JP2020532953A

JP2020532953A - コンフォメーションが安定化されたｒｓｖ融合前ｆタンパク質

Info

Publication number: JP2020532953A
Application number: JP2020506859A
Authority: JP
Inventors: マーシャル、クリストファー; ヨンドラ、マーク; マリアニ、ロベルト; ゾンバック、アーロン; ギドワニ、ソナル
Original assignee: カルダー・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2020-11-19
Anticipated expiration: 2038-08-07
Also published as: US20250092094A1; CN111405907A; CN119529036A; US20200361997A1; JP2025016444A; EP3664836A4; CA3072293A1; AU2018313000A1; US11926649B2; KR20200035115A; US20230053714A1; JP7566315B2; CN111405907B; AU2018313000B2; US11267848B2; WO2019032480A1; EP3664836A1

Abstract

本発明は、変異ＲＳＶＦ分子、たとえば、１つ以上のＤＴ架橋の導入によって融合前のコンフォメーションで安定化され得るか、又は安定化されている変異ＲＳＶＦ分子を提供する。本発明はまた、かかる変異ＲＳＶＦ分子を作製する方法、かかる変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物、並びに、たとえば、ワクチン接種方法、治療方法、及び抗体製造方法において、かかる変異ＲＳＶＦ分子を使用する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月７日に出願された米国特許仮出願第６２／５４２，２４７号、２０１８年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／６２９，６８５号、２０１８年３月８日に出願された米国特許仮出願第６２／６４０，４６７号、および２０１８年５月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／６７４，７９１号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年８月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩによる複製物は、Avatar_009_WO1_SL.txtという名称であり、サイズは452,739バイトである。

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＡＩ１１２１２４の下、政府支援を受けてなされた。本発明において政府はある一定の権利を有する。

参照による援用
参照による援用を許容する法的範囲のみを目的として、本明細書で引用されるすべての文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

米国では、毎年４００〜５００万人の小児がＲＳウイルス（ＲＳＶ）に感染し、乳幼児の入院の最も大きな原因となっている（約１５０，０００人の入院者数）。全世界では１歳未満の乳幼児における死者の６．７％をＲＳＶが占め、マラリアに次いで第２位である。加えて、高齢および免疫不全の対象をはじめとした他の高リスク群にも深刻な脅威となっており、米国において概算で１８０，０００人の入院者数と１２，０００人の死者数をさらに生み出している。ＲＳＶに対する現行のフロントライン治療は存在せず、現在認可されているＲＳＶに対する唯一の予防的治療は、認可済みのモノクローナル抗体シナジス（登録商標）（パリビズマブ）の受動的投与であり、これはＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を認識し、重症疾患の発生率を約５０％減少させる。シナジス（登録商標）による予防は高コストであるため、その使用は未熟児および先天性心疾患を有する生後２４ヶ月未満の乳幼児にのみ限定される。総説としては、Costelloら, “Targeting RSV with Vaccines and Small Molecule Drugs, Infectious Disorders,” Drug Targets, 2012, vol. 12, no. 2.を参照されたい。より有効で、理想的には費用対効果のより高いＲＳＶワクチンの開発は、莫大な価値があるものと思われる。

ＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質である。自然界では、ＲＳＶＦタンパク質は、「Ｆ０」で表記される単一の前駆体ポリペプチドとして翻訳される。Ｆ０前駆体ポリペプチドは一般に長さが５７４アミノ酸であり、そのうち第１〜２５位のアミノ酸がシグナルペプチドを構成する。前駆体ポリペプチドＦ０は前駆体三量体を形成し、これは細胞プロテアーゼによりタンパク質分解で切断されて、Ｐｅｐ２７ポリペプチド、Ｆ１ポリペプチド、およびＦ２ポリペプチドを生じる。Ｆ２ポリペプチドは、典型的に、Ｆ０前駆体の第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含む。Ｆ１ポリペプチドは、典型的に、Ｆ０前駆体の第１３７〜５７４位のアミノ酸残基を含む。Ｆ１ポリペプチドとＦ２ポリペプチドとがジスルフィド結合によって連結されて、ＲＳＶＦ「プロトマー」と呼ばれるヘテロ二量体を形成する。かかるプロトマー３つが、ＲＳＶＦ分子の成熟三量体型形態を形成する。

ＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶに対する防御に関係する強力な中和抗体を誘導することが知られている。近年、ＲＳＶＦタンパク質三量体の融合前のコンフォメーション（以下、「融合前Ｆ」または「ｐｒｅ−Ｆ」という場合がある）が、ヒト血清中における中和活性の最も大きな決定因子であることが示されている。これまでに単離された最も強力な中和抗体（ｎＡｂ）もまた、融合前のコンフォメーションにのみ特異的に結合する。しかし、可溶型ｐｒｅ−Ｆは非常に不安定で、融合後のコンフォメーションに容易に移行するため、ワクチン用免疫原としてのその有用性が限定されている。

融合前のコンフォメーションで安定化されたＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶワクチン免疫原の候補で、非常に価値がある可能性がある。

ＲＳＶＦタンパク質（強力な中和ＡｂであるＤ２５に結合したもの）のその融合前のコンフォメーションにおける結晶構造は、McLellanら, 2013, Science, 340, p. 1113-1117に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＲＳＶＦをそのｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで安定化しようとする目的で、いくつかの異なる手法が開発されている。たとえば、これまでにMarshallらは、ＲＳＶＦタンパク質のある特定の位置における、「チロシンへの」点変異およびジチロシン（ＤＴ）架橋を導入することを記載している。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６を参照されたい。他の手法は、ＲＳＶＦタンパク質のある特定の位置における、「システインへの」変異、ジスルフィド結合、および／または空洞充填アミノ酸置換を導入することを含んでいる。米国特許第９７３８６８９号明細書、米国特許第９９５００５８号明細書、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598を参照されたい。

本発明は、これまでに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６にてMarshallらによって記載された研究を超える、一定の新たな進展と改善をもたらすものであり、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６に記載されておらず、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６に記載された分子と比較して、さらには、他のＲＳＶＦ変異体およびＲＳＶＦ免疫原の候補と比較して改善された特性を有する、ある種の新規の変異ＲＳＶＦ分子を提供することを含むが、これに限定されない。本明細書の実施例に示すように、これらの新規の変異ＲＳＶＦ分子を認められている前臨床動物モデルを使用してインビボで動物に投与したとき、それらは高い免疫原性を示す。

一部の態様において、本発明は、第４２８位のアミノ酸位置におけるチロシン（標準的な慣習に従って「Ｔｒｙ」または「Ｙ」と略記する）への点変異、すなわち、「４２８Ｙ変異」を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。本明細書の実施例でさらに説明するように、かかる４２８Ｙ変異を含む変異ＲＳＶＦ分子（「４２８Ｙ変異体」という）は、４２８Ｙ変異ではなく４２７Ｙ変異を含む以外は同一である変異ＲＳＶＦ分子と比較して、改善された特性を有する。これらの改善された特性には、（ｉ）ワクチン接種後の血清中和力価がおよそ５倍に増加すること、（ｉｉ）抗原部位ＩＶ−Ｖに特異的な抗体および融合前の特定の抗原部位「Ｏ」（翻訳文注：「Ｏ」は、

という文字を意味する。以下、この注記は省略する。また、「ｏ」はその小文字である。）に特異的な抗体への結合によって決定される抗原プロファイルが、著しく改善されること、ならびに（ｉｉｉ）ＲＳＶＦ三量体型複合体の産生量が六量体型複合体と比較して著しく増加することが含まれる。これらの発見に基づき、本発明は、成熟ＲＳＶＦ三量体、１つ以上のＤＴ架橋により融合前のコンフォメーションにコンフォメーションが固定された成熟ＲＳＶＦ三量体、これらの様々な前駆体、およびこれらの様々な構成要素（Ｆ１およびＦ２ポリペプチドならびにプロトマーを含む）が含まれるがこれらに限定されない、新規の改善された様々な変異ＲＳＶＦ分子を提供する。また、本発明は、かかる変異ＲＳＶＦ分子のアミノ酸配列、かかる変異ＲＳＶＦ分子をコードする塩基配列、かかる塩基配列を含むベクター、かかる塩基配列またはベクターを含む、および／または発現する細胞、かかる変異ＲＳＶＦ分子の製造方法、ならびに、ＲＳＶに対するワクチン接種のためのインビボでの使用および抗体製造のための免疫原としての使用を含むがこれらに限定されない、かかる変異ＲＳＶＦ分子の使用方法を提供する。

したがって、一態様において、本発明は、第４２８位のアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異（すなわち、４２８Ｙ変異）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第４２８位に相当するアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、４２８Ｙ変異をそれぞれが含むＲＳＶＦ単量体またはプロトマーであるか、またはこれを含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、３つの４２８Ｙ変異を含むＲＳＶＦ三量体（たとえば、成熟ＲＳＶＦ三量体）であるか、またはこれを含む。

一部の態様において、４２８Ｙ変異を含むかかる変異ＲＳＶＦ分子はまた、第２２６位のアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異（すなわち、２２６Ｙ変異）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第２２６位に相当するアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異を含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、４２８Ｙ変異と２２６Ｙ変異の両者をそれぞれが含むＲＳＶＦ単量体またはプロトマーであるか、またはこれを含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、３つの４２８Ｙ変異と３つの２２６Ｙ変異とを含むＲＳＶＦ三量体（たとえば、成熟ＲＳＶＦ三量体）であるか、またはこれを含む。

一部の態様において、４２８Ｙ変異を含むかかる変異ＲＳＶＦ分子はまた、第１８５位のアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異（すなわち、１８５Ｙ変異）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第１８５位に相当するアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異を含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、４２８Ｙ変異と１８５Ｙ変異の両者をそれぞれが含むＲＳＶＦ単量体またはプロトマーであるか、またはこれを含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、３つの４２８Ｙ変異と３つの１８５Ｙ変異とを含むＲＳＶＦ三量体（たとえば、成熟ＲＳＶＦ三量体）であるか、またはこれを含む。

一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子はまた、（ａ）第２２６位のアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異（すなわち、２２６Ｙ変異）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第２２６位に相当するアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異と、（ｂ）第１８５位のアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異（すなわち、１８５Ｙ変異）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第１８５位に相当するアミノ酸位置におけるチロシンへの点変異の両者を含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、４２８Ｙ変異と、２２６Ｙ変異と、１８５Ｙ変異とをそれぞれが含むＲＳＶＦ単量体またはプロトマーであるか、またはこれを含む。一部の態様において、かかる変異ＲＳＶＦ分子は、３つの４２８Ｙ変異と、３つの２２６Ｙ変異と、３つの１８５Ｙ変異とを含むＲＳＶＦ三量体（たとえば、成熟ＲＳＶＦ三量体）であるか、またはこれを含む。

本明細書に記載の様々な変異ＲＳＶＦ分子の各々は、他の様々な変異を含むこともできる。

一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子はまた、１つ以上のさらなるチロシンへの変異、たとえば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６（国際公開第２０１５／０１３５５１号）に記載されたチロシンへの変異のうちの１つ以上を含み、同文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子はまた、１つ以上のシステインへの変異、たとえば、１つ以上または米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載されたものを含み、これらの文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載される、いわゆる「ＤＳ」変異を含む。たとえば、一部の態様において、ＲＳＶＦ分子は、１５５Ｃ変異、２９０Ｃ変異、または１５５Ｃ変異と２９０Ｃ変異の両者を含む。

一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子はまた、１つ以上の空洞充填アミノ酸置換、たとえば、１つ以上または米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載されるものを含み、これらの文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載される、いわゆる「Ｃａｖ１」変異を含む。たとえば、一部の態様において、ＲＳＶＦ分子は、Ｓ１９０Ｆ空洞充填変異、Ｖ２０７Ｌ空洞充填変異、またはＳ１９０Ｆ空洞充填変異とＶ２０７Ｌ空洞充填変異の両者を含む。

一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子は、異種三量体形成ドメインをさらに含む。かかる態様の一部において、三量体形成ドメインはフォールドン（foldon）ドメインである。

一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子は、ＲＳＶＦ分子の検出および／または精製に有用であり得る、１つ以上のタグをさらに含む。一部の態様において、かかるタグは切断可能なタグであってもよい。かかる態様の一部において、タグは、Ｈｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、またはＳｔｒｅｐＩＩタグである。

本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子の各々は、膜結合型または可溶型（すなわち、非膜結合型）形態のいずれかで提供することができる。一部の態様において、膜結合型形態には、天然に存在するＲＳＶＦタンパク質の膜貫通および細胞質ドメインが含まれ、これらの詳細（配列を含む）は、本明細書の詳細な説明に示される。一部の態様において、膜結合型形態は、他の、すなわち、ＲＳＶＦタンパク質に本来備わっていない膜貫通および細胞質ドメインを含んでいてもよい。一部の態様において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子の可溶型（すなわち、非膜結合型）形態が使用される。可溶型形態は、ＲＳＶＦ分子が医薬組成物の成分として使用される場合、たとえば、ＲＳＶに対する防御のためのワクチンとして使用する場合に特に有用であり得る。本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子のかかる可溶型は、たとえば、本明細書の詳細な説明でさらに説明するように、膜貫通および細胞質ドメインを除去することによって作製することができる。一部のかかる態様において、本明細書の詳細な説明でさらに説明するように、異種配列を付加して、膜貫通および細胞質ドメイン、たとえば、異種三量体形成ドメイン、たとえば、フォールドン（foldon）ドメインを置きかえてもよい。

本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子の各々は、１つ以上のＤＴ架橋を含み、そのｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにコンフォメーションが固定された、成熟ＲＳＶＦ三量体の形態で提供することができる。かかるコンフォメーションが固定されたＲＳＶＦ分子は、この明細書の詳細な説明および実施例の項で説明するように、ならびに／または国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６（国際公開第２０１５／０１３５５１号）で記載されるように、ＤＴ架橋反応を行うことによって作製することができ、同文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の態様において、本発明は、少なくとも１つのＤＴ架橋を含む、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を提供する。一部の態様において、本発明は、少なくとも３つのＤＴ架橋を含む、本明細書に記載される三量体型変異ＲＳＶＦ分子を提供する。一部の態様において、本発明は、少なくとも６つのＤＴ架橋を含む、本明細書に記載される三量体型変異ＲＳＶＦ分子を提供する。

一部の態様において、本発明は、少なくとも１つのＤＴ架橋を含み、少なくとも１つのＤＴ架橋の少なくとも１つのチロシンがチロシンへの点変異によって導入された、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を提供する。一部の態様において、本発明は、少なくとも３つのＤＴ架橋を含み、少なくとも３つのＤＴ架橋の各々の少なくとも１つのチロシンがチロシンへの点変異によって導入された、本明細書に記載される三量体型変異ＲＳＶＦ分子を提供する。

たとえば、一部の態様において、ＤＴ架橋は、第１９８位の残基におけるチロシン（一般に、天然に存在するチロシン）と第２２６位の残基における導入されたチロシン（すなわち、２２６Ｙ変異の結果生じたもの）の間に導入されて、分子内１９８Ｙ−２２６ＹＤＴ架橋を形成する。これにより、３つの分子内ＤＴ架橋を含むＲＳＶＦ三量体が創出される。

一部の態様において、ＤＴ架橋は、第１８５位の残基における導入されたチロシン（すなわち、１８５Ｙ変異の結果生じたもの）と第４２８位の残基における導入されたチロシン（すなわち、４２８Ｙ変異の結果生じたもの）の間に導入されて、１８５Ｙ−４２８Ｙ分子間ＤＴ架橋を形成する。これにより、３つの分子間ＤＴ架橋を含むＲＳＶＦ三量体が創出される。

さらに一部の態様において、１９８Ｙ−２２６Ｙ分子内ＤＴ架橋と１８５Ｙ−４２８Ｙ分子間ＤＴ架橋の両者が導入される。これにより、６つのＤＴ架橋、すなわち、３つの分子内ＤＴ架橋と３つの分子間ＤＴ架橋とを含むＲＳＶＦ三量体が創出される。

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子のうちの１つ以上を含む、組成物を提供する。一部のかかる態様において、組成物は医薬組成物であり、すなわち、その成分は生きている対象への投与に適する。一部のかかる態様において、医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含む。例示的なアジュバントとしてはアラムアジュバントが挙げられるが、これに限定されない。一部の態様において、医薬組成物は担体を含む。一部の態様において、医薬組成物は免疫賦活剤を含む。一部の態様において、組成物はＲＳＶワクチンであるか、またはその一部を形成するか、またはワクチン接種の方法において使用することができる。

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される様々な異なる変異ＲＳＶＦ分子をコードする、核酸分子を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる核酸分子を含むベクターを提供する。一部の態様において、本発明は、かかる核酸分子またはベクターを含む細胞を提供する。

一部の態様において、本発明は、対象におけるＲＳＶを治療または予防するための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、対象にＲＳＶのワクチン接種を行う方法を提供する。一部の態様において、本発明は、対象においてＲＳＶ中和抗体の産生を誘発する方法を提供する。かかる方法の各々は、有効量の本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子、またはかかる変異ＲＳＶＦ分子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。一部のかかる態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。たとえば、一部の態様において、対象は、前臨床試験を行うのに有用な非ヒト哺乳動物、たとえば、齧歯類（たとえば、マウスまたはコットンラット）または非ヒト霊長類であってもよい。一部の態様において、対象はヒトであってもよい。対象がヒトである態様において、ヒト対象は任意の年齢とすることができる。一部の態様において、ヒト対象は乳幼児である。一部の態様において、ヒト対象は小児である。一部の態様において、ヒト対象は生後２４ヶ月未満である。一部の態様において、ヒト対象は成人である。一部の態様において、ヒト対象は５０歳超である。一部の態様において、ヒト対象は６０歳超である。

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を免疫原として使用して抗ＲＳＶＦ抗体を製造するための方法を提供する。かかる抗体は、研究用途および治療的用途をはじめとした様々な用途に有用であり得る。たとえば、一部の態様において、かかる方法は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を、抗体の製造に有用な動物対象、たとえば、マウスまたはウサギに投与することを含む。一部の態様において、対象は、完全ヒト抗体を産生できるように遺伝子改変された動物であってもよい。他の態様において、ライブラリースクリーニング法、たとえば、ファージディスプレイスクリーニング法が挙げられるがこれらに限定されない、抗体製造に有用な他の系において、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を免疫原として使用することができる。

本発明のこれらの側面および他の側面について、この特許出願の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲、図面、および図面の簡単な説明でさらに説明するが、これらの項のすべてが相互に組み合わせて読まれることが意図されている。さらに、本明細書に記載した本発明の様々な態様を、様々な異なる様式で組み合わせることができること、ならびに、かかる組合せが本発明の範囲内であることを、当業者は認識するはずである。

