在42℃下热处理45秒钟。在上述反应液中加入900μl的LB(Luria-Bertani)液体培养基，培养(37℃，1小时)后，通过离心分离(13000rpm，10分钟)收集细胞。将收集的细胞溶液(0.1ml)铺板/培养(37℃)在卡那霉素LB固体培养基中后，将所形成的菌落中的一种加入含有0.1％卡那霉素的10ml的LB液体培养基中，培养18小时(37℃)，超声波处理并纯化培养液来获得作为产物质粒。通过公司(Cosmogene Tech，韩国)确认上述质粒的序列。在上述过程中所使用的引物的序列如表9所示，详细的组成和反应条件如图10所示。

表9

表10

5-2.Fc-eslMSP的纯化

以与上述实施例2-2的eslMSP相同的方法纯化Fc-eslMSP，通过用SDS-PAGE凝胶确认的结果可知，包含Fc结合结构域的Fc-eslMSP被正常纯化(图11)

5-3.包含Fc-eslMSP的纳米穿孔器Fc-eslNP的制备

作为脂质，将POPC溶解于氯仿中来准备浓度为25mg/ml的脂质溶液。然后，将121.616μl的25mg/ml的POPC溶液转移到玻璃管中，以使使用添加了400ml的胆酸钠的ND缓冲液(40mM的Tris-Cl、300mM的NaCl、0.5mM的EDTA、pH7.4)溶解时脂质的浓度成为10mM。之后，加入氮气，在真空状态下放置至少4小时，除去溶剂，得到脂质膜。在上述所得脂质膜中使用添加了胆酸钠的0.4ml上述ND缓冲液以使上述脂质膜水合，在55℃下超声波处理15分钟，获得脂质膜被粉碎的含有脂质膜的悬浮液。对上述得到的悬浮液处理作为膜支架蛋白的上述Fc-eslMSP(分子量为63.2kDa)，以使蛋白质与脂质的摩尔比为480。然后，以混合液的总体积为基准，处理还原剂(TCEP)以使浓度成为2mM。然后处理(4℃，3小时)与混合液的总量等量的生物珠，从而通过自组装过程制备出包含Fc结合结构域的纳米穿孔器(Fc-eslND)。

实施例6.PEG附着纳米穿孔器的制备

为了提高结构体的稳定性，将Thermo Fisher公司的BM(PEG)3(1,11-bismaleimido-triethyleneglycol)连接到的在上述实施例2-3及实施例5-3中制备的eslNP及Fc-eslNP。具体地，将5mM的TCEP用上述制备的eslNP及Fc-eslNP在常温下处理30分钟，然后通过脱盐或浓缩去除TCEP。用BM(PEG)2或BM(PEG)3处理以使eslNP及Fc-eslNP的膜蛋白摩尔数加倍后，在常温下反应1小时。之后，为了终止反应，将10mM的DTT在常温下处理15分钟以制备在eslNP及Fc-eslNP附着PEG的PEG-eslND及PEGylated Fc-eslND。

实验例1.纳米穿孔器的结构确认

1-1.esND的结构确认

在上述实施例1-4中制备的esND的大小和形态通过尺寸排阻色谱法(sizeexclusion chromatography；SEC)、动态光散射(dynamic light scattering；DLS)和电子显微镜来确认。具体地，上述制备的esNPs通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化。当在不添加TCEP的情况下制备esND时，观察到ND及esND的两个主峰(main peak)(图12)。

1-2.eslND的结构确认

通过尺寸排阻色谱法(SEC)对在上述实施例2-3中制备的eslND进行纯化，结果确认，与用MSP1E3D1制备的ND相比，峰(peak)的位置随着分子量的增加而改变(图13的左侧)。并且，通过动态光散射(DLS)分析测定每个纳米穿孔的直径，结果确认，ND的直径为12.37nm，而eslND的直径约为2倍(25.70nm)(图13右侧)，这与设计蛋白质时的预期值一致。并且，图13下端将大小增大的纳米穿孔器的结构示意性地示出，绿色部分表示通过内含肽反式剪接(intein trans-splicing)由共价键连接的部分。

1-3.Di-ND的结构确认

通过尺寸排阻色谱法确认在上述实施例3-3中制备的Di-ND具有每个纳米穿孔器的约两倍的分子量(图14a)，并且由此确认，通过SDS-PAGE分离的Di-ND具有结合两种现有蛋白质MSP1E3D1的分子量(图14b)。并且，通过动态光散射法的分析的结果确认，与具有约12nm直径的现有的纳米穿孔器相比，分析出Di-ND具有约20nm的直径(图14c)。考虑到动态光散射法在测定椭圆环状结构体时测定长轴和短轴长度的平均值的测定法，Di-ND被明确识别为两个纳米穿孔器结合的形式。

1-4.FcND的结构确认

通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化在上述实施例4-3中制备的FcND。通过在纯化过程中添加还原剂TCEP，在约8.5ml和10.5ml的洗脱体积(elution volume)中观察到的聚集体(aggregate)和二聚体形式(dimer form)的FcND减少，并且确认了能够与抗体的Fc区结合的单环FcND(mono cyclic FcND)的收率的增加(图15的a部分)。如上述SEC结果那样将洗脱液(Elution)分为三个，SDS-PAGE分析的结果再次确认了单环FcND的收率随着TCEP处理而增加(图15的b部分)。这里，图15b中以红色表示的部分是示意性示出的接头结构，而以黄色表示的部分是Fc结合结构域。

