KR102651521B1

KR102651521B1 - 리파아제를 이용한 4-에틸말레이트의 제조방법

Info

Publication number: KR102651521B1
Application number: KR1020210176180A
Authority: KR
Inventors: 엄기남; 김형권
Original assignee: 주식회사 씨원바이오; 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2024-03-28
Also published as: KR20230087708A

Abstract

본 발명은 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제의 위치특이적 가수분해능을 이용한 4-에틸말레이트(4-EM)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 종래 화학적인 방법으로 생산하여 왔던 포토레지스트 전구체인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤 생산에 필요한 4-에틸말레이트를 환경친화적인 효소반응공정을 통해 고효율로 제조할 수 있다.

Description

리파아제를 이용한 4-에틸말레이트의 제조방법{Method for Preparing 4-Ethyl malate Using Lipase}

본 발명은 리파아제를 이용한 4-에틸말레이트의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제의 위치특이적 가수분해능을 이용한 4-에틸말레이트(4-EM)의 제조방법에 관한 것이다.

리파아제(EC 3.1.1.3) 효소는 지방을 가수분해하여 글리세롤과 지방산을 생성하는 효소이다. 리파아제는 다양한 지방산 사슬을 지닌 트리글리세리드를 가수분해 할 수 있을 뿐만 아니라, 비수계 반응조건에서 다양한 에스테르 합성 반응 또는 트랜스에스테르화 반응을 촉매할 수 있기 때문에 산업적으로 매우 유용한 효소촉매이다. 지금까지 각종 동물, 식물, 미생물로부터 수많은 리파아제가 발굴되었고, 효소의 반응특성 및 효소의 3차 구조가 연구되었다. 특히, 미생물 리파아제 효소는 미생물 기원에 따라서 다양한 반응특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 즉, 미생물 리파아제는 지방산 길이 및 불포화도에 따른 기질특이성을 갖고 있으며, 위치특이성과 입체특이성도 지니고 있다.

한편, 지금까지 구조가 밝혀진 모든 리파아제는 전형적인 α/β 하이드롤레이즈 접힘(hydrolase fold) 구조를 공통으로 갖고 있으며, 효소의 활성부위에 Ser, His, Asp로 구성되는 세 작용기 촉매(catalytic triad) 구조를 갖고 있다. 각 미생물 리파아제 효소가 지닌 다양한 반응특이성은 활성부위 포켓을 구성하는 일부 아미노산과 '리드(lid)'를 구성하는 아미노산에 의해서 결정된다(Khan FI et al., Front. Bioeng. Biotechnol. 5: 16, 2017).

리파아제-리간드 결합체에 대한 X선 결정구조 연구와 docking model 연구를 통해서 리파아제가 지닌 반응특이성을 분자적 수준에서 설명할 수 있다

리파아제는 식품, 농업, 화학, 제약, 화장품, 환경, 에너지 산업에서 효소촉매로서 널리 사용된다. 예를 들어, 특정 지방의 분해 및 합성, 향미성분, 의약품, 항산화제, 항균제, 바이오디젤의 합성에 사용된다. 또한, 리파아제 자체가 세제 및 소화제의 한 성분으로 사용된다. 한편, 세균 리파아제의 가수분해반응 시, 적정 pH는 중성 또는 알칼리성이고, 곰팡이 리파아제의 적정 pH는 산성으로 알려져 있다. 따라서 리파아제를 산업적으로 활용하기 위해서는 기질 및 생성물의 종류, 반응조건에 따라서 적합한 리파아제를 선택하여 사용하는 것이 필요하다.

일반적으로 화학촉매를 이용하여 에스테르 화합물을 합성하는 경우, 반응속도가 빠르고 촉매가격이 저렴하다는 장점을 갖고 있지만, 높은 온도에서 반응을 수행해야 하고 원치 않는 부반응이 진행되며 환경오염 물질을 많이 사용해야 하는 문제점이 있다. 한편, 리파아제 촉매를 이용하는 경우, 실온 또는 저온에서 반응을 수행하며, 기질, 위치, 입체특이성을 이용해서 원하는 물질만 선택적으로 합성함으로써 부산물 발생량을 줄일 수 있기 때문에 산업체에서 환경친화적인 효소반응공정을 점점 많이 사용하고 있다.

포토레지스트(Photoresist)는 빛에 노출됨으로써 약품에 대한 내성이 변화하는 고분자 재료로 반도체 제조의 주재료로 사용되는 중요한 물질이다. 많이 사용하는 고분자가 argon fluoride (ArF) photoresist인데, 이것을 생산하기 위해서는 전구체인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤(-hydroxy-γ-butyrolactone, 2-HGBL)이 필요하다. 고순도의 2-HGBL을 생산하기 위해서는 기질 디에틸말레이트(diethyl malate, DEM)의 1번 위치와 특이적으로 반응하는 리파아제를 사용하여 4-에틸말레이트(4-ethyl malate, 4-EM)을 생산하는 과정이 필수적이다. 4-EM은 화학적 방법을 통해서 디하이드록시부틸산(dihydroxybutyric acid, DHBA)를 거쳐 2-HGBL로 전환된다(도 1).

본 발명에서는 2-하이드록시-γ-부틸로락톤에서 4-에틸말레이트(4-EM)로 전환하는 능력을 가진 효소를 개발하고자 예의 노력한 결과, 미생물 유래 여러 종의 리파아제를 이용하여, 디에틸말레이트(DEM)에서 4-에틸말레이트(4-EM)으로의 전환능을 확인한 결과, Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제가 기질 DEM을 위치특이적으로 가수분해하여 4-EM을 선택적으로 생성하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 포토레지스트 전구체인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤 생산에 필요한 4-에틸말레이트를 효소학적 방법으로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 효소학적 방법으로 4-에틸말레이트를 제조하기 위한조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 4-에틸말레이트(4-ethyl malate, 4-EM)의 제조방법을 제공한다:

(a) 디에틸말레이트(diethyl malate, DEM) 기질과 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제를 반응시켜 4-에틸말레이트를 생성시키는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4-에틸말레이트를 수득하는 단계.

본 발명은 또한, 디에틸말레이트(diethyl malate, DEM) 기질과 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제를 함유하는 4-에틸말레이트 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 종래 화학적인 방법으로 생산하여 왔던 포토레지스트 전구체인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤 생산에 필요한 4-에틸말레이트를 환경친화적인 효소반응공정을 통해 고효율로 제조할 수 있다.