本明細書に記載されるＲＳＶＦ分子を哺乳動物細胞内で発現するための、例示的な核酸ベクター。１９８Ｙ−２２６ＹＤＴ架橋（「設計１」）と１８５Ｙ−４２８ＹＤＴ架橋（設計２）とを含む変異ＲＳＶＦ分子の概略図。分子の構造中の抗原部位「Ｏ」、ＩＶ、およびＶを示す。図３Ａ；ＤＴ架橋反応を行った後、部位「Ｏ」に結合する融合前特異的ｍＡｂであるＤ２５を用いたＥＬＩＳＡにより、１９８Ｙと２２６Ｙの間の分子内架橋（「設計１」）によって導入された安定性を、４℃で２週間にわたって測定した。図３Ｂ；ウェスタンブロッティングによりＷＴと比較することで、１８５Ｙと４２８Ｙの間の分子間ＤＴ結合形成（「設計２」）についてアッセイを行った（モタビズマブは一次Ａｂである）。Ｆ_１タンパク質は三量体（ＴＭ）の大きさまで移動する。ＤＴ架橋ＡＶＲ０２を製造するための例示的なプロトコールの概略図。規格化するためにモタビズマブを使用し、コンフォメーションの完全性を調べるために抗原部位ＩＶ／Ｖに結合する抗体（図５Ａ）および部位「Ｏ」に結合する抗体（図５Ｂ）を使用したＥＬＩＳＡによる、ＤＳ−Ｃａｖ１、４２８ＹＲＳＶＦ変異体の未架橋体（ＡＶＲ０２）、および４２８Ｙ変異体のＤＴ架橋体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）のコンフォメーションの完全性についての比較。３７℃で１００時間の熱負荷後における、部位「Ｏ」の抗原性。図６Ａ；４℃および３７℃でのインキュベーション後における、５Ｃ４（部位「Ｏ」）による、４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＡＶＲ０２）および４２８ＹＲＳＶＦ変異体のＤＴ架橋体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）に対する保持された結合の比較。図６Ｂ；３７℃での１００時間のインキュベーション後における、ＤＳ−Ｃａｖ１およびＤＴ−ＡＶＲ０２に対する保持された５Ｃ４およびＤ２５の結合。各対の左の棒は５Ｃ４である。各対の右の棒はＤ２５である。図６Ｃ；４℃で５週間後における、５Ｃ４（部位「Ｏ」）による４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＡＶＲ０２）に対する保持された結合。マウスにおけるインビボでのＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２またはＤＴ−ｐｒｅＦ）の有効性。中和力価。アラムを添加したＤＳＣＡＶ１またはＤＴ−ＡＶＲ０２のいずれかでワクチン接種した動物から得た、ＲＳＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ中和力価。例示的なワクチン接種スケジュールの概略図。コットンラットにおける、ＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２またはＤＴ−ｐｒｅＦという）のインビボでの有効性。＋３９日目における、Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体の、鼻洗浄液中のＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ力価に対する効果。記載の対照および処理群の各々について、ＲＳＶ力価を示す。コットンラットにおける、ＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２／ＤＴ−ｐｒｅＦ）のインビボでの有効性。＋３９日目における、肺洗浄液中のＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ力価に対する、Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体。記載の対照および処理群の各々について、ＲＳＶ力価を示す。コットンラットにおける、ＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２／ＤＴ−ｐｒｅＦ）のインビボでの有効性。Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ−ｐｒｅＦの、ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ血清中和抗体の生成に対する効果。コットンラットにおける、ＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２／ＤＴ−ｐｒｅＦ）のインビボでの有効性。Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ−ｐｒｅＦの、ＲＳＶ／Ｂ／１８５３交差反応性中和抗体の生成に対する効果。第４２７位（４４７Ｙ）ではなく第４２８位（４４８Ｙ）におけるチロシン置換は、ＲＳＶＦ変異体の抗原プロファイルを劇的に改善する。Streptactin（登録商標）で精製された可溶型４２７Ｙ（ＤＴ−Ｃａｖ１）変異体（図１３Ａ〜Ｂ）または４２８Ｙ（ＤＴ−ＡＶＲ０２）変異体（図１３Ｃ〜Ｄ）をＤＴ架橋に供し、精製し、記載のｍＡｂを用いて抗原性について分析した。ＥＬＩＳＡを、モタビズマブを用いて総タンパクについて規格化し、Ｎｉ−ＮＴＡ被覆プレート上で実施した。ＤＳＣａｖ１を陽性対照として使用した。２つのコンフォメーションの抗体、部位「Ｏ」に特異的なｍＡｂおよび抗原部位ＩＶ／Ｖの間で結合する融合前特異的ｍＡｂを用いて、融合前の構造を詳しく調べた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＤＴ架橋４２７ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−Ｃａｖ１）とＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）の顕著に異なるプロファイルが明らかとなる。ジチロシン架橋反応の直後における記載のＲＳＶＦ変異体（４２７Ｙ／ＤＴ−Ｃａｖ１図１４Ａ上、左、および４２８Ｙ／ＤＴ−ＡＶＲ０２図１４Ｂ下左）のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。４２８Ｙ変異により、架橋反応後に高次種の劇的な減少が実現される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上還元および変性条件下で分離後、クーマシー染色を行った後における最終生成物を図１４Ｃ（右）に示す。矢印は、高次種（４２７Ｙ／ＤＴ−Ｃａｖ１）と架橋三量体型種（４２８Ｙ／ＤＴ−ＡＶＲ０２）を示す。ＤＴ架橋４２８ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）でワクチン接種した動物の血清中和力価は、ＤＴ架橋４２７ＹＲＳＶＦ変異体（ＤＴ−Ｃａｖ１）でワクチン接種した動物の中和力価より劇的に高い。プライム−ブーストレジメンにより、ＤＳ−Ｃａｖ１対照（ベンチマーク比較基準）または記載のＤＴ架橋分子のいずれか（図１５Ａ（左）が４２７Ｙ／ＤＴ−Ｃａｖ１、図１５Ｂ（右）が４２８Ｙ／ＤＴ−ＡＶＲ０２）を１０μｇ用い、動物にワクチン接種を行った。追加免疫後に血清を採取し、加熱失活させ、ＲＳＶ−ウミシイタケルシフェラーゼレポーターウイルスを用いて中和力価を取得した。記載の中和力価は５動物／群の平均であり、ルシフェラーゼ活性の５０％阻害をもたらす逆数血清希釈度として計算される。スクロースを用いた調合により、ＲＳＶＦ凝集体の形成が減少する。実験は、ＤＴ架橋４２８Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）を用いて実施した。最終濃縮後、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。図１６Ａに示されるように、３つのピークが同定され、それらのうちピークＣは三量体であり、ピークＡおよびＢは凝集体である。精製工程の溶出中に１０％スクロースを用いてＤＴ−ＡＶＲ０２分子を調合することにより、凝集体の形成がなくなったように見える。図１６Ｂに示されるように、１０％スクロースを用いて調合された試料では、ピークＣ（三量体）は残存したがピークＡおよびＢ（凝集体）は明白ではなかった。

発明の詳細な説明

本発明は、その一部において、１つ以上のチロシンへの変異を含み、１つ以上のＤＴ架橋を導入することにより融合前のコンフォメーションで安定化され得る、または安定化されている変異ＲＳＶＦ分子を提供する。本発明はまた、かかる変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子、かかる変異ＲＳＶＦ分子を作製する方法、かかる変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物、ならびに、ワクチン接種方法、治療方法、および抗体製造方法が含まれるがこれらに限定されない、かかる変異ＲＳＶＦ分子を使用する方法を提供する。

定義
本開示において使用される科学技術用語は当業者が一般に理解する意味を有し、および／または、それらの意味は、本明細書で具体的に別段の定義がない限り、用語が使用される文脈から明らかである。以下でいくつかの用語を定義する。他の用語は、本明細書のいずれかの箇所で定義される。

本明細書および特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を含む。「a」（または「an」）ならびに「１つ以上」および「少なくとも１つの」という用語は、交換可能に使用することができる。

さらに、「および／または」は、他方を伴っているかまたは伴っていない、２つの明記された特徴または構成要素の各々を具体的に開示していると解釈されるものとする。よって、「Ａおよび／またはＢ」のような語句で使用される場合の「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」のような語句で使用される場合の「および／または」という用語は、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を含むことが意図される。

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）に認可された形式で記載される。本明細書で提示される数値範囲は、その範囲を規定している数字を含む。

本明細書で使用される「約」および「およそ」という用語は、数値との関連で使用される場合、その値の＋または−２０％の範囲内であることを意味する。

本明細書で使用される「例示的な」という用語は、例、事例、または例示となることを意味する。

本明細書で使用される「ＲＳＶＦ分子」という用語は、Ｆ１ポリペプチドとＦ２ポリペプチドとを含むＲＳＶＦタンパク質のあらゆる形態を指し、すなわち、Ｆ０前駆体ポリペプチド、Ｆ０前駆体ポリペプチドの三量体、ＲＳＶＦプロトマー、および成熟ＲＳＶＦ三量体が含まれ、これらは膜結合型であっても可溶型であってもよい。本明細書で使用される「変異ＲＳＶＦ分子」という用語は、人工的に導入された／人の手による１つ以上の変異を含むＲＳＶＦ分子を指す。

本明細書で使用される「Ｆ１ポリペプチド」という用語は、ＲＳＶＦＦ０前駆体配列の第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。第１３７〜５１３位のアミノ酸残基はＲＳＶＦ膜貫通および細胞質ドメインを含まない。一部の態様において、Ｆ１ポリペプチドはまた、ＲＳＶＦ膜貫通および細胞質ドメイン（ＲＳＶＦＦ０前駆体配列の第５１４〜５７４位の残基内に位置する）を含んでいてもよい。

本明細書で使用される「Ｆ２ポリペプチド」という用語は、ＲＳＶＦＦ０前駆体配列の第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。

本明細書で使用される「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、別段の記載がない限り、交換可能に使用される。本明細書で使用される「タンパク質複合体」という用語は、２つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニット、たとえば、２つ以上の単量体またはプロトマーの集合体である。別段の記載がない限り、タンパク質またはポリペプチドに関する本明細書のすべての記載はタンパク質複合体にも等しく適用され、逆もまた同様である。

本明細書で使用される「核酸分子」、「核酸配列」、および「塩基配列」という用語は、交換可能に使用される。

本明細書で使用される「安定化」および「固定」という用語は、たとえば、ＲＳＶＦタンパク質をその融合前のコンフォメーションで安定化させるかまたは固定する際の架橋の効果に関連して、交換可能に使用される。これらの用語は１００％の安定性を必要としない。これらの用語はむしろ、ある程度改善または増加した安定性を意味する。たとえば、一部の態様において、融合前のコンフォメーションにおいて架橋されているＲＳＶＦタンパク質に関連して「安定化」という用語が使用される場合、この用語は、融合前のコンフォメーションが、かかる架橋の前またはそれがない状態で有すると考えられるより大きい安定性を有することを意味する。安定性および相対的安定性は、本出願の他の部分で記載される、たとえば、ＲＳＶの融合前のコンフォメーションの半減期に基づいた様々な様式で測定してもよい。安定性の改善または増加は、意図する用途にとって有用または重要である、いかなる程度であってもよい。たとえば、一部の態様において、安定性は、約１０％、２５％、５０％、１００％、２００％（すなわち、２倍）、３００％（すなわち、３倍）、４００％（すなわち、４倍）、５００％（すなわち、５倍）、１０００％（すなわち、１０倍）、またはそれより大きく増加してもよい。

本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、免疫原または免疫原性組成物、たとえば、ワクチンに対する身体の免疫応答を、増強、加速、または延長することが可能な物質を指す。

本明細書で使用される「ＤＳ−Ｃａｖ１」という用語は、McLellanら, Science, 342(6158), 592-598, 2013に記載される変異ＲＳＶＦタンパク質を指し、これは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む。

本明細書で使用される「融合前のコンフォメーション」という用語は、融合前特異的抗体によって特異的に結合され得るＲＳＶＦ分子の立体構造を指す。

本明細書で使用される「融合前特異的抗体」という用語は、融合前のコンフォメーションにあるＲＳＶＦ分子に特異的に結合するが、融合後のコンフォメーションにあるＲＳＶＦタンパク質に結合しない抗体を指す。融合前特異的抗体としては、Ｄ２５、ＡＭ２２、５Ｃ４、およびＡＭ１４抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ＡＭ１４」という用語は、国際公開第２００８／１４７１９６号（Ａ２）に記載される抗体を指す。

本明細書で使用される「ＡＭ２２」という用語は、国際公開第２０１１／０４３６４３号（Ａ１）に記載される抗体を指す。

本明細書で使用される「Ｄ２５」という用語は、国際公開第２００８／１４７１９６（Ａ２）に記される抗体を指す。

本明細書で使用される「５Ｃ４」という用語は、McLellanら, 2010, Nat. Struct. Mol. Biol., Feb 17(2): 248-50に記載される抗体を指す。McLellanら（Science 340: 1113-1117 (2013)）。

変異ＲＳＶＦ分子
ＲＳＶ融合または「Ｆ」タンパク質は、ＲＳウイルスのエンベロープ糖タンパク質である。自然界では、ＲＳＶＦタンパク質は、単一の前駆体ポリペプチドとして翻訳される（Ｆ０と表記）。Ｆ０前駆体ポリペプチドは、一般に長さが５７４アミノ酸である。Ｆ０前駆体の第１〜２５位のアミノ酸が一般にシグナルペプチドを構成する。前駆体ポリペプチドＦ０は前駆体三量体を形成し、これは典型的に、１つ以上の細胞プロテアーゼにより、保存されたフリンコンセンサス切断部位においてタンパク質分解で切断されて、Ｐｅｐ２７ポリペプチド、Ｆ１ポリペプチド、およびＦ２ポリペプチドを生じる。Ｐｅｐ２７ポリペプチド（一般に、Ｆ０前駆体の第１１０〜１３６位のアミノ酸）は取り除かれ、成熟ＲＳＶＦ三量体の一部を形成することはない。Ｆ２ポリペプチド（以下、「Ｆ２」または「Ｆ２領域」という場合がある）は、一般に、Ｆ０前駆体の第２６〜１０９位のアミノ酸残基からなる。Ｆ１ポリペプチド（以下、「Ｆ１」または「Ｆ１領域」という場合がある）は、一般に、Ｆ０前駆体の第１３７〜５７４位のアミノ酸残基からなり、細胞外領域（一般に、第１３７〜５２４位の残基）と、膜貫通ドメイン（一般に、第５２５〜５５０位の残基）と、細胞質ドメイン（一般に、第５５１〜５７４位の残基）とを含む。Ｆ１ポリペプチドとＦ２ポリペプチドとはジスルフィド結合によって連結されて、ＲＳＶＦ「プロトマー」と呼ばれるヘテロ二量体を形成する。かかる３つのプロトマーが、成熟ＲＳＶＦ三量体、すなわち、３つのプロトマーによるホモ三量体を形成する。自然界では、成熟ＲＳＶＦ三量体は一般に膜結合型である。しかし、成熟ＲＳＶＦ三量体の可溶型（すなわち、非膜結合型）を、膜貫通および細胞質ドメインを除去することによって作製することができる。たとえば、ＲＳＶＦタンパク質を第５１３位のアミノ酸で切断することによって（すなわち、第５１４位以降のアミノ酸を除去することによって）、可溶型形態への変換を実現することができる。

自然界では、成熟ＲＳＶＦ三量体は、ウイルス膜と細胞膜との融合を媒介する。成熟ＲＳＶＦ三量体の融合前のコンフォメーション（以下、「ｐｒｅ−Ｆ」という場合がある）は、非常に不安定（準安定）である。しかし、ＲＳＶウイルスが細胞膜と合体すると、ＲＳＶＦタンパク質三量体は、一連のコンフォメーションの変化および遷移を経て、非常に安定な融合後の（「ｐｏｓｔ−Ｆ」）コンフォメーションになる。成熟ＲＳＶＦタンパク質はＲＳＶに対する防御に関係する強力な中和抗体（「ｎＡｂ」）を誘導することが知らている。たとえば、ＲＳＶＦタンパク質を用いた免疫化により、ヒトにおいて保護作用のあるｎＡｂが誘導される（たとえば、シナジス（登録商標））。ＲＳＶＦタンパク質の融合後形態には、いくつかの中和エピトープ（部位Ｉ、ＩＩ、およびＩＶ）が存在する。しかしながら、近年、Magroらは、融合後のコンフォメーションにあるＲＳＶＦタンパク質とヒト血清のインキュベーションでは、Ｆタンパク質に対する中和活性の大半の枯渇に失敗したことを示しており、このことは、融合前のコンフォメーションに特有の中和抗原部位の存在を示唆した（Magro et al, 2012, PNAS 109(8): 3089）。Ｘ線結晶構造解析により、パリビズマブ（シナジス（登録商標））、モタビズマブ（Numax）、およびより最近に発見された１０１Ｆモノクローナル抗体（McLellanら, 2010, J. Virol., 84(23): 12236-44；およびMcLellanら, 2010, Nat. Struct. Mol. Biol., Feb 17(2): 248-50）によって認識されるエピトープがマッピングされた。McLellanら（Science 340: 1113-1117 (2013)）は融合前のコンフォメーションにあるＦタンパク質の構造を解明し、これにより、新規の中和エピトープである部位「ｏ」が明らかとなった。部位「ｏ」は融合前のコンフォメーションにのみ提示され、部位「ｏ」には、最大でシナジス（登録商標）およびNumaxの５０倍強力な中和力のある一連の抗体、たとえば、５Ｃ４が結合する。したがって、この融合前のコンフォメーションにあって部位「ｏ」を提示するＲＳＶワクチン用免疫原が効果的な保護作用を誘発し得るという証拠が、ますます増えている。しかし、ＲＳＶＦタンパク質の融合前のコンフォメーションが有する非常に不安定（準安定）な性質は、かかるワクチンの開発にとって大きな障害であることが判明している。McLellanらの融合前後のＲＳＶＦの構造を比較すると、大きなコンフォメーションの変化（＞５Å）を生じるＦタンパク質の２つの領域があるように思われる。これらの領域は、Ｆ１サブユニットのＮおよびＣ末端（それぞれ、第１３７〜２１６位および第４６１〜５１３位の残基）に位置している。部位「ｏ」エピトープに結合したＤ２５抗体によって融合前のコンフォメーションに保持されたＲＳＶＦタンパク質の結晶構造において、フォールドン（foldon）三量体形成ドメインを付属させることで、Ｃ末端Ｆ１残基を融合前のコンフォメーションで安定化させることができる。Ｆ１のＮ末端領域を安定化させるべく、McLellanらは、抗体Ｄ２５の結合が結晶構造研究に十分であることを見出した。しかし、ワクチン用免疫原の製造には別の安定化戦略、たとえば、大きな抗体分子に結合させるＲＳＶＦタンパク質が要求されない安定化戦略が必要である。これまでに試みられた１つの代替的な手法は、Ｆ１Ｎ末端の近くに対形成したシステイン変異（ジスルフィド結合形成用）および空洞充填変異を導入することを伴っている（McLellan et al, (2013) Science 342: 592-598に記載のＤＳ−Ｃａｖ１ＲＳＶＦタンパク質バリアントを参照、同文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかし、かかるバリアントの結晶学的解析により、その構造は融合前のコンフォメーション中に部分的に存在しているにすぎないことが明らかとなった。したがって、臨床用ワクチンの開発のための免疫原を獲得するためには、ＲＳＶＦタンパク質のさらなる操作が必要である。