1-5.Fc-eslND的结构确认

使用尺寸排阻色谱法比较在上述实施例5-3中制备的Fc-eslND与eslND，结果确认，Fc-eslND具有相似的分子量(图16)并且，通过SDS-PAGE分析通过上述过程获得的9.88mL的峰，通过结果(图11)可知，考虑到它与Fc-eslMSP具有相同的分子量，形成了Fc-eslND。

1-6.根据TCEP的有无制备的esNP及esdNP的结构比较

在上述1-2中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)对作为制成通过添加TCEP纯化的esMSP的esNP的essND和作为制成使用不添加TCEP纯化的esMSP的esNP的esdNP(esNP通过二硫键结合的形式)进行纯化。在未添加TCEP制备esNP时，观察到两个主峰，先出现峰被确认为esdNP，随后出现的峰被确认为esNP(图17)。通过动态光散射(DLS)测定，结果，测出esdNP的大小为25nm，约为esNP(约12nm)的两倍，在通过二硫键连接的esdNP的情况下，在DLS测定后处理TCEP并再次测定DLS时，二硫键断裂，尺寸减小，因此可以更准确地理解esdNP的结构。(图17)。并且，通过在纳米圆盘制备过程中处理TCEP可以获得esNPs，并且通过DLS确认像这样获得的esNP即使在TCEP处理后也不会改变大小，因此可知根据是否处理TCEP可以获得两种形式的NP(图18)。

实验例2.纳米穿孔器的抗病毒效果的确认

2-1.esNP

分别在NP及esdNP制备过程中开始时制备脂质膜时，使用70％的POPC和30％的TG的混合物代替100％的POPC修改脂质组成来制备NPTG及esdNPTG(包含TG作为受体的NP及esdNP)，为了确认该NPTG及esdNPTG的抗病毒效果，用流感病毒株A/PR/8/34感染MDCK细胞后，将NPTG或esdNPTG一起处理，并测定由于抑制病毒感染而导致的细胞病变效应的降低。具体地，在96孔细胞培养板的每个孔中以3×10⁵cell/ml分配200μl的MDCK细胞，并在37℃的5％CO₂培养箱中培养24小时。此后，从细胞中除去培养基，每个孔中分配100μl的PBS，取出并洗涤两次。将流感病毒稀释至MOI(感染复数(infection))＝0.01，并根据不同浓度的esNP(从1μM稀释2倍)混合。之后，准备100μl 3×10⁵pfu/ml，在每个孔中处理，然后在37℃下感染1小时。此后，细胞在37℃的5％CO₂培养箱中反应1小时，然后处理在用PBS洗涤的细胞。在37℃的5％CO₂培养箱中培养18小时后，去除培养基，每孔分配100μl的4％甲醛，在25℃下反应1小时进行固定。固定后，将100μl的0.5％结晶紫溶液分配到每个孔中并在25℃下染色1小时。之后，除去结晶紫溶液，每孔加入100μl的甲醇溶解干燥的结晶紫，在分光光度计中测定570nm波长处的吸光度，测定细胞病变效应的降低。此时，在没有抗病毒剂情况下只培养病毒和MDCK细胞，将其作为阴性对照组，在没有病毒感染的情况下只培养MDCK细胞，将其作为阳性对照组，将用MSP1E3D1制备的之前没有进行末端剪接(end-spliced)NP作为对照组，测定抗病毒制剂引起的病毒致细胞病变效应的降低。并且，处理样品的浓度以通过DC测定法(与洗涤剂相容的蛋白质浓度测定(detergent-compatible proteinconcentration determination，DC assay))测定的蛋白质浓度(与洗涤剂相容的蛋白质浓度测定)为基准，分析相同摩尔数的NDTG和esdNPTG的抗病毒效果。

分析在实施例1-4中制备的各末端被末端剪接的形式的esdNPTG对CPE的抑制作用，结果确认，与NPTG相比，esdNPTG显示出增强的作用，如图19的上端所示，最高浓度(1μM)，与传统的NPTG相比，最高浓度(1μM)下的NPTG的抗病毒能力提高了约70％。

2-2.Di-NP

以与实验例2-1相同的方法，确认在上实施例中制备的双纳米穿孔器(由两个纳米穿孔器通过共价键结合的状态)的CPE抑制试验(CPE inhibition assay)，并以曲线图表示。在这里，对Di-NPTG和现有的NPTG进行了比较。并且，处理样品的浓度以通过DC测定法测量的蛋白质浓度，并且由于双纳米穿孔器由两个纳米穿孔器连接而成的形式，因此以1/2的摩尔数计算。

结果，与NPTG相比，在最高浓度下的Di-NPTG的抗病毒功效增加了2.5倍以上，效果显著(图19的下端)。并且，通过光学显微镜比较细胞病变效应的降低时，感染PR8流感病毒后，随着时间的经过，最高浓度下的NPTG中，MDCK细胞也会像阴性对照组一样死亡并上浮，并观察到空白空间(图20的a部分)。然而，经确认，Di-NPTG在低浓度下显示出相对较小的抗病毒功效，但在最高浓度下，即使在感染48小时后，大多数细胞也像阳性对照组一样健康且粘附良好(图20的b部分)。

2-3.eslNP

以与上述实验例2-1的相同方法确认在上述实施例2-3中制备的直径约25nm的eslNP的CPE抑制试验。这里，作为对照组，使用直径为13nm的现有的NP。

结果，对照组NDTG显示出高达约20％的病毒抑制能力，而eslNDTG显示出接近80％的改进的抑制能力，并且不含受体的ND和eslND显示没有热门任何效果(图21)。

