CN117720628A - 一种呼吸道合胞病毒二价抗原制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的二价抗原及其应用。本发明基于RSVA、B两种亚型毒株的F蛋白序列,通过去除post‑F特有I、IV表位序列及pre‑F、post‑F共有的III表位部分序列,分别获得A、B两种亚型的新F二价抗原序列;再将A、B两种亚型的新F二价抗原序列串联在一起形成新F二价抗原二聚体,在体内、体外维持在pre‑F构象,从而刺激机体产生针对pre‑F表位特有的且具有高中和活性的抗体。本发明的二价二聚体抗原具有刺激机体产生更多中和抗体的优点以及具有产量高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的蛋白质及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV,Respiratory syncytial virus)是全球最常见的导致婴幼儿下呼吸道感染的病原微生物之一,几乎所有儿童2岁前都会至少感染一次RSV而导致肺炎或支气管炎,甚至死亡。在免疫缺陷和免疫力低下的老年人群中,RSV感染会出现严重的下呼吸道临床症状,从而提高死亡风险。因此,开发安全有效和价格低廉的预防RSV感染疫苗,成为全世界迫切需要解决的问题之一。
RSV属于副粘病毒科、肺病毒属,其基因组为单股负链病毒,全长15.2Kb,编码11个病毒蛋白。根据RSV病毒的基因组序列,将其分为A和B两种亚型。由于RSVF蛋白具有较强保守性的特点,不同RSV亚型间差异仅有10%左右,因此F蛋白是广谱RSV疫苗设计及开发的主要抗原。
RSVF蛋白在病毒与宿主细胞膜融合的过程中,由势能较高、稳定性较差的pre-F构象变为势能较低、相对稳定的post-F构象。在这一构象变化的过程中,pre-F特异性表位和V表位被遮挡,致使机体无法产生具有高中和活性的抗体;因此开发基于pre-F的RSV疫苗,成为预防RSV感染研究热点。目前已有临床可用的RSV疫苗,这些疫苗均是在F蛋白单体结构的基础上进行改造[Krarup A.,et al.A highly stable prefusion RSV F vaccinederived from structural analysis of the fusion mechanism.NatureCommunications,2015,6:8143;CrankMC.,et al.A proof of concept for structure-based vaccine design targeting RSV in humans.Science,2019,365,505-509.],使其能保持pre-F的构象。然而,根据文献报道,这些蛋白疫苗均存在产量较低(低于6mg/L)[Joyce MG.,et al.Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine against RSV.Nature Structural&Molecμlar biology,2016,23(9):811-820.]、无法始终保持pre-F构象等问题[CrankMC.,et al.Science,2019,365,505-509.]。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明人通过研究在于RSVF蛋白序列进行改造而完成本发明。具体地,本发明关键设计在于:一、分别基于RSVA、B两种亚型的F蛋白序列,通过去除post-F特有I、IV表位序列及pre-F、post-F共有的III表位部分序列,分别获得新F抗原序列;二、分别将两个或多个新F抗原序列串联在一起形成新F二价抗原二聚体。这两点设计使新F二价抗原二聚体在体内外维持在pre-F构象,从而刺激机体产生针对A、B两种亚型的pre-F表位特有的且具有高中和活性的抗体。
本发明提供一种呼吸道合胞病毒二价抗原,其是去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位一部分的RSV A、RSV B两种亚型毒株的F蛋白单体,或者两者串联一起得到的呼吸道合胞病毒抗原,优选地所述RSV A亚型毒株的F蛋白单体以一个或多个(例如,三个、四个、五个、六个)与所述RSV B亚型毒株的F蛋白单体的一个或多个(例如,三个、四个、五个、六个)串联在一起得到的呼吸道合胞病毒抗原;
