KR102018269B1

KR102018269B1 - 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법

Info

Publication number: KR102018269B1
Application number: KR1020170152379A
Authority: KR
Inventors: 박지영; 강인수
Original assignee: 주식회사 씨원켐
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2019-09-05
Also published as: KR20190055542A

Abstract

본 발명은 생합성 경로를 통하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산으로부터 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 포름산(formic acid)으로부터 효소를 통한 생합성 경로를 통해 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.

Description

2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법{Method of Producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone}

본 발명은 생합성 경로를 통하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산으로부터 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

하이드록시부티로락톤(hydroxybutyrolactone)은 포토레지스트, 금속 표면의 코팅재료, 제약, 농약, 조미료 및 향료 등의 중간물질로 널리 활용되는 물질이다.

이 중, (S)-3-하이드록시부티로락톤은 콜레스테롤 강하약, (S)-카르니틴, 안티 HIV 프로테아제 억제약, 광범위한 항생제를 포함한 다양한 약품의 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다. (S)-3-하이드록시부티로락톤은 Hollingsworth 공정으로 제조될 수 있다(미국등록특허 5,374,773).

(R)-3-하이드록시부티로락톤 또는 (R)-3,4-디하이드록시 부티르산 감마 락톤은 다양한 약품 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다. 또한 이것은 건강식품 첨가제 및 강장제 보충물, 다양한 신경 시스템 및 대사 장애의 치료를 포함한 여러 용도에 사용되는 성분 및 천연 발생 비타민인 L-카르니틴으로 전환될 수 있다. (R)-3-하이드록시부티로락톤은 4-연결 L-헥소스를 갖는 출발물질을 사용할 필요가 있으므로 Hollingsworth 공정으로 제조될 수 없는데, 이러한 출발물질은 알려져 있지 않다. 즉 (R)-3-하이드록시부티로락톤의 상업적 가치가 있는 직접 합성루트는 없다. 이에 따라, 3-하이드록시부티로락톤의 경우 제조시 카이랄성이 치우쳐져 있다.

한편, 2번 탄소 위치에 하이드록시기(수산화기, OH)가 치환된 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 포토레지스트를 위한 수지 및 금속 표면의 코팅을 위한 재료로 이용될 수 있는 중요한 중간체이다. 특히 (R) 또는 (S) 형태의 이성질체를 가지는 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 포토레지스트, 금속 표면의 코팅재료의 중간체 뿐만 아니라 제약, 농약, 조미료 및 향료의 중간물질로도 활용된다.

그러나, 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 현재까지 화학공정을 통하여 합성될 뿐, 생합성경로를 통하여 생물학적으로 합성되는 방법은 개발되고 있지 않고있다.

이에, 본 발명자들은 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 원료로 하여, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생화학적으로 합성하는 생합성 경로를 개발하고, 상기 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들이 도입된 재조합 미생물을 이용하는 경우, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생합성할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 이용한 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 포름산(formic acid)으로부터 효소를 통한 생합성 경로를 통해 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.

도 1 ~도 6은 본 발명에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 7은 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 8은 PFL 도입 변이체, LDH 도입 변이체 및 PFL 및 LDH 도입 변이체의2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 종래 화학적인 합성방법으로만 합성되었던 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 방법으로 생합성하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 일 양태에서는 3-하이드록시프로피온산과 CoA(Coenzyme A)이 제1효소(E1)에 의하여, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)으로 전환되는 단계, 상기 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산(formic acid)을 제2효소(E2)로 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)을 얻는 단계, 상기 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 상기 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 통하여, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하였다. 여기서, 상기 제1효소는 ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)이고, 상기 제2효소는 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)이며, 상기 제3효소는 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 이고, 상기 제4효소는 파라옥소나제(paraoxonase)인 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태에서는 상기 제2효소로, 피루베이트 포메이트 라이에에즈를 사용하고, 상기 효소의 활성을 높이기 위하여, 변이체를 제조하였다.

따라서, 본 발명에서는 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는 상기 제3효소인 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)로 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 락테이트 디하이드로게나아제는 Geobacillus stearothermophilus 유래 또는 Lactococcus lactis 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생성능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 미생물은 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 유전자 또는 α-케토글루타레이트세미알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 대장균을 사용할 수 있다(대한민국 등록특허 10-1069016 참조).

도 1 및 도 2는 일 실시예에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 나타낸 도면이다.

도 1을 참조하면, 3-하이드록시프로피온산이 준비된다. 3-하이드록시프로피온산은 포도당과 같은 당류 또는 글리세롤과 같은 탄소원을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산(개미산, formic acid)을 생산할 수 있도록 한 미생물로부터 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계에 대해서는 후술한다.

우선, 3-하이드록시프로피온산에 제1효소(E1)를 접촉시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제1효소(E1)는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈로, 3-하이드록시프로피온산과 CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 인산염(phosphate)을 생성물질로 하는 효소로, 반응시 ATP를 소모한다.

일 실시예에 따르면, 제1효소(E1)는 ATP를 소모하고 ADP 및 오쏘인산염(orthophosphate, Pi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 1 참조) 또 다른 실시예에 따르면, 제1효소(E1)는 ATP를 소모하고 AMP 및 파이로인산염(pyrophosphate, PPi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 2 참조) 제1효소(E1)의 효소번호(Enzyme Commission number, EC)는 EC 6.2.1.36일 수 있다.

