WO2018093135A2 - 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법 - Google Patents

2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법 Download PDF

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WO2018093135A2
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coa
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김용환
이성국
박성훈
박지영
강인수
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주식회사 씨원켐
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C53/00—Saturated compounds having only one carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or hydrogen
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    • C07D307/32—Oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone via a biosynthetic pathway, and more particularly to 2-hydroxy-gamma-butyro from 3-hydroxypropionic acid and formic acid using recombinant microorganisms. It relates to a process for producing lactones.
  • Hydroxybutyrolactone is a material widely used as an intermediate material such as photoresist, metal surface coating material, pharmaceutical, pesticide, seasoning and flavoring.
  • (S) -3-hydroxybutyrolactone is a key 4-carbon intermediate for the preparation of intermediates of various drugs, including cholesterol lowering drugs, (S) -carnitine, anti-HIV protease inhibitors, and a wide range of antibiotics.
  • (S) -3-hydroxybutyrolactone can be prepared by the Hollingsworth process (US Pat. No. 5,374,773).
  • (R) -3-hydroxybutyrolactone or (R) -3,4-dihydroxybutyric acid gamma lactone is a key 4-carbon intermediate for the manufacture of various drug intermediates. It can also be converted to L-carnitine, a naturally occurring vitamin and ingredients used in many applications including the treatment of health food additives and tonic supplements, various nervous systems and metabolic disorders.
  • (R) -3-hydroxybutyrolactone cannot be prepared by the Hollingsworth process since it is necessary to use a starting material having a 4-linked L-hexose, which is not known. That is, there is no commercially available direct synthetic route of (R) -3-hydroxybutyrolactone. Accordingly, in the case of 3-hydroxybutyrolactone, chirality is biased during manufacture.
  • 2-hydroxy-gamma-butyrolactone substituted with a hydroxyl group (hydroxyl group, OH) at the carbon position 2 is an important intermediate that can be used as a material for coating resins and metal surfaces for photoresists.
  • 2-hydroxy-gamma-butyrolactone having isomers in the form of (R) or (S) is used not only as an intermediate of photoresist, coating material of metal surface, but also as intermediate of pharmaceutical, pesticide, seasoning and flavoring. .
  • the present inventors developed a biosynthetic pathway for biochemically synthesizing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone using 3-hydroxypropionic acid and formic acid as a raw material, and a gene encoding an enzyme involved in the biosynthetic pathway.
  • 2-hydroxy-gamma-butyrolactone could be biosynthesized, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism having the ability to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone using a recombinant microorganism having the 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability.
  • the present invention is a gene encoding 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase that consumes ATP in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid generating ability .
  • a gene encoding 2-ketobutyrate formate lyase, a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase and a gene encoding paraoxonase are introduced. It provides a recombinant microorganism having a 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability.
  • the present invention also relates to a gene encoding 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase that consumes adenosine triphosphate (ATP) in a microorganism having a 3-hydroxy propionic acid producing ability, Genes encoding formyl-CoA synthetase consuming adenosine triphosphate (ATP), genes encoding thiolase, 2-oxobutyrate dehydrogenase To provide a recombinant microorganism having a 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability is introduced, a gene encoding a thioesterase and a gene encoding a paraoxonase.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the present invention also encodes a gene encoding 2-acyl-CoA transferase, 2-ketobutyrate formate lyase, in a microorganism having 3-hydroxy propionic acid generating ability.
  • the present invention also relates to a gene encoding acyl-CoA transferase, a gene encoding thiolase, and a 2-oxobutyrate dehydrogenase in a microorganism having 3-hydroxy propionic acid production ability. Recombination with 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability, in which a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase, a gene encoding thioesterase and a gene encoding paraoxonase are introduced Provide microorganisms.
  • the present invention also provides a method for preparing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone by culturing a recombinant microorganism having the 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. step; And (b) provides a method for producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone comprising the step of obtaining the prepared 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • the present invention also provides a pyruvate formate lieze variant comprising a mutation selected from the group consisting of A273G, Y324G, Y324A, Y324I, Y324I and Y324F in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also relates to a gene encoding 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase, 2-ketobutyl, which consumes ATP in a microorganism having 3-hydroxy propionic acid producing ability.
  • Genes encoding 2-ketobutyrate formate lyase and genes encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase have the ability to produce 2,4-dihydroxy-butanoic acid. Provide a recombinant microorganism.