优选地,根据RSV A2毒株的F蛋白序列(优选地其如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列),去除了N104-V147段(具体是如SEQ ID NO:2所示)和V308-S552段(具体是如SEQ IDNO:3所示);将T103与G148之间插入linker序列(例如GS两个氨基酸)链接,将C37突变为A,得到包含pre-F特有的V和表位、pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV A2F蛋白单体的氨基酸序列;
根据RSV B9320毒株的F蛋白氨基酸序列(优选地其如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列),去除了N104-V147段(具体是如SEQ ID NO:5所示)和V308-S552段(具体是如SEQ IDNO:6所示);将A103与G143直接链接,将C37突变为A,T97突变为M,S197突变为N,Q202突变为R,K226突变为M,得到pre-F特有的V和表位、pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV B9320F蛋白单体的氨基酸序列;
分别所获得的新的RSVA2F蛋白单体和RSV B9320F蛋白单体串联或两种蛋白单体多个串联在一起,串联在后面的蛋白不包括M1-Q26段(具体是如SEQ ID NO:9所示),得到呼吸道合胞病毒二价抗原。
优选地,去除了post-F特有的I表位的氨基酸序列为F387-D392(FNPKYD)和去除了post-F特有的I表位的氨基酸序列为K427-S436(KNRGIIKTFS);及去除了pre-F、post-F共有的III表位除氨基酸序列为V40-L45(VSKGYL)以外的部分;
更优选地,分别将两个或多个单体串联得到的所述呼吸道合胞病毒二价抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
另外,还在3'端加上标签序列和终止密码子序列;优选地,各单体之间还有连接肽。
进一步优选地,其氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示,或者进一步包括标签序列,优选地如其氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示。
本发明还提供所述的呼吸道合胞病毒二价抗原的编码基因;优选地,所述标签序列的编码核苷酸序列是编码6个组氨酸的核酸序列,优选地,如SEQ ID NO:8所示;进一步地,还包括所述终止密码子的编码核苷酸序列是1个终止密码子。
优选地,其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明还提供含有所述的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞,具体地所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体,所述重组宿主细胞出发宿主细胞是哺乳动物细胞如293F细胞。
进一步提供所述的呼吸道合胞病毒抗原的编码基因。
本发明还提供含有所述的编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞,具体地所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体,所述宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
本发明还提供所述的呼吸道合胞病毒二价抗原的制备方法,其特征在于,所述呼吸道合胞病毒抗原编码基因通过重组表达载体在宿主细胞中表达得到所述呼吸道合胞病毒抗原;具体地,所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体,所述宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞;任选地,还包括表达后收集细胞上清和纯化所述呼吸道合胞病毒抗原的步骤。
本发明还提供以所述的呼吸道合胞病毒抗原为有效成分和佐剂组成的抗原组合物,优选地所述佐剂为铝佐剂和AddaVax佐剂。
本发明也提供所述的呼吸道合胞病毒抗原在制备用于免疫动物获得抗体的试剂中的应用。
本发明提供的二聚体抗原,不仅使其在体内外维持在pre-F构象,从而刺激机体产生针对pre-F表位特有的且具有高中和活性的抗体,具有刺激机体产生更多中和抗体的优点。另外,通过实验证实,本发明F抗原二聚体还具有产量高的优点(在实验中超过30mg/L)。
附图说明
图1、RSV新F二价抗原二聚体的Superdex 200 Increase 10/300(GE)分子筛层析及电泳图。