本発明は、ＲＳＶＦタンパク質をその融合前のコンフォメーションで安定化させるためのいくつかの代替的な手法を提供し、これらは、ＲＳＶＦ分子の特定の位置に１つ以上の「チロシンへの」変異と１つまたは１つ以上のＤＴ架橋とを導入することに基づく。

いくつかの例示的なＲＳＶＦおよび変異ＲＳＶＦ分子のアミノ酸配列を、表１および配列表に示す。表１に提示されている配列の多くは「Ｆ０」配列として表されており、すなわち、これらの配列は、シグナルペプチドと、Ｆ０前駆体中に存在するが成熟ＲＳＶＦタンパク質中に存在しないｐｅｐ２７ペプチドとを含む。同様に、表１に提示されている配列のうちのいくつかは、一部の態様において除去して成熟ＲＳＶ三量体の可溶型を形成することが可能な、本来備わっている膜貫通および細胞質ドメインを含む。よって、これらの例示的な変異ＲＳＶ分子の最終／成熟形態（すなわち、ＤＴ架橋されていてもよい形態）は、典型的に、表１中の配列に示されたアミノ酸のすべてを含むとは限らない。しかし、これらの例示的な変異ＲＳＶ分子の最終／成熟形態は、これらの配列のうち、Ｆ２領域と、Ｆ１領域の少なくとも一部分とを含む。典型的に、これらの例示的な変異ＲＳＶ分子の最終／成熟形態は、これらの配列のうち、第２６〜１０９位のアミノ酸残基と、第１３７〜５１３位のアミノ酸残基とを含む。特定の例示的なアミノ酸配列を有するＲＳＶＦ分子に言及する、本明細書のすべての態様において、完全Ｆ０配列、またはそれについての第２６〜１０９位のアミノ酸残基および第１３７〜５１３位のアミノ酸残基のいずれかが想定されていることは、留意しなくてはならない。

本明細書全体を通じて、アミノ酸残基番号によってＲＳＶＦ分子の特定のアミノ酸位置／残基に言及がなされる場合（たとえば、第４２８位のアミノ酸残基）、別段の記載がない限り、アミノ酸の番号付けは、本出願の配列表および表１に提示されるＲＳＶＦアミノ酸配列に対して使用されている番号付けである（たとえば、配列番号１〜９１を参照）。これは、ＲＳＶＦ配列を記述する際に当該技術分野で常用されるものと同じ付番法である。しかし、異なる付番法を使用できることには留意しなければならず、当業者はこれを理解するはずである。たとえば、配列番号１〜９１のいずれかと比較して付加または欠失されたさらなるアミノ酸残基が存在する場合。そういうものとして、理解されたい点は、特定のアミノ酸残基がその番号を用いて言及される場合、その記載は、所与のアミノ酸配列の開始位置から数えて番号付けされた位置に正確に位置するアミノ酸だけに限らず、むしろ、任意のすべてのＲＳＶＦ配列において、その残基が所与の分子における番号付けされた正確に同じ位置にあるのではない場合、たとえば、ＲＳＶ配列が配列番号１より短いもしくは長い、または配列番号１と比較して挿入もしくは欠失を有する場合であっても、「相当する」アミノ酸残基が意図されていることである。当業者は、本明細書で記載される番号付けされた特定の残基のいずれかについて、「相当する」アミノ酸位置がいずれであるかを、たとえば、所与のＲＳＶＦ配列を配列番号１または本明細書に示される他のＲＳＶＦアミノ酸配列のいずれか（すなわち、配列番号１〜９１）とアライメントすることによって、容易に決定することができる。かかるアライメントは、ＲＳＶＦ配列がＲＳＶサブタイプおよびＲＳＶ株間で高度に保存的な性質を有していると仮定すれば、コンピュータによってであれ目視によってであれ、容易に行うことができる。異なるＲＳＶサブタイプおよび株に由来する数多くのＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子のアミノ酸配列、ならびに、かかるＲＳＶＦ分子をコードする核酸配列が、当該技術分野において知られている。いくつかの例示的なＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子のアミノ酸配列を、配列番号１〜２０および８２〜８５に示す。他のかかる配列は公共の配列データベース中に見出すことができる。他のかかる配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６、米国特許第９７３８６８９号、および米国特許第９９５００５８号に記載されており、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

ＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子は、ＲＳＶサブタイプ間とＲＳＶ株間の両者で、驚くほど高いレベルの配列保存性を示す。たとえば、国際公開第２０１４／１６０４６３号を参照されたい。たとえば、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢは、Ｆ０前駆体分子において９０％の配列同一性を有する。所与のＲＳＶサブタイプ（たとえば、サブタイプＡまたはＢ）内で、株間での配列同一性は約９８％である。さらに、これまでに同定されたほぼすべてのＲＳＶＦＦ０前駆体は、５７４個のアミノ酸からなる。長さに幾分の小さな相違があり得るが、そのような相違は一般に細胞質ドメインで生じる。

本明細書に記載されるチロシンへの特定の変異を、任意の適切なＲＳＶＦ「バックグラウンド」配列中に導入することができる。

一部の態様において、かかる「バックグラウンド」配列は、ＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子（すなわち、自然界に存在するＲＳＶＦ分子）の配列である。当該技術分野において、異なるＲＳＶサブタイプおよび株に由来する数多くのＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子のアミノ酸および塩基配列が知られている。いくつかの例示的なＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子のアミノ酸配列を、配列番号１〜２０および８２〜８５に示す（表１および配列表を参照）。他のかかる配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６、米国特許第９７３８６８９号、および米国特許第９９５００５８号に記載されており、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の態様において、かかる「バックグラウンド」配列は、変異ＲＳＶＦ分子の配列、すなわち、ＷＴ／天然ＲＳＶＦ分子と比較した場合に１つ以上の人工的に導入された変異を含む配列である。たとえば、一部の態様において、「バックグラウンド」ＲＳＶＦ配列は、「Ｃａｖ１」変異、「ＤＳ」変異、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。本明細書に記載される特定の変異を導入してもよい、適切な変異バックグラウンドＲＳＶ分子の非限定的な例としては、配列番号８６〜９１のいずれかのアミノ酸配列を有するもの、または配列番号８６〜９１のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸（すなわちＦ２）と第１３７〜５１３位のアミノ酸（すなわち、Ｆ１）とを含むものが挙げられる（表１および配列表を参照）。本明細書に記載される特定の変異を導入してもよい、他の適切な変異バックグラウンドＲＳＶ分子としては、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６、米国特許第９７３８６８９号、および米国特許第９９５００５８号に記載されるものが挙げられる。

一部の態様において、本明細書に記載される特定の変異を導入してもよい「バックグラウンド」ＲＳＶＦ分子は、「完全長」ＲＳＶＦ分子、すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＲＳＶＦ分子であってもよい。本明細書に記載される特定の変異および架橋を導入してもよい、適切な「完全長」バックグラウンドＲＳＶ分子の非限定的な例としては、配列番号１〜９、１１〜２９、３１〜４９、５１〜８０、８３、８５、８７、もしくは８９のいずれかのアミノ酸配列を有するもの、または配列番号１〜９、１１〜２９、３１〜４９、５１〜８０、８３、８５、８７、もしくは８９のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸（Ｆ２）と第１３７〜５１３位のアミノ酸（Ｆ１）とを含むものが挙げられる（表１および配列表を参照）。

一部の態様において、本明細書に記載される特定の変異および架橋を導入してもよい「バックグラウンド」ＲＳＶＦ分子は、「可溶型」ＲＳＶＦ分子、すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まないＲＳＶＦ分子であってもよい。本明細書に記載される特定の変異および架橋を導入してもよい、適切な「可溶型」バックグラウンドＲＳＶ分子の非限定的な例としては、配列番号１０、３０、５０、８１、８２、８４、８６、８８、もしくは９０のいずれかのアミノ酸配列を有するもの、または配列番号１０、３０、５０、８１、８２、８４、８６、８８、もしくは９０のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸（すなわち、Ｆ２）と第１３７〜５１３位のアミノ酸（すなわち、Ｆ１）とを含むものが挙げられる。

同様に、一部の態様において、本明細書に記載される特定の変異および架橋を導入してもよい可溶型「バックグラウンド」ＲＳＶＦ分子は、「完全長」ＲＳＶＦ分子から膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを除去することによって、たとえば、第５１４位以降のアミノ酸を「完全長」ＲＳＶＦ分子、たとえば、上述のもののうちの１つから除去することによって創出することができる。

一部の態様において、本発明は、第４２８位のアミノ酸残基におけるチロシンへの点変異（４２８Ｙ点変異という場合もある）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第４２８位に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。

一部の態様において、４２８Ｙ変異を含むかかる変異ＲＳＶＦ分子は、第１８５位のアミノ酸残基におけるチロシンへの点変異（１８５Ｙ点変異という場合もある）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第１８５位に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異をさらに含む。よって、かかる変異体は、４２８Ｙ変異と１８５Ｙ変異の両者を含む。

一部の態様において、４２８Ｙ変異を含むかかる変異ＲＳＶＦ分子は、第２２６位のアミノ酸残基におけるチロシンへの点変異（２２６Ｙ点変異という場合もある）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第２２６位に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異をさらに含む。よって、かかる変異体は、４２８Ｙ変異と２２６Ｙ変異の両者を含む。

一部の態様において、４２８Ｙ変異を含むかかる変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）第２２６位のアミノ酸残基におけるチロシンへの点変異（２２６Ｙ点変異という場合もある）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第２２６位に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異と、（ｂ）第１８５位のアミノ酸残基におけるチロシンへの点変異（１８５Ｙ点変異という場合もある）、または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、第１８５位に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異の両者をさらに含む。よって、かかる変異体は、４２８Ｙ変異と、１８５Ｙ変異と、２２６Ｙ変異とを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含まない、すなわち、可溶型（非膜結合型）ＲＳＶＦ分子である。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、ＲＳＶＡ型またはＲＳＶＢ型分子である。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、融合前特異的抗体に結合することができる。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、抗原部位「ｏ」を認識する抗体、たとえば、米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載されているもののうちの１つに結合することができ、これらの文献の各々は、その全体がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれる。かかる抗体の非限定的な例としては、Ｄ２５、５Ｃ４、およびＡＭ２２が挙げられる。抗原部位「ｏ」を認識する他の抗体は、本明細書に開示されているか、または当該技術分野において知られている。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、Ｆ２ポリペプチドとＦ１ポリペプチドとを含み、Ｆ２ポリペプチドのＣ末端がジスルフィド結合によってＦ１ポリペプチドのＮ末端に連結している。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子はＦ２ポリペプチドとＦ１ポリペプチドとを含み、Ｆ２ポリペプチドのＣ末端が人工的に導入されたペプチドリンカーによってＦ１ポリペプチドのＮ末端に連結している。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）およそ８４個のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）アミノ酸残基およそ３７５個のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）およそ７４〜８４個の酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）アミノ酸残基およそ３６５〜３７５個のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）配列番号２１〜８１のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）配列番号２１〜８１のいずれかの第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）配列番号２１〜８１のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸残基のうちのおよそ７４〜８４個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）配列番号２１〜８１のいずれかの第１３７〜５１３位のアミノ酸残基のうちのおよそ３６５〜３７５個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）配列番号８１の第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）配列番号８１の第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）配列番号８１の第２６〜１０９位のアミノ酸残基のうちのおよそ７４〜８４個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなるＦ２ポリペプチドと、（ｂ）配列番号８１の第１３７〜５１３位のアミノ酸残基のうちのおよそ３６５〜３７５個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなるＦ１ポリペプチドとを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上のジチロシン架橋により融合前のコンフォメーションで安定化されている。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は成熟ＲＳＶＦ三量体である。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、３つ以上のジチロシン架橋により融合前のコンフォメーションで安定化されている、成熟ＲＳＶＦ三量体である。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、第４２８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第１８５位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間に、ジチロシン架橋を含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、第１９８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第２２６位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間に、ジチロシン架橋を含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）第１９８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第２２６位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間のジチロシン架橋と、（ｂ）第４２８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第１８５位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間のジチロシン架橋の、両者を含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は３つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、ジチロシン架橋の各々は、第４２８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第１８５位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間にある。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は３つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、ジチロシン架橋の各々は、第１９８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第２２６位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間にある。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は６つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、ジチロシン架橋のうち、３つは、１９８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第２２６位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間にあり、３つは、第４２８位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンと、第１８５位のアミノ酸位置（または、たとえば、配列番号１とアライメントして決定した場合に、および／もしくは、配列番号１のアミノ酸番号付けを用いて決定した場合に、これに相当するアミノ酸位置）におけるチロシンの間にある。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上の人工的に導入された非ＤＴ架橋をさらに含む。一部のかかる態様において、かかる非ＤＴ架橋はジスルフィド結合である。一部のかかる態様において、かかるＲＳＶＦ分子は、システインへの１つ以上の点変異を含む。一部のかかる態様において、ジスルフィド結合のうちの１つ以上は２つのシステインの間に形成され、これらのうちの一方または両方は、点変異によって導入されたものである。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第１５５位のアミノ酸残基におけるシステインへの点変異（すなわち、１５５Ｃ変異）を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第２９０位のアミノ酸残基におけるシステインへの点変異（すなわち、２９０Ｃ変異）を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第１５５位のアミノ酸残基におけるシステインへの点変異（すなわち、１５５Ｃ変異）と、第２９０位のアミノ酸残基におけるシステインへの点変異（すなわち、２９０Ｃ変異）の両者を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号、またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598のいずれかに開示されているシステインへの点変異のうちの１つ以上を含み、これらの文献の各々は、その全体がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上の人工的に導入された空洞充填変異（たとえば、置換）をさらに含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第１９０位のアミノ酸残基におけるＦへの変異（１９０Ｆ変異）を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第２０７位のアミノ酸残基におけるＬへの点変異（２０７Ｌ変異）を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、第１９０位のアミノ酸残基におけるＦへの変異（１９０Ｆ変異）と、第２０７位のアミノ酸残基におけるＬへの点変異（２０７Ｌ変異）の両者を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、５８Ｗ、８３Ｗ、８７Ｆ、９０Ｌ、１５３Ｗ、１９０Ｆ、２０３Ｗ、２０７Ｌ、２２０Ｌ、２６０Ｗ、２９６Ｆ、および２９８Ｌからなる群から選択される１つ以上の空洞充填アミノ酸置換を含む。一部のかかる態様において、ＲＳＶＦ分子は、米国特許第９７３８６８９号、米国特許第９９５００５８号またはMcLellanら(2013) Science 342: 592-598のいずれかに開示されている空洞充填アミノ酸置換のうちの１つ以上を含み、これらの文献の各々は、その全体がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子はオリゴマー形成ドメイン、たとえば、三量体形成ドメインを含む。一態様において、三量体形成ドメインは、Ｔ４フォールドン（foldon）ドメイン、ＧＣＮ４ドメイン、またはＴ４フィブリニチンドメインである。使用可能な他の三量体形成ドメインの例としては、Habazettlら、2009（Habazettl et al., 2009. NMR Structure of a Monomeric Intermediate on the Evolutionarily Optimized Assembly Pathway of a Small Trimerization Domain. J.Mol.Biol. pp. null）；Kammererら、2005（Kammerer et al., 2005. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci USA 102 (39): 13891-13896）；Innamoratiら、2006（Innamorati et al., 2006. An intracellular role for the C1q-globular domain. Cell signal 18(6): 761-770）；Schellingら、2007（Schelling et al., 2007. The reovirus σ-1 aspartic acid sandwich: A trimerization motif poised for conformational change. Biol Chem 282(15): 11582-11589）；Panceraら、2005（Soluble Mimetics of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Viral Spikes Produced by Replacement of the Native Trimerization Domain with a Heterologous Trimerization Motif: Characterization and Ligand Binding A
nalysis. J Virol 79 (15): 9954-9969）；Gutheら、2004（Very fast folding and association of a trimerization domain from bacteriophage T4 fibritin. J.Mol.Biol. v337 pp. 905-15）；およびPapanikolopoulouら、2008（Creation of hybrid nanorods from sequences of natural trimeric fibrous proteins using the fibritin trimerization motif. Methods Mol Biol 474: 15-33）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、配列番号９３のフォールドン（foldon）ドメインを含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、ＲＳＶＦ分子の検出および／または精製に有用な１つ以上のタグ（たとえば、Ｃ末端タグ）をさらに含む。例示的なタグとしては、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、プロテインＡタグ、およびプロテインＧタグ等が挙げられるが、これらに限定されない。一部のかかる態様において、かかるＲＳＶＦ分子は、配列番号９５のＨｉｓタグを含む。一部のかかる態様において、かかるＲＳＶＦ分子は、配列番号９６のＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。一部のかかる態様において、かかるタグは切断可能なタグであり、すなわち、所望であればこれを変異ＲＳＶＦ分子から切断／除去することができる。一部のかかる態様において、かかるタグは、プロテアーゼを使用してタグを除去できる、タンパク質分解切断部位に隣接して（たとえば、Ｃ末端に）位置している。一部のかかる態様において、かかるＲＳＶＦ分子は、配列番号９４のトロンビン切断部位を含む。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上のペプチド「リンカー」配列をさらに含む。適切なリンカー配列としては、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳ、およびＳＡＩＧ（配列番号９２の第１〜４位のアミノ酸）リンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。かかるリンカーは、Ｆ２のＣ末端とＦ１のＮ末端の間、Ｆ１のＣ末端と任意の人工三量体形成ドメインのＮ末端の間、および／または他の任意の人工的に導入された配列同士、たとえば、三量体形成ドメイン、タンパク質分解切断ドメイン、ならびに検出および／または精製に有用なタグ同士の間に設けられてもよい。

一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上のリーダー配列、前駆体ポリペプチド配列、分泌シグナル、および／または局在化シグナルを含む。