도 1은 2-히드록시-γ-부티로락톤(2-HGBL) 생성과정을 나타낸 것으로, 4-에틸말레이트(4-EM)는 1번 위치 특이적 리파아제를 사용하여 디에틸말레이트(DEM)로부터 생산되고, 4-EM은 포토레지스트의 중간체인 2-HGBL의 생산에 사용되는 것을 나타낸다. DHBA; 2,4-디히드록시 부티르산.
도 2는 효소 반응 생성물의 박막 크로마토그래피(TLC)결과를 나타낸 것이다.
도 3은 효소 반응 생성물의 HPLC 결과를 나타낸 것으로, 반응 혼합물을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 4-EM(생성물) 및 DEM(기질)은 각각 8분 및 12분에 용리되었다.
도 4는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리된 4-EM을 이용하여 ¹H-NMR (CDCl₃)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. A는 DEM의 NMR 결과이고, B는 4-EM의 NMR 결가이다.
도 5는 4-EM 생산을 위한 pH 조절 효소 반응 시스템을 나타낸 것이다.
도 6은 M37 리파아제를 이용한 4-EM 생산에서 온도와 pH의 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 pH-stat 반응 시스템을 이용한 4-EM 생산을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 효소반응은 50℃에서 20mL 구연산 버퍼(pH 4.0)를 사용하여 4-EM 양의 증가를 확인하였다. A는 2시간 효소 반응 후 반응산물의 HPLC 결과를 나타낸 것이고, B는 시간에 따른 전환 수율을 나타낸 것이며, C는 시간에 따른 4-EM 농도를 계산한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 반도체 제조의 주재료로 사용되는 포토레지스트(Photoresist)를 생산하기 위한 전구체인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤(-hydroxy-γ-butyrolactone, 2-HGBL)의 생산에 필수적인 4-에틸말레이트(4-ethyl malate, 4-EM)를 효소반응을 통해 생산하는 방법을 개발하였다.

디에틸말레이트(diethyl malate, DEM)를 기질로하여, 사용되는 리파아제의 위치특이성에 따라 1-EM(1-ethyl malate) 또는 4-EM(4-ethyl malate)이 생산된다 (도 1). 이 중에서 4-EM을 이용하여 포토레지스트 물질인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤(2-hydroxy-γ-butyrolactone, 2-HGBL)을 합성하기 때문에, 본 발명에서는 1-specific lipase 활성을 갖는 효소를 스크리닝하였다.

본 발명의 일 양태에서는 본 발명자들이 발굴한 4종의 리파아제인, Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제(서열번호 1), Proteus vulgaris K80(서열번호 2) 유래 리파아제, Bacillus sterarothermophilus L1 유래 리파아제(서열번호 3), Staphylococcus haemolyticus L62 유래 리파아제(서열번호 4)를 사용하여, 4-EM 생성능을 가지는 효소를 확인한 결과, M37 효소가 가장 낮은 PNPC 분해활성을 보였음에도 불구하고 DEM과 가장 높은 반응 특이성을 나타내며, 실질적으로 4-EM를 생성하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 4-에틸말레이트(4-ethyl malate, 4-EM)의 제조방법에 관한 것이다:

(b) 상기 생성된 4-에틸말레이트를 수득하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 4-에틸말레이트 생성능을 가지면서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92%이상 93% 이상, 94%이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 효소를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 상기 M37 리파아제 유전자를 포함하는 재조합 pET22 플라스미드를 전기천공법으로 Escherichia coli BL21 (DE3) 균에 넣어 LB-ampicilin (100 μg/ml) 고체배지에서 배양한 후, LB-ampicillin 액체배지에 형질전환된 대장균을 접종하여 37℃ 에서 진탕배양하고, 배양액의 OD_600nm가 0.5-0.6이 되도록 균이 자랐을 때, IPTG를 1mM 농도로 첨가하여 20℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕배양한 후, 원심분리를 통해 배양액으로부터 균체를 회수하고, 균체를 초음파 분쇄법으로 깬 후 원심 분리하여 얻은 상등액을 리파아제 효소액으로 사용하였다.

또한, 본 발명에서는 4-EM을 대량 생산하기 위한 효소반응기를 제작하고, 효소반응을 최적화하는 실험을 수행하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 20~60℃에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, pH 2~5에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 M37 리파아제의 반응을 10℃부터 70℃까지 온도를 10℃씩 증가하면서 30분간 효소반응을 진행한 후, HPLC 분석을 수행한 결과, 10℃에서는 4-EM이 생성되지 않았으며, 온도가 높아질수록 4-EM 양이 증가하였다. 50℃에서는 DEM이 모두 4-EM으로 전환되었고 온도를 더 높이면 4-EM 양이 감소하였다(도 6 참조).

본 발명의 M37 리파아제의 반응 적정 pH는 산성이며, 일반적으로 세균 리파아제의 적정 pH가 중성 또는 알칼리성이고 곰팡이 리파아제가 산성인 것으로 보고되었다. M37 리파아제는 세균 유래의 효소이지만, 단백질 서열이 곰팡이 유래의 리파아제와 더 유사한 것으로 보고되었기 때문에 이 효소가 곰팡이 효소처럼 적정 pH가 산성인 것으로 판단된다. 한편, pH 3.0에서 반응수율이 가장 높았지만, 장시간 반응과정에서 발생기는 효소변성을 최소화하기 위해서 pH 4.0 조건에서 반응스케일-업을 실험을 진행하였다.

본 발명의 다른 양태에서, M37 리파아제를 이용한 기질 반응 실험에서, 기질(DEM) 2-6% 반응의 경우, 1시간 반응 후, 기질이 모두 분해되었고 생성된 4-EM 의 양이 기질 농도에 비례하여 증가하였다. DEM 기질 6%은 0.32 M 농도에 해당된다. 따라서 최적 조건에서 20 ml 반응시스템을 사용하면 최대 0.32 M 농도의 4-EM 을 고순도로 생산할 수 있음이 확인되었다. 기질 8%, 10%, 12% 반응의 경우, 4시간 반응 후 전환수율이 각각 98%, 88%, 81%임을 확인하였다(도 7B).