이후, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA에 포름산과 제2효소(E2)를 접촉시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산을 얻는 단계가 수행된다. 포름산은 포도당과 같은 당류 또는 글리세롤과 같은 탄소원을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물로부터 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이 때 제2효소(E2)는 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제로, 아세틸-CoA와 포름산을 반응물질로, 피루브산(pyruvate)과 CoA를 생성물질로 하는 효소이다. 즉 제2효소(E2)에 의해 3-하이드록시-프로피오닐-CoA의 1번 탄소에 결합되어 있던 CoA가 떨어져 나가고, 포름산이 결합하여 4-하이드록시-2-옥소부타노익산이 생성된다. 제2효소(E2)의 효소번호는 EC 2.3.1.54일 수 있다.

이후, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제3효소(E3)는 2-옥소부티레이트 탈수소효소로, NAD(P)H를 조효소로 하여 4-하이드록시-2-옥소부타노익산의 탈수소 반응을 일으켜 2,4-디하이드록시부타노익산과 NAD(P)+를 생성한다. 제3효소(E3)의 효소번호는 EC 1.1.1.27일 수 있다.

이후, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 접촉시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제4효소(E4)는 파라옥소나제(paraoxonase)로, 2,4-디하이드록시부타노익산을 고리화하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는다. 제4효소(E4)의 효소번호는 EC 3.1.8.1일 수 있다.

제1효소(E1), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제1 내지 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 3-하이드록시프로피온산에 CoA을 제1효소(E1)를 이용하여 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)로 전환하는 단계, 포름산과 CoA를 제5효소(E5)를 반응시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA와 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA(4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA)를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA을 제3효소(E3)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA을 제7효소(E7)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산을 제4효소(E4)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계를 포함한다(도 3 및 도 4).

도 4를 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산에 제1효소(E1)를 접촉시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제1효소(E1)는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈로, 3-하이드록시프로피온산과 CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 인산염(phosphate)을 생성물질로 하는 효소로, 반응시 ATP를 소모한다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계와는 별도로, 포름산에 CoA와 제5효소(E5)를 접촉시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제5효소(E5)는 포름산과 CoA를 반응물질로 하고, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하여 포르밀-CoA를 얻는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)이다.

일 실시예에 따르면, 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)는 ATP를 소모하고 ADP 및 오쏘인산염(orthophosphate, Pi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 3 참조) 또 다른 실시예에 따르면, 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)는 ATP를 소모하고 AMP 및 파이로인산염(pyrophosphate, PPi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 4 참조) 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)의 효소번호는 각각 EC 6.2.1.36, EC 6.2.1.1일 수 있다.

이후, 생성된 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제6효소(E6)는 티올레이즈(thiolase)이고, 효소번호는 EC 2.3.1.9일 수 있다.

이후, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 제3효소(E3)는 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)로, NAD(P)H를 조효소로 하여 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA의 탈수소 반응을 일으켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA와 NAD(P)+를 생성한다. 제3효소(E3)의 효소번호는 EC 1.1.1.27일 수 있다.

이후, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA에 제7효소(E7)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제7효소(E7)는 티오에스터라제(thioesterase)이고, 이에 의해 2,4-디하이드록시부타노일-CoA의 1번 탄소에 결합된 CoA가 떨어져나가고, 하이드록시기(OH)가 결합하여 2,4-디하이드록시부타노익산이 생성된다. 제7효소(E7)의 효소번호는 EC 3.1.2.X일 수 있다.

제1효소(E1), 제5효소(E5), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제1효소(E1), 제5효소(E5), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.

본 발명에서 제2효소인 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제를 이용하여 개미산 (formate)와 3-hydroxypropionate-CoA를 반응시킬 경우, 2-keto-4-hydroxy butyrate이 생성된다. 제3효소인 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 이용하여 2-keto-4-hydroxy butyrate 환원이 일어난다.

본 발명의 또다른 양태에서는 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 도 5에 나타내었다.

도 5에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법은, 3-하이드록시프로피온산과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)을 제8효소(E8)와 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산을 제2효소(E2)와 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)을 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 포함한다.

도 5를 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산과 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제8효소(E8)는 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세테이트(acetate)를 생성물질로 하는 효소이다. 제8효소(E8)의 효소번호는 EC 2.8.3.8일 수 있다.

이후, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산을 제2효소(E2)로 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산을 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 차례로 수행된다. 제2 내지 제4효소(E4)의 반응 메커니즘은 상술한 바와 같다.

제8효소(E8), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제8효소(E8), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 양태에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 도 6에 나타내었다.

도 6에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법은, 3-하이드록시프로피온산과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계, 포름산에 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 제8효소(E8)를 반응시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포르밀-CoA을 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA(4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA)를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA을 제3효소(E3)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA와 제7효소(E7)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산을 제4효소(E4)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 포함한다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

도 6을 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산에 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제8효소(E8)는 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세테이트(acetate)를 생성물질로 하는 효소이다. 제8효소(E8)의 효소번호는 EC 2.8.3.8일 수 있다.

3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계와는 별도로, 포름산에 아세틸-CoA와 제8효소(E8)를 접촉시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 즉 제8효소(E8)는 양 단계에서 모두 기능할 수 있다.