変異ＲＳＶＦ分子の特定の例示的なアミノ酸配列（たとえば、配列番号２１〜８１のアミノ酸配列）または「バックグラウンド」ＲＳＶＦ分子の特定の例示的なアミノ酸配列（たとえば、配列番号１〜２０または８２〜９１のアミノ酸配列）に関する、またはかかる配列の特定の領域（たとえば、これらのＦ１および／またはＦ２領域）に関する本発明の上記態様において、かかるアミノ酸配列と等価なバリアント形態もまた使用することができる。たとえば、一部の態様において、本明細書に記載されるＲＳＶＦアミノ酸配列のいずれかに対して、そのＦ１およびＦ２領域にわたって（具体的には、第２６〜１０９位（Ｆ２）および第１３７〜５１３位（膜貫通および細胞質ドメインを除いたＦ１の一部）のアミノ酸残基にわたって）少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を使用することができる。一部の態様において、かかるアミノ酸配列に対して、そのＦ１およびＦ２領域にわたって少なくとも約８０％または少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を使用することができる。かかるバリアント形態は、本明細書に示される特定のアミノ酸配列のうちの１つ以上と比較した場合に、付加、欠失、または置換されたアミノ酸を有してもよい。よって、それらは、明記された配列より長くても短くてもよい。

同様に、本明細書に示される例示的なＲＳＶＦアミノ酸配列の各々の第５１４位以降のアミノ酸残基は、欠失されていても変化していてもよい。たとえば、本明細書に示されるアミノ酸配列のいくつかにおいて、第５１４位以降のアミノ酸残基は、天然のＲＳＶＦ膜貫通および細胞質ドメインを含む。一部の態様において、これらの天然のＲＳＶＦ膜貫通および細胞質ドメインを除去してＲＳＶＦ分子の可溶型（すなわち、非膜結合型）を生成することも、異なる膜貫通および／または細胞質ドメインと置きかえることもできる。同様に、本明細書に示されるアミノ酸配列のいくつかにおいて、第５１４位以降のアミノ酸残基は、様々な人工的に付加されたＣ末端配列、たとえば、フォールドン（foldon）ドメイン（配列番号９３）、トロンビン切断部位（配列番号９４）、ヒスチジンタグ（配列番号９５）、ＳｔｒｅｐＩＩタグ（配列番号９６）、および各種リンカーを含む、配列番号９２に提示される人工Ｃ末端配列の組合せを含む。一部の態様において、かかる人工Ｃ末端配列は、必要に応じて、欠失、改変、再配置、または置換することができる。たとえば、一部の態様において、異なる三量体形成ドメインを使用してもよく、および／または異なる切断部位を使用してもよく、および／または異なるエピトープタグを使用してもよい。

一部の態様において、本明細書に記載される特定の変異ＲＳＶＦ分子の中の１つ以上のアミノ酸残基を、別のアミノ酸で置換することができる。一部の態様において、１つ以上のアミノ酸残基を、類似の極性を有し機能的な等価物として作用し得る別のアミノ酸で置換して、サイレント変化をもたらしてもよい。一部の態様において、配列内のアミノ酸に対する置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択して、たとえば、保存的置換を生じさせてもよい。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性的に中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。一般に、かかる置換は保存的置換であると理解されている。

一部の態様において、人工、合成、または非古典的なアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を使用して、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を作製することができる。非古典的なアミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ異性体、フルオロアミノ酸、および「デザイナー」アミノ酸、たとえば、β-メチルアミノ酸、Ｃγ-メチルアミノ酸、Ｎγ-メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらに限定されない。非古典的なアミノ酸のさらなる非限定的な例としては、α-アミノカプリル酸、Ａｃｐａ；(S)-2-アミノエチル-L-システイン／ＨＣｌ、Ａｅｃｙｓ；アミノフェニルアセテート、Ａｆａ；6-アミノヘキサン酸、Ａｈｘ；γ-アミノイソ酪酸およびα-アミノイソビチル酸、Ａｉｂａ；アロイソロイシン、Ａｉｌｅ；L-アリルグリシン、Ａｌｇ；2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、およびα-アミノ酪酸、Ａｂａ；p-アミノフェニルアラニン、Ａｐｈｅ；b-アラニン、Ｂａｌ；p-ブロモフェニルアライン、Ｂｒｐｈｅ；シクロヘキシルアラニン、Ｃｈａ；シトルリン、Ｃｉｔ；β-クロロアラニン、Ｃｌａｌａ；シクロロイシン、Ｃｌｅ；p-コロルフェニルアラニン、Ｃｌｐｈｅ；システイン酸、Ｃｙａ；2,4-ジアミノ酪酸、Ｄａｂ；3-アミノプロピオン酸および2,3-ジアミノプロピオン酸、Ｄａｐ；3,4-デヒドロプロリン、Ｄｈｐ；3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニン、Ｄｈｐｈｅ；p-フルロフェニルアラニン、Ｆｐｈｅ；D-グルコサミン酸、Ｇａａ；ホモアルギニン、Ｈａｇ；δ-ヒドロキシリシン／ＨＣｌ、Ｈｌｙｓ；DL-β-ヒドロキシノルバリン、Ｈｎｖｌ；ホモグルタミン、Ｈｏｇ；ホモフェニルアラニン、Ｈｏｐｈ；ホモセリン、Ｈｏｓ；ヒドロキシプロリン、Ｈｐｒ；p-ヨードフェニルアラニン、Ｉｐｈｅ；イソセリン、Ｉｓｅ；α-メチルロイシン、Ｍｌｅ；DL-メチオニン-S-メチルスルホニウムクロリド、Ｍｓｍｅｔ；3-(1-ナフチル)アラニン、１Ｎａｌａ；3-(2-ナフチル)アラニン、２Ｎａｌａ；ノルロイシン、Ｎｌｅ；N-メチルアラニン、Ｎｍａｌａ；ノルバリン、Ｎｖａ；O-ベンジルセリン、Ｏｂｓｅｒ；O-ベンジルチロシン、Ｏｂｔｙｒ；O-エチルチロシン、Ｏｅｔｙｒ；O-メチルセリン、Ｏｍｓｅｒ；O-メチルトレオニン、Ｏｍｔｈｒ；O-メチルチロシン、Ｏｍｔｙｒ；オルニチン、Ｏｒｎ；フェニルグリシン；ペニシラミン、Ｐｅｎ；ピログルタミン酸、Ｐｇａ；ピペコリン酸、Ｐｉｐ；サルコシン、Ｓａｒ；t-ブチルグリシン；t-ブチルアラニン；3,3,3-トリフルロアラニン、Ｔｆａ；6-ヒドロキシドーパ、Ｔｈｐｈｅ；L-ビニルグリシン、Ｖｉｇ；(-)-(2R)-2-アミノ-3-(2-アミノエチルスルホニル)プロパン酸ジヒドロキソクロリド、Ａａｓｐａ；(2S)-2-アミノ-9-ヒドロキシ-4,7-ジオキサノナン酸、Ａｈｄｎａ；(2S)-2-アミノ-6-ヒドロキシ-4-オキサヘキサン酸、Ａｈｏｈａ；(-)-(2R)-2-アミノ-3-(2-ヒドロキシエチルスルホニル)プロパン酸、Ａｈｓｏｐａ；(-)-(2R)-2-アミノ-3-(2-ヒドロキシエチルスルファニル)プロパン酸、Ａｈｓｐａ；(2S)-2-アミノ-12-ヒドロキシ-4,7,10-トリオキサドデカン酸、Ａｈｔｄａ；(2S)-2,9-ジアミノ-4,7-ジオキサノナン酸、Ｄａｄｎａ；(2S)-2,12-ジアミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸、Ｄａｔｄａ；(S)-5,5-ジフルオロノルロイシン、Ｄｆｎｌ；(S)-4,4-ジフルオロノルバリン、Ｄｆｎｖ；(3R)-1-1-ジオキソ-[1,4]チアジアン-3-カルボン酸、Ｄｔｃａ；(S)-4,4,5,5,6,6,6-ヘプタフルオロノルロイシン、Ｈｆｎｌ；(S)-5,5,6,6,6-ペンタフルオロノルロイシン、Ｐｆｎｌ；(S)-4,4,5,5,5-ペンタフルオロノルバリン、Ｐｆｎｖ；ならびに(3R)-1,4-チアジナン-3-カルボン酸、Ｔｃａが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）であってもＬ（左旋性）であってもよい。古典的および非古典的アミノ酸の総説については、Sandbergら、1998（Sandberg et al., 1998. New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides. A multivariate characterization of 87 amino acids. J Med Chem 41(14): pp. 2481-91）を参照されたい。

変異ＲＳＶＦ分子の特性
本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、本明細書に示される例示的なアミノ酸配列（たとえば、配列番号２１〜８１）のうちの１つのアミノ酸配列を含む変異ＲＳＶＦ分子、かかる例示的なアミノ酸配列のうちの１つの第２６〜１０９位および／または第１３７〜５１３位の残基を含む変異ＲＳＶＦ分子、かかる例示的なアミノ酸配列のうちの１つのＦ１および／またはＦ２ポリペプチド、ならびにかかる特定のアミノ酸配列のバリアント形態を含むが、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、（ａ）Ｆ１ポリペプチドおよびＦ２ポリペプチドを含み、かつ、（ｂ）（本明細書に記載／定義される）融合前のコンフォメーションをとることが可能な成熟ＲＳＶＦ三量体を形成することが可能であるか、または、（たとえば、Ｆ０のような前駆体が）処理されてそのような三量体を形成することが可能でなければならない。本発明の変異ＲＳＶＦ分子はまた、一部の態様において、以下の特性のうちの１つ以上を有してもよい：（１）ｐｒｅ−Ｆ特異的抗体に結合する、（２）部位「ｏ」に結合する抗体に結合する、（３）中和抗体に結合する、（４）広域中和抗体に結合する、（５）Ｄ２５、ＡＭ２２、５Ｃ４、１０１Ｆからなる群から選択される抗体に結合する、（６）パリビズマブ（シナジス（登録商標））に結合する、（７）Ｂ細胞受容体に結合する、および／もしくは、これを活性化する、（８）動物中で抗ＲＳＶ抗体応答を誘発する、（９）動物中で防御的抗ＲＳＶ抗体応答を誘発する、（１０）動物中で抗ＲＳＶ中和抗体の産生を誘発する、（１１）動物中で抗ＲＳＶ広域中和抗体の産生を誘発する、（１２）動物中で四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗ＲＳＶ抗体の産生を誘発する、ならびに／または、（１３）動物中で抗ＲＳＶ防御的免疫応答を誘発する。

ＤＴ架橋
一部の態様において、本発明は、少なくとも１つの人工的に導入されたＤＴ架橋を含む変異ＲＳＶ
Ｆ分子を提供する。かかるＤＴ架橋は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子をその融合前のコンフォメーションで安定化させる働きをする。

一部の態様において、かかるＤＴ架橋は、２つの内在的なチロシン残基の間、２つの人工的に導入されたチロシン残基の間（すなわち、「チロシンへの」変異に起源を持つ）、または人工的に導入されたチロシン残基と内在的なチロシン残基の間に導入されてもよい。

一部の態様において、少なくとも１つのＤＴ架橋の少なくとも１つのチロシンは、チロシンへの点変異に由来する（すなわち、チロシンへの点変異によって導入された）。一部の態様において、本発明は、少なくとも３つのＤＴ架橋を含む変異三量体型ＲＳＶＦ分子を提供し、ここで、少なくとも３つのＤＴ架橋の各々の少なくとも１つのチロシンは、チロシンへの点変異に由来する（すなわち、チロシンへの点変異によって導入された）。

たとえば、一部の態様において、本発明は、第１９８位の残基におけるチロシン（典型的に、天然に存在するチロシン）と第２２６位の残基における導入されたチロシン（すなわち、２２６Ｙ変異の結果生じたもの）の間にＤＴ架橋を含む、すなわち、分子内１９８Ｙ−２２６ＹＤＴ架橋を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。よって、変異ＲＳＶＦ分子が三量体である態様において、三量体は３つの分子内１９８Ｙ−２２６ＹＤＴ架橋を含む。

一部の態様において、本発明は、第１８５位の残基における導入されたチロシン（すなわち、１８５Ｙ変異の結果生じたもの）と第４２８位の残基における導入されたチロシン（すなわち、４２８Ｙ変異の結果生じたもの）の間にＤＴ架橋を含む、すなわち、１８５Ｙ−４２８Ｙ分子間ＤＴ架橋を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。よって、変異ＲＳＶＦ分子が三量体である態様において、三量体は３つの分子間１８５Ｙ−４２８ＹＤＴ架橋を含む。

そして一部の態様において、本発明は、１９８Ｙ−２２６Ｙ分子内ＤＴ架橋と１８５Ｙ−４２８Ｙ分子間ＤＴ架橋の両者を含む変異ＲＳＶＦ分子を提供する。よって、変異ＲＳＶＦ分子が三量体である態様において、三量体は６つのＤＴ架橋、すなわち、３つの分子内１９８Ｙ−２２６ＹＤＴ架橋と３つの分子間１８５Ｙ−４２８ＹＤＴ架橋とを含む。

上述したように、成熟ＲＳＶＦ三量体の各プロトマーは、Ｆ１およびＦ２と名付けられた２つの別個のポリペプチドを含み、これらが非共有結合的に会合してプロトマーを形成している。同一プロトマー内でのＦ１ポリペプチドとＦ２ポリペプチドの間の結合は、分子間結合およびプロトマー内結合の例である。１８５Ｙ−４２８ＹＤＴ架橋は、三量体の２つのプロトマーを一緒に保持するように設計され、すなわち、分子間プロトマー間結合である。一方のプロトマー上の第１８５位におけるチロシンは、もう一方のプロトマー上の第４２８位におけるチロシンとジチロシン結合を形成する。

ＤＴ架橋反応を行う例示的な方法は、本明細書の実施例に示される。さらに、ＤＴ架橋を行う方法は当該技術分野において知られており、たとえば、Marshallらの米国特許第７０３７８９４号および第７４４５９１２号に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。ジチロシン架橋により、最小限の変化であり、長さがゼロである炭素−炭素共有結合が導入される。ＤＴ架橋は生理的条件下では加水分解されない。ジチロシン架橋はインビボで自然に形成され、一般的な食物中に多量に存在するため、安全であることが知られている。たとえば、ＤＴ結合はコムギグルテンの構造を形成している。ジチロシン結合はインビトロでは自発的に形成されない。むしろ、チロシル側鎖を有するタンパク質をＤＴ結合の形成をもたらす反応条件下に供する、酵素的架橋反応を行わなければならない。ＤＴ結合形成反応は酸化的架橋反応であるため、かかる条件は酸化的反応条件であるか、またはそうなる。一部の態様において、ＤＴ架橋反応条件により、他の点で改変されていない、または検出可能には改変されていないタンパク質が得られる。かかる条件は、Ｈ_２Ｏ_２の形成を触媒する酵素、たとえば、ペルオキシダーゼを使用することによって達成してもよい。ＤＴ結合形成を、３２０ｎｍ付近の励起波長を用いた分光光度法と４００ｎｍ付近の波長で測定される蛍光とによってモニタリングしてもよく（たとえば、図３４を参照）、チロシル蛍光の消失を標準的な手順でモニタリングしてもよい。チロシル蛍光の消失がもはやＤＴ結合形成と化学量論的に合致しないとき、当業者に公知の任意の方法、たとえば、還元剤の添加とその後の試料の冷却（氷上）または凍結によって、反応を停止させてもよい。適切なＤＴ架橋法のさらなる詳細は、米国特許第７０３７８９４号および第７４４５９１２号に、また、本明細書の実施例に記載されている。

核酸分子
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子、およびかかる核酸分子を含むベクターを提供する。当業者間で普遍的に知られており、また、理解されている遺伝コードの性質を前提にすれば、当業者は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子のいずれか１つをコードする核酸分子の核酸配列を容易に決定することができる。

一部の態様において、核酸分子は、適当な細胞中で発現させたときに適正に処理されて変異ＲＳＶＦ分子を生成する、前駆体Ｆ０ポリペプチドをコードする。たとえば、一部の態様において、核酸分子は、表１および配列表に提示されたアミノ酸配列の前駆体（Ｆ０）ポリペプチドのうちの１つをコードしていてもよい。一部の態様において、核酸分子は、Ｆ２ポリペプチドのみ、またはＦ１ポリペプチドのみをコードしていてもよい。

本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子は、当該技術分野で知られた適切な方法により取得または作製することができる。たとえば、変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子を、クローニングされたＤＮＡから取得しても、化学合成によって作製してもよい。一部の態様において、核酸分子は、当業者に知られた方法で調製された逆転写ＲＮＡによって取得してもよい。点変異、または本明細書に記載されるその他の改変（たとえば、Ｃ末端配列の除去、Ｃ末端配列の置換など）を、当業者に周知であり理解されている標準的な組換えＤＮＡ手法によって作製することができる。たとえば、当業者は、チロシンに変異させる特定のアミノ酸残基をコードする（たとえば、第１８５位、第２２６位、または第４２８位のアミノ酸残基をコードする）ヌクレオチドコドンを探し出し、必要に応じてそのコドンのヌクレオチドを変異させてチロシンをコードするコドンを生成することにより、本明細書に記載される「チロシンへの」変異を容易に作り出すことができる。

供給源が何であれ、本発明の変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子を、任意の適切なベクター、たとえば、核酸分子の増殖に使用されるベクターまたは核酸分子の発現に使用されるベクター中にクローニングすることができる。発現が必要な態様において、核酸を、所望の細胞型、たとえば、哺乳動物細胞または昆虫細胞中で発現させるのに適したプロモーターに操作可能に連結することができ、任意の適切な発現ベクター、たとえば、哺乳動物または昆虫発現ベクター中に組み込んでもよい。

一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子は、特定の生物または種の細胞中での発現に向けてコドン最適化することができる。たとえば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４８０８６は、ヒト、ハムスター、マウス、および昆虫細胞中での発現に向けてコドン最適化された、ＲＳＶＦ分子の塩基配列を提示している。ＲＳＶＦタンパク質をコードするかかるコドン最適化された塩基配列を、本明細書に記載される特定の変異のいずれかを導入するための「バックグラウンド」配列として使用することができる。

製造方法
本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、当該技術分野において知られた適切な手段によって作製することができる。一般に、変異ＲＳＶＦ分子は、組換えタンパク質の製造に用いられる標準的な方法を使用して作製される。たとえば、本発明の変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子を、哺乳動物細胞および昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意の適切な細胞型中で（たとえば、ＳＦ９またはＨｉ５細胞、たとえば、バキュロウイルス発現系を使用して）発現させることができる。核酸分子からタンパク質を発現させるための方法は当該技術分野で常用され、周知であり、当該技術分野において知られた適切な方法、ベクター、系、および細胞型を使用することができる。たとえば、典型的に、本発明の変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子を、適切なプロモーターを含む適切な発現構築物中に挿入し、次いでこれを発現用の細胞に送ることになる。