2-4.FcNP

确认在上述实施例4-3中制备的FcNP的微量中和试验，并以曲线图表示。具体地，首先将NP或FcNP稀释2倍，在96孔板的每孔中加入50μl，在37℃下反应1小时。之后，加入50μl的MOI＝0.01浓度的A/PR/8/34病毒，在37℃下反应1小时。然后，以2×10⁵cells/ml的浓度在每孔中加入100μl的MDCK细胞，然后在37℃的5％CO₂加湿培养箱中反应18小时。将荧光标记的4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-α-D-神经氨酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)以500μM的浓度添加到每孔中，每孔添加50μl，随后在37℃反应1小时。然后，使用荧光酶标仪测量激发(Excitatin)355nm/发射(Emission)460nm。并且，由于处理样品的浓度是以通过DC测定法测量的蛋白质浓度为基准，因此可以认为分析了相同摩尔数的NP和FcNP的抗病毒效果。

结果，与NP相比，FcNP显示出提高的抗病毒功效，并且与仅处理抗体时相比，增加了病毒中和功效(图22)。

2-5.Fc-eslNP

确认在上述实施例5-3中制备的Fc-eslNP的空斑减数试验，并以曲线图表示。具体地，首先，将抗病毒中和抗体(Antibody，Abs)或Abs与Fc-eslNP混合并稀释5倍，在37℃下与浓度为100PFU的1mL的A/PR/8/34病毒反应1小时。之后，将1mL的上述反应溶液添加到在6孔板中以约90％的密度培养的MDCK细胞中，并在37℃下反应1小时。然后，用PBS洗涤反应溶液后，处理2mL的含有DMEM、1％琼脂(Agar)及2μg/mL的TPCK-胰蛋白酶的培养基。之后，在37℃的5％CO₂的加湿培养箱中反应72小时后，每孔加入1mL的3.65％甲醛固定MDCK细胞，用0.5％结晶紫对该细胞进行染色以确认噬菌斑。结果，与仅使用抗病毒中和抗体时相比，将Fc-eslNP及相应抗体混合时显示出提高的抗病毒功效。此时，与使用POPC作为脂质制备的作为Fc-eslNP的Fc-eslNPpopc相比，使用融合(fusion)组合物(POPC 55％、DOPS 15％及胆固醇30％)作为脂质制备的作为eslNP的Fc-eslNPfusion的效果更大(图23)。这表明与抗病毒中和抗体结合的Fc-eslNPfusion结构可以在细胞内穿孔病毒。

实验例3.纳米穿孔器的稳定性的确认

3-1.esdNP的热耐久性及凝聚抗性的确认

将300μl的在上述实施例1-4中制备的100μM的esdND置于37℃培养24小时后，通过尺寸排阻色谱法(SEC)确认空隙率峰值(void peak)的变化。在这里，将ND用作对照组。

结果确认，在esdND的情况下，SEC的形态几乎没有变化，但ND中的空隙率峰值增加，由此可以确认，esdND与对照组ND相比具有耐温性。

3-2.PEG附着eslND的稳定性的确认

为了确认在上述实施例6中通过将PEG附着到eslND来制备的PEG-eslND的稳定性和裂解酶抗性，将0.4mg/ml的PEG化的纳米圆盘用100nM胰蛋白酶处理，然后在37℃下反应，并在0、1、2、3、4、24、48、72及96小时确认结构分解与否并进行比较。

结果确认，在PEG结合的结构中，胰蛋白酶对结构的分解明显减少。在现有的eslND的情况下，当暴露于100nM的胰蛋白酶24小时或更长时间时，所有蛋白质都被分解，而在PEG-eslND中，确认到96小时仍有50％以上未分解(图25)。考虑到已知不形成纳米圆盘结构的蛋白质都会在短时间内被胰蛋白酶分解，这种现象可以判断为纳米圆盘结构本身已经获得了对胰蛋白酶分解的抵抗力。

3-3.使用插入荧光染料的纳米穿孔器的体内稳定性分布模式及增加的确认

在现有的纳米穿孔器(ND)的制备方法和上述实施例1-4、实施例2-3及实施例6的方法中，通过混合0.5mol％的DiR荧光染料作为脂质组分来分别制备发出荧光的ND、esdND、eslND及PEG-eslND。之后，将100μl的每种结构的纳米穿孔器以5mg/kg的浓度在PBS中稀释，并通过腹腔内注射(n＝3)注射到小鼠体内。在注射后立即、麻醉后的第3天和第6天，使用IVIS成像系统(IVIS imaging system)对小鼠表面测定的荧光值进行拍照(图26的a部分)。经确认，由于所有实验组的饲料中都含有苜蓿(alfalfa)干草，在腹部测定到了连续的荧光值。然而，比较胸部的荧光值时，作为对照组的PBS注射组的胸部荧光值在注射后立即、注射后72小时、甚至144小时后都没有变化，而在纳米穿孔器注射组中，注射72小时后，胸部出现荧光。经确认，可通过测定胸部的荧光值来比较这些值(图26的b部分)。在ND实验组和eslND实验组的情况下，与注射后72小时相比，注射后144小时后的荧光值分别下降至75％、50％。另一方面，确认了esdND实验组和PEG-eslND实验组的荧光值几乎没有降低。即，ND和eslND显示出相似的体内稳定性，但与ND相比，即使经过144小时，esdND仍显示出显着增加的荧光值维持率，这是由于esdND的环状结构比ND稳定性增加所致。并且，作为通过聚乙二醇化(pegylation)确认体内稳定性，结果确认，当比较72小时和144小时的荧光值时，与eslND相比，PEG-eslND并没有像esdND那样降低胸部荧光值，由此确认，通过聚乙二醇化提高了eslND在体内的稳定性。因此，eslND具有类似于esdND的环状结构，但其生物稳定性低于esdND，因为它比ND具有更大的直径，但可以看出这种不稳定性可以通过聚乙二醇化(PEG-eslND)改善。