다른 관점에서, 본 발명은 또한, 디에틸말레이트(diethyl malate, DEM) 기질과 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제를 함유하는 4-에틸말레이트 제조용 조성물에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 디에틸말레이트 위치특이적 가수분해용 리파아제 탐색

디에틸말레이트(diethyl malate, DEM)분해과정에서 리파아제의 위치특이성에 따라 1-EM(1-ethyl malate) 또는 4-EM(4-ethyl malate)이 생산된다 (도 1). 이 중에서 4-EM을 이용하여 포토레지스트 물질인 2-하이드록시-γ-부틸로락톤(2-hydroxy-γ-butyrolactone, 2-HGBL)을 합성하기 때문에 1-specific lipase 활성을 갖는 효소를 스크리닝하였다.

사용한 효소로는 본 발명자들이 발굴한 4종의 리파아제인, Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제(서열번호 1), Proteus vulgaris K80(서열번호 2) 유래 리파아제, Bacillus sterarothermophilus L1 유래 리파아제(서열번호 3), Staphylococcus haemolyticus L62 유래 리파아제(서열번호 4)와 대조군으로 시판되는 CalB (Candida antarctica lipase B) 효소(Novo사) 및 Alcalase (Bacillus licheniformis protease)(시그마-알드리치사)를 사용하였다.

상기 M37, K80, L1, L62 리파아제 유전자를 포함하는 4종류의 재조합 pET22 플라스미드를 전기천공법으로 Escherichia coli BL21 (DE3) 균에 넣어 LB-ampicilin (100 μg/ml) 고체배지에서 배양하였다.

LB-ampicillin 액체배지에 형질전환된 대장균을 접종하여 37℃ 에서 진탕배양하였다. 배양액의 OD_600nm가 0.5-0.6이 되도록 균이 자랐을 때, IPTG를 1mM 농도로 첨가하여 20℃ 에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 원심 분리(4000ⅹg, 10 min)를 통해 배양액으로부터 균체를 회수하고 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 에 현탁하였다. 균체를 초음파 분쇄법으로 깬 후 원심 분리(1000ⅹg, 10 min) 하여 얻은 상등액을 리파아제 효소액으로 사용하였다.

PNPC assay를 통해 각 효소액의 리파아제 활성을 측정하였다. 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 기질혼합액은 p-nitrophenyl caprylate (aceotnitile에 10 mM 농도로 녹임)와 에탄올 및 50 mM potassium phosphate (pH 7.0) 완충용액을 10:40:950의 비율로 섞어 총 1 ml을 사용하였다. 이 혼합액에 소량의 효소액을 넣고, 충분히 섞어준 후 37℃에서 3분간 반응시키고 효소반응에 의해 생성된 p-nitrophenol의 양을 405nm 파장의 흡광도로 측정하여 정량하였다. 효소 활성 1 unit은 1분 동안 1 μmol의 p-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과, 효소활성은 M37은 21 U/ml, K80은 130 U/ml, L1은 657 U/ml, L62는 27 U/ml 인 것을 확인하였으며, L1이 가장 높은 리파아제 활성을 보였고, M37이 가장 낮은 활성을 보였다.

DEM과 높은 반응성을 가지는 리파아제를 탐색하기 위해 4종의 자체 리파아제와 2종의 상업용 효소(CalB, Alcalase)의 반응성을 비교하였다.

Potassium phosphate (50 mM, pH 7.0) 완충용액 890 μl, DEM 10 μl, 리파아제 용액 100 μl를 반응 tube (2 ml) 에 넣었다. DEM (1%, v/v)의 농도는 50 mM에 해당되었다. 반응 tube를 진탕반응기에 넣고, 30℃에서 2시간 동안 200 rpm을 회전시키면서 반응을 진행하였다. (단, L1은 50℃에서 반응을 수행하였다.)

효소반응 후, 기질과 반응 산물의 양을 정성적으로 분석하기 위해서 TLC 분석을 수행하였다. 효소 반응액에서 0.5 μl 부피를 샘플링하여 실리카겔 플레이트에 떨어뜨리고 건조시켰다. 이 과정을 3번 반복하였다. TLC 전개용매로 1-butanol/acetic acid/water (40:10:10)을 사용하였다. TLC 전개 후, 실리카겔 플레이트를 핫플레이트 위에서 5분동안 가열하였다. 건조시킨 실리카겔 플레이트를 발색시약에 2초간 담갔다가 빼서 직립상태로 건조시켰다. KMnO₄ 1 g, K₂CO₃ 6.67 g, 5% NaOH 1.6 ml을 증류수 100 mL에 넣고 균일하게 섞어준 후, 발색시약으로 사용하였다. 발색처리 30분 이후에 실리카겔 플레이트 상의 기질과 반응산물을 관찰하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, K80, M37 및 양성대조군인 Alcalase의 반응에서 DEM이 크게 감소되고 반응산물이 생성되는 것을을 확인하였다 (CalB의 경우 TLC상에서 0시간과 2시간 spot이 동일하게 나온 것으로 보아 효소 보존제의 일부임을 확인함). 그 중 M37의 경우 DEM을 모두 분해하여 반응산물이 생성된 것을 확인할 수 있었다.

리파아제 활성 측정 결과와 TLC 분석 결과를 바탕으로 M37, K80, L1 및 L62 중 M37이 가장 낮은 PNPC 분해활성을 보였음에도 불구하고 DEM과 가장 높은 반응 특이성을 보임을 알 수 있었다. 일반적으로 리파아제 효소는 에스테르 기질의 종류에 따라서 각기 다른 가수분해 활성을 갖는다. 이것은 각 기질에 대한 kinetic parameters (k _cat, K _M) 값이 다르기 때문이다. 상기 결과로부터 M37은 다른 3가지 효소와 비교할 때, PNPC에 대해 낮은 k _cat/K _M 값을 갖지만, DEM에 대해 높은 k _cat/K _M 값을 갖는 것으로 판단된다. 또한 상업용 효소인 CalB와 Alcalase의 반응과 비교하였을 때에도 M37의 DEM 분해 수율이 가장 높았기 때문에 4-EM 생성을 위한 효소로 M37을 선택하였다.

실시예 2: M37 리파아제를 이용한 DEM 가수분해 수율 확인

M37 리파아제 효소를 사용하여 DEM 분해반응을 수행한 후, HPLC을 이용해서 반응물질의 정량분석을 진행하였다.