  • the present invention also relates to a gene encoding 3-hydroxypropionyl-CoA-synthetase, adenosine triphosphate (ATP), which consumes ATP in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid producing ability.
  • Gene encoding thiolase, gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase, and thio genes encoding formyl-CoA synthetase consuming is a recombinant microorganism having a 2,4-dihydroxy-butanoic acid production ability in which a gene encoding an esterase (thioesterase) is introduced.
  • the present invention also encodes a 2-ketobutyrate formate lyase, a gene encoding an acyl-CoA transferase, in a microorganism having 3-hydroxy propionic acid generating ability.
  • the present invention provides a recombinant microorganism having a 2,4-dihydroxy-butanoic acid generating ability in which a gene and a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase are introduced.
  • the present invention also relates to a gene encoding acyl-CoA transferase, a gene encoding thiolase, and a 2-oxobutyrate dehydrogenase in a microorganism having 3-hydroxy propionic acid production ability.
  • a recombinant microorganism having a 2,4-dihydroxy-butanoic acid generating ability in which a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase and a gene encoding thioesterase are introduced.
  • the present invention also provides a method for preparing 2,4-dihydroxy-butanoic acid by (a) culturing a recombinant microorganism having the 2,4-dihydroxy-butanoic acid producing ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. Manufacturing step; And (b) to provide a method for producing 2, 4-dihydroxy-butanoic acid comprising the step of obtaining the prepared 2, 4-dihydroxy-butanoic acid.
  • the present invention also provides a method for preparing 2,4-dihydroxy-butanoic acid by (a) culturing a recombinant microorganism having the 2,4-dihydroxy-butanoic acid producing ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. Manufacturing step; And (b) reacting the prepared 2,4-dihydroxy-butanoic acid with paraoxonase to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • a method for preparing gamma-butyrolactone is provided.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a step of preparing 3-hydroxypropionic acid.
  • 3-hydroxypropionic acid and CoA (Coenzyme A) is converted to 3-hydroxy-propionyl-CoA (3-hydroxy-propionyl-CoA) by the first enzyme (E1), Reacting the 3-hydroxy-propionyl-CoA and formic acid with a second enzyme (E2) to obtain 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid (4-hydroxy-2-oxobutanoic acid).
  • the first enzyme is 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase that consumes ATP
  • the second enzyme is 2-ketobutylate formate lyase (2- ketobutyrate formate lyase)
  • the third enzyme is 2-oxobutyrate dehydrogenase
  • the fourth enzyme may be characterized as being paraoxonase.
  • the present invention provides a gene encoding 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase that consumes ATP in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid producing ability,
  • the gene encoding 2-ketobutyrate formate lyase, the gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase and the gene encoding paraoxonase were introduced.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability.
  • a variant was prepared using pyruvate formate lyase as the second enzyme, in order to increase the activity of the enzyme.
  • the 2-ketobutyrate formate lyase is a mutation selected from the group consisting of A273G, Y324G, Y324A, Y324I, Y324I and Y324F in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may be characterized in that the pyruvate formate lyase variant comprising a.
  • lactate dehydrogenase or maltose dehydrogenase may be used as the third enzyme, 2-oxobutyrate dehydrogenase.
  • the lactate dehydrogenase may be derived from Geobacillus stearothermophilus or Lactococcus lactis.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that it has the ability to generate 3-hydroxypropionic acid and formic acid, the microorganism is a gene encoding a glycerol dihydratase; Genes encoding glycerol dehydratase reactivation factor; And E. coli into which a gene encoding aldehyde dehydrogenase or a gene encoding ⁇ -ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase is introduced (see Korean Patent Registration 10-1069016).
  • 1 and 2 are diagrams showing a synthetic route of 2-hydroxy-gamma-butyrolactone according to one embodiment.
  • 3-hydroxypropionic acid is prepared.
  • 3-hydroxypropionic acid can be obtained from a microorganism capable of producing 3-hydroxypropionic acid and formic acid (formic acid) using a saccharide such as glucose or a carbon source such as glycerol, but is not limited thereto.
  • a saccharide such as glucose or a carbon source such as glycerol
  • the step of preparing 3-hydroxypropionic acid will be described later.
  • a step of obtaining 3-hydroxy-propionyl-CoA by contacting the first enzyme (E1) with 3-hydroxypropionic acid is performed.