3-4.Fc-eslND的热耐久性的确认

以0.5mg/ml的浓度准备360μl在上述实施例4-3中制备的FcND和在实施例5-3中制备的Fc-eslND。之后，在37℃下反应，并在0、1、2、4、8、12、18、24、36、48、60及72小时确认结构分解与否并进行比较。

结果，尽管直到60小时也没有显示出显着差异，但FcND在72小时时完全分解并消失了。另一方面，可以确认60％以上的Fc-eslND残留(图27的a部分)，由此可以推断通过纳米圆盘的环化赋予了热耐久性。

3-5.PEG附着Fc-eslND的稳定性的确认

为了确认在上述实施例6中通过将PEG附着到Fc-eslND来制备的PEGylated Fc-eslND的稳定性和裂解酶抗性，将0.4mg/ml的PEGylated Fc-eslND用100nM胰蛋白酶处理，然后在37℃下反应，并在0、2、4、8、16、24及48小时确认结构分解与否并进行比较。

结果确认，在现有的FcND的情况下，当暴露于100nM的胰蛋白酶3小时时，被分解50％以上，而在PEGylated Fc-eslND中，当暴露于100nM的胰蛋白酶30小时以上时才被分解50％以上(图27b)，由此确认，当PEG结合时，胰蛋白酶对结构的分解明显减少。考虑到已知不形成纳米圆盘结构的蛋白质都会在短时间内被胰蛋白酶分解，这种现象可以判断为纳米圆盘结构本身已经获得了对胰蛋白酶分解的抵抗力。进一步地，可以得出结论，作为PEG结合的结构的PEGylated Fc-eslND具有比PEG未结合的FcND更好的胰蛋白酶耐久性。。

实验例4.FcND及Fc-eslND的抗体结合模式分析

4-1.FcND中的抗体结合模式分析

由于Fcbp只有在序列中存在的一对半胱氨酸氨基酸形成二硫键形成环状(cyclic)结构时才能与抗体的Fc部分结合(图28)，因此，为了确认导入FcND中的Fcbp是否保持与抗体的结合性质，通过表面等离子体共振法(Surface plasmin resonance：SPR)测定抗体与纳米穿孔器的结合。具体地，在CM5金(gold)芯片表面固定1μM的抗体并用1M的乙醇胺封闭以仅暴露抗体后，ND和FcND分别以7μl/min流到芯片表面，并测定了根据与抗体的结合而由抗体的细微摇动所指示的金颗粒的全反射角的变化。

结果确认，由于FcND是能够与抗体结合的结构，因此显示出比ND更高的结合力(图29)。

4-2.Fc-eslND中的抗体结合模式分析

为了确认导入Fc-eslND中的Fcbp是否保持与抗体的结合性质，进行了斑点印迹分析。具体地，如图30的a部分所示，用3μl的5μg/ml的A/PR/8/34病毒在硝酸纤维素膜(NCmembrance)上打一个点，然后在常温下干燥1小时。然后，通过将5％脱脂奶粉溶解(w/v)在TBS缓冲液中进行1小时的NC膜封闭。将抗A/PR/8/34病毒的小鼠来源一抗以1μg/ml的浓度溶解在TBST中，然后在NC膜上处理1小时。用TBST洗涤10分钟，此过程重复3次。之后，将能够捕获小鼠来源一抗并引起化学发光的二抗以1：1000的比例溶解在TBST缓冲液中，然后在NC膜上处理1小时。之后，用TBST洗涤10分钟，此过程重复3次。之后，通过ECL引起化学发光反应，对膜进行光敏化固定。

结果确认，由于Fc-eslND是能够与抗体结合的结构，因此通过竞争性地抑制能够引起化学发光的二抗与一抗的结合，膜没有被光敏化。另一方面经确认具有相同大小的eslND与对照组一样，膜被光敏化(图30的b部分)。因此，可以确认导入Fc-eslND中的Fcbp保持了能够与抗体的结合的性质。

实验例5.纳米穿孔器的体内(in vivo)病毒感染抑制能力的确认

5-1.esdNP的提高的体内病毒感染抑制能力

在使用70％的POPC和30％的GD1a受体的混合物制备脂质膜后，在小鼠模型中确认分别通过上述实施例1-4的方法制备的NDG(包含GD1a受体的ND)和esdNDG(包含GD1a受体的esdND)的PR8病毒感染抑制能力。具体地，将适应实验环境一周的6周龄雌性Balb/c小鼠IP注射100μL的麻醉剂(Alfaxan：xylazene：PBS＝2：1：2)，然后用4MLD50的PR8病毒进行攻击接种。接种后一小时，最初以0.5mg/kg的剂量IP给药(n＝10)NPG或esdNPG，然后每隔一天进行两次额外给药。观察并记录13天的体重变化和存活率。结果，现有的NPG显示出10％的存活率，但esdNPG在相同浓度下显示出高出3倍的存活率，由此证明可以通过结构改进来提高抗病毒功效(图31)。