Potassium phosphate (50 mM, pH 7.0) 완충용액 890 μl, DEM 10 μl, M37 리파아제 용액 100 μl를 반응 tube (2 ml) 에 넣은 반응액을 진탕배양기에서 4시간 반응하였다. 0시간 반응액과 4시간 반응액을 각각 샘플링한 후, HPLC를 이용하여 기질과 반응 산물을 분석하였다.

200 μl씩 샘플링된 샘플을 나일론 시린지 필터(0.2 μm)를 이용하여 여과하였다. 분석 컬럼은 Cogent Bidentate C18 column (4.6 mm ⅹ 250 mm, 5 μm particle size; microSolv Technology Corp., Eatontown, NJ, USA)을 사용하였다.컬럼에 여과액 10 μl를 injection 한 후, UV 검출기 (220 nm)를 통해 컬럼을 통과한 반응 산물과 기질을 분석하였다. HPLC 용매로 A용액 (100% water, 0.1% formic acid)과 B용액 (70% acetonitrile, 30% water, 0.1% formic acid) 을 사용하였다. Injection 이후, 0-2분(10% B, isocratic), 2-15분(10-100%B, gradient), 15-18분(100-10%B, gradient), 18-25분(10%B, isocratic) 구간마다 정해진 방법에 따라 A용액과 B용액을 컬럼에 통과시켰다. 이후, HPLC 크로마토그램으로부터 기질의 반응 전 피크면적(A _DEM,0h )과 반응 후 피크면적(A _DEM,t )을 구한 후, 다음 식에 따라 효소반응 전환율을 계산하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0시간 반응액에서는 11.6분대의 피크를 확인 할 수 있었다. 4시간 반응액에서는 0시간과 비교하여 양이 줄어든 11.6분대의 피크와 새롭게 나타난 7.6분대의 피크를 확인 할 수 있었다. 이에 따라 11.6분대의 피크는 기질인 DEM임을 알 수 있었다. 또한, DEM이 감소됨에 따라 4시간 결과에서 나타난 7.6분대의 피크는 반응산물임을 알 수 있었다. 한편, 화학적으로 합성한 1-EM과 4-EM 혼합액을 HPLC 분석을 통해 확인해본 결과 7.5분대와 7.6분대에서 용출되는 두 개의 피크를 확인하였다 (데이타 미첨부). 이중에서 7.6분대 피크가 4-EM임이 NMR 분석을 통해 나중에 확인되었다.

결론적으로 HPLC 분석을 통해서 M37 리파아제는 DEM의 1번 위치 에스테르 결합을 선택적으로 분해함으로써 4-EM 만 생성함을 알 수 있었다. 상업용 4-EM 표준물질이 없기 때문에 HPLC 결과로부터 4-EM을 정확하게 정량할 수 없었다. 이에 따라 기질 DEM 피크 면적의 감소량을 이용해서 M37 반응 수율을 계산하였다.

실시예 3: M37 리파아제에 의한 반응 산물 분리 및 반응 산물의 NMR 분석

실시예 2의 반응 산물에 대한 화학구조를 분석하기 위해서 실리카겔 컬럼을 이용하여 효소 반응액으로부터 반응 산물을 분리하였다.

Acetonitrile 용매에 silica gel (60-100 mesh, Sigma Davisil Grade 635, pore size 60Å)을 넣어 겔 슬러리를 제조하였다. 실리카겔 슬러리를 컬럼 (15 mm ⅹ 30 mm)에 채우고 acetonitrile 용매로 컬럼을 씻었다. M37 효소를 이용해서 4시간 동안 DEM 분해반응을 수행하여 얻은 효소 반응액 1 ml을 실리카겔 컬럼 상단에 가하였다. Acetonitrile 용매를 컬럼 상단에 계속 첨가하면서 컬럼으로부터 용출되는 용액을 1ml씩 25개 tube에 받았다. Tube 속 용액을 각각 TLC plate에 가하여 발색반응을 진행함으로써 4-EM 물질이 포함된 tube를 확인하였다. TLC plate 상에 발색반응을 보이는 11번부터 15번까지의 5개 tube 용액에 대해 각각 TLC 전개반응을 수행한 결과, 모든 tube 용액에서 4-EM spot을 확인할 수 있었다.

또한, HPLC 분석을 통해 tube에 들어 있는 4-EM을 정량적으로 확인하였다. 4-EM 물질이 포함된 용액들을 모두 모은 후, rotary evaporation concentration을 통해 용매를 증발시켜서 4-EM 물질을 얻었다. 5개 tube의 용액에 대해 HPLC 분석을 수행한 결과, 기질은 전혀 관찰되지 않았고 4-EM에 해당하는 7.6분대의 피크를 확인하였다.

실리카겔 크로마토그래피를 통해 분리한 물질의 화학구조를 확인하기 위해서 ¹H-NMR 분석을 수행하였다. 효소반응에 기질로 사용한 DEM에 CDCl₃ 600 μl를 넣고 ¹H-NMR (300MHz Nuclear Magnetic Resonance)를 통해 분석하였다. 또한, 실리카겔 크로마토그래피를 통해 분리한 물질도 동일한 방법으로 ¹H-NMR 분석을 수행하였다. ChemDraw 프로그램에서 구한 DEM, 1-EM, 4-EM의 NMR 피크와 실제 기기분석을 통해 얻은 NMR 피크를 비교하여 분리 물질의 화학구조를 확인하였다.

5개 tube의 용액을 모두 모은 후, rotary evaporation concentration을 통해 acetonitrile을 증발시키고 기질 DEM과 함께 ¹H-NMR 분석을 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

DEM의 NMR 결과는 다음과 같다 (도 4A). δ: (1.245 - 1.329) (m, 6H, ethyl 2CH₃), (2.742 - 2.892) (m, 2H, 3-CH₂), (4.140 - 4.312) (m, 4H, ethyl 2CH₂), (4.462 - 4.497) (m, 1H, 2-CH). 분리 정제한 반응산물의 NMR 결과는 다음과 같다 (도 4B). δ: (1.227 - 1.384) (m, 3H, ethyl CH₃), (2.773 - 2.925) (m, 2H, 3-CH₂), 3.461 (s, 3H, methyl CH₃, impurity), (4.127 - 4.199) (m, 2H, ethyl CH₂), (4.478 - 4.555) (m, 1H, 2-CH).