  • the first enzyme (E1) is hydroxy-propionyl-CoA-sinterase, reacts with 3-hydroxypropionic acid and CoA, and generates 3-hydroxy-propionyl-CoA and phosphate. It is an enzyme made from substances that consumes ATP during the reaction.
  • the first enzyme (E1) may be an enzyme that consumes ATP and produces ADP and orthophosphate (Pi).
  • the first enzyme E1 may be an enzyme that consumes ATP and produces AMP and pyrophosphate (PPi).
  • the enzyme commission number (EC) of the first enzyme E1 may be EC 6.2.1.36.
  • Formic acid and the second enzyme (E2) are contacted with 3-hydroxy-propionyl-CoA to obtain 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid.
  • Formic acid may be obtained from microorganisms capable of producing 3-hydroxypropionic acid and formic acid using a sugar such as glucose or a carbon source such as glycerol, but is not limited thereto.
  • the second enzyme (E2) is 2-ketobutylate formate lyase, and is an enzyme that uses acetyl-CoA and formic acid as a reaction material and pyruvate and CoA as a product. That is, CoA which was bound to carbon number 1 of 3-hydroxypropionyl-CoA by the second enzyme (E2) is taken off, and formic acid is bonded to produce 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid.
  • the enzyme number of the second enzyme (E2) may be EC 2.3.1.54.
  • a step of obtaining 2,4-dihydroxybutanoic acid by contacting the third enzyme (E3) with 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid is performed.
  • the third enzyme (E3) is 2-oxobutyrate dehydrogenase, and NAD (P) H is used as a coenzyme to cause dehydrogenation of 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid to produce 2,4-dihydroxybuta. Produces noic acid and NAD (P) +.
  • the enzyme number of the third enzyme (E3) may be EC 1.1.1.27.
  • the step of contacting 2,4-dihydroxybutanoic acid with the fourth enzyme (E4) to obtain 2-hydroxy-gamma-butyrolactone is performed.
  • the fourth enzyme (E4) is paraoxonase, which cyclizes 2,4-dihydroxybutanoic acid to obtain 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • the enzyme number of the fourth enzyme (E4) may be EC 3.1.8.1.
  • the first enzyme (E1), the second enzyme (E2), the third enzyme (E3) and the fourth enzyme (E4) may be recombinant enzymes expressed from the recombinant gene.
  • a microorganism to express the enzyme for example, a variety of host microorganisms such as E. coli, yeast, Coryne bacteria can be used. That is, 3-hydroxypropionic acid and formic acid are introduced into the genetically engineered microorganism so that the first to fourth enzymes (E4) can be expressed to produce an enzyme reaction, thereby producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone. can do. If microorganisms capable of producing 3-hydroxypropionic acid and formic acid are used, low-cost sugars and glycerol can be used to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • the step of converting CoA into 3-hydroxypropionyl-CoA (3-hydroxypropionyl-CoA) using 3-hydroxypropionic acid using a first enzyme (E1), formic acid and CoA Reacting a fifth enzyme (E5) to obtain formyl-CoA (formyl-CoA), through a sixth enzyme (E6) using 3-hydroxypropionyl-CoA and formyl-CoA as a reactant.
  • E1 first enzyme
  • E5 formic acid
  • CoA Reacting a fifth enzyme (E5) to obtain formyl-CoA (formyl-CoA)
  • E6 3-hydroxypropionyl-CoA and formyl-CoA as a reactant.
  • Obtaining 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA reacting 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA with a third enzyme (E3) to obtain 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA.
  • a step of obtaining 3-hydroxy-propionyl-CoA is performed by contacting the prepared 3-hydroxypropionic acid with a first enzyme (E1).
  • the first enzyme (E1) is hydroxy-propionyl-CoA-sinterase, reacts with 3-hydroxypropionic acid and CoA, and generates 3-hydroxy-propionyl-CoA and phosphate. It is an enzyme made from substances that consumes ATP during the reaction.
  • the present invention provides a hydroxy-propionyl-CoA-synthetase that consumes adenosine triphosphate (ATP) in a microorganism having a 3-hydroxypropionic acid generating ability.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Gene coding gene gene coding for formyl-CoA synthetase consuming adenosine triphosphate (ATP), gene encoding thiolase, 2-oxobutyrate dehydrogenase (2-oxobutyrate) Recombinant microorganisms having a 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability in which a gene encoding dehydrogenase, a gene encoding thioesterase and a gene encoding paraoxonase are introduced will be.