5-2.PEGylated eslNP的提高的体内病毒感染抑制能力

以与上述实验例5-1相同的方法，在小鼠模型中实验了PEGylated eslNP对PR8病毒感染性的抑制效果。为此，将NPG和PEGylated eslNPG(以下，简称PEG-eslNPG)分别以2.5mg/kg或0.5mg/kg给药3次，持续4天，然后观察存活率和体重变化。结果，与NDG组不同，PEG-eslNPG给药组在两种浓度下感染的所有小鼠均存活，并且体重变化也在与未感染组相似的水平上不显着(图32)。经胰蛋白酶抗性实验确认，推测PEG-eslNPG在体内对蛋白限制酶具有优越的稳定性。并且，上述与实验例5-1的esdNPG实验结果相比，对限制性内切酶稳定性没有提高的esdNPG在体内表现出只有30％的存活率，而PEG-eslNPG表现出100％的存活率，可见，随着纳米穿孔器面积的增加，体内的稳定性对其药效非常重要。

5-3.PEGylated Fc-eslNP的提高的体内病毒感染抑制能力

以与上述实验例5-1相同的方法，在小鼠模型中实验了PEGylated Fc-eslNP(pFc-eslNP)对PR8病毒感染性的抑制效果。为此，静脉内单独注射给药5mg/kg(mpk)、2.5mpk或0.5mpk的Abs(中和抗体)或者将上述浓度的Abs和10mpk、5mpk、1mpk的PEGylated Fc-eslNP混合来静脉内注射一次后，观察存活率和体重变化。结果，在仅用Abs 2.5mpk处理的组中，存活率为40％，而在用Abs 2.5mpk+pFc-eslNP5mpk处理的组中，存活率为100％(图33)，由此确认pFc-eslNP可以增大中和抗体的抗病毒效果。

<110> 成均馆大学研究与商业基金会

<120> 抗病毒活性增强的纳米穿孔器

<130> R-2019-0230-KR-1

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CfaC-linker-MSP1E3D1-HisX7-CfaN (esMSP)

<400> 1

gtcaagatca ttagtcgtaa gagtctgggc actcaaaacg tctacgatat tggagtagaa 60

aaagatcata attttttgct gaagaatggg ctggtggcct ctaactgctt caacggtgga 120

ggaggctctg gtggaggcgg tagcggaggc ggagggtcgt ctaccttcag taaacttcgc 180

gaacaactgg gccccgtgac gcaggaattc tgggacaacc tggaaaaaga aaccgaggga 240

ctgcgtcagg aaatgtccaa agatttagaa gaggtgaagg ccaaggttca gccatatctc 300

gatgactttc agaaaaaatg gcaggaagag atggaattat atcgtcaaaa ggtggaaccg 360

ctgcgtgcgg aactgcaaga gggggcacgc caaaaactcc atgagctcca agagaagctc 420

agcccattag gcgaagaaat gcgcgatcgc gcccgtgcac atgttgatgc actccggact 480

catttggcgc catatctcga tgactttcag aaaaaatggc aggaagagat ggaattatat 540

cgtcaaaagg tggaaccgct gcgtgcggaa ctgcaagagg gggcacgcca aaaactccat 600

gagctccaag agaagctcag cccattaggc gaagaaatgc gcgatcgcgc ccgtgcacat 660

gttgatgcac tccggactca tttggcgccg tattcggatg aacttcgcca gcgtttggcc 720

gcacgtctcg aggcgctgaa agaaaacggg ggtgcccgct tggctgagta ccacgcgaaa 780

gcgacagaac acctgagcac cttgagcgaa aaagcgaaac cggcgctgga agatctacgc 840

cagggcttat tgcctgttct tgagagcttt aaagtcagtt ttctgtcagc tctggaagaa 900

tatactaaaa agctgaatac ccagcatcat catcatcatc atcactgcct gtcttacgac 960

acagagattc tgaccgttga atatggattc cttcctatcg gtaagatcgt ggaggaacgg 1020

attgaatgca cagtctatac ggtagataaa aatggctttg tgtatacaca acctattgct 1080

cagtggcata accggggaga acaggaagtt ttcgaatact gcttagaaga cggttcgatt 1140

atccgtgcaa cgaaagatca caaatttatg acgaccgacg gtcagatgtt accgattgat 1200

gagattttcg aacgggggtt agacctgaaa caagttgatg gtttgccgta a 1251

<210> 2

<211> 2016

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CfaC-linker-MSP1-MSP2-HisX7-CfaN (eslMSP)