한편, ChemDraw 프로그램을 통해 DEM, 1-EM, 4-EM의 예상 NMR을 비교한 결과, 모든 수소의 ppm 값이 유사하였으나, 2번 탄소에 결합한 수소의 ppm값에 차이가 있었다. 즉, 4-EM은 기질 DEM 보다 큰 값을 갖고, 1-EM은 DEM 보다 작은 값을 갖는 것으로 나타났다. 우리 실험 결과에 따르면, 반응산물의 해당 수소 ppm 값(4.478 - 4.555)이 DEM의 ppm 값(4.462 - 4.497)보다 크기 때문에 분리한 물질이 4-EM인 것을 확인하였다.

실시예 4: 효소 반응기를 이용한 M37 리파아제 효소 반응 스케일-업

1 ml 부피의 효소반응을 통해 얻은 정보를 기반으로 효소반응기를 이용하여 20 ml 부피의 효소반응을 수행하였다 (도 5). 효소반응기를 제작하여 사용한 이유는 다음과 같다. 첫째, photoresist를 생산하기 위해 많은 양의 2-HGBL이 필요하다. 따라서 효소 반응기를 통해 2-HGBL의 전구물질인 4-EM을 대량 합성하고자 하였다. 둘째, 효소반응의 스케일-업이 가능한지 확인하고자 하였다. 즉, 20 ml 효소 반응액에서도 M37 효소가 4-EM을 안정적으로 생산하는지 확인하기 위해서이다. 셋째, 1 ml tube 수준의 반응에서 확인한 M37 효소의 적정 pH와 적정 온도가 스케일-업한 환경에서도 적용되는지 확인하기 위해서이다.

4-EM을 대량 생산하기 위한 효소 반응기 장치는 다음과 같다 (Fig. 5). 우선, water bath와 water jacket을 pump로 연결하여 반응기의 온도를 일정하게 유지시켜주었다. 또한, pH controller와 peristaltic pump를 이용하여 반응기의 pH를 일정하게 조절시켜주었다. 이를 위해 자동으로 4% NaOH를 첨가해주었다. 반응액을 균일하게 섞어주기 위해 교반장치를 이용했다. 효소반응기에 DEM과 M37 효소를 넣고 반응을 수행한 결과, pH가 지속적으로 내려가고 이에 따라서 NaOH 용액이 자동으로 공급되는 것을 확인하였다. 일정한 시간이 경과한 후, pH가 더 이상 내려가지 않는 시점에서 샘플링하여 HPLC 분석했을 때 기질이 모두 분해되어 4-EM으로 전환되었음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 우리가 제작한 효소 반응기가 안정적인 효소반응 환경을 제공함을 확인하였다. 기질의 반응 전 피크면적(A _DEM,0h )과 반응 후 피크면적(A _DEM,t )을 구하여 효소 반응 수율을 계산하였다.

실시예 5: 반응온도와 pH에 따른 DEM 분해반응 수율

M37 리파아제를 이용한 DEM 분해반응의 적정 온도를 확인하기 위해 1 ml 반응 시스템에서 DEM 분해의 초기 반응속도를 측정하였다.

M37의 DEM 분해반응에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 2가지 방법으로 실험을 수행하였다. 첫째, potassium phosphate (50 mM, pH 6.0) 완충용액 890 μl, DEM 10 μl, M37 용액 100 μl를 반응 tube (2 ml)에 넣었다. 반응 tube를 water bath에 넣고 10℃부터 70℃까지 온도를 10℃씩 증가하면서 효소반응을 수행하였다. 각 온도에서 30분 동안 효소반응을 진행하고 반응액에 대해 HPLC 분석을 수행하였다. 둘째, 반응기를 사용하여 20 ml 반응시스템에서 온도의 영향을 조사하였다. Potassium phosphate (100 mM, pH 6.0) 완충용액 20 ml, DEM 400 μl, M37 500 μl를 반응기에 넣고 30℃, 40℃, 50℃에서 효소반응을 수행하였다. 각 온도에서 5시간 동안 반응을 진행하면서 일정 시간 별로 반응액을 샘플링하여 HPLC 분석을 수행하였다.

10℃부터 70℃까지 온도를 10℃씩 증가하면서 30분간 효소반응을 진행한 후, HPLC 분석을 수행한 경우의 결과를 도 6A에 나타내었다. 분석 결과 10℃에서는 4-EM이 생성되지 않았으며, 온도가 높아질수록 4-EM 양이 증가하였다. 50℃에서는 DEM이 모두 4-EM으로 전환되었고 온도를 더 높이면 4-EM 양이 감소하였다.

또한, 20 ml 반응 시스템에서 온도별로 효소반응을 수행하면서 반응 시간에 따른 반응수율을 측정했다. 우리는 1 ml 반응 시스템에서의 초기반응속도를 토대로 30℃, 40℃, 50℃에서 반응을 수행하였다. 60℃에서도 초기반응속도가 높았지만 실험을 수행하지 않은 이유는 다음과 같다. 첫째, 장시간 반응을 진행했을 때 높은 온도로 인해 효소의 변성이 진행되기 때문이다. 둘째, buffer의 증발로 인해 반응액의 조성이 변하기 때문이다.

20 ml 반응 시스템에서 반응수율을 측정한 결과를 도 6B에 나타내었다. 5시간에서의 반응수율은 30℃는 99%, 40℃는 99%, 50℃는 98%로 비슷한 결과를 나타냈다. 하지만 1시간에서의 반응수율은 30℃는 13%, 40℃는 70%, 50℃는 88%로 나타났다. 따라서 50℃에서 반응이 가장 빠르게 진행됐음을 확인할 수 있었다. 이에 따라 M37 리파아제의 반응 적정온도는 초기반응속도가 가장 빠른 50℃로 확인됐다.

M37 리파아제를 이용한 DEM 분해반응의 적정 pH를 확인하기 위해 다양한 pH의 완충 용액을 사용하였다; sodium citrate (100 mM, pH 2.5-6.0), potassium phosphate (100 mM, pH 6.0-8.0). 효소반응기에 완충용액 20 ml, DEM 400 μl, M37 500 μl를 넣고 온도를 50℃로 맞추어 반응을 수행하였다. 각 pH 조건에서 4시간 동안 반응을 진행하면서 일정 시간 별로 반응액을 샘플링하여 HPLC 분석을 수행하였다. 기질의 반응 전 피크면적(A _DEM,0h )과 반응 후 피크면적(A _DEM,t )을 구하여 효소반응 수율을 계산하였다.