一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで安定化された成熟ＲＳＶＦ三量体である。かかる態様において、変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸分子は、典型的に、細胞中において可溶型形態で発現され、次いで、通常の三量体型ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションへと会合させた後、これらの分子を酵素的ＤＴ架橋反応に供する。一部の態様において、酵素的架橋反応の前および／または最中に、たとえば、架橋を行いながら、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにある（および／またはそれに維持された）変異ＲＳＶＦ分子を取得してもよい。一部の態様において、ほとんどまたは実質的にすべての変異ＲＳＶＦ分子がｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで存在するように、変異ＲＳＶＦ分子を製造および／または単離してもよい。一部の態様において、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにある一部と他のコンフォメーションにある一部とを含むＲＳＶＦタンパク質分子の混合集団から、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにある変異ＲＳＶＦ分子を分離してもよい。一部の態様において、ＲＳＶＦタンパク質は細胞内で発現され（たとえば、その膜結合型または可溶型形態として）、自発的にその通常のｐｒｅ−Ｆコンフォメーションへと会合する。一部の態様において、ＤＴ架橋の前に変異ＲＳＶＦ分子をそのｐｒｅ−Ｆ形態に維持するために、さらなる安定化は必要でない。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子を、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションの形成および／または維持に適した特定の条件下、または特定の組成中に留めてもよい。たとえば、一部の態様において、細胞との接触がｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションへの変化を引き起こす可能性があるため、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションの変異ＲＳＶＦ分子は、細胞の不在下で維持される。イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィー法のような標準的なタンパク質精製法が含まれるがこれらに限定されない、当該技術分野において知られた適切な方法により、変異ＲＳＶＦ分子をｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで取得、および／または単離、および／または維持してもよい。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子は、ＲＳＶＦタンパク質に結合し、ＲＳＶＦタンパク質をそのｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで安定化する分子の存在下で発現されてもよく、該分子と共発現されてもよく、該分子と接触させてもよく、該分子としては、抗体、小分子、ペプチド、および／またはペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。融合前ＲＳＶＦタンパク質に結合する抗体の非限定的な例としては、５Ｃ４、ＡＭ２２、およびＤ２５抗体が挙げられる（McLellanら(2013) Science 342: 592-598を参照。同文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子を、タンパク質が存在する媒体／緩衝液のイオン強度を制御することによって（たとえば、高または低イオン強度の媒体を使用することによって）、そのｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで、取得、単離、または維持してもよい。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子を、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションの保存に好適な１つ以上の温度で、取得、単離、または維持してもよい。一部の態様において、変異ＲＳＶＦ分子を、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションが失われる程度が少ない期間にわたって、取得、単離、または維持してもよい。

一部の態様において、分析を行って、変異ＲＳＶＦ分子において望ましいコンフォメーション、たとえば、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションが形成および／または維持されていることを確認してもよい。かかる分析は、架橋の前、架橋処理の最中、架橋処理の後、またはこれらの段階の任意の組合せにおいて行ってもよい。かかる分析は、機能解析および結晶学的解析などを含む、タンパク質またはタンパク質複合体の三次元構造を調べるための、当該技術分野において知られた適切な方法を含んでいてもよい。一部の態様において、かかる分析は、ある抗体、たとえば、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションに特異的な抗体および／または「ｏ」部位に結合することが知られた抗体に対する、変異ＲＳＶＦ分子の結合を調べることを含んでいてもよく、本明細書に記載されているように、こうした抗体としては、５Ｃ４、ＡＭ２２、およびＤ２５抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の態様において、製造過程中の１つ以上の工程の前、最中、または後で、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を精製してもよい。たとえば、一部の態様において、製造工程のすべてが完了した後で、変異ＲＳＶＦ分子を精製してもよい。一部の態様において、架橋処理を開始する前、または処理中の中間体法工程のうちの１つ以上の後、たとえば、変異ＲＳＶＦ分子を発現後、変異ＲＳＶＦ分子を成熟三量体へと会合させた後、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにある変異ＲＳＶＦ分子を取得後、またはＤＴ架橋反応の実施の最中もしくは後で、変異ＲＳＶＦ分子を精製してもよい。本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、当該技術分野において知られた適切な方法を使用して単離または精製してもよい。かかる方法としては、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー）、硫酸アンモニウム沈殿法、遠心分離、分画溶解法、またはタンパク質を精製するための、当業者に知られた他の技法が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、ＤＴ架橋成熟三量体型変異ＲＳＶＦ分子を、十分に架橋されていないもの、またはｐｒｅ−Ｆコンフォメーションが十分に安定化されていないものから分離する必要があり得る。これを、当該技術分野において知られた適切な系を使用して行うことができる。たとえば、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにある変異ＲＳＶＦ分子を、ｐｒｅ−Ｆまたはｐｏｓｔ−Ｆ特異的抗体を用いる抗体ベースの分離法を使用して、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションにないものから分離することができる。本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、それを製造するために使用される任意の供給源から精製してもよい。純度は変動してもよいが、様々な態様において、精製された本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、該分子が最終組成物中の総タンパク質の約１０％、２０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または、９９．９％を構成する形態で提供される。一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、標準的な方法によって他のタンパク質または他のいずれかの望ましくない生成物（たとえば、非架橋または非ｐｒｅ−ＦＲＳＶＦ）から単離または精製してもよく、標準的な方法としては、クロマトグラフィー、グリセロール勾配法、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー、またはタンパク質を精製するための、当該技術分野において知られた他の標準的な技法が挙げられるが、これらに限定されない。単離する変異ＲＳＶＦ分子を高または低イオン性の媒体中で発現させてもよく、高または低イオン性の緩衝液または溶液中で単離してもよい。また、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、望ましいコンフォメーションの保存に好適な１つ以上の温度で単離してもよい。また、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、調製物が望ましいコンフォメーションを失ってしまう程度が少ない期間にわたって単離してもよい。生化学的、生物物理学的、免疫学的、およびウイルス学的分析が挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において知られた適切な方法を使用して、タンパク質の調製物が１つ以上の望ましいコンフォメーション（たとえば、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション）を維持する程度について、アッセイを行ってもよい。かかるアッセイとしては、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、結晶学的解析（抗体との共結晶化を含む）、沈降法、分析用超遠心分離、動的光散乱法（ＤＬＳ）、電子顕微鏡観察（ＥＭ）、低温ＥＭ断層撮影、熱量測定、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、円二色性解析およびＸ線小角散乱法、中和アッセイ、抗体依存性細胞傷害性アッセイ、ならびに／またはインビボにおけるウイルス感染試験が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の変異ＲＳＶＦ分子の収率は、当該技術分野において知られた手段、たとえば、操作された最終的なタンパク質（たとえば、架橋ｐｒｅ−ＦＲＳＶ）の量を出発材料の量、または製造法のいずれかの先行する工程で存在する材料の量と比較することによって決定することができる。タンパク質濃度は、標準的な手順、たとえば、ブラッドフォードまたはローリータンパク質アッセイによって決定することができる。ブラドッフォードアッセイは還元剤および変性剤と適合する（Bradford, M, 1976. Anal. Biochem. 72: 248）。ローリーアッセイは界面活性剤とより良好な適合性を有し、その反応は、タンパク質濃度および読み出し値についてより線形である（Lowry, O J, 1951. Biol. Chem. 193: 265）。

特性のアッセイ
一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子またはその製造における任意の中間体を分析して、それらが望ましい特性、たとえば、上述されているか、または本特許明細書の他の箇所で認定された特性のうちの１つ以上を有していることを確認してもよい。たとえば、一部の態様において、インビトロまたはインビボのアッセイを実施して、ＲＳＶＦタンパク質の立体構造、安定性（たとえば、熱安定性）、半減期（たとえば、対象の身体内での）、溶液中での凝集、抗体（たとえば、中和抗体、広域中和抗体；ｐｒｅ−Ｆ特異的抗体；部位「ｏ」を認識する抗体、コンフォメーション特異的抗体、準安定なエピトープを認識する抗体、Ｄ２５、ＡＭ２２、５Ｃ４、１０１Ｆ、またはパリビズマブ）への結合、Ｂ細胞受容体への結合、Ｂ細胞受容体の活性化、抗原性、免疫原性、抗体応答を誘発する能力、防御的抗体／免疫応答を誘発する能力、中和抗体の産生を誘発する能力、または広域中和抗体の産生を誘発する能力を調べることができる。本発明の変異ＲＳＶＦ分子を動物においてインビボで試験する態様において、動物は任意の適切な動物種であってもよく、かかる動物種としては、哺乳動物（たとえば、齧歯類種（たとえば、マウスまたはラット）、ウサギ、フェレット、ブタ種、ウシ種、ウマ種、ヒツジ種、または霊長類種（たとえば、ヒトまたは非ヒト霊長類））、または鳥類（たとえば、ニワトリ）が挙げられるが、これらに限定されない。

タンパク質の立体構造を調べるためのアッセイは当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用することができ、かかるアッセイとしては、結晶学的解析（たとえば、Ｘ線結晶構造解析または電子結晶構造解析）、沈降分析、分析用超遠心分離、電子顕微鏡観察（ＥＭ）、低温電子顕微鏡観察（低温ＥＭ）、低温ＥＭ断層撮影、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、Ｘ線小角散乱法、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。

タンパク質の安定性を調べるためのアッセイは当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用することができ、かかるアッセイとしては、変性および非変性電気泳動、等温滴定型熱量測定、ならびに、タンパク質をインキュベートし、タンパク質濃度、温度、ｐＨ、または酸化還元条件を変えて経時的に分析する、タイムコース実験が挙げられるが、これらに限定されない。また、タンパク質をタンパク質分解に対する感受性について分析してもよい。

タンパク質の抗体への結合を調べるためのアッセイは当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用することができ、かかるアッセイとしては、免疫沈降アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、結晶学的アッセイ（抗体との共結晶化を含む）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。

中和活性を調べるためのアッセイは当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用することができる。たとえば、アッセイを実施して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体を用いた動物のワクチン接種／免疫化によって生成される抗体または抗血清の中和活性を決定することができる。当該技術分野において公知の中和アッセイとしては、Deyら、2007（Dey et al., 2007, Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Monomeric and Trimeric gp120 Glycoproteins Stabilized in the CD4-Bound State: Antigenicity, Biophysics, and Immunogenicity. J Virol 81(11): 5579-5593）、および、Beddowsら、2006（Beddows et al., 2007, A comparative immunogenicity study in rabbits of disulfide-stabilized proteolytically cleaved, soluble trimeric human immunodeficiency virus type 1 gp140, trimeric cleavage-defective gp140 and momomeric gp120. Virol 360: 329-340）によって記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

ワクチン用免疫原が免疫応答を誘発することができるかどうかを調べ、および／または防御的な免疫を立証するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用することができる。たとえば、アッセイを実施して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体を用いた動物のワクチン接種／免疫化が、ＲＳＶによる８に対して免疫応答および／または防御的免疫をもたらすかどうかを決定することができる。一部の態様において、プラセボとワクチン接種した被験群の間で、感染もしくはセロコンバージョン率、またはウイルス量について比較を行ってもよい。

タンパク質の薬物動態および体内分布を調べるためのアッセイもまた当該技術分野において周知であり、任意の適切なアッセイを使用して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体の上記特性を調べることができる。

組成物
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子のうちの１つ以上を含む組成物を提供する。一部の態様において、かかる組成物は医薬組成物であってもよく、すなわち、生きた対象への投与に適する成分を含んでいてもよい。

一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上のさらなる活性成分、たとえば、１つ以上のさらなるワクチン用免疫原または治療剤を含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、１つ以上の他の成分を含む組成物、たとえば、医薬組成物で提供されてもよく、かかる他の成分としては、薬学的に許容される担体、アジュバント、免疫賦活剤、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、および／または組成物の意図される使用に適する他の任意の成分が挙げられるが、これらに限定されない。かかる組成物は、液剤、懸濁剤、および乳剤などの形態をとることができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、その中で、またはそれを用いて本発明の変異ＲＳＶＦ分子を提供することができる、様々な希釈剤、賦形剤、および／またはビヒクルを含み、該用語は、ヒトおよび／もしくは他の動物への送達にとって安全であることが知られており、ならびに／または連邦もしくは州政府の規制当局によって認可されており、ならびに／または米国薬局方および／もしくは他の一般に認知されている薬局方に記載されており、ならびに／または１つ以上の一般に認知されている規制当局からヒトおよび／もしくは他の動物において使用するための明示的もしくは個別の認可を受けている担体を含むが、これに限定されない。かかる薬学的に許容される担体としては、水、水溶液（たとえば、生理食塩水溶液および緩衝液など）、および有機溶媒（たとえば、ある種のアルコールおよび油であって、油としては、石油、動物、植物、または合成起源のもの、たとえば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油が挙げられる）などが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様において、本発明の組成物はまた、１つ以上のアジュバントを含む。例示的なアジュバントとしては、アラムアジュバント、無機または有機アジュバント、油性アジュバント、ビロソーム、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原用の分子ケージ（たとえば、免疫刺激複合体（「ＩＳＣＯＭ」）、流入領域リンパ節に輸送される安定なかご状構造を形成する、Ａｇ改質サポニン／コレステロールミセル、細菌細胞壁のコンポーネント、エンドサイトーシスを受けた核酸（たとえば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、および脱メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ）、ＡＵＭ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびスクアレンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様において、ビロソームをアジュバントとして使用する。本発明に従って使用することのできるさらなる市販のアジュバントとしては、Ribi Adjuvant System（ＲＡＳ、２％スクアレン中に脱毒化エンドトキシン（ＭＰＬ）と、マイコバクテリウムの細胞壁コンポーネントとを含む、水中油型エマルション（Sigma M6536））、TiterMax（安定な、代謝可能な油中水型アジュバント（CytRx Corporation 150 Technology Parkway Technology Park/Atlanta Norcross, Georgia 30092））、Syntex Adjuvant Formulation（ＳＡＦ、Tween（登録商標）80およびプルロニック（登録商標）ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーＬ１２１で安定化された、水中油型エマルション（Chiron Corporation, Emeryville, CA））、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＡＬＵＭ−水酸化アルミニウム、Ａｌ（ＯＨ）_３、（Alhydrogel（登録商標）として入手可能、Accurate Chemical & Scientific Co, Westbury, NY）、SuperCarrier（Syntex Research 3401 Hillview Ave. P.O. Box 10850 Palo Alto, CA 94303）、Elvax 40W1,2（エチレン−酢酸ビニルコポリマー（(DuPont Chemical Co. Wilmington, DE））、抗原と共沈させたL-チロシン（多数の化学会社から入手可能）；Montanide（オレイン酸マニド、ISA Seppic Fairfield, NJ））、AdjuPrime（炭水化物ポリマー）、ニトロセルロースに吸収させたタンパク質、およびGerbuアジュバント（C-C Biotech, Poway, CA）などが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、糖を含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、スクロースを含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、約５％のスクロースを含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、約１０％のスクロースを含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、約１５％のスクロースを含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、約２０％のスクロースを含む組成物で提供されてもよい。一部の態様において、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、約２５％のスクロースを含む組成物で提供されてもよい。重要なことに、スクロースを含有させることにより、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体の組成物中で、凝集体の形成が減少することが見出されている。

一部の態様において、本発明は、「有効量」の本発明の変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物を提供する。同様に、一部の態様において、本発明は、「有効量」の変異ＲＳＶＦ分子または変異ＲＳＶＦを含む組成物を対象に投与することを伴う方法を提供する。「有効量」とは、望ましい最終結果を達成するのに要求される量である。望ましい最終結果の例としては、ＲＳＶに対する体液性免疫応答の発生、ＲＳＶに対する中和抗体応答の発生、ＲＳＶに対する広域中和抗体応答の発生、ＲＳＶに対する防御的免疫の発生、阻害またはＲＳＶウイルス複製、およびＲＳＶ感染症の１つ以上の症状の改善が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の変異ＲＳＶＦ分子またはかかる分子を含む組成物の、望ましい最終結果を達成するのに有効な量は、様々な要素に依存し得るが、かかる要素として、ＲＳＶウイルスのタイプ、サブタイプ、および株、対象の種（たとえば、ヒトか他の何らかの動物種であるか）、対象の年齢、対象の性、対象の重量、企図される投与経路、企図される投与レジメン、およびいずれかの進行中のＲＳＶ感染症の重症度（たとえば、治療的使用の場合）などが挙げられるが、これらに限定されない。有効量はある範囲の有効量であってもよく、過度な実験法を何ら用いることのない標準的な技法で、たとえば、意図する対象種または任意の適切な動物モデル種でインビトロアッセイおよび／またはインビボアッセイを使用して決定することができる。適切なアッセイとしては、インビトロおよび／またはインビボモデル系に由来する用量応答曲線および／または他のデータからの外挿を伴うものが挙げられるが、これに限定されない。一部の態様において、具体的な状況に基づき、医師または獣医師の判断に従って有効量を決定してもよい。

変異ＲＳＶＦ分子の使用
一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、研究ツールとして、診断用ツールとして、治療剤として、抗体試薬または治療用抗体の製造のための標的として、および／またはワクチンもしくはワクチン組成物の成分として有用であり得る。たとえば、一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、動物対象、たとえば、ヒトを含む哺乳動物対象におけるワクチン用免疫原として有用である。本発明の変異ＲＳＶＦ分子のこれらおよび他の使用について、以下でより十分に説明する。本発明の変異ＲＳＶＦ分子が他の様々な用途にも有用であり得ること、そしてそのような用途および使用のすべてが本発明の範囲にあることが意図されていることを、当業者は理解するはずである。

ＲＳＶＦ抗体を研究するためのツール
一態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ／ＳＰＲ結合アッセイ、および／または抗体結合に関する当該技術分野において知られた他のアッセイにおいて、抗ＲＳＶＦ抗体の結合および／または力価のアッセイおよび／または測定のための分析物として有用であり得る。たとえば、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、抗ＲＳＶＦ抗体の有効性を分析および／または比較するために使用することができる。