이후, 생성된 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA에 제7효소(E7)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 접촉시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 차례로 수행된다. 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)의 반응 메커니즘은 상술한 바와 같다.

제8효소(E8), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제8효소(E8), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.

도 7은 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계를 나타낸 도면이다.

상술한 실시예들 중 어느 하나에 있어서, 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계는, 포도당(glucose)의 해당과정(glycolysis)을 통해 얻을 수 있는 피루브산(pyruvic acid)에 제9효소(E9)를 접촉시켜 아세틸-CoA(acetyl-CoA)를 얻는 단계, 아세틸-CoA에 제10효소(E10)를 접촉시켜 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 얻는 단계, 말로닐-CoA에 제11효소(E11)를 접촉시켜 말론산(malonic acid)을 얻는 단계, 말론산에 제12효소(E12)를 접촉시켜 말로네이트-세미알데하이드(malonate-mialdehyde)를 얻는 단계 및 말로네이트-세미알데하이드에 제13효소(E13)를 접촉시켜 상기 3-하이드록시프로피온산을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

도 7을 참조하면, 포도당의 해당과정을 통해 얻을 수 있는 피루브산에 제9효소(E9)를 접촉시켜 아세틸-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 제9효소(E9)는 피루베이트 포르메이트 리아제(pyruvate formate lyase)로, 피루브산과 CoA를 반응물로, 아세틸-CoA와 포르메이트(formate) 또는 포름산을 생성물로 하는 효소이다. 제9효소(E9)의 효소번호는 EC 2.3.1.54일 수 있다.

이후, 아세틸-CoA에 제10효소(E10)를 접촉시켜 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 제10효소(E10)는 말로닐-CoA 카르복시-리아제(malonyl-CoA carboxy-lyase)로, 이산화탄소(CO₂)와 아세틸-CoA를 반응물로, 말로닐-CoA를 생성물로 하는 효소이다. 제10효소(E10)의 효소번호는 EC　4.1.1.9일 수 있다.

이후, 말로닐-CoA에 제11효소(E11)를 접촉시켜 말론산(malonic acid)을 얻는 단계가 수행된다. 제11효소(E11)는 말로네이트-CoA 트랜스퍼라아제(malonate-CoA transferase)로, 말로닐-CoA와 아세테이트를 반응물로, 말론산과 아세틸-CoA를 생성물로 하는 효소이다. 제11효소(E11)의 효소번호는 EC　2.8.3.3일 수 있다.

이후, 말론산에 제12효소(E12)를 접촉시켜 말로네이트-세미알데하이드(malonate-mialdehyde)를 얻는 단계가 수행된다. 제12효소(E12)는 말로네이트-세미알데하이드 탈수소효소(malonate-semialdehyde dehydrogenase)이다. 제12효소(E12)의 효소번호는 EC 1.2.1.15일 수 있다.

이후, 말로네이트-세미알데하이드에 제13효소(E13)를 접촉시켜 3-하이드록시프로피온산을 얻는 단계가 수행된다. 제13효소(E13)는 3-하이드록시프로피오네이트 탈수소효소(3-hydroxypropionate dehydrogenase)이다. 제13효소(E13)의 효소번호는 EC 1.1.1.59일 수 있다.

이렇게 3-하이드록시프로피온산을 얻은 이후에는, 상술한 합성 경로를 따라 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산(formic acid)을 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)으로 전환할 수 있는 효소로 피루베이트 포메이트 라이에에즈를 선택하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피루베이트 포메이트 라이에에즈의 273번째 아미노산과 324번째 아미노산을 변이시킨 변이체를 제조하고, 효소활성을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: His-tagged 야생형 PFL 유전자 클로닝

His6 친화성 태그를 갖는 피루베이트 포메이트 라이에에즈(PFL, pyruvate formate lyase; Gene ID : 12877393, 서열번호 2)를 클로닝하기 위하여, 대장균 DH5α 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 pET-22 (b) + 에 클로닝하기 위하여 적절한 제한효소(각각 NdeI 및 XhoI) 절단부위를 혼입시킨 프라이머 쌍 (센스, 5'-AAAACAATATGTCCGACTTAATGAAAA GTTAGC:서열번호 6와 안티센스, 5'- TTT TCT CGA GCA TAG ATT GAG TGA AGG TAC GAG -3':서열번호 7)을 이용하여, PCR을 수행하였다. PCR 산물과 pET-22(b)+ 벡터(Novagen, USA)을 상기 제한효소로 각각 처리한 후 연결시켜, pET-22(b)+_PFL을 제조하였다. DNA 시퀀싱(Macrogen, Korea)을 수행하여, pET-22(b)+/PFL벡터에 PFL 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.