M37 리파아제를 이용한 DEM 분해반응의 적정 pH를 확인하기 위해서 1 ml 반응 시스템에서 DEM 분해의 초기 반응속도를 측정하였다. Sodium citrate (50 mM, pH 2.5-6.0), potassium phosphate (50 mM, pH 6.0-8.0), Tris-HCl (50 mM, pH 8.0-9.0) 를 이용하여 30분간 효소반응을 진행한 후, HPLC 분석을 수행하였다. pH 6.0와 pH 9.0의 경우, 두 종류의 완충용액에서 각각 반응을 진행한 후, 반응수율을 보정하였다. 분석결과 pH 3.0에서 pH 6.0까지 높은 반응수율을 보였으며, 이중에서도 pH 3.0에서 가장 높은 반응수율을 갖는 것으로 확인되었다 (데이타 미첨부).

또한, 20 ml 반응 시스템에서 pH 별로 효소반응을 수행하면서 반응 시간에 따른 반응수율을 측정했다. 우리는 100 mM 농도의 pH 완충용액을 사용해서 pH 2.5에서부터 pH 8.0까지 4시간동안 반응을 진행했다. 분석 결과, potassium phosphate (100 mM, pH 6.0-8.0)의 경우, pH 6은 98%, pH 7은 79%, pH 8은 32%의 반응수율을 보였다 (도 6C). 한편, sodium citrate (100 mM, pH 2.5-6.0)의 경우, pH 6은 59%로 낮은 반응수율을 보였고, pH 2.5-5.0는 99%로 모두 동일하게 높은 반응수율을 보였다 (도 6D). 이것은 예상과 달리, M37 리파아제의 반응 적정 pH가 산성임을 보여주는 결과이다. 일반적으로 세균 리파아제의 적정 pH가 중성 또는 알칼리성이고 곰팡이 리파아제가 산성인 것으로 보고되었다. M37 리파아제는 세균 유래의 효소이지만, 단백질 서열이 곰팡이 유래의 리파아제와 더 유사한 것으로 보고되었기 때문에 이 효소가 곰팡이 효소처럼 적정 pH가 산성인 것으로 판단된다. 한편, pH 3.0에서 반응수율이 가장 높았지만, 장시간 반응과정에서 발생기는 효소변성을 최소화하기 위해서 pH 4.0 조건에서 반응스케일-업을 진행하기로 결정하였다.

실시예 6: 기질 농도 증가에 따른 DEM 분해반응 수율

M37효소의 DEM 분해반응에 대한 기질 농도의 영향을 알아보기 위해서 다음과 같이 효소 반응을 진행하였다. 최적 반응조건(pH 4.0, 50℃)에서 sodium citrate (100 mM) 완충용액(20 ml)에 M37 효소 (500 μl)를 넣고, 기질 DEM을 2%부터 12%까지 2%씩 증가하면서 각각 4시간 동안 효소반응을 수행하였다. 효소반응에 의한 DEM 감소량과 4-EM 증가량을 측정하기 위해서 일정 시간 별로 반응액을 샘플링하였다. HPLC 분석 전에 물질의 농도를 낮추기 위해 sodium citrate 완충용액으로 샘플을 희석하였다. 즉, 기질 2-4%는 2배, 기질 6-8%는 4배, 기질 10-12%는 6배 만큼 희석하여 HPLC 분석을 수행하였다. 기질의 반응 전 피크면적(A _DEM,0h )과 반응 후 피크면적(A _DEM,t )을 구하여 효소반응 수율과 생성된 4-EM의 농도를 계산하였다.

그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, 기질 2-6% 반응의 경우, 1시간 반응 후, 기질이 모두 분해되었고 생성된 4-EM 의 양이 기질 농도에 비례하여 증가하였다. DEM 기질 6%은 0.32 M 농도에 해당된다. 따라서 최적 조건에서 20 ml 반응시스템을 사용하면 최대 0.32 M 농도의 4-EM 을 고순도로 생산할 수 있음이 확인되었다. 도 7B에 나타난 바와 같이, 기질 8%, 10%, 12% 반응의 경우, 4시간 반응 후 전환수율이 각각 98%, 88%, 81%임을 확인하였다.