  • ATP adenosine triphosphate
  • a step of obtaining formyl-CoA is performed by contacting formic acid with CoA and a fifth enzyme (E5).
  • the fifth enzyme (E5) is a formyl-CoA synthetase which uses formic acid and CoA as a reactant and consumes adenosine triphosphate (ATP) to obtain formyl-CoA.
  • the first enzyme (E1) and the fifth enzyme (E5) may be an enzyme that consumes ATP and produces ADP and orthophosphate (Pi).
  • the first enzyme (E1) and the fifth enzyme (E5) may be enzymes that consume ATP and produce AMP and pyrophosphate (PPi).
  • the enzyme numbers of the first enzyme (E1) and the fifth enzyme (E5) may be EC 6.2.1.36 and EC 6.2.1.1, respectively.
  • a step of obtaining 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA is carried out through a sixth enzyme (E6) using the produced 3-hydroxy-propionyl-CoA and formyl-CoA as reactants.
  • the sixth enzyme (E6) is thiolase (thiolase), the enzyme number may be EC 2.3.1.9.
  • the third enzyme (E3) is 2-oxobutyrate dehydrogenase, which causes dehydrogenation of 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA using NAD (P) H as a coenzyme. Produces dihydroxybutanoyl-CoA and NAD (P) +.
  • the enzyme number of the third enzyme (E3) may be EC 1.1.1.27.
  • a step of obtaining 2,4-dihydroxybutanoic acid (2,4-dihydroxy-butanoic acid) is performed by contacting 2,4-dihydroxybutanoyl-CoA with a seventh enzyme (E7).
  • the seventh enzyme (E7) is a thioesterase, whereby CoA bound to carbon 1 of 2,4-dihydroxybutanoyl-CoA is separated, and the hydroxy group (OH)
  • the 2,4-dihydroxybutanoic acid is produced by combining.
  • the enzyme number of the seventh enzyme (E7) may be EC 3.1.2.X.
  • the step of contacting 2,4-dihydroxybutanoic acid with the fourth enzyme (E4) to obtain 2-hydroxy-gamma-butyrolactone is performed.
  • the fourth enzyme (E4) is paraoxonase, which cyclizes 2,4-dihydroxybutanoic acid to obtain 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • the enzyme number of the fourth enzyme (E4) may be EC 3.1.8.1.
  • the first enzyme (E1), the fifth enzyme (E5), the sixth enzyme (E6), the third enzyme (E3), the seventh enzyme (E7) and the fourth enzyme (E4) are recombinant enzymes expressed from the recombinant gene.
  • a microorganism to express the enzyme for example, a variety of host microorganisms such as E. coli, yeast, Coryne bacteria can be used.
  • genetically engineered to express the first enzyme (E1), fifth enzyme (E5), sixth enzyme (E6), third enzyme (E3), seventh enzyme (E7) and fourth enzyme (E4) 3-hydroxypropionic acid and formic acid can be added to the microorganism from outside to produce an enzyme reaction, thereby producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone. If microorganisms capable of producing 3-hydroxypropionic acid and formic acid are used, low-cost sugars and glycerol can be used to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • 2-keto-4-hydroxy butyrate is produced.
  • 2-keto-4-hydroxy butyrate reduction occurs using the second enzyme, 2-oxobutyrate dehydrogenase.
  • 3-hydroxypropionyl is reacted with 3-hydroxypropionic acid and acetyl-CoA (acetyl-CoA) with an eighth enzyme (E8).
  • a step of obtaining 3-hydroxy-propionyl-CoA (3-hydroxy-propionyl-CoA) by reacting the prepared 3-hydroxypropionic acid with the eighth enzyme (E8) is performed.
  • the eighth enzyme (E8) is an acyl-CoA transferase, 3-hydroxy-propionyl-CoA and acetyl-CoA as a reactant, and 3-hydroxy-propionyl-CoA And enzymes that produce acetate.
  • the enzyme number of the eighth enzyme (E8) may be EC 2.8.3.8.
  • the eighth enzyme (E8), the second enzyme (E2), the third enzyme (E3) and the fourth enzyme (E4) may be recombinant enzymes expressed from the recombinant gene.