실시예 2: His-tagged PFL_AE 유전자 클로닝

His6 친화성 태그를 갖는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 활성화 효소(PFL-AE; pyruvate formate lyase activating enzyme; Gene ID:917728, 서열번호 4)를 클로닝하기 위하여, 대장균 DH5α 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 pET-22 (b) + 에 클로닝하기 위하여 적절한 제한효소(각각 NdeI 및 XhoI) 절단부위를 혼입시킨 프라이머 쌍 (PFL-AE-F:5'-AAA ACA TAT GTC AGT TAT TGG TCG CAT TC:서열번호 8와 PFL-AE-R: 5'- TTT TCT CGA GGA ACA TTA CCT TAT GAC C -3':서열번호 9)을 이용하여, PCR을 수행하였다. PCR 산물과 pET-22(b)+ 벡터(Novagen, USA)을 상기 제한효소로 각각 처리한 후 연결시켜, pET-22(b)+_PFL-AE를 제조하였다. DNA 시퀀싱(Macrogen, Korea)을 수행하여, pET-22(b)+/PFL-AE벡터에 PFL-AE 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.

실시예 3: pET-22 (b)+/PFL 및 pET-22 (b)+/PFL_AE의 발현 및 정제

플라스미드 PET-22b(+)/ PFL을 대장균 BL21(DE3) 숙주 균주로 형질전환시켰다. 배양액을 LB/Amp 배지에서 OD600에서 0.7이 되도록 배양한 후, 온도를 16℃로 낮추어 1mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 PFL의 발현을 유도하였다. 추가적으로 12시간 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하였다. BL21(DE3)/PET-22b(+)/ PFL 세포를 50mM NaH₂PO₄, 10mM 이미다졸 및 250mM NaCl을 함유하는 버퍼(pH 8.0) (3 mL/g 습윤중량)에 용해시키고, 리소자임(0.5mg/mL), PMSF(1mM) 및 미량의 DNAse 및 RNase를 첨가하였다. 완만하게 교반하면서 30℃에서 1 시간 인큐베이션 한 후, 현탁액을 9000g에서 30분간 원심분리하였다. 상등액(5mL)을 50mM NaH₂PO₄, 10mM 이미다졸 및 250mM NaCl (pH 8)의 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 컬럼(1mL, Qiagen) 상에 로딩하였다. 컬럼을 50mM NaH₂PO₄, 20mM 이미다졸 및 250mM NaCl, pH 8에서 세척한 후, PFL-His6을 50mM NaH₂PO₄, 250mM 이미다졸 및 250mM NaCl, pH 8에서 용출시켰다.

PFL-AE-His6은 PET-22b(+)/ PFL_AE을 대장균 BL21(DE3) 숙주균주를 배양하여, PET-22b(+)/ PFL 숙주세포와 동일한 조건에서 배양하여, IPTG를 첨가한 후, 20℃에서 추가 배양하여 발현을 유도하고, 원심분리로 세포를 수득한 후, PFL-His6와 동일한 방법으로 PFL-AE-His6을 수득하였다.

실시예 4: PFL 활성화 및 PFL 활성분석

PFL 활성화 반응은 산소 농도가 0ppm으로 유지되는 혐기성 챔버(Coy Laboratories, CAM-12 검출기)에서 수행하였다. 반응을 시작하기 전에 모든 시약을 완전히 탈기시켰다. PFL 활성화 믹스는 150mM MOPs, pH 8.0, 10mM 소듐 옥사메이트, 10mM DTT, 100㎕ (1.26 mg / mL) PFL-AE, 200㎕ (0.63 mg/mL) PFL, 0.2mM AdoMet, 0.5mM Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ 및 50μM 5-deazariboflavin을 순서대로 첨가하여 혼합한 후, 혐기성 챔버 내에서 샘플을 500W 할로겐 램프로 조사하여 활성화를 개시 하였다. 활성화 샘플은 램프로부터 약 20cm 거리로 유지시켰으며, 45분간 조사 후, PFL 활성을 측정하였다.

PFL 활성 분석은 밀봉된 석영 큐벳에서 산소 농도가 0ppm으로 유지되는 혐기성 챔버 (Coy Laboratories, CAM-12 검출기)에서 수행되었다. PFL 활성은 포름산 탈수소효소(Candida Boidinii) 커플링된 효소을 사용하여 측정하였다. 커플링 분석 믹스로는 총 부피 1000μL에 150mM MOPs, pH 8.0, 30mM NAD +, 10mM CoA, 0.1mg BSA, 10mM sodium pyruvate, 5μL(50U / mL) 포름산 탈수소효소를 함유하는 용액을 사용하였다. PFL 활성은 커플링 분석 믹스에 활성화된 PFL 50μL을 첨가하고 340nm에서 NADH의 생성속도를 모니터링하여 분석하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

PFL 또는 그 변이체의 활성

PFL 효소/변이체	pyruvate	2-keto-4-hydroxy butyrate	비고
Wild type	25	0
A273G	20	12
Y324G	0	15
Y324A	0	13
Y324I	0	11
Y324F	0	10
Y273G:Y324A	0	0
Y324V	nd	nd	불용성
Y324S	nd	nd	불용성
Y324L	nd	nd	불용성

nd: not determined

1 U는 1분에 1μmole의 NADH를 생성하는 효소활성으로 정의함

실시예 5: His-tagged LDHs, MDHs 플라스미드의 클로닝 및 LDHs의 발현

C- 말단에서 H6로 표지된 LDH(lactate dehydrogenase) 유전자(서열번호 5)는 pUC57 벡터에 삽입되도록 GenScript (USA)에서 화학적으로 합성하였으며, LDH 유전자의 N 말단에 NdeI 제한효소 부위를 포함하도록 설계하였으며, C 말단 부위는 EcoRI 제한 효소 부위를 포함하도록 하였다.