<400> 2

atggtcaaga tcattagtcg taagagtctg ggcactcaaa acgtctacga tattggagta 60

gaaaaagatc ataatttttt gctgaagaat gggctggtgg cctctaactg cttcaacggt 120

ggaggaggct ctggtggagg cggtagcgga ggcggagggt cgtctacctt cagtaaactt 180

cgcgaacaac tgggccccgt gacgcaggaa ttctgggaca acctggaaaa agaaaccgag 240

ggactgcgtc aggaaatgtc caaagattta gaagaggtga aggccaaggt tcagccatat 300

ctcgatgact ttcagaaaaa atggcaggaa gagatggaat tatatcgtca aaaggtggaa 360

ccgctgcgtg cggaactgca agagggggca cgccaaaaac tccatgagct ccaagagaag 420

ctcagcccat taggcgaaga aatgcgcgat cgcgcccgtg cacatgttga tgcactccgg 480

actcatttgg cgccatatct cgatgacttt cagaaaaaat ggcaggaaga gatggaatta 540

tatcgtcaaa aggtggaacc gctgcgtgcg gaactgcaag agggggcacg ccaaaaactc 600

catgagctcc aagagaagct cagcccatta ggcgaagaaa tgcgcgatcg cgcccgtgca 660

catgttgatg cactccggac tcatttggcg ccgtattcgg atgaacttcg ccagcgtttg 720

gccgcacgtc tcgaggcgct gaaagaaaac gggggtgccc gcttggctga gtaccacgcg 780

aaagcgacag aacacctgag caccttgagc gaaaaagcga aaccggcgct ggaagatcta 840

cgccagggct tattgcctgt tcttgagagc tttaaagtca gttttctgtc agctctggaa 900

gaatatacta aaaagctgaa tacccagacc ttcagtaaac ttcgcgaaca actgggcccc 960

gtgacgcagg aattctggga caacctggaa aaagaaaccg agggactgcg tcaggaaatg 1020

tccaaagatt tagaagaggt gaaggccaag gttcagccat atctcgatga ctttcagaaa 1080

aaatggcagg aagagatgga attatatcgt caaaaggtgg aaccgctgcg tgcggaactg 1140

caagaggggg cacgccaaaa actccatgag ctccaagaga agctcagccc attaggcgaa 1200

gaaatgcgcg atcgcgcccg tgcacatgtt gatgcactcc ggactcattt ggcgccatat 1260

ctcgatgact ttcagaaaaa atggcaggaa gagatggaat tatatcgtca aaaggtggaa 1320

ccgctgcgtg cggaactgca agagggggca cgccaaaaac tccatgagct ccaagagaag 1380

ctcagcccat taggcgaaga aatgcgcgat cgcgcccgtg cacatgttga tgcactccgg 1440

actcatttgg cgccgtattc ggatgaactt cgccagcgtt tggccgcacg tctcgaggcg 1500

ctgaaagaaa acgggggtgc ccgcttggct gagtaccacg cgaaagcgac agaacacctg 1560

agcaccttga gcgaaaaagc gaaaccggcg ctggaagatc tacgccaggg cttattgcct 1620

gttcttgaga gctttaaagt cagttttctg tcagctctgg aagaatatac taaaaagctg 1680

aatacccagc atcatcatca tcatcatcac tgcctgtctt acgacacaga gattctgacc 1740

gttgaatatg gattccttcc tatcggtaag atcgtggagg aacggattga atgcacagtc 1800

tatacggtag ataaaaatgg ctttgtgtat acacaaccta ttgctcagtg gcataaccgg 1860

ggagaacagg aagttttcga atactgctta gaagacggtt cgattatccg tgcaacgaaa 1920

gatcacaaat ttatgacgac cgacggtcag atgttaccga ttgatgagat tttcgaacgg 1980

gggttagacc tgaaacaagt tgatggtttg ccgtaa 2016

<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MSP-linker-CfaN

<400> 3

atgggtcatc atcatcatca tcatcacgat tatgatattc ctactactga gaatttgtat 60

tttcagggtt ctaccttcag taaacttcgc gaacaactgg gccccgtgac gcaggaattc 120

tgggacaacc tggaaaaaga aaccgaggga ctgcgtcagg aaatgtccaa agatttagaa 180

gaggtgaagg ccaaggttca gccatatctc gatgactttc agaaaaaatg gcaggaagag 240

atggaattat atcgtcaaaa ggtggaaccg ctgcgtgcgg aactgcaaga gggggcacgc 300

caaaaactcc atgagctcca agagaagctc agcccattag gcgaagaaat gcgcgatcgc 360

gcccgtgcac atgttgatgc actccggact catttggcgc catatctcga tgactttcag 420

aaaaaatggc aggaagagat ggaattatat cgtcaaaagg tggaaccgct gcgtgcggaa 480

ctgcaagagg gggcacgcca aaaactccat gagctccaag agaagctcag cccattaggc 540

gaagaaatgc gcgatcgcgc ccgtgcacat gttgatgcac tccggactca tttggcgccg 600

tattcggatg aacttcgcca gcgtttggcc gcacgtctcg aggcgctgaa agaaaacggg 660

ggtgcccgct tggctgagta ccacgcgaaa gcgacagaac acctgagcac cttgagcgaa 720

aaagcgaaac cggcgctgga agatctacgc cagggcttat tgcctgttct tgagagcttt 780

aaagtcagtt ttctgtcagc tctggaagaa tatactaaaa agctgaatac ccagggtgga 840

ggaggctctg gtggaggcgg tagcggaggc ggagggtcgt gcctgtctta cgacacagag 900

attctgaccg ttgaatatgg attccttcct atcggtaaga tcgtggagga acggattgaa 960