图2、免疫策略示意图。
图3、棉鼠免疫RSV新F二价抗原二聚体后诱导产生RSVF特异性IgG抗体滴度结果。
图4、棉鼠免疫RSV新F二价抗原二聚体后蛋白在体内构象分析结果(通过Elisa的方法推测抗原在体内是pre-F还是post-F,及特内中和活性相对较高的V和标为抗体水平)。
图5、棉鼠免疫RSV新F二价抗原二聚体后诱导产生RSVA2病毒中和抗体滴度结果。
图6、棉鼠免疫RSV新F二价抗原二聚体后诱导产生RSVB9320病毒中和抗体滴度结果。
图7、棉鼠免疫RSV新F二价抗原二聚体再攻毒后各组织活病毒滴度结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明,但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例一:RSV新F抗原二聚体的表达和纯化
根据RSVA2毒株的F蛋白序列(如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列),RSV B9320毒株的F序列(如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列),不包含post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV F蛋白单体的氨基酸序列所获得的新的RSVF蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起(如SEQ ID NO:7所示),3’端加入6个组氨酸标签(如SEQ ID NO:8所示),经密码子优化后得到呼吸道合胞病毒抗原编码基因(SEQ ID NO:10)。
然后将所得到呼吸道合胞病毒抗原编码基因序列克隆到pCAGGS载体,得到pCAGGS-新F二价抗原二聚体质粒。再将质粒转染到293F细胞表达系统进行表达,表达后收集细胞上清,纯化。
使用Superdex 200 Increase 10/300(GE)分子筛进行层析,收集13.5ml附近的洗脱峰(如图1所示)进行SDS-PAGE分析。洗脱体积13.5ml附近的蛋白在非还原条件下(不加DTT)和还原条件下(加DTT)大小均约为54Kd,证明该洗脱峰获得的蛋白质为新F二价抗原二聚体。
实施例二:RSV新F二价抗原二聚体抗体亲和力分析
使用生物大分子相互作用分析系统Biacore 8K,将实施例一所获得的RSV新F抗原二聚体固定在SM芯片上,然后在芯片表面流动多种针对F蛋白不同表位的抗体Fab段,测定抗原与多种抗体之间的亲和力大小。本实施例选用I表位4D7[Flynn JA.,et al.StabilityCharacterization of a Vaccine Antigen Based on the Respiratory SyncytialVirus Fusion Glycoprotein.PLoS ONE,2016,11(10):e0164789.]、II表位Palivazumab[The IMPACT-RSV Study Group.Palivizumab,a humanized respiratory syncytialvirus monoclonal antibody,reduces hospi-talization from respiratory syncytialvirus infection in high-risk infants.Pediatrics,1998,102,531-537]、III表位MPE8[Gilman MS.et al.Characterization of a prefusion-specific antibody thatrecognizes a quaternary,cleavage-dependent epitope on the RSV fusionglycoprotein.PLoSPathogen,2015,11:e1005035.]、IV表位101F[McLellan JS.etal.Structure of amajor antigenic site onthe respiratory syncytial virusfusion glycoprotein in complex withneutralizing antibody 101F.Journal ofVirology,2010,84:12236-12244.]、V表位CR9501[Gilman MS.et al.Transient openingof trimeric prefusion RSV F proteins.Nature Communications,2019,10:2105.]、表位Am22[McLellan JS.et al.Structure of RSV fusion glycoprotein trimer boundto a prefusion-specific neutralizing antibody.Scinece,2013,340(6136):1113-1117.]。通过Biacore 8K分析后,获得RSV新F二价抗原二聚体与抗体的结合情况及亲和力(如表1所示),空白格部分表示抗原与抗体不结合。