d-LDH 유전자를 포함하는 pUC57 벡터를 대장균 DH5α세포(RBC Bioscience, 대만)를 사용하여 증폭시키고, LaboPassTM Plasmid Mini Purification Kit (Cosmo Genetech, 대한민국)을 사용하여 단리하였다. LDH 유전자 또는 MDH 유전자를 상응하는 제한효소로 절단하고 NdeI-EcoRI 처리된 pET-22b(+) 벡터(Novagen, USA)와 각각 연결하고, LDH 유전자와 MDH 유전자를 포함하는 플라스미드 pET-22b(+)-LDH/ MDH 벡터를 대장균 DH5α 세포로 형질전환시켰다. 이후, pET-22b(+)-LDH/ MDH 벡터도 발현 숙주인 E. coli BL21 (λDE3)(RBC Bioscience, 대만)으로 형질전환시켰다.

소규모 실험을 위해, 플레이트에서 배양한 pET-22b(+)-LDH/MDH를 함유한 대장균 형질전환체를 100μg / mL 암피실린을 함유하는 5mL의 LB 배지(10g 트립톤, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g)에 접종하여 하룻밤 배양한 후, 100㎍/mL 암피실린을 함유한 새로운 LB 배지(150 mL)에 접종하고 37에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. OD600이 0.6-0.8에 이르렀을 때 LDHs와 MDHs의 발현을 유도하기 위하여, 1.0 mM IPTG를 첨가한 후, 25℃, 200rpm에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 원심분리 (13,000 x g, 30 분 및 4 ℃)에 의해 수확하고, 상층액을 따라 내고, 펠릿을 제조업자의 지침에 따라 BugBuster Master Mix (Novagen, USA)에 재현탁하였다. 생성 된 현탁액을 25℃에서 30분 동안 온화하게 흔들어 주면서 배양하였다. 현탁액을 13,000 x g에서 30분 동안 4℃에서 원심 분리하여 가용성 및 불용성 분획으로 분리 하였다. LDH 또는 MDH는 H6 친화성 크로마토그래피 (Ni-NTA 컬럼, Qiagen, USA)를 사용하여 재조합 LDH 또는 MDH를 정제하였다.

재조합 LDH 및 MDH의 발현 및 순도는 SDS-PAGE 및 native PAGE 방법으로 모니터링 하였다. SDS-PAGE는 5 % 스태킹 겔 및 10 % 분리 겔을 사용하여 Laemmli 방법으로 수행하였다. 동일한 시스템에 SDS를 제외한 겔을 native PAGE에 사용하였다. 5 % 스태킹 겔 및 10 % 분리 겔을 분해겔로서 사용하였다. SDS-PAGE 및 native PAGE 후, 겔을 메탄올/아세트산/물의 45:10:45(v/v)의 혼합물 중 0.1 % Coomasie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich, USA)로 30분 염색 후 메탄올/아세트산/물의 혼합용액(10:10:80(v/v))에서 하룻밤 처리하였다. 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 Bradford 시약 (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 결정하였다.

실시예 6: 2- 케토-4-하이드록시부티레이트를 환원하는 효소활성 측정

효소활성 측정을 위한 반응혼합물은 60 mM Hepes(pH 7), 50mM 칼륨클로라이드, 5 mM MgCl₂및 0.25 mM NADH (선택적으로, 5 mM 프룩토오스 -1,6- 비스포스페이트)및 적절한 양의 정제된 LDH 효소 및 MDH 효소를 포함한다. 반응은 적절한 양의 2- 케토-4-하이드록시부티레이트를 첨가하여 시작하고, 효소 분석은 37℃에서 수행 하였다. 340nm에서 NADH의 흡광도(NADH = 6.22mM-1cm-1)를 측정하였다.

효소	2-keto-4-hydroxy butyrate 환원 효소활성 ( U/mg)
E. coli malate dehydrogenase	0.1
(L)-lactate dehydrogenase of Geobacillus stearothermophilus	50
(L)-lactate dehydrogenase of Lactococcus lactis	15

실시예 7: 본 발명의 변이체를 이용한 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 생성

실시예 3과 실시예 5의 방법으로 제작한 PFL 변이체 도입 재조합 미생물, LDH 도입 재조합 미생물과 PFL 변이체 및 LDH 도입 재조합 미생물을 50 mg/L kanamycin을 포함하는 LB 배지 150mL를 이용하여, 미세호기조건을 유지하기 위하여 180 rpm, 37 ㅀC에서 42시간 배양한 후, 배양액을 수득하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 생성여부를 HPLC로 분석하였다.