tgcacagtct atacggtaga taaaaatggc tttgtgtata cacaacctat tgctcagtgg 1020

cataaccggg gagaacagga agttttcgaa tactgcttag aagacggttc gattatccgt 1080

gcaacgaaag atcacaaatt tatgacgacc gacggtcaga tgttaccgat tgatgagatt 1140

ttcgaacggg ggttagacct gaaacaagtt gatggtttgc cgtaa 1185

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CfaC-linker-MSP

<400> 4

atggtcaaga tcattagtcg taagagtctg ggcactcaaa acgtctacga tattggagta 60

gaaaaagatc ataatttttt gctgaagaat gggctggtgg cctctaactg cttcaacggt 120

ggaggaggct ctggtggagg cggtagcgga ggcggagggt cgggtcatca tcatcatcat 180

catcacgatt atgatattcc tactactgag aatttgtatt ttcagggttc taccttcagt 240

aaacttcgcg aacaactggg ccccgtgacg caggaattct gggacaacct ggaaaaagaa 300

accgagggac tgcgtcagga aatgtccaaa gatttagaag aggtgaaggc caaggttcag 360

ccatatctcg atgactttca gaaaaaatgg caggaagaga tggaattata tcgtcaaaag 420

gtggaaccgc tgcgtgcgga actgcaagag ggggcacgcc aaaaactcca tgagctccaa 480

gagaagctca gcccattagg cgaagaaatg cgcgatcgcg cccgtgcaca tgttgatgca 540

ctccggactc atttggcgcc atatctcgat gactttcaga aaaaatggca ggaagagatg 600

gaattatatc gtcaaaaggt ggaaccgctg cgtgcggaac tgcaagaggg ggcacgccaa 660

aaactccatg agctccaaga gaagctcagc ccattaggcg aagaaatgcg cgatcgcgcc 720

cgtgcacatg ttgatgcact ccggactcat ttggcgccgt attcggatga acttcgccag 780

cgtttggccg cacgtctcga ggcgctgaaa gaaaacgggg gtgcccgctt ggctgagtac 840

cacgcgaaag cgacagaaca cctgagcacc ttgagcgaaa aagcgaaacc ggcgctggaa 900

gatctacgcc agggcttatt gcctgttctt gagagcttta aagtcagttt tctgtcagct 960

ctggaagaat atactaaaaa gctgaatacc cagtaa 996

<210> 5

<211> 880

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FcMSP

<400> 5

nggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggtc atcatcatca 60

tcatcatcac gattatgata ttcctactac tgagaatttg tattttcagg gttctacctt 120

cagtaaactt cgcgaacaac tgggccccgt gacgcaggaa ttctgggaca acctggaaaa 180

agaaaccgag ggactgcgtc aggaaatgtc caaagattta gaagaggtga aggccaaggt 240

tcagccatat ctcgatgact ttcagaaaaa atggcaggaa gagatggaat tatatcgtca 300

aaaggtggaa ccgctgcgtg cggaactgca agagggggca cgccaaaaac tccatgagct 360

ccaagagaag ctcagcccat taggcgaaga aatgcgcgat cgcgcccgtg cacatgttga 420

tgcactccgg actcatttgg cgccatatct cgatgacttt cagaaaaaat ggcaggaaga 480

gatggaatta tatcgtcaaa aggtggaacc gctgcgtgcg gaactgcaag agggggcacg 540

ccaaaaactc catgagctcc aagagaagct cagcccatta ggcgaagaaa tgcgcgatcg 600

cgcccgtgca catgttgatg cactccggac tcatttggcg ccgtattcgg atgaacttcg 660

ccagcgtttg gccgcacgtc tcgaggcgct gaaagaaaac gggggtgccc gcttggctga 720

gtaccacgcg aaagcgacag aacacctgag caccttgagc gaaaaagcga aaccggcgct 780

ggaagatcta cgccagggct tattgcctgt tcttgagagc tttaaagtca gttttctgtc 840

agctctggaa gaatatacta aaaagctgaa tacccagtaa 880

<210> 6

<211> 1999

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc-eslMSP

<400> 6

gtcaagatca ttagtcgtaa gagtctgggc actcaaaacg tctacgatat tggagtagaa 60

aaagatcata attttttgct gaagaatggg ctggtggcct ctaactgctt caacggtgga 120

ggaggctctn ggaggcggag ggtcgtctac cttcagtaaa cttcgcgaac aactgggccc 180

cgtgacgcag gaattctggg acaacctgga aaaagaaacc gagggactgc gtcaggaaat 240

gtccaaagat ttagaagagg tgaaggccaa ggttcagcca tatctcgatg actttcagaa 300

aaaatggcag gaagagatgg aattatatcg tcaaaaggtg gaaccgctgc gtgcggaact 360

gcaagagggg gcacgccaaa aactccatga gctccaagag aagctcagcc cattaggcga 420

agaaatgcgc gatcgcgccc gtgcacatgt tgatgcactc cggactcatt tggcgccata 480

tctcgatgac tttcagaaaa aatggcagga agagatggaa ttatatcgtc aaaaggtgga 540

accgctgcgt gcggaactgc aagagggggc acgccaaaaa ctccatgagc tccaagagaa 600

gctcagccca ttaggcgaag aaatgcgcga tcgcgcccgt gcacatgttg atgcactccg 660

gactcatttg gcgccgtatt cggatgaact tcgccagcgt ttggccgcac gtctcgaggc 720

gctgaaagaa aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga cagaacacct 780