表1 RSV新F二价抗原二聚体与抗体的结合情况及亲和力
实施例三:RSV新F二价抗原二聚体免疫棉鼠实验
MF59(以下使用的AddaVax是一种MF59-like佐剂)和铝佐剂是SFDA批准的两种常用佐剂。本发明选择这两种佐剂作为动物实验的疫苗佐剂,对于后续临床试验将具有直接的指导作用;因此本发明将实施例一获得的抗原与PBS溶液稀释成所需浓度后,分别与A1hydrogel铝佐剂和AddaVax佐剂混合后乳化,然后对6-8周龄雌性棉鼠进行分组免疫。免疫分组情况、各组使用免疫原剂量和佐剂情况如表2所示,空白格部分表示“无”。免疫策略如图2所示,通过大腿肌肉注射的方式,每只棉鼠分别在第0、21、42天接受3次疫苗免疫,每次200μ1接种体积,两侧大腿各接种100μ1。分别于第19、40、56天进行眼眶采血。血液样品静置后3000 rpm离心10分钟获得血清,56℃水浴30分钟灭活后,保存于-80℃冰箱,用于特异性抗体滴度检测和RSV中和实验。
表2免疫分组情况、各组使用免疫原剂量、佐剂和攻毒毒株情况
序号 | 只数 | 剂量/佐剂 | 攻毒毒株亚型 |
1 | 6 | PBS-Al | A |
2 | 6 | PBS-Al | B |
3 | 6 | PBS-Add | A |
4 | 6 | PBS-Add | B |
5 | 7 | 3μg-Add | A |
6 | 7 | 3μg-Add | B |
7 | 7 | 10μg-Al | A |
8 | 7 | 10μg-Al | B |
实施例四:ELISA实验检测抗原诱导的特异性抗体滴度
将实施例一获得的RSV新F二价抗原二聚体蛋白用ELISA包被液稀释至3μg/ml加入至ELISA 96孔板(Coring,3590)中,每孔加入100μl。4℃放置12小时后,倒掉包被液,加入PBS洗二遍后,用PBS配置的5%脱脂奶粉作为封闭液,每孔加入100μl,37℃封闭1小时。封闭后倒掉封闭液,加入实施例三获得的血清梯度稀释样本100μl。血清样品从50倍起,用封闭液4倍梯度稀释,共稀释12个梯度;阴性对照孔直接加入100μl封闭液。37℃孵育1小时后,倒掉上清液后,使用PBST洗板3遍后,加入封闭液1:5000稀释的鸡抗棉鼠IgG二抗,37℃孵育1小时后,使用PBST洗板4遍。加入封闭液1:5000稀释的偶联HRP的羊抗鸡IgG三抗,37℃孵育0.5小时后,使用PBST洗板4遍。加入TMB显色液显色,在适当反应时间后加入2M盐酸终止反应,在酶标仪上检测OD450读值。抗体滴度值被定义为反应值大于2.1倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.1倍阴性对照值时,该样品滴度定义为最低稀释倍数的一半,即1:25。
结果如图3所示,在整个免疫过程中,各免疫组棉鼠血清中特异性抗体水平伴随着免疫次数的增加而显著增加,3次免疫后抗体水平最高。这一结果说明RSV新F二价抗原二聚体能有效激活棉鼠的抗体反应。
实施例五:ELISA实验检测新F二价抗原二聚体在体内的构象
将实施例一获取的RSV新F二价抗原二聚体蛋白和RSV post-F蛋白分别用ELISA包被液稀释至3μg/ml加入至ELISA 96孔板(Coring,3590)中,每孔加入100μl。4℃放置12小时后,倒掉包被液,加入PBS洗二遍后,用PBS配置的5%脱脂奶粉作为封闭液,每孔加入100μl,37℃封闭1小时。
将已被好RSV新F二价抗原二聚体的96孔板,每孔加入100μl浓度为3μg/ml的V表位抗体CR9501Fab蛋白溶液或表位抗体Am22Fab蛋白溶液,37℃孵育1小时。然后上清液弃除后,使用PBST洗板3遍。加入实施例三获得的血清样本,将血清样品从50倍起,用封闭液4倍梯度稀释,共稀释12个梯度;阴性对照孔直接加入100μl封闭液。37℃孵育1小时后,倒掉上清液后,使用PBST洗板3遍后,加入封闭液1:5000稀释的鸡抗棉鼠IgG二抗,37℃孵育1小时后,使用PBST洗板4遍。加入封闭液1:5000稀释的偶联HRP的羊抗鸡IgG三抗,37℃孵育0.5小时后,使用PBST洗板4遍。加入TMB显色液显色,在适当反应时间后加入2M盐酸终止反应,在酶标仪上检测OD450读值。抗体滴度值被定义为反应值大于2.1倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.1倍阴性对照值时,该样品滴度定义为最低稀释倍数的一半,即1:25。