抗体の生成のためのツール
本発明の変異ＲＳＶＦ分子は、治療用抗体および／もしくは研究ツールとして、または他の任意の所望の用途に使用することができる抗体の生成にも有用であり得る。たとえば、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、研究ツールとして、および／または治療薬として使用するための、ＲＳＶＦタンパク質に対する抗体を取得するための免疫化に使用することができる。一部の態様において、抗体を生成するために、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を使用して、非ヒト動物、たとえば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類等が挙げられるがこれらに限定されない脊椎動物を免疫化することができる。その後、かかるモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい抗体および／またはかかる抗体を産生する細胞を、動物から得ることができる。たとえば、一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を使用して、マウスを免役し、モノクローナル抗体および／またはかかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製および取得してもよい。かかる方法を、ハイブリドーマ製造のための標準的な方法を含む、当該技術分野において公知のマウスモノクローナル抗体を製造するための標準的な方法を使用して行うことができる。一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子を、たとえば、現在、当該技術分野において公知のキメラ（たとえば、部分ヒト）、ヒト化、および完全ヒト抗体を製造するための方法のいずれかを用いた、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体の製造に使用してもよく、かかる方法としては、ＣＤＲ移植法、ファージディスプレイ法、トランスジェニックマウス法（たとえば、遺伝子改変されて完全ヒト抗体を産生することができるようになったマウス、たとえば、Xenomouseの使用）、および／または当該技術分野において公知の他の適切な方法が挙げられるが、これらに限定されない。かかる系を使用して作製された本発明の変異ＲＳＶＦ分子に対する抗体を、好ましくは本発明の変異ＲＳＶＦ分子それ自体を含む１つまたはいくつかの抗原の組を使用して、抗原性に関して特徴付けすることができる。かかる抗体のさらなる特徴付けを当業者に公知の標準的な方法によって行ってもよく、かかる方法としては、ＥＬＩＳＡに基づく方法、ＳＰＲに基づく方法、生化学的方法（たとえば等電点測定であるが、これに限定されない）、ならびに、たとえば、前臨床および臨床研究において抗体の体内分布、安全性、および有効性を研究するための、当該技術分野において公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

対象への投与
一部の態様において、本発明は、本発明の変異ＲＳＶＦ分子、またはかかる変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。かかる方法は、ＲＳＶを有する個体を治療するための方法（すなわち、治療法）、および／または将来的なＲＳＶ感染から個体を防護するための方法（すなわち、予防法）を含んでいてもよい。

本発明の変異ＲＳＶＦ分子、またはかかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物を投与することができる（たとえば、治療の方法またはワクチン接種の方法の過程で）対象には、任意のあらゆる動物種が含まれ、そのような動物種としては、特に、ＲＳＶ感染を受けやすいか、またはＲＳＶ感染の研究のためのモデル動物系となり得る動物種が挙げられる。一部の態様において、対象は哺乳動物種である。一部の態様において、対象は鳥類である。哺乳動物対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、およびフェレットが挙げられるが、これらに限定されない。鳥類としては、ニワトリ、たとえば、家禽農場のニワトリが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子、またはかかる変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物を投与する対象は、ＲＳＶを有するか、またはＲＳＶ感染のリスクを有するかのいずれかである。一部の態様において、対象は免疫不全である。一部の態様において、対象は心疾患または障害を有する。一部の態様において、対象は約５０歳超、または約５５歳超、または約６０歳超、または約６５歳超、または約７０歳超、または約７５歳超、または約８０歳超、または約８５歳超、または約９０歳超のヒトである。一部の態様において、対象は、生後約１ヶ月未満、または生後約２ヶ月未満、または生後約３ヶ月未満、または生後約４ヶ月未満、または生後約５ヶ月未満、または生後約６ヶ月未満、または生後約７ヶ月未満、または生後約８ヶ月未満、または生後約９ヶ月未満、または生後約１０ヶ月未満、または生後約１１ヶ月未満、または生後約１２ヶ月未満、または生後約１３ヶ月未満、または生後約１４ヶ月未満、または生後約１５ヶ月未満、または生後約１６ヶ月未満、または生後約１７ヶ月未満、または生後約１８ヶ月未満、または生後約１９ヶ月未満、または生後約２０ヶ月未満、または生後約２１ヶ月未満、または生後約２２ヶ月未満、または生後約２３ヶ月未満、または生後約２４ヶ月未満のヒトである。

様々な送達系が当該技術分野において知られており、任意の適切な送達系を使用して本発明の組成物を対象に投与することができる。かかる送達系としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口送達系が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物を任意の好都合な経路によって、たとえば、点滴もしくはボーラス投与によって、上皮もしくは粘膜（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通じた吸収によって投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。投与は全身的であっても局所的であってもよい。たとえば、吸入器またはネブライザーとエアゾール剤を含む製剤とを用いた、肺内投与を採用することもできる。

一部の態様において、本発明の医薬組成物を、変異ＲＳＶＦ分子が望ましい治療成績を生むために最も効果的であり得る組織に、局所的に投与することが望ましい可能性がある。これを、たとえば、局所的な点滴、注射、カテーテルを使用した送達、またはインプラント、たとえば、多孔質、非多孔質、もしくはゼラチン状のインプラント、または、そこからもしくはそれを通じてタンパク質もしくはタンパク質複合体を局所的に放出し得る、１つ以上の膜（たとえば、シアラスティック製の膜）もしくは繊維を含むインプラントを用いて達成してもよい。一部の態様において、徐放系を使用してもよい。一部の態様において、ポンプを使用してもよい（Langer, supra; Sefton, 1987. CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwaldら, 1980. Surgery 88: 507; Saudekら, 1989. N. Engl. J. Med. 321: 574を参照）。一部の態様において、ポリマー材料を使用して、本発明の変異ＲＳＶＦ分子の放出を促進および／または制御してもよい（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974. CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, 1984. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York; Ranger & Peppas, 1983 Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; see also Levy ら, 1985. Science 228: 190; Duringら, 1989. Ann. Neurol. 25: 351; Howardら, 1989. J. Neurosurg 71: 105も参照）。一部の態様において、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはポリペプチドを送達する組織／器官の近くに徐放系を設置することができる（たとえば、Goodson, 1984. Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2: 115 138を参照）。本発明と組み合わせて使用してもよいいくつかの適切な徐放系が、Langer, 1990, Science; vol. 249: pp. 527-1533に記載されている。

一部の態様において、本発明の組成物の投与を、１つ以上の免疫賦活剤の投与と組み合わせて実施することができる。かかる免疫賦活剤の非限定的な例としては、各種サイトカイン、免疫賦活、免疫強化、および炎症促進活性を有するリンホカインおよびケモカイン、たとえば、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（たとえば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに他の免疫賦活剤、たとえば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２が挙げられる。免疫賦活剤を変異ＲＳＶＦ分子と同じ製剤で投与することができ、別個に投与することもできる。

一部の態様において、本発明の変異ＲＳＶＦ分子またはそれを含む組成物を、様々な異なるＲＳＶワクチン接種方法またはレジメンで対象に投与することができる。一部のかかる態様において、単回用量の投与を実施する。しかしながら、他の態様において、同じまたは異なる経路によってさらなる投与量を投与して、所望の予防効果を達成することができる。たとえば、新生児および乳幼児においては、十分なレベルの免疫を誘発するためには複数回の投与が必要であり得る。必要であれば、小児期全体にわたって間隔を設けて投与を継続して、ＲＳＶ感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、ＲＳＶ感染を特に受けやすい成人、たとえば、高齢および免疫不全の個体は、防御的免疫応答を確立および／または維持するために、複数回の免疫化が必要であり得る。所望のレベルの防御を誘発および維持するために、誘起された免疫のレベルを、たとえば、分泌および血清中和抗体の量を測定することによってモニタリングすることができ、必要に応じて、投与量を調整することもワクチン接種を繰り返すこともできる。

一部の態様において、投与レジメンは、単回の投与／免疫化を含んでいてもよい。他の態様において、投与レジメンは、複数回の投与／免疫化を含んでいてもよい。たとえば、ワクチンを、一次免疫およびその後の１回以上の追加免疫として与えてもよい。本発明の一部の態様において、こうした「プライム−ブースト」ワクチン接種レジメンを使用してもよい。たとえば、一部のかかるプライム−ブーストレジメンにおいて、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物を、別々の時間に複数回（たとえば、２回、３回、またはさらに多くの回数）個体に投与してもよく、この場合、初回の投与は「初回免疫」投与であり、後続の投与は「追加免疫」投与である。他のかかるプライム−ブーストレジメンにおいて、ＲＳＶポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体をコードするウイルスまたはＤＮＡベクターを含む組成物を「初回免疫」投与として最初に個体に投与し、その後、本明細書に記載されるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体を含む組成物を１回以上「追加免疫」投与することで、本明細書に記載される変異ＲＳＶＦ分子を含む組成物を個体に投与してもよい。追加免疫は、初回免疫免疫と同じおよび／または異なる経路で送達されてもよい。追加免疫は一般に、初回免疫免疫または以前に投与された追加免疫からある一定の期間後に投与される。たとえば、追加免疫を初回免疫免疫の約２週間以上後に行うことができ、および／または２回目の追加免疫を１回目の追加免疫の約２週間以上後に行うことができる。追加免疫を、対象の生存期間の全体にわたって、たとえば、約２週間以上の期間をおいて繰り返し行ってもよい。追加免疫は、初回免疫免疫後、または以前の追加免疫後、たとえば、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１．５年、約２年、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年、約５年、またはそれよりも長く間隔をおいてもよい。

一部の態様において、本発明の医薬組成物を、適宜に単位剤形で供給してもよい。単位剤形は、単回用量もしくは単位（たとえば、有効量）、またはそれらの適当な分割量の本発明の変異ＲＳＶＦ分子を含有するものである。単位剤形を、単回用量または複数回用量用の容器中にて提供してもよい。

一部の態様において、本発明の組成物を密閉されたアンプルまたはバイアル中にて供給してもよく、使用の直前に滅菌された液体担体（たとえば、水）の添加のみが必要な、凍結乾燥状態で保存してもよい。

キット
本発明は、本発明の変異ＲＳＶＦ分子またはかかる変異ＲＳＶＦ分子を含有する組成物を含む、キットをさらに提供する。本発明の方法および組成物の使用を容易にするために、本明細書に記載される成分および／または組成物のいずれかと、実験または治療用またはワクチンの目的に有用なさらなる成分とを、キットの形態で包装することができる。典型的に、キットは、上記成分に加え、たとえば、成分、包装材料、容器、および／または送達用の器具を使用するための取扱説明書を含み得る、さらなる構成物を収容する。

表１中、配列番号１〜９１は例示的なＷＴおよび変異ＲＳＶＦアミノ酸配列であり、配列番号９２〜９６は、ＲＳＶＦ分子のＣ末端に導入することができる例示的な人工配列である。配列番号１〜９１において、下線が引かれた残基はＦ１およびＦ２ポリペプチドであり、太字の残基は導入された変異であり、斜字体の残基は、一部の態様において欠失または置換されてもよい残基であり、二重下線が引かれた残基は人工的に導入されたＣ末端配列である。

また、本発明の様々な態様を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する：

例１
選択した材料および方法
変異ＲＳＶＦタンパク質をヒト細胞中で発現させ、以下で説明するようにジチロシン結合の導入によって改変した。

標準的な方法を使用して、５’ＢａｍＨＩおよび３’ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を介して、変異ＲＳＶＦ分子をコードするｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ＋発現ベクター（Invitrogen）中にクローニングした（図１を参照）。

ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）中で増殖させた。細胞を６ウェル組織培養プレート（Corning）中に播種し、８０％のコンフルエンシーになるまで増殖させた（約２４時間）。ＤＮＡとポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、直鎖状）の１：４（Ｍ／Ｖ）を用い、細胞を１ウェル当たり２μｇの各ＲＳＶＦ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから１６時間後、培地を除去し、２ｍｌ／ウェルの血清不含Freestyle-293発現培地（Invitrogen）で置きかえた。回収および分析に先立ち、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２中でさらに４８時間〜７２時間培養した。

ＥＬＩＳＡによる細胞上清中のＲＳＶ−Ｆの検出
回収後、ＥＩＡ／ＲＩＡ高結合９６ウェルプレート（Corning）中で、室温において１時間、細胞上清から総ＲＳＶＦタンパク質を直接捕捉した。次いで、タンパク質含有ウェルおよび対照ウェルを、室温において１時間、ＰＢＳ−tween（登録商標）20（０．０５％）中の４％脱脂乳でブロッキングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（４００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。ＲＳＶＦの融合前と融合後の両者の形態を認識する高親和性ヒト抗ｈＲＳＶ抗体（ＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して、総ＲＳＶＦを１時間検出した。部位「ｏ」を認識するｐｒｅ−Ｆ特異的ヒトモノクローナル抗体（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）を使用して。融合前Ｆを検出した。ウェルを再びＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２（Jackson Immunoresearch）を用いて室温で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで６回洗浄し、発色シグナルを発する3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ用いて、総ＲＳＶ−Ｆを検出し定量した。等体積の４Ｎ硫酸を添加することで発色反応を停止させた。BioRad Benchmark Plusマイクロプレート吸光度分光光度計を用いて、最終光学濃度の読み値を４５０ｎｍで取得した。各上清の２倍の連続希釈シリーズを用いて、試料間におけるＲＳＶ−Ｆの相対量の正確な比較が可能な、各試料の検出可能なシグナルの線形範囲を決定した。

細胞上清中のジチロシン架橋
回収後すぐに、１００μｌのトランスフェクトされた細胞上清および対照細胞上清を黒色平底非結合９６ウェルＦＩＡプレート（Greiner bio-one）のウェルに移した。３００ｎｇのアルスロマイセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）ペルオキシダーゼを各試料に添加して、架橋させた。次いで、１μｌの１．２ｍＭＨ_２Ｏ_２を対照とＤＴ反応物の両者に加えて、１２０μＭＨ_２Ｏ_２の最終反応濃度とした。室温で２０分間反応を進行させ、その後、等体積のｐＨ１０のリン酸ナトリウム緩衝液を添加することで反応物をアルカリ化した。Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FLを用いて、励起波長３２０ｎｍおよび発光波長４０５ｎｍでジチロシンに特異的な蛍光を読み取った。

トランスフェクションから７２時間後、上清を架橋させるか（ＤＴ）または未架橋のままとし、ＲＳＶ−Ｆの融合前と融合後の両者の形態を認識する高親和性ヒト抗ｈＲＳＶ抗体（ＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍｌ）を用いたＥＬＩＳＡにより、総タンパク質を測定した。一部の実験では、４℃で１６日間保存した後、部位「ｏ」を認識するｐｒｅＦ特異的ヒトモノクローナル抗体（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）を用いたＥＬＩＳＡにより、部位「ｏ」の提示を測定した。

例２
４２８Ｙ、１８５Ｙ、２２６Ｙ変異ＲＳＶＦ分子の製造およびインビトロでの特徴付け
図２は、３つのチロシンへの変異、すなわち、４２８Ｙ変異、１８５Ｙ変異、および２２６Ｙ変異を含む、例示的な変異ＲＳＶＦ分子の概略図である。この例示的な変異ＲＳＶＦ分子を、「ＡＶＲ０２」という。ＡＶＲ０２のＦ０前駆体形態は、配列番号８１のアミノ酸配列を有する。成熟ＡＶＲ０２分子（配列番号８１をコードする核酸分子のトランスフェクションおよび細胞中での発現後に形成される）は、配列番号８１の第２６〜１０９位および第１３７〜５６８位のアミノ酸残基を含み、第２６〜１０９位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ２残基であり、第１３７〜５１３位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ１残基であり、第５１４〜５６８位のアミノ酸残基は異種配列であり、フォールドン（foldon）ドメイン、Ｈｉｓタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、およびトロンビン切断部位を含む。第１〜２５位のアミノ酸に由来するシグナルペプチドおよび第１００〜１３６位のアミノ酸に由来するｐｅｐ２７ペプチドは、最終的な成熟三量体型ＡＶＲ０２分子中に存在しない。

図４は、ＤＴ架橋ＡＶＲ０２（「ＤＴ−ＡＶＲ０２」という）を製造する方法の概略図である。ＰＥＩを用いた標準的な方法によって非架橋ＡＶＲ０２を一時的に293 Freestyle細胞（Invitrogen）にトランスフェクトし、５日間分泌／可溶型形態として発現させる。５日目に細胞を採取し、スイングバケットローター中で低速遠心回転によりペレット化し（１０００ｘｇ×１０分）、第２のチューブにデカントし、より高速で回転して清澄化し（３０００ｘｇ×１５分）、その後、精製の前に７０ｕＭのセルストレーナーを通過させる。Streptactin（登録商標）樹脂（IBA Lifesciences）を用いて、製造業者による取扱説明書に従ってＡＶＲ０２を精製する。ＡＶＲ０２は、１ｍＭＥＤＴＡおよび２．５ｍＭデスチオビオチンを含有するＰＢＳ系溶出バッファーを用いて溶出し、接線流濾過（Pall Corporation）を用いて濃縮し、最終遠心分離工程（４℃、＞２０，０００ｘｇ×５分）によって清澄化する。

２０〜４０ｕｇ／ｍＬのアルスロマイセス・ラモサス（arthromyces ramosus）由来のペルオキシダーゼ酵素および濃度１０〜２０ｕｇ／ｍＬのＡＶＲ０２を用いて、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸含有緩衝液中で架橋反応を行う。３９℃で３００〜６００ｕＭのＨ_２Ｏ_２を２０分間添加することによって反応を開始し、アスコルビン酸（８０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｕｇ／ｍＬ）の添加によって反応を停止させ、このときイミダゾールを２０ｍＭになるように添加する。次いで、ペルオキシダーゼを取り除くために、ＩＭＡＣクロマトグラフィーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ）を通じたＦＰＬＣを用いてＡＶＲ０２タンパク質を精製し、その後ＰＢＳを溶離液として用いたサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 pg）を行う。次いで、ＡＶＲ０２を含有する画分をプールし、５００ｕｇ／ｍＬまで濃縮し、２単位／ｍＬのビオチン化トロンビン（Millipore）を用いて４℃で終夜（２０時間）切断を行う。次いで、トロンビンを製造業者による取扱説明書に従って取り除き、ＲＴでStreptactin（登録商標）ビーズを用いたバッチ形式の３０分のインキュベーションにより、切断されていないあらゆるＡＶＲ０２タンパク質を取り除く。タンパク質の定量のための最終的なアッセイを行う前に、ビーズを取り除くために、タンパク質はスピンフィルターを通過させ、最後に４℃で回転させる。最終的なタンパク質アッセイは、Starcher, B. Analytical Biochemistry 292: 125-129 (2001)の方法に従った、ニンヒドリンによるタンパク質アッセイである。タンパク質を液体窒素中で瞬間凍結し、使用まで−８０℃で保存する。

図３は、ＡＶＲ０２中に組み込まれた２つの「設計」の各々がジチロシン結合を形成することを示すデータである。図３Ａ；架橋反応を適用した後、部位「Ｏ」に結合する融合前特異的ｍＡｂであるＤ２５を用いたＥＬＩＳＡにより、１９８Ｙと２２６Ｙの間の分子内架橋（設計１）によって導入された安定性を、４℃で２週間にわたって測定した。図３Ｂ；ウェスタンブロッティングによりＷＴと比較することで、１８５Ｙと４２８Ｙの間の分子間ＤＴ結合形成（設計２）についてアッセイを行った（モタビズマブは一次Ａｂである）。Ｆ_１タンパク質は三量体（ＴＭ）の大きさまで移動する。

図５Ａ〜Ｂは、ＤＳ−Ｃａｖ１と呼ばれるＲＳＶ変異体（McLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載され、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む）と比較したときの、部位ＩＶ／Ｖ抗体（図５Ａ）および部位「Ｏ」抗体（図５Ｂ）の結合に基づいて決定した、ＡＶＲ０２およびＤＴ架橋ＡＶＲ０２のコンフォメーションの完全性を示すデータである。