상기 실시예를 통해 P, lipolyticum 유래의 M37 리파아제를 사용하는 경우, 기질 DEM을 위치특이적으로 분해하여 포토레지스트의 원료물질인 4-EM을 선택적으로 생산할 수 있다는 것을 처음으로 밝혔다. 온도와 pH 조절장치를 장착한 효소반응기를 사용하여 M37 효소반응의 최적 온도와 pH 조건을 찾았다. 또한, 최적 반응 조건에서 기질 농도를 증가시킴으로써 4-EM을 대량으로 생산하기 위한 효소반응 시스템을 확립하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> C1Chem Co., Ltd The Catholic University of Korea <120> Method for Preparing 4-Ethyl malate Using Lipase <130> P21-B252 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Photobacterium lipolyticum M37 <400> 1 Met Ser Tyr Thr Lys Glu Gln Leu Met Leu Ala Phe Ser Tyr Met Ser 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Ile Thr His Thr Gly Ser Ala Lys Lys Asn Ala Glu Leu 20 25 30 Ile Leu Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Lys Thr Trp Lys Pro Phe Gln 35 40 45 Glu Asp Asp Trp Glu Val Val Trp Gly Pro Ala Val Tyr Thr Met Pro 50 55 60 Phe Thr Ile Phe Asn Asp Ala Met Met Tyr Val Ile Gln Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ala Glu Gly Glu Tyr Val Ile Ala Ile Arg Gly Thr Asn Pro Val Ser 85 90 95 Ile Ser Asp Trp Leu Phe Asn Asp Phe Met Val Ser Ala Met Lys Lys 100 105 110 Trp Pro Tyr Ala Ser Val Glu Gly Arg Ile Leu Lys Ile Ser Glu Ser 115 120 125 Thr Ser Tyr Gly Leu Lys Thr Leu Gln Lys Leu Lys Pro Lys Ser His 130 135 140 Ile Pro Gly Glu Asn Lys Thr Ile Leu Gln Phe Leu Asn Glu Lys Ile 145 150 155 160 Gly Pro Glu Gly Lys Ala Lys Ile Cys Val Thr Gly His Ser Lys Gly 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Ser Thr Leu Ala Leu Trp Leu Lys Asp Ile Gln Gly 180 185 190 Val Lys Leu Ser Gln Asn Ile Asp Ile Ser Thr Ile Pro Phe Ala Gly 195 200 205 Pro Thr Ala Gly Asn Ala Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Asp Cys Leu 210 215 220 Gly Asp Gln Cys Thr Arg Ile Ala Asn Ser Leu Asp Ile Val Pro Tyr 225 230 235 240 Ala Trp Asn Thr Asn Ser Leu Lys Lys Leu Lys Ser Ile Tyr Ile Ser 245 250 255 Glu Gln Ala Ser Val Lys Pro Leu Leu Tyr Gln Arg Ala Leu Ile Arg 260 265 270 Ala Met Ile Ala Glu Thr Lys Gly Lys Lys Tyr Lys Gln Ile Lys Ala 275 280 285 Glu Thr Pro Pro Leu Glu Gly Asn Ile Asn Pro Ile Leu Ile Glu Tyr 290 295 300 Leu Val Gln Ala Ala Tyr Gln His Val Val Gly Tyr Pro Glu Leu Met 305 310 315 320 Gly Met Met Asp Asp Ile Pro Leu Thr Asp Ile Phe Glu Asp Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Leu Leu 340 <210> 2 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Proteus vulgaris K80 <400> 2 Met Ser Thr Thr Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Leu Ser Gly Phe 1 5 10 15 Asp Asp Ile Val Gly Tyr Pro Tyr Phe Tyr Gly Ile Arg Asp Ala Leu 20 25 30 Glu Lys Asp Gly His Lys Val Phe Thr Ala Ser Leu Ser Ala Phe Asn 35 40 45 Ser Asn Glu Val Arg Gly Glu Gln Leu Trp Glu Phe Val Gln Lys Val 50 55 60 Leu Lys Glu Thr Lys Ala Lys Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln 65 70 75 80 Gly Pro Leu Ala Cys Arg Tyr Val Ala Ala Lys His Ala Lys Asn Ile 85 90 95 Ala Ser Val Thr Ser Val Asn Gly Val Asn His Gly Ser Glu Ile Ala 100 105 110 Asp Leu Val Arg Arg Ile Met Arg Lys Asp Ser Val Pro Glu Tyr Ile 115 120 125 Ala Asp Ala Val Met Lys Ala Ile Gly Thr Ile Ile Ser Thr Phe Ser 130 135 140 Gly Asn Arg Gly Asn Pro Gln Asp Ala Ile Ala Ala Leu Glu Ala Leu 145 150 155 160 Thr Thr Glu Asn Val Met Glu Phe Asn Lys Lys Tyr Pro Gln Gly Leu 165 170 175 Pro Ala Ile Arg Gly Gly Glu Gly Lys Glu Val Val Asn Gly Val His 180 185 190 Tyr Tyr Ser Phe Gly Ser Tyr Ile Gln Gly Leu Ile Ala Gly Glu Lys 195 200 205 Gly Asn Leu Leu Asp Pro Thr His Ala Ala Met Arg Val Leu Ser Ala 210 215 220 Phe Phe Thr Glu Arg Glu Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Thr Ser Met 225 230 235 240 Arg Leu Gly Lys Leu Ile Lys Asp Asp Tyr Ala Glu Asp His Leu Asp 245 250 255 Met Val Asn Gln Val Ala Gly Leu Val Gly Pro Gly Glu Asp Ile Val 260 265 270 Ala Ile Tyr Thr Asn His Ala Asn Phe Leu Ala Ser Lys Lys Leu 275 280 285 <210> 3 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Bacillus sterarothermophilus L1 <400> 3 Ala Ser Pro Arg Ala Asn Asp Ala Pro Ile Val Leu Leu His Gly Phe 1 5 10 15 Thr Gly Trp Gly Arg Glu Glu Met Leu Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gly 20 25 30 Val Arg Gly Asp Ile Glu Gln Trp Leu Asn Asp Asn Gly Tyr Arg Thr 35 40 45 Tyr Thr Leu Ala Val Gly Pro Leu Ser Ser Asn Trp Asp Arg Ala Cys 50 55 60 Glu Ala Tyr Ala Gln Leu Val Gly Gly Thr Val Asp Tyr Gly Ala Ala 65 70 75 80 His Ala Ala Asn Asp Gly His Ala Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Pro Gly 85 90 95 Leu Leu Pro Glu Leu Lys Arg Gly Gly Arg Val His Ile Ile Ala His 100 105 110 Ser Gln Gly Gly Gln Thr Ala Arg Met Leu Val Ser Leu Leu Glu Asn 115 120 125 Gly Ser Gln Glu Glu Arg Glu Tyr Ala Lys Glu His Asn Val Ser Leu 130 135 140 Ser Pro Leu Phe Glu Gly Gly His Arg Phe Val Leu Ser Val Thr Thr 145 150 155 160 Ile Ala Thr Pro His Asp Gly Thr Thr Leu Val Asn Met Val Asp Phe 165 170 175 Thr Asp Arg Phe Phe Asp Leu Gln Lys Ala Val Leu Glu Ala Ala Ala 180 185 190 Val Ala Ser Asn Ala Pro Tyr Thr Ser Glu Ile Tyr Asp Phe Lys Leu 195 200 205 Asp Gln Trp Gly Leu Arg Arg Glu Pro Gly Glu Ser Phe Asp His Tyr 210 215 220 Phe Glu Arg Leu Lys Arg Ser Pro Val Trp Thr Ser Thr Asp Thr Ala 225 230 235 240 Arg Tyr Asp Leu Ser Val Pro Gly Ala Glu Thr Leu Asn Arg Trp Val 245 250 255 Lys Ala