将实施例三获取的三免后采集的血清样品从50倍起,用封闭液4倍梯度稀释,共稀释12个梯度后,与已用PBS洗好的包被RSVpost-F蛋白的96孔板直接37℃孵育。1小时后,将上清液弃除后,使用PBST洗板3遍后,加入封闭液1:5000稀释的鸡抗棉鼠IgG二抗,37℃孵育1小时后,使用PBST洗板4遍。加入封闭液1:5000稀释的偶联HRP的羊抗鸡IgG三抗,37℃孵育0.5小时后,使用PBST洗板4遍。加入TMB显色液显色,在适当反应时间后加入2M盐酸终止反应,在酶标仪上检测OD450读值。
抗体滴度计算方法与实施例三相同,将实施例三中三免血清中特异性结合抗体(三免)的数据(黑色)、血清和post-F直接结合的数据(白色)、血清和封闭表位后血清中特异性抗体结合的数据(浅灰色)、血清和封闭V表位后血清中特异性抗体结合的数据(深灰色)比较(如图4所示)。三免数据显著高于post-F直接结合数据102倍以上,说明在体内,RSV新F抗原二聚体蛋白主要以pre-F的构象存在。三免数据与封闭/>表位数据相比,约相差101-2倍,两者差值为RSV新F抗原二聚体在体内产生的/>表位抗体。同样,三免数据与封闭V表位数据相比,约相差101.5-2倍,两者差值为RSV新F抗原二聚体在体内产生的V表位抗体。由于/>表位和V表位的抗体是对RSV病毒中和活性最强的抗体,这一结果说明,RSV新F抗原二聚体可以在体内有效刺激产生具有良好病毒中和活性的抗体,从而实现对机体的免疫保护作用。
实施例六:免疫血清的病毒中和实验
将实施例三所获得的血清按照起始1:5稀释后,4倍梯度稀释7个梯度,分别与等体积的200TCID50的RSV A2和RSV B9320混合。37℃共孵育1小时后,将混合液100μl加入HEp-2细胞覆盖度约为70%的96孔板中,37℃孵育2小时后弃掉混合液,加入100μl 2%FBS的DMEM培养基。37℃孵育4天后,弃掉培养基,PBS洗涤细胞2次,加入冰冷的80%丙酮溶液固定20分钟。弃除上清,加入PBS洗二遍后,用PBS配置的5%脱脂奶粉作为封闭液,每孔加入100μl,37℃封闭1小时。封闭后倒掉封闭液,加入封闭液配制的浓度为3μg/ml的Palivazumab一抗溶液100μl/孔,37℃孵育1小时后,使用PBST洗板3遍。加入封闭液1:5000稀释的HRP偶联标记的羊抗人IgG二抗,37℃孵育1小时后,使用PBST洗板4遍。加入TMB显色液显色,在适当反应时间后加入2M盐酸终止反应,在酶标仪上检测OD450读值。抗体滴度值被定义为反应值大于2.1倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.1倍阴性对照值时,该样品滴度定义为最低稀释倍数的一半,即1:25。
结果如图5、图6所示,在整个免疫过程中,铝佐剂10μg剂量下和AddaVax佐剂3μg剂量下,3次免疫后中和抗体可分别达到210和28以上的抗体滴度水平。这一结果说明RSV新F二价抗原二聚体能有效刺激棉鼠产生中和抗体,实现对机体的免疫保护。
实施例七:棉鼠攻毒保护实验
将实施例三中棉鼠在第63天滴鼻,分别感染105TCID50RSV A2病毒和105TCID50RSVB9320病毒(如图2所示,分组情况如表2所示),5天后处死,取出肺脏、气管和鼻颊骨,组织匀浆后,按照3倍梯度稀释组织均浆,将100μl匀浆液加入事先准备好的细胞覆盖度约70%的HEp-2细胞96孔板中,37℃,5%CO2通气量,孵育1小时。然后弃除上层组织匀浆,每孔加入100μl含2%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%CO2通气量培养4天后,检测病毒滴度(TCID50)。结果如图7所示,肺、鼻颊骨和气管三个组织病毒培养的结果均显示,无论使用RSVA2病毒还是使用RSV B9320病毒,无论使用AddaVax佐剂还是铝佐剂,疫苗组棉鼠各组织中病毒载量均位于检测线(图中虚线)附近,约为22.3的病毒滴度,而无蛋白仅使用佐剂组(PBS),平均病毒滴度为27-10。这一结果充分说明RSV新F二价抗原二聚体对机体具有良好的保护效果。
Claims (10)
1.一种呼吸道合胞病毒二价抗原,其特征在于,去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV A、RSV B两种亚型毒株的F蛋白单体,或者两者串联一起得到的呼吸道合胞病毒抗原,优选地所述RSV A亚型毒株的F蛋白单体以一个或多个(例如,三个、四个、五个、六个)与所述RSV B亚型毒株的F蛋白单体的一个或多个(例如,三个、四个、五个、六个)串联在一起得到的呼吸道合胞病毒抗原;