図６Ａ〜Ｂは、ＤＴ−ＡＶＲ０２の温度安定性を示すデータである。図６Ｃは、４℃での５週間の保存後、ＡＶＲ０２が０特異的ｍＡｂ（５Ｃ４）への結合を失わなかったことを示すデータである。

例３
マウスにおける４２８Ｙ、１８５Ｙ、２２６Ｙ変異ＲＳＶＦ分子のインビボ試験
ＤＳ−Ｃａｖ１と比較したＤＴ架橋ＡＶＲ０２（ＤＴ−ＡＶＲ０２）の免疫原性を試験した。ＡＶＲ０２およびＤＴ−ＡＶＲ０２分子の詳細は上述されている。ＤＳ−Ｃａｖ１変異体は、McLellanら(2013) Science 342: 592-598に記載され、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む。１０匹の６〜８週齢メス病原体非保持ｂａｌｂ／ｃマウス（Jackson Labs）からなる２つの群を、プライム（０日目）−ブースト（２１日目）レジメンにおいて、筋肉内注射で免疫化した。群１には、動物１匹１回用量当たり１０μｇのアラムアジュバントが追加されたＤＴ−ＡＶＲ０２を用い、群２には、動物１匹１回用量当たり１０μｇのアラムアジュバントが追加されたＤＳ−Ｃａｖ１を用いた。２回目の免疫化（追加免疫）から２週間後である３５日目に、血清を採取した。

熱失活血清を、glutamax、５％ＦＢＳ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたフェノール不含ＭＥＭ中で１：８００に希釈し、４倍で連続希釈した（最終体積５０ｕＬ）。次いで、ＲＳＶ−ウミシイタケルシフェラーゼウイルスを同じ培地中で上述したように希釈して２×１０^４ｐｆｕ／ｍＬとし、５０ｕＬを、ウイルスのみまたはモタビズマブ対照と共に各ウェルに添加した（１０，０００ｐｆｕ／ウェル）。ウイルスおよび血清を３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。次いで、Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ）をトリプシン処理し、計数し、同じ培地中で１×１０^６個／ｍＬに希釈し、２５ｕＬを各ウェルに添加した（２．５×１０^４個／ウェル）。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で６０〜７２時間インキュベートし、ウミシイタケ−グロールシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて、製造業者による取扱説明書に従ってルシフェラーゼ活性を定量化した。各血清希釈物のＩＣ_５０濃度を計算するため、非線形回帰を用いてデータを解析した（Graphpad Prism）。

図７はこの研究の結果を提示し、アラムを追加したＤＳ−Ｃａｖ１またはＤＴ−ＡＶＲ０２のいずれかでワクチン接種した動物から得た、ＲＳＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ中和力価を示す。

例４
コットンラットにおける４２８Ｙ、１８５Ｙ、２２６Ｙ変異ＲＳＶＦ分子のインビボ試験
この実施例および図面で使用される「ＤＴ−ｐｒｅＦ」という用語は、上記実施例において「ＤＴ−ＡＶＲ０２」と呼ばれた分子を指し、ＤＴ−ｐｒｅＦという用語はＤＴ−ＡＶＲ０２という用語と交換可能に使用することができる。ＤＴ−ＡＶＲ０２分子の構造およびその製造の詳細は上述されている。

概要／全体像
本実験の目標は、コットンラット（ＣＲ）におけるＲＳＶに対する防御に関して、ＤＴ−ＡＶＲ０２の有効性および安全性を評価することであった。アジュバント（４ｍｇ／ＣＲの２％Alhydrogel（登録商標）（ＡＬＨ））を添加することの効果も評価した。ブライム−ブースト戦略を使用し、ワクチンを筋肉内注射した。ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ感染（＋３５日目）後の＋３９日目、右肺の大きい肺葉の２つ（２）からの肺洗浄液と鼻洗浄液とを得て、プラークアッセイによってＲＳＶ力価を決定した。右肺の１つ（１）の肺葉を液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。実験の全体を通じて血清試料を取得し、ＲＳＶ／Ａ／ＴｒａｃｙおよびＲＳＶ／Ｂ／１８５３７に対する中和抗体活性を測定するために使用した。

ＤＴ−ＡＶＲ０２タンパク質／コットンラットの用量として、２μｇと１０μｇのいずれもが、生理食塩水対照と比較して、肺においてはおよそ４ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｇ肺、鼻においてはおよそ１．５ｌｏｇ_１０総ＰＦＵだけＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙを減少させるのに非常に有効であった。これら無感作のコットンラットにおいて、すべてのワクチンが２回目（追加免疫）のワクチン接種後にＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ特異的中和抗体応答を発生させ、これは０日目の生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙによる感染によって発生したものより大きかった。

２用量レジメンを用いて２μｇまたは１０μｇのいずれかの用量で投与された、ＤＴ−ＡＶＲ０２（ＤＴ−ｐｒｅＦ）アジュバント追加ワクチンは、ＲＳＶ無感作コットンラットに頑強な免疫応答をもたらした。２μｇと１０μｇの両者の用量が、肺においてはＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ複製に対する優れた防御を、鼻においては有意ではあるが中程度の減少をもたらし、ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ特異的およびＲＳＶ／Ｂ／１８５３７特異的血清中和抗体を誘発した。データは、これらのワクチンが、ＲＳＶ免疫前集団、たとえば、高齢の成人集団において特に有効であることを示唆している。

実験設計の詳細、結果および結論
本発明者らは、目的とするジチロシン架橋（ＤＴ）を導入してＲＳＶＦタンパク質をその融合前のコンフォメーションにコンフォメーションを固定することが可能なチロシン置換を有する、一連のＲＳＶＦ変異体を設計し、試験した。１つのかかる分子を、本明細書ではＤＴ−ＡＶＲ０２という（本明細書ではＤＴ−ｐｒｅＦとも呼ばれる）。この分子の構造および製造の詳細は、上記実施例に記述されている。マウスにおける予備研究（上記実施例参照）により、ＤＴ−ＡＶＲ０２は、部分的に安定化され、同時に劇的に改善された熱安定性を有する現在「最高」とされる２つのｐｒｅＦ設計（ＤＳ−Ｃａｖ１およびＳＣ−ＤＭ）の１つであるＤＳ−Ｃａｖ１と、免疫原性的に少なくとも等価であることが示された。ＤＳ−Ｃａｖ１およびＳＣ−ＤＭはｐｒｅＦ抗原として有望であることが示されているが、それでもこれらのタンパク質は比較的不安定であり、４℃においてたった数週間後に抗原性を失う。本研究者らによるインビトロの安定性アッセイが示すところによれば、ＤＴ−ＡＶＲ０２はＤＳ−Ｃａｖ１およびＳＣ−ＤＭより熱的に安定であり、３７℃で少なくとも１００時間、ｐｒｅＦ抗原性を保持する。このことは、ＤＴ−ＡＶＲ０２は臨床開発にとって十分に安定である可能性が高く、さらにその改善された安定性により、インビボでのワクチンの曝露および有効性も改善されることを示している。

この実施例で記載する実験の目標は、コットンラットにおける、２つの用量（２または１０μｇ／ＣＲ）でのインビボでのＤＴ−ＡＶＲ０２／ＤＴ−ｐｒｅＦＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ワクチンを評価することであった。

製剤にアジュバントである２％Alhydrogel（登録商標）（ＡＬＨ）を添加することの効果も評価した。プライム−ブースト戦略を使用し、ワクチンを筋肉内注射した。ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ感染（＋３５日目）後の＋３９日目、右肺の大きい肺葉の２つ（２）からの肺洗浄液と鼻洗浄液とを得て、プラークアッセイによってＲＳＶ力価を決定した。実験の全体を通じて血清試料を取得し、ＲＳＶ／Ａ／ＴｒａｃｙおよびＲＳＶ／Ｂ／１８５３７に対する中和抗体活性を測定するために使用した。

図８に示すワクチン接種スケジュール−０日目にワクチン接種、２１日目に追加免疫、その１４日後にウイルス感染、でワクチン接種（筋肉内）を実施した。

＋３５日目に、すべての動物に生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙを感染させた。群１は、生理食塩水を筋肉内注射した５匹のコットンラット（ＣＲ）とした（陽性ウイルス感染対照）。群２は、０日目に生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙに感染させた５匹のＣＲとした（「ゴールドスタンダード」）。群３は、２μｇのＤＴ−ｐｒｅＦを筋肉内注射し、１００μｇの２％ＡＬＨ／ＣＲのアジュバントを追加した５匹のＣＲとした。群４〜５は、１０μｇのＤＴ−ｐｒｅＦを筋肉内注射し、１００μｇの２％ＡＬＨ／ＣＲのアジュバントを追加したＣＲとした。

使用したコットンラットは、約７５〜１５０ｇの範囲の体重を有していた（開始時の年齢によって決まる）。実験の終了時にも体重を測定した。開始時、動物の体重、年齢、および性別の分布は、すべての群間で同様であった。ＮＩＨおよび米国農務省のガイドラインである、The Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animalsを利用して実験を実施し、実験プロトコールは動物実験委員会（Investigational Animal Care and Use Committee：ＩＡＣＵＣ）によって認可された。

イソフルランで軽く麻酔したコットンラットに、１．２１×１０^５ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ（ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ）（Ｐ３ｗ．ｐ．３／１３／２０１５）を鼻腔内投与した（１００μＬ）。０日目（群２）および３５日目（すべての群）の接種後、ウイルス接種材料を逆滴定して、初期濃度（ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を確認した。

Alhydrogel（登録商標）（水酸化アルミニウムゲル；ＡＬＨ）をＲＴ［２１℃］で保存した。ＤＴ−ＡＶＲ０２原液のタンパク質濃度は、ＰＢＳ中１６０μｇ／ｍＬであった（−８０℃で保存）。すべての工程を滅菌フード下で実施した。Alhydrogel（登録商標）２％調合物を、動物１匹当たり１００μＬの用量で、７回（計７００μＬ）にわたって使用した。

タンパク質試料を、水で濡らした氷の上で解凍した。１０μｇの用量は、タンパク質をＰＢＳ中１０５．２６μｇ／ｍＬ（計６６５μＬ、４３７μＬのＤＴ−ＰｒｅＦ、２２８μＬのＰＢＳ）の濃度に希釈した。２μｇの用量は、タンパク質をＰＢＳ中２１．０５μｇ／ｍＬ（計６６５、８７．４μＬのＤＴ−ＰｒｅＦ、５７７．６μＬのＰＢＳ）の濃度に希釈した。タンパク質試料を逆さにして混合した。Alhydrogel（登録商標）（２％、Brenntag）を逆さにすることによって十分に混合した。Alhydrogel（登録商標）のボトルを開封し、３５μＬを各用量中にピペットで移し、手で十分に混合して、均一な懸濁液とした。ワクチン接種の前に、調合した溶液を数回混合し、各々の注射の前に混合を再度行って均一な溶液を確実に維持した。

ＤＴ−ＡＶＲ０２およびアジュバント（１００μＬのＤＴ−ＡＶＲ０２およびＡＬＨ（群３、４））を左前脛骨筋（ＴＡ）に筋肉内注射した（ツベルクリンシリンジ）。反対側の脚を、２回目のワクチン接種に用いた（＋２１日目の追加免疫）。

０日目、各群の中の１匹のコットンラットの眼窩神経叢から血液を採取した。指定された他のすべての日に、すべてのコットンラット（５ＣＲ／群；４つの群）から血液を採取した。

ＣＯ_２による安楽死の後、右肺を結紮した。右肺から２つの肺葉を切り出し、滅菌水ですすいで血液による外部の汚れを除去し、秤量した。２６Ｇ３／８針付きの３ｍＬシリンジに入った１５％グリセリンと２％ＦＢＳ−ＭＥＭとが混合した（１：１、ｖ／ｖ）３ｍＬのIscove培地を用い、肺葉が全体的に膨張するように複数の部位に注射することで、同じ２つの右肺葉を経胸膜洗浄した。膨張した一方の肺葉をそっと平らに押しつけることで洗浄液を回収し、これを使用して、同じ技法に従って他方の肺葉を経胸膜洗浄した。洗浄液を採収し、滴定を行うまで氷上で保存した。上部気道の鼻洗浄液は、顎の関節を外すことで得た。頭部を切り出し、１５％グリセリンと２％ＦＢＳ−ＭＥＭとが混合した（１：１、ｖ／ｖ）１ｍＬのIscove培地を各鼻孔に押し流した（計２ｍＬ）。パレットの後部開口から流出液を採取し、滴定を行うまで氷上で保存した。試料は滴定前に凍結させず、滴定は試料の採取の終了時に行った。血清試料の一定分量を抗体分析のために取っておいた。

ＲＳＶＴｒａｃｙ肺洗浄液力価（ＰＦＵ／ｇ肺）および鼻洗浄液力価（総ＰＦＵ）を以下のように決定した。アッセイ開始の２４時間前に１０％ＦＢＳでほぼコンフルエント（約２×１０^５個／ウェル）なＨＥｐ−２細胞の単層を調製し、これを収容した２４ウェル組織培養プレートを用いてプラークアッセイを実施した。各アッセイの開始時に、被験試料から希釈物（通常は連続ｌｏｇ_１０）を作製した。次いで、各々の０．２ｍＬの試料をウェルに二重に添加し、ときどきそっとかき混ぜながら９０分間吸着させた。接種材料を除去した後、次いで、抗生物質、ビタミン類、および他の栄養塩類を含有するＭＥＭ中の０．７５％メチルセルロースで単層の上を覆った。各アッセイは、組織培養および陽性ウイルス対照を含んでいた。プレートを３６℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中に置いた。６日目（±１日）、プレートを０．０１％クリスタルバイオレット／１０％ホルマリン溶液（約１．５ｍＬ／ウェル）で染色し、室温で２４〜４８時間静置した。ウェルを水ですすいだ。存在する場合、プラークは容易に視認可能であった（非常に濃い青の背景上に明瞭な円）。約２０〜１００個のプラークを含むウェル中のすべてのプラークを計数し、平均化し、ウイルス力価を、鼻洗浄液については総ｌｏｇ_１０ＰＦＵとして、肺または他の器官についてはｌｏｇ_１０ＰＦＲ／ｇ組織として計算した。この方法による検出の下限値は、それぞれ、０．７０ｌｏｇ_１０総ＰＦＵ、またはおよそ１．４ｌｏｇ_１０ＰＦＵｇ肺組織である。

０、２１、３５、および３９日目における抗ＲＳＶ中和抗体の試験を、以下のように行った。ＲＳＶ／Ａ／ＴｒａｃｙおよびＲＳＶ／Ｂ／１８５３７に対する血清中和抗体の試験を、ＨＥｐ−２細胞を含む９６ウェルマイクロタイタープレート中で実施した。プラーク精製したＲＳＶウイルスをマイクロ中和（Ｎｔ）アッセイで使用した。試料を５６℃で３０分間熱失活させた。３ｌｏｇ_２で始まる繰返しによる２倍連続希釈を実施して、各試料について中和抗体（Ａｂ）力価を決定した。中和抗体力価を、ウイルスによる細胞壊死効果（Cytopathic effect：ＣＰＥ）において５０％以上の減少が観察された血清希釈度と定義した。ＣＰＥを組織破壊量として定義し、ウェルを１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、目視によって決定した。中和抗体（ＮｔＡｂ）力価はカテゴリカルなｌｏｇ数であって、連続的でない値として提示した。検出可能な最小のＮｔＡｂ力価は２．５ｌｏｇ_２であった。検出可能でないＮｔＡｂ力価を有する試料には、２ｌｏｇ_２という値を与えた。ＮｔＡｂ力価は０．５ｌｏｇ_２の倍数（たとえば、２．５、３．０、３．５、４．０等）で報告した。試料が試験の上限値以上（１４ｌｏｇ_２以上）のＮｔＡｂ力価を有していた場合、希釈度を２６ｌｏｇ_２まで延長することでＮｔＡｂ力価を決定することができるように、その試料を再試験した。内部標準として、４０μｇ／ｍＬのパリビズマブを含めた。

ＲＳＶ特異的抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施する前に、血清試料を−２０℃で保存した。最初に、Excel（Microsoft Office 2013）の両側スチューデントｔ検定を使用して、ｌｏｇ_１０変換ウイルス力価またはｌｏｇ_２変換抗体力価により、対照とワクチン群の間でウイルス感染またはＲＳＶ特異的中和抗体濃度を分析した。事後テユーキー比較を用いたＩｎＳｔａｔ３（GraphPad）を使用したＡＮＯＶＡにより、さらなる比較を分析することができる。

実験設計のさらなる詳細を表Ａに示す。結果は上述されている。結果のさらなる詳細を、表Ｂ〜Ｌを含む以下に示す。

コットンラット２Ｂは９日目にそのケージ内で死んでいるのが発見された。死因は不明である。

Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ−ｐｒｅＦ／ＤＴ−ＡＶＲ０２の鼻洗浄液におけるＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ力価に対する効果：生理食塩水対照（群１）と比較して、０日目における生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙの感染（群２）では、力価が４．４２ｌｏｇ_１０総ＰＦＵ（Ｐ＜０．００００１；両側スチューデントｔ検定）減少した（図９、表Ｂ）。ワクチンの組合せのいずれにおいても、ウイルス力価が１．３７〜１．７７ｌｏｇ_１０総ＰＦＵ（Ｐ≦０．０００２４；両側スチューデントｔ検定）減少した。ワクチンの組合せの間で統計的な差異はなかった。

Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ−ｐｒｅＦ／ＤＴ−ＡＶＲ０２の肺洗浄液におけるＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ力価に対する効果：生理食塩水対照（群１）と比較して、０日目における生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙの感染（群２）により、力価が検出限界未満まで減少した（４．０３ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｇ肺；Ｐ＜０．００００１；両側スチューデントｔ検定）（図１０、表Ｃ）。群３および４に対するワクチンの組合せにより、ＲＳＶ力価は検出限界未満まで減少した（４．０４〜４．１３ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｇ肺；Ｐ＜０．００００１；両側スチューデントｔ検定）。ワクチンの組合せ間で統計的な差異はなかった。

Alhydrogel（登録商標）２％のアジュバントが追加されたＤＴ−ｐｒｅＦ／ＤＴ−ＡＶＲ０２のＲＳＶ／Ａ／ＴｒａｃｙまたはＲＳＶ／Ｂ／１８５３７特異的中和抗体の生成に対する効果：ＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙ特異的中和抗体（ＮｔＡｂ）については、２１日目までに生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙによる自然な感染（群２）によってＮｔＡｂが生じ（約５．５ｌｏｇ_２／０．０５ｍＬ）、３９日目までその濃度のままであった（図１１；表Ｄ〜Ｇ）。２１日目において、これはいずれのＤＴ−ＡＶＲ０２とも統計的に異なっていた（Ｐ≦０．００３６；両側スチューデントｔ検定）。しかし、２１日目における２回目のワクチン接種後、いずれのワクチンによっても、生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙによる感染よりも大きな、頑強なＮｔＡｂ応答があった。

生きたＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙによる感染および２つのワクチンにより、ＲＳＶ／Ｂ／１８５３架橋ＮｔＡｂが生じた（図１２；表Ｈ〜Ｌ）。２つのワクチンに対するＮｔＡｂ応答のパターンはＲＳＶ／Ａ／Ｔｒａｃｙの場合と類似していたが、１〜２ｌｏｇ_２低いレベルであった。

例５
インビトロおよびインビボでの４２８Ｙおよび４２７Ｙ変異ＲＳＶＦ分子の比較
上記実施例に記載した方法を使用して、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで安定化された２種類のＤＴ架橋変異ＲＳＶＦ分子を生成した。この２種類の変異体は、一方が第４２８位のアミノ酸においてチロシンへの点変異（４２８Ｙ変異）を有し、他方が第４２７位のアミノ酸においてチロシンへの点変異（４２７Ｙ変異）を有している点のみが異なっていた。いずれの分子もＳ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌ変異（すなわち、「Ｃａｖ１」変異）と、第１８５位および第２２６位のアミノ酸残基におけるチロシンへの変異（すなわち、１８５Ｙ変異および２２６Ｙ変異）とを含んでいた。

本明細書では、４２８Ｙ変異体（Ｖ１８５Ｙ、Ｋ４２８Ｙ、Ｋ２２６Ｙ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む）は、「４２８Ｙ変異体」または「ＤＴ−ＡＶＲ０２」のいずれかと交換可能に呼ばれる。４２８Ｙ変異体のＦ０前駆体形態は、配列番号８１のアミノ酸配列を有する。成熟４２８Ｙ変異体分子（配列番号８１をコードする核酸分子のトランスフェクションおよび細胞中での発現後に形成される）は、配列番号８１の第２６〜１０９位および第１３７〜５６８位のアミノ酸残基を含み、第２６〜１０９位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ２残基であり、第１３７〜５１３位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ１残基であり、第５１４〜５６８位のアミノ酸残基は異種配列であり、フォールドン（foldon）ドメイン、Ｈｉｓタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、およびトロンビン切断部位を含む。第１〜２５位のアミノ酸に由来するシグナルペプチドおよび第１００〜１３６位のアミノ酸に由来するｐｅｐ２７ペプチドは、最終的な成熟三量体型４２８Ｙ変異体分子中に存在しない。

本明細書では、４２７Ｙ変異体（Ｖ１８５Ｙ、Ｋ４２７Ｙ、Ｋ２２６Ｙ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む）は、「４２７Ｙ変異体」または「ＤＴ−ＣＡＶ１」のいずれかと交換可能に呼ばれる。４２８Ｙ変異体のＦ０前駆体形態は配列番号８１のアミノ酸配列を有するが、ただし、第４２８位のアミノ酸位置におけるリシン（Ｋ）残基を含み、第４２７位のアミノ酸位置におけるチロシンを含む点が異なる。成熟４２７Ｙ変異体分子（配列番号８１のこの改変版をコードする核酸分子のトランスフェクションおよび細胞中での発現後に形成される）は、この改変された配列の第２６〜１０９位および第１３７〜５６８位のアミノ酸残基を含み、第２６〜１０９位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ２残基であり、第１３７〜５１３位のアミノ酸残基はＲＳＶＦＦ１残基であり、第５１４〜５６８位のアミノ酸残基は異種配列であり、フォールドン（foldon）ドメイン、Ｈｉｓタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、およびトロンビン切断部位を含む。第１〜２５位のアミノ酸に由来するシグナルペプチドおよび第１００〜１３６位のアミノ酸に由来するｐｅｐ２７ペプチドは、最終的な成熟三量体型４２７Ｙ変異体分子中に存在しない。

４２７Ｙおよび４２８Ｙ変異体を上記方法に従って発現させ、精製し、総タンパク質を規格化するためのモタビズマブ、ならびにコンフォメーション的な５Ｃ４（部位「Ｏ」、融合前特異的）抗体および抗原部位ＩＶと抗原部位Ｖの間の領域に結合する融合前特異的モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡにより、コンフォメーションの完全性について分析した。Ｎｉ−ＮＴＡ被覆プレート（Qiagen）を使用し、one-step ＴＭＢ試薬（Pierce）でアッセイを展開した。図１３に示すように、Ｋ４２７Ｙの代わりにＮ４２８Ｙ置換を行うことで、部位ＩＶ−Ｖ抗体への結合が大幅に改善され（図１３ＢおよびＤ）、部位「Ｏ」抗体への結合も改善される（図１３ＡおよびＣ）。

Ｋ４２７Ｙの代わりにＮ４２８Ｙの置換を行うことは、架橋反応後における分子の凝集状態にも影響を与える。本明細書に記載されている方法に従ってタンパク質を精製し、両タンパク質を同一の条件下で架橋し、本明細書に記載されているように処理した。溶離液としてＰＢＳを用い、Superdex 200 26/60pgカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行っている間、架橋された材料のクロマトグラムは著しく異なっている。図１４Ａに示すように、架橋反応後、４２７Ｙ変異体（ＤＴ−ＣＡＶ１）は、図１４中の対応する最終生成物のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１４Ｃ、左側の２つのゲル）に示されるように、高次凝集体種を主に生成する。４２８Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）を同じ処理で生成したとき、クロマトグラム（図１４Ｂ）および対応する最終生成物のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１４Ｃ、右側のゲル）から明らかなように、タンパク質の大部分が三量体型画分に存在していた。

また、４２７Ｙ変異体（ＤＴ−ＣＡＶ１）、４２７Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）、およびMcLellanら(2013) Science 342:592-598に記載されたＤＳ−Ｃａｖ１（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ変異を含む）の免疫原性を試験した。１０匹の６〜８週齢病原体非保持メスＣＢ６／Ｆ１Ｊマウス（Jackson Labs）からなる２つの群を、プライム（０日目）−ブースト（２１日目）レジメンによって免疫化した。両実験において、群１を１０μｇのアラムのアジュバントが追加されたＤＳ−Ｃａｖ１でワクチン接種し、他方、群２を、第１の研究では、アラムのアジュバントが追加された４２７Ｙ変異体（ＤＴ−ＣＡＶ１）の１用量につき、１匹当たり１０μｇ、第２の研究では、アラムのアジュバントが追加された４２８Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）の１用量につき、１匹当たり１０μｇでワクチン接種した。２回目のワクチン接種（追加免疫）から２週間後の３５日目に血清を採取した。結果を図１５Ａ〜Ｂに示す。この結果は、４２８Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）でワクチン接種した動物の血清中和力価（図１５Ｂ）が、４２７Ｙ変異体（ＤＴ−Ｃａｖ１）でワクチン接種したものの血清中和力価より劇的に高い（図１５Ａ）ことを示している。

例６
スクロースを用いた調合によりＲＳＶＦ凝集体の形成が減少する
スクロースを本発明の変異ＲＳＶＦ分子の調合物に含有させることで、望ましくない凝集体の形成が著しく減少することが見出されている。上記例示的なＤＴ架橋４２８Ｙ変異体（ＤＴ−ＡＶＲ０２）を用いて実験を実施した。最終濃縮後、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、所望のＤＴ−ＡＶＲ０２三量体（図１６Ａ中のピークＣ）と、さらに凝集体（図１６Ａ中のピークＡおよびＢ）の存在も実証された。精製工程の溶出中に１０％スクロースを含むＤＴ−ＡＶＲ０２分子を調合することにより、凝集体の形成が防がれたようであった。図１６Ｂに示すように、スクロースを用いて調合した試料中では、ピークＣ（三量体）は残ったが、ピークＡおよびＢ（凝集体）は見えなかった。

例７
非ヒト霊長類におけるＡＶＲ０２のインビボ試験
５匹の非ヒト霊長類からなる６つの群を、プライム（０日目）−ブースト（２８日目）レジメンで筋肉内注射によって免疫化する。群１および２を、高用量（５０ｍｇ／匹／注射）のＤＴ−ＡＶＲ０２で、アジュバントあり（群１）、なし（群２）でワクチン接種し；群３および４を、低用量（１０ｍｇ／匹／注射）のＤＴ−ＡＶＲ０２で、アジュバントあり（群３）、なし（群４）でワクチン接種し；群５および６を、高用量（５０ｍｇ／匹／注射）の本発明における比較対照であるＤＳ−Ｃａｖ１で、アジュバントあり（群１）、なし（群２）でワクチン接種する。

０日目および２８日目に、すべての群の動物に２回注射する。０日目の初回免疫の前および２８日目の２回目の免疫化の前に、すべての動物から血液を採取する。４２および４９日目に、再び血液を採取／採収する。ＲＳＶ特異的Ｔ細胞応答の頻度および表現型（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の特徴付けを行うため、標準的な方法によって末梢血単核細胞を単離し；血清を分析して、ＮＨＰ抗Ｆ応答（ＩｇＭ、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）を定量化し、標準的な方法による競合分析によってエピトープ解析を実施し（部位「Ｏ」および部位ＩＩ）、これも標準的な方法によって中和力価を定量化する。

例８
ＡＶＲ０２の第Ｉ相ヒト臨床試験
健康な（妊娠していない）成人（１８〜５０歳）における、安定化された融合前ＲＳＶＦサブユニットタンパク質ワクチンＤＴ−ＡＶＲ０２の、単独またはアラムアジュバントありにおける安全性、認容性、および免疫原性を調べるための、無作為化プラセボ対照盲検用量漸増試験
１５０人の対象を７つのコホートに分配し、６つの調合物とプラセボを試験する。対象に４：１の比で無作為にワクチン処理または生理食塩水プラセボを割り当て、各コホートが、活性ワクチンを受ける２０人の対象（群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）と、プラセボを受ける５人の対象（群Ｇ）とを含むようにする。２０人（活性ワクチン）および５人（プラセボ）の対象からなる６つの群を試験する。６×２５＝１５０対象。低、中、および高用量（１回の注射当たり５０ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、および５００ｍｃｇ）で、各用量はアジュバントとしてアラムありまたはなしで調合される。

０日目および９０日目（±５日）に、対象は２回筋肉内注射される。各ワクチン接種時（０および９０日目）からワクチン接種後の３０日にわたって、重篤な有害事象（ＳＡＥ）および重篤でないＡＥを含むあらゆるＡＥについて、対象を追跡する。さらに、６０、１５０、１８０、２１０、および３１０日目）に、電話によって対象と連絡を取り、ＳＡＥおよび新たな目立った医学的状態の発生について質問する。

第１の目的は、４４週間にわたってモニタリングされる健康な成人に筋肉内注射された場合、単独またはアラムありの３つの用量のＤＴ−ＡＶＲ０２による安全性、反応原性、および認容性を評価することである。第２の目的は、総Ａｂ応答を評価するためのＥＬＩＳＡ（Ａｂサブタイプ分析を含む）、各注射から２および４週間後におけるエピトープ特異的応答を評価するための競合ＥＬＩＳＡ、ならびに各注射から２および４週間後における中和アッセイによって測定した場合に、被験対象におけるアジュバント追加のなしまたはありの３つの用量のＤＴ−ＡＶＲ０２に対する抗体の応答を評価することである。

前述の発明を明確化および理解の目的で幾分詳細に説明したが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細に様々な変化を施すことが可能であることは、当業者には明らかなはずである。本発明はまた、以下の特許請求の範囲の用語でさらに規定することができる。

Claims

第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に第４２８位の残基に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異を含む変異ＲＳＶＦ分子。
第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に第１８５位の残基に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異をさらに含む、請求項１に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に第２２６位の残基に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異をさらに含む、請求項１に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に第１８５位の残基に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異、及び（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に第２２６位の残基に相当するアミノ酸におけるチロシンへの点変異をさらに含む、請求項１に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、ＲＳＶＡ型又はＲＳＶＢ型分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が融合前特異的抗体に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が抗原部位
を認識する抗体に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、Ｄ２５、５Ｃ４、ＡＭ２２、及びＡＭ１４からなる群から選択される抗体に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、Ｆ２ポリペプチド及びＦ１ポリペプチドを含み、前記Ｆ２ポリペプチドのＣ末端が、ジスルフィド結合によって前記Ｆ１ポリペプチドのＮ末端に連結している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、Ｆ２ポリペプチド及びＦ１ポリペプチドを含み、前記Ｆ２ポリペプチドのＣ末端が、人工的に導入されたペプチドリンカーによって前記Ｆ１ポリペプチドのＮ末端に連結している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
およそ８４個のアミノ酸残基を有するＦ２ポリペプチド、及びおよそ３７５個のアミノ酸残基を有するＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
およそ７４〜８４個のアミノ酸残基を有するＦ２ポリペプチド、及び、およそ３６５〜３７５個のアミノ酸残基を有するＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）配列番号２１〜８１のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含むか、又はこれらからなるＦ２ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号２１〜８１のいずれかの第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含むか、又はこれらからなるＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）配列番号２１〜８１のいずれかの第２６〜１０９位のアミノ酸残基のおよそ７４〜８４個のアミノ酸を含むか、又はこれらからなるＦ２ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号２１〜８１のいずれかの第１３７〜５１３位のアミノ酸残基のおよそ３６５〜３７５個のアミノ酸を含むか、又はこれらからなるＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）配列番号８１の第２６〜１０９位のアミノ酸残基を含むか、又はこれらからなるＦ２ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号８１の第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含むか、又はこれらからなるＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）配列番号８１の第２６〜１０９位のアミノ酸残基のおよそ７４〜８４個のアミノ酸を含むか、又はこれらからなるＦ２ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号８１の第１３７〜５１３位のアミノ酸残基のおよそ３６５〜３７５個のアミノ酸を含むか、又はこれらからなるＦ１ポリペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、１つ以上のジチロシン架橋により融合前のコンフォメーションで安定化されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が成熟ＲＳＶＦ三量体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、３つ以上のジチロシン架橋により融合前のコンフォメーションで安定化されている成熟ＲＳＶＦ三量体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、（ｂ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間に、ジチロシン架橋を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、（ａ）第１９８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合に相当するアミノ酸残基おけるチロシン、及び、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間に、ジチロシン架橋を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、（ｉ）第１９８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間のジチロシン架橋、並びに、（ｉｉ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間のジチロシン架橋の両者を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、３つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、前記架橋の各々が、（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、（ｂ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間にある、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、３つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、前記架橋の各々が、（ａ）第１９８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間にある、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、６つのジチロシン架橋を含む成熟ＲＳＶＦ三量体であり、前記ジチロシン架橋のうち、（ｉ）３つが、第１９８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間にあり、（ｉｉ）３つが、第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシン、及び、第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるチロシンの間にある、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、１つ以上の人工的に導入された非ＤＴ架橋をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、１つ以上の人工的に導入されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子がシステインへの１つ以上の点変異をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記ジスルフィド結合が２つのシステインの間に形成され、前記システインのうちの一方又は両方が点変異によって導入されたものである、請求項２９に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、第１５５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるシステインへの点変異を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、第２９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるシステインへの点変異を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、（ａ）第１５５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるシステインへの点変異、及び、（ｂ）第２９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるシステインへの点変異の両者を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、１つ以上の人工的に導入された空洞充填変異を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、第１９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるフェニルアラニンへの点変異を含む、請求項３５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、第２０７位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるロイシンへの点変異を含む、請求項３５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、（ａ）第１９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるフェニルアラニンへの点変異、及び、（ｂ）第２０７位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるロイシンへの点変異の両者を含む、請求項３５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、５８Ｗ、８３Ｗ、８７Ｆ、９０Ｌ、１５３Ｗ、１９０Ｆ、２０３Ｗ、２０７Ｌ、２２０Ｌ、２６０Ｗ、２９６Ｆ、及び２９８Ｌからなる群から選択される１つ以上の空洞充填変異を含む、請求項３５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が異種オリゴマー形成ドメインを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記異種オリゴマー形成ドメインが三量体形成ドメインである、請求項４０に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記三量体形成ドメインが、フォールドン（foldon）ドメイン、ＧＣＮ４ドメイン、又はＴ４フィブリニチンドメインである、請求項４１に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記三量体形成ドメインが、配列番号９３を含むフォールドン（foldon）ドメインである、請求項４１に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、前記ＲＳＶＦ分子の検出に有用な１つ以上のタグを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記分子が、前記ＲＳＶＦ分子の精製に有用な１つ以上のタグを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記タグが、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、プロテインＡタグ、及びプロテインＧタグからなる群から選択される、請求項４４又は４５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記タグが配列番号９５を含む、請求項４４又は４５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記タグが配列番号９６を含む、請求項４４又は４５に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
前記タグがタンパク質分解で切断可能なタグである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、及び（ｃ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸の各々におけるチロシンへの点変異を含む変異ＲＳＶＦ分子。
配列番号８１の第２６〜１０９位及び第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含む、請求項５０に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ｉ）（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、及び（ｃ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸の各々におけるチロシンへの点変異、（ｉｉ）第１９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるフェニルアラニンへの点変異、並びに、（ｉｉｉ）第２０７位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるロイシンへの点変異、を含む変異ＲＳＶＦ分子。
配列番号８１の第２６〜１０９位及び第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含む、請求項５２に記載の変異ＲＳＶＦ分子。
（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、及び（ｃ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸の各々におけるチロシンへの点変異を含む、可溶型成熟三量体型ＲＳＶＦ分子。
配列番号８１の第２６〜１０９位及び第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含む、請求項５４に記載の可溶型成熟三量体型ＲＳＶＦ分子。
（ｉ）（ａ）第４２８位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、（ｂ）第２２６位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸、及び（ｃ）第１８５位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸の各々におけるチロシンへの点変異、（ｉｉ）第１９０位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるフェニルアラニンへの点変異、並びに、（ｉｉｉ）第２０７位のアミノ酸残基、又は配列番号１とアライメントして決定した場合にこれに相当するアミノ酸残基におけるロイシンへの点変異を含む、可溶型成熟三量体型ＲＳＶＦ分子。
配列番号８１の第２６〜１０９位及び第１３７〜５１３位のアミノ酸残基を含む、請求項５６に記載の可溶型成熟三量体型ＲＳＶＦ分子。
前記分子が１つ以上のＤＴ架橋を含み、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで安定化されている、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載のＲＳＶＦ分子。
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶＦ分子をコードする核酸。
請求項５９に記載の核酸分子を含むベクター。
請求項５９に記載の核酸分子を含む細胞。
請求項６０に記載のベクターを含む細胞。
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の変異ＲＳＶ分子を含む医薬組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項６３に記載の医薬組成物。
ＲＳＶに対するワクチン接種を行う方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項６４に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。