Ser Pro Asn Thr Tyr Tyr Leu Ser Phe Ser Thr Glu Arg Thr 260 265 270 Tyr Arg Gly Ala Leu Thr Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Gly Met Asn 275 280 285 Ala Phe Ser Ala Ile Val Cys Ala Pro Phe Leu Gly Ser Tyr Arg Asn 290 295 300 Ala Ala Leu Gly Ile Asp Ser His Trp Leu Gly Asn Asp Gly Ile Val 305 310 315 320 Asn Thr Ile Ser Met Asn Gly Pro Lys Arg Gly Ser Asn Asp Arg Ile 325 330 335 Val Pro Tyr Asp Gly Thr Leu Lys Lys Gly Val Trp Asn Asp Met Gly 340 345 350 Thr Tyr Lys Val Asp His Leu Glu Val Ile Gly Val Asp Pro Asn Pro 355 360 365 Ser Phe Asn Ile Arg Ala Phe Tyr Leu Arg Leu Ala Glu Gln Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Arg Pro 385 <210> 4 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Staphylococcus haemolyticus L62 <400> 4 Ala Thr Ile Lys Ser Asn Gln Tyr Lys Asn Lys Tyr Pro Val Val Leu 1 5 10 15 Val His Gly Phe Leu Gly Leu Val Gly Asp Asn Ala Pro Ala Leu Tyr 20 25 30 Pro Asn Tyr Trp Gly Gly Thr Lys Phe Pro Val Lys Lys Arg Leu Glu 35 40 45 Lys Leu Gly Tyr Asp Val His Glu Ala Ser Val Gly Ala Phe Ser Ser 50 55 60 Asn Tyr Asp Arg Ala Val Glu Leu Tyr His Tyr Ile Lys Gly Gly Lys 65 70 75 80 Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala Lys Thr Gly His Asp Arg Tyr 85 90 95 Gly Lys Phe Tyr Gln Gly Ile Met Pro Asp Trp Glu Pro Gly Lys Lys 100 105 110 Ile His Leu Ile Gly His Ser Met Gly Gly Gln Thr Ile Arg Leu Leu 115 120 125 Glu His Phe Leu Arg His Gly Asn Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Gln Lys 130 135 140 Ala His Gly Gly Glu Ile Ser Pro Leu Phe Thr Gly Gly Lys Asp Asn 145 150 155 160 Met Ile Ser Ser Ile Thr Thr Leu Ala Thr Pro His Asn Gly Thr Pro 165 170 175 Ala Ala Asp Lys Leu Gly Asn Thr Asp Phe Val Lys Val Tyr Leu Ile 180 185 190 Arg Ile Gly Arg Leu Ser Gly Asn Lys Tyr Ser His Ile Asp Leu Gly 195 200 205 Phe Ser Gln Trp Gly Phe Lys Gln Arg Pro Asp Glu Ser Tyr Ile Asp 210 215 220 Tyr Val Lys Arg Val Ala Asn Ser Lys Ile Trp Lys Thr Gln Asp Ser 225 230 235 240 Ala Val Tyr Asp Leu Thr Thr Glu Gly Ser Glu Lys Leu Asn Gln Met 245 250 255 Thr Ser Ile Asn Pro Asn Ile Val Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Leu Asp 260 265 270 Thr His Thr Gly Pro Leu Gly Asn Glu Asn Pro Asn Ile Arg Gln Phe 275 280 285 Phe Leu Phe Asp Leu Thr Ser Arg Leu Ile Gly Arg Asp Asp Asn Val 290 295 300 Asn Val Arg Lys Asn Asp Gly Ile Val Pro Val Ser Ser Ser Leu Phe 305 310 315 320 Pro Thr Asn Gln Ala Ala Lys Thr Val Gly Met Thr Ser Pro Thr Thr 325 330 335 Asp Lys Gly Ile Trp Gln Val Lys Pro Val Met Asn Gly Trp Asp His 340 345 350 Leu Asp Phe Val Gly Leu Asp Ala Thr Asp Tyr Lys Arg Ile Gly Glu 355 360 365 Glu Leu Ser Gln Phe Tyr Leu Gly Ile Ile Asn Asn Leu Ile Arg Ile 370 375 380 Glu Asp Ile Asp Gly Ile Lys His 385 390 <210> 5 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Photobacterium lipolyticum M37 <400> 5 atgtcttata caaaagaaca actcatgttg gcattcagct atatgagcta ctatggcatc 60 actcacacag gttcagcaaa aaaaaatgct gagctcatcc ttaaaaaaat gaaagaagcc 120 ttgaaaacat ggaagccttt tcaggaagat gactgggaag tcgtctgggg tcctgcggtt 180 tataccatgc ctttcacaat cttcaacgat gccatgatgt atgtcataca gaagaaaggt 240 gctgaagggg aatacgtgat agccattcgc ggcaccaatc cagtatcaat ttcagactgg 300 ctgtttaatg atttcatggt cagcgcaatg aagaagtggc cttacgcatc cgttgaaggc 360 cgcatactca aaatatccga aagtaccagc tacggactga aaaccttaca gaaattgaag 420 ccaaaatccc atatccccgg cgaaaataaa acgattctgc agttcctgaa tgaaaagata 480 ggcccagagg gtaaagcaaa aatctgtgta 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tccgaagcgt ggatcaaacg atcgaatcgt gccgtatgac 1020 gggacgttga aaaaaggagt ttggaatgat atggggacgt acaaggtcga ccatttggaa 1080 gtcatcggcg ttgacccgaa tccgtcattt aatattcgcg ccttttattt gcggcttgcc 1140 gagcaactgg cgagtttgcg gccttaa 1167 <210> 8 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase of Staphylococcus haemolyticus L62 <400> 8 gctactatca aaagtaatca atataaaaac aaatatccgg tagtgctagt acatggattt 60 ttaggtttag tgggtgacaa tgcaccagct ttgtatccta attattgggg tggtacgaaa 120 ttcccagtta agaaacgatt agagaaacta ggttatgacg tgcatgaagc gagtgtcggt 180 gcttttagta gtaactatga ccgcgctgta gaactgtatc attatattaa aggtggaaaa 240 gtagattatg gtgcagcaca tgctgctaaa acgggacatg atagatatgg taaattttat 300 caagggatta tgccagattg ggagccaggt aaaaagattc atttaatagg tcacagcatg 360 ggcggtcaaa cgatacgtct gcttgagcat tttttaagac atggtaatca agaagaaata 420 gattatcaaa aagcacatgg tggtgagatt tctcctttat ttacaggtgg gaaagataat 480 atgatttcat caatcacaac tttagcgacc ccacataatg gcacaccagc tgcagataaa 540 cttggtaata ctgattttgt 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Claims

다음 단계를 포함하는 4-에틸말레이트(4-ethyl malate, 4-EM)의 제조방법:
(a) 디에틸말레이트(diethyl malate, DEM) 기질과 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제를 반응시켜 4-에틸말레이트를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 4-에틸말레이트를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (a) 단계는 20~60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (a) 단계는 pH 2~5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
디에틸말레이트(diethyl malate, DEM) 기질과 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제를 함유하는 4-에틸말레이트 제조용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 Photobacterium lipolyticum M37 유래 리파아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.