분석방법은 Agilent HPLC 1200를 이용하였으며, 컬럼은 Aminex HPX-87H column, 0.01% Formic acid aqueous solution을 용매로 이용하여 flow rate=0.4 ml/min, DAD detector with 210 nm에서 체류시간 8.2 min 피크를 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 PFL 변이체 도입 재조합 미생물, LDH 도입 재조합 미생물과 PFL 변이체 및 LDH 도입 재조합 미생물을 이용하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성 실험한 결과, PFL 변이체와 LDH 도입 재조합 미생물에서 74 mg/L 2-하이드록시-감마-부티로락톤이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> C1 Chem <120> Method of producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone <130> P17-B237 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pyruvate formate lyase <400> 1 Met Ser Glu Leu Asn Glu Lys Leu Ala Thr Ala Trp Glu Gly Phe Thr 1 5 10 15 Lys Gly Asp Trp Gln Asn Glu Val Asn Val Arg Asp Phe Ile Gln Lys 20 25 30 Asn Tyr Thr Pro Tyr Glu Gly Asp Glu Ser Phe Leu Ala Gly Ala Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Thr Thr Leu Trp Asp Lys Val Met Glu Gly Val Lys Leu 50 55 60 Glu Asn Arg Thr His Ala Pro Val Asp Phe Asp Thr Ala Val Ala Ser 65 70 75 80 Thr Ile Thr Ser His Asp Ala Gly Tyr Ile Asn Lys Gln Leu Glu Lys 85 90 95 Ile Val Gly Leu Gln Thr Glu Ala Pro Leu Lys Arg Ala Leu Ile Pro 100 105 110 Phe Gly Gly Ile Lys Met Ile Glu Gly Ser Cys Lys Ala Tyr Asn Arg 115 120 125 Glu Leu Asp Pro Met Ile Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr 130 135 140 His Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Pro Asp Ile Leu Arg Cys 145 150 155 160 Arg Lys Ser Gly Val Leu Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly 165 170 175 Arg Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Val Ala Leu Tyr Gly Ile Asp Tyr 180 185 190 Leu Met Lys Asp Lys Leu Ala Gln Phe Thr Ser Leu Gln Ala Asp Leu 195 200 205 Glu Asn Gly Val Asn Leu Glu Gln Thr Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile 210 215 220 Ala Glu Gln His Arg Ala Leu Gly Gln Met Lys Glu Met Ala Ala Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Pro Ala Thr Asn Ala Gln Glu Ala Ile 245 250 255 Gln Trp Thr Tyr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Val Lys Ser Gln Asn Gly 260 265 270 Ala Ala Met Ser Phe Gly Arg Thr Ser Thr Phe Leu Asp Val Tyr Ile 275 280 285 Glu Arg Asp Leu Lys Ala Gly Lys Ile Thr Glu Gln Glu Ala Gln Glu 290 295 300 Met Val Asp His Leu Val Met Lys Leu Arg Met Val Arg Phe Leu Arg 305 310 315 320 Thr Pro Glu Tyr Asp Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Ile Trp Ala Thr 325 330 335 Glu Ser Ile Gly Gly Met Gly Leu Asp Gly Arg Thr Leu Val Thr Lys 340 345 350 Asn Ser Phe Arg Phe Leu Asn Thr Leu Tyr Thr Met Gly Pro Ser Pro 355 360 365 Glu Pro Asn Met Thr Ile Leu Trp Ser Glu Lys Leu Pro Leu Asn Phe 370 375 380 Lys Lys Phe Ala Ala Lys Val Ser Ile Asp Thr Ser Ser Leu Gln Tyr 385 390 395 400 Glu Asn Asp Asp Leu Met Arg Pro Asp Phe Asn Asn Asp Asp Tyr Ala 405 410 415 Ile Ala Cys Cys Val Ser Pro Met Ile Val Gly Lys Gln Met Gln Phe 420 425 430 Phe Gly Ala Arg Ala Asn Leu Ala Lys Thr Met Leu Tyr Ala Ile Asn 435 440 445 Gly Gly Val Asp Glu Lys Leu Lys Met Gln Val Gly Pro Lys Ser Glu 450 455 460 Pro Ile Lys Gly Asp Val Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met Glu Arg Met 465 470 475 480 Asp His Phe Met Asp Trp Leu Ala Lys Gln Tyr Ile Thr Ala Leu Asn 485 490 495 Ile Ile His Tyr Met His Asp Lys Tyr Ser Tyr Glu Ala Ser Leu Met 500 505 510 Ala Leu His Asp Arg Asp Val Ile Arg Thr Met Ala Cys Gly Ile Ala 515 520 525 Gly Leu Ser Val Ala Ala Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys 530 535 540 Val Lys Pro Ile Arg Asp Glu Asp Gly Leu Ala Ile Asp Phe Glu Ile 545 550 555 560 Glu Gly Glu Tyr Pro Gln Phe Gly Asn Asn Asp Pro Arg Val Asp Asp 565 570 575 Leu Ala Val Asp Leu Val Glu Arg Phe Met Lys Lys Ile Gln Lys Leu 580 585 590 His Thr Tyr Arg Asp Ala Ile Pro Thr Gln Ser Val Leu Thr Ile Thr 595 600 605 Ser Asn Val Val Tyr Gly Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg 610 615 620 Arg Ala Gly Ala Pro Phe Gly Pro Gly Ala Asn Pro