  • a microorganism to express the enzyme for example, a variety of host microorganisms such as E. coli, yeast, Coryne bacteria can be used. That is, 3-hydroxypropionic acid and formic acid are externally introduced into a microorganism genetically engineered to express the eighth enzyme (E8), the second enzyme (E2), the third enzyme (E3), and the fourth enzyme (E4).
  • the present invention in the microorganism having the ability to produce 3-hydroxy propionic acid, a gene encoding acyl-CoA transferase, 2-ketobutyrate formate lyase (2-ketobutyrate 2-hydroxy-gamma-butyrolactone incorporating a gene encoding formate lyase, a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase, and a gene encoding paraoxonase It relates to a recombinant microorganism having a producing ability.
  • 3-hydroxypropionyl is reacted with 3-hydroxypropionic acid, acetyl-CoA (acetyl-CoA), and the eighth enzyme (E8).
  • the present invention provides a gene encoding acyl-CoA transferase, a gene encoding thiolase, and 2-, in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid generating ability.
  • 2-hydroxy-gamma-butyro which incorporates a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase, a gene encoding thioesterase and a gene encoding paraoxonase It relates to a recombinant microorganism having a lactone generating ability.
  • an eighth enzyme (E8) is reacted with the prepared 3-hydroxypropionic acid to obtain 3-hydroxy-propionyl-CoA.
  • the eighth enzyme (E8) is an acyl-CoA transferase, 3-hydroxy-propionyl-CoA and acetyl-CoA as a reactant, and 3-hydroxy-propionyl-CoA And enzymes that produce acetate.
  • the enzyme number of the eighth enzyme (E8) may be EC 2.8.3.8.
  • a step of obtaining formyl-CoA is performed by contacting formic acid with acetyl-CoA and an eighth enzyme (E8). That is, the eighth enzyme (E8) can function at both stages.
  • 4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA is obtained through the sixth enzyme (E6) using 3-hydroxy-propionyl-CoA and formyl-CoA as reactants.
  • a third enzyme (E3) to obtain 2,4-dihydroxybutanoyl-CoA (2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)
  • 2,4-di Contacting hydroxybutanoyl-CoA with the seventh enzyme (E7) to obtain 2,4-dihydroxy-butanoic acid, 2,4-dihydroxybutanoic acid
  • the reaction mechanism of the sixth enzyme (E6), the third enzyme (E3), the seventh enzyme (E7), and the fourth enzyme (E4) is as described above.
  • the eighth enzyme (E8), the sixth enzyme (E6), the third enzyme (E3), the seventh enzyme (E7) and the fourth enzyme (E4) may be recombinant enzymes expressed from the recombinant gene.
  • a microorganism to express the enzyme for example, a variety of host microorganisms such as E. coli, yeast, Coryne bacteria can be used. That is, 3-hydroxy to microorganisms genetically engineered to express the eighth enzyme (E8), the sixth enzyme (E6), the third enzyme (E3), the seventh enzyme (E7), and the fourth enzyme (E4).
  • Propionic acid and formic acid may be externally introduced to produce an enzyme reaction to prepare 2-hydroxy-gamma-butyrolactone. If microorganisms capable of producing 3-hydroxypropionic acid and formic acid are used, low-cost sugars and glycerol can be used to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a step of preparing 3-hydroxypropionic acid.
  • the step of preparing 3-hydroxypropionic acid, the ninth enzyme (E9) to pyruvic acid (pyruvic acid) obtained through glycolytic glycolysis (glycolysis) Contacting to obtain acetyl-CoA (acetyl-CoA), contacting acetyl-CoA with the tenth enzyme (E10) to obtain malonyl-CoA (malonyl-CoA), and obtaining malonyl-CoA to eleventh enzyme (E11 )
  • To obtain malonic acid to contact malonic acid with the twelfth enzyme (E12) to obtain malonate-mialdehyde and to malonate-semialdehyde to the thirteenth enzyme ( Contacting E13) to obtain the 3-hydroxypropionic acid.
  • a step of obtaining acetyl-CoA by contacting a ninth enzyme (E9) to pyruvic acid, which is obtained through glycolysis, is performed.
  • the ninth enzyme (E9) is a pyruvate formate lyase, a pyruvate and CoA as a reactant, and an acetyl-CoA and formate (forme) or formic acid as products.
  • the enzyme number of the ninth enzyme (E9) may be EC 2.3.1.54.
  • a step of obtaining malonyl-CoA is performed by contacting acetyl-CoA with the tenth enzyme (E10).