优选地,根据RSV A2毒株的 F蛋白序列(优选地其如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列),去除了N104-V147段(具体是如SEQ ID NO:2所示)和V308-S552段(具体是如SEQ ID NO:3所示);将T103与G148之间插入linker序列(例如GS两个氨基酸)链接,将C37突变为A,得到包含pre-F特有的V和ø表位、pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV A2 F蛋白单体的氨基酸序列;
根据RSV B9320毒株的F蛋白氨基酸序列(优选地其如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列),去除了N104-V147段(具体是如SEQ ID NO:5所示)和V308-S552段(具体是如SEQ ID NO:6所示);将A103与G143直接链接,将C37突变为A,T97突变为M,S197突变为N,Q202突变为R,K226突变为M,得到包含pre-F特有的V和ø表位、pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV B9320 F蛋白单体的氨基酸序列;
分别所获得的新的RSV A2 F蛋白单体和RSV B9320 F蛋白单体串联或两种蛋白单体多个串联在一起,串联在后面的蛋白不包括M1-Q26段(具体是如SEQ ID NO:9所示),得到呼吸道合胞病毒二价抗原。
2.如权利要求1所述的呼吸道合胞病毒二价抗原,其特征在于,去除了post-F特有的I表位的氨基酸序列为F387-D392(FNPKYD)和去除了post-F特有的I表位的氨基酸序列为K427-S436(KNRGIIKTFS);及去除了pre-F、post-F共有的III表位除氨基酸序列为V40-L45(VSKGYL)以外的部分;
优选地,分别将两个或多个单体串联得到的所述呼吸道合胞病毒二价抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.如权利要求1所述的呼吸道合胞病毒二价抗原,其特征在于,还在3'端加上标签序列和终止密码子序列。
4.如权利要求1至3任一项所述制备方法得到的呼吸道合胞病毒二价抗原,其特征在于,其氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示,或者进一步包括标签序列,优选地如其氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示。
5.如权利要求1至4任一项所述的呼吸道合胞病毒二价抗原的编码基因;优选地,所述标签序列的编码核苷酸序列是编码6个组氨酸的核酸序列,优选地,如SEQ ID NO:8所示;进一步地,还包括所述终止密码子的编码核苷酸序列是1个终止密码子。
6.如权利要求5所述的呼吸道合胞病毒二价抗原的编码基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
7.含有如权利要求6所述的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞,具体地所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体,所述重组宿主细胞出发宿主细胞是哺乳动物细胞如293F细胞。
8.如权利要求1至4任一项所述的呼吸道合胞病毒二价抗原的制备方法,其特征在于,所述呼吸道合胞病毒抗原编码基因通过重组表达载体在宿主细胞中表达得到所述呼吸道合胞病毒抗原;具体地,所述重组载体的出发载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体,所述宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞;任选地,还包括表达后收集细胞上清和纯化所述呼吸道合胞病毒抗原的步骤。
9.以如权利要求1至4任一项所述的呼吸道合胞病毒二价抗原为有效成分和佐剂组成的抗原组合物,优选地所述佐剂为铝佐剂或AddaVax佐剂。
10.如权利要求1至4任一项所述的呼吸道合胞病毒二价抗原在制备用于免疫动物获得抗体的试剂中的应用。
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