Met His Gly Arg 625 630 635 640 Asp Gln Lys Gly Ala Val Ala Ser Leu Thr Ser Val Ala Lys Leu Pro 645 650 655 Phe Ala Tyr Ala Lys Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Phe Ser Ile Val Pro 660 665 670 Asn Ala Leu Gly Lys Asp Asp Glu Val Arg Lys Thr Asn Leu Ala Gly 675 680 685 Leu Met Asp Gly Tyr Phe His His Glu Ala Ser Ile Glu Gly Gly Gln 690 695 700 His Leu Asn Val Asn Val Met Asn Arg Glu Met Leu Leu Asp Ala Met 705 710 715 720 Glu Asn Pro Glu Lys Tyr Pro Gln Leu Thr Ile Arg Val Ser Gly Tyr 725 730 735 Ala Val Arg Phe Asn Ser Leu Thr Lys Glu Gln Gln Gln Asp Val Ile 740 745 750 Thr Arg Thr Phe Thr Gln Ser Met 755 760 <210> 2 <211> 2280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pyruvate formate lyase <400> 2 atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttaccaa aggtgactgg 60 cagaatgaag taaacgtccg tgacttcatt cagaaaaact acactccgta cgagggtgac 120 gagtccttcc tggctggcgc tactgaagcg accaccaccc tgtgggacaa agtaatggaa 180 ggcgttaaac tggaaaaccg cactcacgcg ccagttgact ttgacaccgc tgttgcttcc 240 accatcacct ctcacgacgc tggctacatc aacaagcagc ttgagaaaat cgttggtctg 300 cagactgaag ctccgctgaa acgtgctctt atcccgttcg gtggtatcaa aatgatcgaa 360 ggttcctgca aagcgtacaa ccgcgaactg gatccgatga tcaaaaaaat cttcactgaa 420 taccgtaaaa ctcacaacca gggcgtgttc gacgtttaca ctccggacat cctgcgttgc 480 cgtaaatctg gtgttctgac cggtctgcca gatgcatatg gccgtggccg tatcatcggt 540 gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gactacctga tgaaagacaa actggcacag 600 ttcacttctc tgcaggctga tctggaaaac ggcgtaaacc tggaacagac tatccgtctg 660 cgcgaagaaa tcgctgaaca gcaccgcgct ctgggtcaga tgaaagaaat ggctgcgaaa 720 tacggctacg acatctctgg tccggctacc aacgctcagg aagctatcca gtggacttac 780 ttcggctacc tggctgctgt taagtctcag aacggtgctg caatgtcctt cggtcgtacc 840 tccaccttcc tggatgtgta catcgaacgt gacctgaaag ctggcaagat caccgaacaa 900 gaagcgcagg aaatggttga ccacctggtc atgaaactgc gtatggttcg cttcctgcgt 960 actccggaat acgatgaact gttctctggc gacccgatct gggcaaccga atctatcggt 1020 ggtatgggcc tcgacggtcg taccctggtt accaaaaaca gcttccgttt cctgaacacc 1080 ctgtacacca tgggtccgtc tccggaaccg aacatgacca ttctgtggtc tgaaaaactg 1140 ccgctgaact tcaagaaatt cgccgctaaa gtgtccatcg acacctcttc tctgcagtat 1200 gagaacgatg acctgatgcg tccggacttc aacaacgatg actacgctat tgcttgctgc 1260 gtaagcccga tgatcgttgg taaacaaatg cagttcttcg gtgcgcgtgc aaacctggcg 1320 aaaaccatgc tgtacgcaat caacggcggc gttgacgaaa aactgaaaat gcaggttggt 1380 ccgaagtctg aaccgatcaa aggcgatgtc ctgaactatg atgaagtgat ggagcgcatg 1440 gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacatcactg cactgaacat catccactac 1500 atgcacgaca agtacagcta cgaagcctct ctgatggcgc tgcacgaccg tgacgttatc 1560 cgcaccatgg cgtgtggtat cgctggtctg tccgttgctg ctgactccct gtctgcaatc 1620 aaatatgcga aagttaaacc gattcgtgac gaagacggtc tggctatcga cttcgaaatc 1680 gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaat gatccgcgtg tagatgacct ggctgttgac 1740 ctggtagaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgtga cgctatcccg 1800 actcagtctg ttctgaccat cacttctaac gttgtgtatg gtaagaaaac gggtaacacc 1860 ccagacggtc gtcgtgctgg cgcgccgttc ggaccgggtg ctaacccgat gcacggtcgt 1920 gaccagaaag gtgcagtagc ctctctgact tccgttgcta aactgccgtt tgcttacgct 1980 aaagatggta tctcctacac cttctctatc gttccgaacg cactgggtaa agacgacgaa 2040 gttcgtaaga ccaacctggc tggtctgatg gatggttact tccaccacga agcatccatc 2100 gaaggtggtc agcacctgaa cgttaacgtg atgaaccgtg aaatgctgct cgacgcgatg 2160 gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgtgtat ctggctacgc agtacgtttc 2220 aactcgctga ctaaagaaca gcagcaggac gttattactc gtaccttcac tcaatctatg 2280 2280 <210> 3 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pyruvate formate lyase activating enzyme <400> 3 Met Ser Val Ile Gly Arg Ile His Ser Phe Glu Ser Cys Gly Thr Val 1 5 10 15 Asp Gly Pro Gly Ile Arg Phe Ile Thr Phe Phe Gln Gly Cys Leu Met 20 25 30 Arg Cys Leu Tyr Cys His Asn Arg Asp Thr Trp Asp Thr His Gly Gly 35 40 45 Lys Glu Val Thr Val Glu Asp Leu Met Lys Glu Val