gagcaccttg agcgaaaaag cgaaaccggc gctggaagat ctacgccagg gcttattgcc 840

tgttcttgag agctttaaag tcagttttct gtcagctctg gaagaatata ctaaaaagct 900

gaatacccag accttcagta aacttcgcga acaactgggc cccgtgacgc aggaattctg 960

ggacaacctg gaaaaagaaa ccgagggact gcgtcaggaa atgtccaaag atttagaaga 1020

ggtgaaggcc aaggttcagc catatctcga tgactttcag aaaaaatggc aggaagagat 1080

ggaattatat cgtcaaaagg tggaaccgct gcgtgcggaa ctgcaagagg gggcacgcca 1140

aaaactccat gagctccaag agaagctcag cccattaggc gaagaaatgc gcgatcgcgc 1200

ccgtgcacat gttgatgcac tccggactca tttggcgcca tatctcgatg actttcagaa 1260

aaaatggcag gaagagatgg aattatatcg tcaaaaggtg gaaccgctgc gtgcggaact 1320

gcaagagggg gcacgccaaa aactccatga gctccaagag aagctcagcc cattaggcga 1380

agaaatgcgc gatcgcgccc gtgcacatgt tgatgcactc cggactcatt tggcgccgta 1440

ttcggatgaa cttcgccagc gtttggccgc acgtctcgag gcgctgaaag aaaacggggg 1500

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cgaatactgc ttagaagacg gttcgattat ccgtgcaacg aaagatcaca aatttatgac 1920

gaccgacggt cagatgttac cgattgatga gattttcgaa cgggggttag acctgaaaca 1980

agttgatggt ttgccgtaa 1999

Claims (36)

1.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合且内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成。

2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白包含两个以上重复的膜支架蛋白。

3.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成。

4.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成。

5.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列。

6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，内含肽的N-末端结构域与融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与融合蛋白的N-末端融合。

7.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及两个以上重复的膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N-末端结构域与上融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与上融合蛋白的N-末端融合。

8.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的C-末端结构域与上述融合蛋白的N-末端融合。

9.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N-末端结构域与上述融合蛋白的C-末端融合。

10.一种环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求1所述的质粒来获得，上述环状膜支架蛋白的N-末端与C-末端剪接。

11.根据权利要求10所述的环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达权利要求1所述的质粒并经还原剂处理来纯化蛋白质而制成。

12.一种双环状膜支架蛋白，其特征在于，由两个环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成。

13.根据权利要求12所述的双环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达权利要求1所述的质粒并未经还原剂处理而纯化。

14.一种大环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求2所述的质粒来获得。

15.一种融合蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求3所述的质粒来获得，上述融合蛋白由内含肽的C-末端结构域与膜支架蛋白的N-末端融合而成。

16.一种融合蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求4所述的质粒来获得，上述融合蛋白由内含肽的N-末端结构域与膜支架蛋白的C-末端融合而成。

17.一种能够与抗体结合的膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求5所述的质粒来获得。

18.根据权利要求17所述的能够与抗体结合的膜支架蛋白，其特征在于，内含肽的N-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的C-末端融合，内含肽的C-末端结构域与Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的N-末端融合。

19.根据权利要求17所述的能够与抗体结合的膜支架蛋白，其特征在于，经还原剂处理来纯化。

20.一种能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白，其特征在于，由两个能够与抗体结合的环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成，上述能够与抗体结合的环状膜支架蛋白通过表达权利要求5所述的质粒并未经还原剂处理而纯化。

21.一种能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白，其特征在于，由权利要求7所述的质粒编码。

22.一种Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，其特征在于，由权利要求8所述的质粒编码，内含肽的C-末端结构域与融合蛋白的N-末端融合。

23.一种Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白，其特征在于，由权利要求9所述的质粒编码，内含肽的N-末端结构域与融合蛋白的C-末端融合。

24.一种纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求10所述的环状膜支架蛋白。

25.一种双纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求12所述的双环状膜支架蛋白。

26.一种纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求14所述的大环状膜支架蛋白。

27.一种双纳米穿孔器，其特征在于，由两个纳米穿孔器通过共价键结合而成，其中一个纳米穿孔器包含由内含肽的C-末端结构域与权利要求15所述的膜支架蛋白的N-末端融合而成的融合蛋白，另一个纳米穿孔器包含由内含肽的N-末端结构域与权利要求16所述的膜支架蛋白的C-末端融合而成的融合蛋白。

28.一种纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求17所述的能够与抗体结合的膜支架蛋白。

29.一种双纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求20所述的能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白。

30.一种纳米穿孔器，其特征在于，包含权利要求21所述的能够与抗体结合的大环状膜支架蛋白。

31.一种双纳米穿孔器，其特征在于，由包含权利要求22所述的融合蛋白的纳米穿孔器与包含权利要求23所述的融合蛋白的纳米穿孔器通过共价键结合而成。

32.一种用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于，包含权利要求24至31中任一项所述的纳米穿孔器。

33.根据权利要求32所述的用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于，纳米穿孔器还包含病毒表面抗原受体。

34.一种纳米穿孔器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

表达权利要求1或5所述的质粒；

经还原剂处理来纯化环状膜支架蛋白或能够与抗体结合的膜支架蛋白；以及

通过自组装过程制备纳米穿孔器。

35.一种双纳米穿孔器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

表达权利要求1或5所述的质粒；

通过排除还原剂来纯化双环状膜支架蛋白或能够与抗体结合的双环状膜支架蛋白；以及

通过自组装过程制备纳米穿孔器。

36.一种双纳米穿孔器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

通过表达并纯化权利要求3所述的质粒或权利要求8所述的质粒来获得融合蛋白；

通过自组装过程制备第一纳米穿孔器；

通过表达并纯化权利要求4所述的质粒或权利要求9所述的质粒来获得融合蛋白；

通过自组装过程制备第二纳米穿孔器；以及

使第一纳米穿孔器与第二纳米穿孔器通过共价键结合。

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