Val Thr Tyr Arg 50 55 60 His Phe Met Asn Ala Ser Gly Gly Gly Val Thr Ala Ser Gly Gly Glu 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Ala Glu Phe Val Arg Asp Trp Phe Arg Ala Cys Lys 85 90 95 Lys Glu Gly Ile His Thr Cys Leu Asp Thr Asn Gly Phe Val Arg Arg 100 105 110 Tyr Asp Pro Val Ile Asp Glu Leu Leu Glu Val Thr Asp Leu Val Met 115 120 125 Leu Asp Leu Lys Gln Met Asn Asp Glu Ile His Gln Asn Leu Val Gly 130 135 140 Val Ser Asn His Arg Thr Leu Glu Phe Ala Lys Tyr Leu Ala Asn Lys 145 150 155 160 Asn Val Lys Val Trp Ile Arg Tyr Val Val Val Pro Gly Trp Ser Asp 165 170 175 Asp Asp Asp Ser Ala His Arg Leu Gly Glu Phe Thr Arg Asp Met Gly 180 185 190 Asn Val Glu Lys Ile Glu Leu Leu Pro Tyr His Glu Leu Gly Lys His 195 200 205 Lys Trp Val Ala Met Gly Glu Glu Tyr Lys Leu Asp Gly Val Lys Pro 210 215 220 Pro Lys Lys Glu Thr Met Glu Arg Val Lys Gly Ile Leu Glu Gln Tyr 225 230 235 240 Gly His Lys Val Met Phe 245 <210> 4 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pyruvate formate lyase activating enzyme <400> 4 atgtcagtta ttggtcgcat tcactccttt gaatcctgtg gaaccgtaga cggcccaggt 60 attcgcttta tcaccttttt ccagggctgc ctgatgcgct gcctgtattg tcataaccgc 120 gacacctggg acacgcatgg cggtaaagaa gttaccgttg aagatttgat gaaggaagtg 180 gtgacctatc gccactttat gaacgcttcc ggcggcggcg ttaccgcatc cggcggtgaa 240 gcaatcctgc aagctgagtt tgttcgtgac tggttccgcg cctgcaaaaa agaaggcatt 300 catacctgtc tggacaccaa cggttttgtt cgtcgttacg atccggtgat tgatgaactg 360 ctggaagtaa ccgacctggt aatgctcgat ctcaaacaga tgaacgacga gatccaccaa 420 aatctggttg gagtttccaa ccaccgcacg ctggagttcg ctaaatatct ggcgaacaaa 480 aatgtgaagg tgtggatccg ctacgttgtt gtcccaggct ggtctgacga tgacgattca 540 gcgcatcgcc tcggtgaatt tacccgtgat atgggcaacg ttgagaaaat cgagcttctc 600 ccctaccacg agctgggcaa acacaaatgg gtggcaatgg gtgaagagta caaactcgac 660 ggtgttaaac caccgaagaa agagaccatg gaacgcgtga aaggcattct tgagcagtac 720 ggtcataagg taatgttc 738 <210> 5 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lactate dehydrogenase <400> 5 atggctgata aacaacgtaa gaaagttatc cttgttggtg acggtgctgt aggttcatca 60 tacgcttttg cccttgttaa ccaaggaatt gcacaagaat taggtattgt tgaccttttt 120 aaagaaaaaa ctcaagggga tgcagaagac ctttctcatg ccttggcatt tacatcacct 180 aaaaagattt actctgcaga ctactctgat gcaagcgacg ctgacctcgt tgtcttgact 240 tctggtgctc cacaaaaacc aggtgaaact cgtcttgacc ttgttgaaaa aaatcttcgt 300 attactaaag atgttgtaac taaaattgtt gcttcaggat tcaaaggaat cttcctcgtt 360 gctgctaacc cagttgacat cttgacatac gcaacttgga aattctctgg tttccctaaa 420 aaccgtgttg taggttcagg tacttcactt gatactgcac gtttccgtca agcattggct 480 gaaaaagttg acgttgatgc tcgttcaatc cacgcataca tcatgggtga acacggtgac 540 tcagaatttg ctgtttggtc acacgctaac gttgctggtg ttaaattgga acaatggttc 600 caagaaaatg actaccttaa cgaagcagaa atcgttgaat tgtttgagtc tgtacgtgat 660 gcagcttact caatcatcgc taaaaaaggt gcaacattct acggtgtggc tgtagccctt 720 gctcgtatta ctaaagcaat tcttgatgat gaacatgcag tacttcctgt atcagtattc 780 caagatggac aatatggggt aagcgacttc taccttggtc aaccagctgt agttggtgct 840 gaaggtgttg ttaacccaat tcacattcca ttgaacgatg ctgaaatgca aaaaatggaa 900 gcttctggag ctcaattgaa agctatcatc gatgaagctt ttgctaaaga agaatttgct 960 tctgcagtta aaaactaa 978 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaaacaatat gtccgactta atgaaaagtt agc 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttttctcgag catagattga gtgaaggtac gag 33 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaaacatatg tcagttattg gtcgcattc 29 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttttctcgag gaacattacc ttatgacc 28

Claims

3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법;
(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제9항에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 하는 미생물.
제9항에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법;
(a) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계.
다음 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법;
(a) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계.