  • the tenth enzyme (E10) is malonyl-CoA carboxy-lyase, an enzyme that reacts carbon dioxide (CO2) with acetyl-CoA and malonyl-CoA as a product.
  • the enzyme number of the tenth enzyme (E10) may be EC 4.1.1.9.
  • the eleventh enzyme (E11) is a malonate-CoA transferase, which is a product of malonyl-CoA and acetate as a reactant and malonic acid and acetyl-CoA as products.
  • the enzyme number of the eleventh enzyme (E11) may be EC 2.8.3.3.
  • Twelfth enzyme (E12) is malonate-semialdehyde dehydrogenase.
  • the enzyme number of the twelfth enzyme (E12) may be EC 1.2.1.15.
  • the step of contacting malonate-semialdehyde with the thirteenth enzyme (E13) to obtain 3-hydroxypropionic acid is performed.
  • Thirteenth enzyme (E13) is 3-hydroxypropionate dehydrogenase.
  • the enzyme number of the thirteenth enzyme (E13) may be EC 1.1.1.59.
  • 2-hydroxy-gamma-butyrolactone can be prepared according to the synthetic route described above.
  • the present invention provides a method for preparing a 2-hydroxy-gamma-butyrolactone by culturing a recombinant microorganism having the 2-hydroxy-gamma-butyrolactone generating ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. Preparing a; And (b) to a method for producing 2-hydroxy-gamma-butyrolactone comprising the step of obtaining the prepared 2-hydroxy-gamma-butyrolactone.
  • Pyru is an enzyme that can be converted into 4-hydroxy-2-oxobutanoic acid by reacting 3-hydroxy-propionyl-CoA with formic acid.
  • a bait formate lyase was selected, and a variant was prepared by mutating the 273th and 324th amino acids of pyruvate formate lyase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and confirmed the enzymatic activity.
  • the present invention provides a pyruvate formate lyase variant comprising a mutation selected from the group consisting of A273G, Y324G, Y324A, Y324I, Y324I and Y324F in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is about.
  • the present invention provides a gene encoding 3-hydroxy-propionyl-CoA-synthetase, which consumes ATP, in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid producing ability.
  • 2,4-dihydroxy-butanoic acid into which a gene encoding 2-ketobutyrate formate lyase, a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase has been introduced It relates to a recombinant microorganism having a producing ability.
  • the 2-ketobutyrate formate lyase is a mutation selected from the group consisting of A273G, Y324G, Y324A, Y324I, Y324I and Y324F in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may be characterized in that the pyruvate formate lyase variant comprising a.
  • the 2-oxobutyrate dehydrogenase may be characterized as lactate dehydrogenase or maltose dehydrogenase.
  • the present invention provides a gene for encoding hydroxy-propionyl-CoA-synthetase, adenosine that consumes ATP, in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid generating ability.
  • Genes encoding formyl-CoA synthetase consuming triphosphate (ATP), genes encoding thiolase, 2-oxobutyrate dehydrogenase The present invention relates to a recombinant microorganism having a 2, 4-dihydroxy-butanoic acid generating ability in which a gene and a gene encoding a thioesterase are introduced.
  • the present invention provides a gene encoding an acyl-CoA transferase, 2-ketobutyrate formate lyase, in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid generating ability.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a 2,4-dihydroxy-butanoic acid generating ability into which a gene encoding a gene) and a gene encoding a 2-oxobutyrate dehydrogenase are introduced.
  • the present invention provides a gene encoding acyl-CoA transferase, a gene encoding thiolase, and 2-oxobutyrate in a microorganism having 3-hydroxypropionic acid generating ability.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a 2,4-dihydroxy-butanoic acid producing ability in which a gene encoding 2-oxobutyrate dehydrogenase and a gene encoding thioesterase are introduced.
  • the present invention also provides a method for preparing 2,4-dihydroxy-butanoic acid by (a) culturing a recombinant microorganism having the 2,4-dihydroxy-butanoic acid producing ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. Manufacturing step; And (b) to a method for producing 2, 4-dihydroxy-butanoic acid comprising the step of obtaining the prepared 2, 4-dihydroxy-butanoic acid.
  • the present invention also provides a method for preparing 2,4-dihydroxy-butanoic acid by (a) culturing a recombinant microorganism having the 2,4-dihydroxy-butanoic acid producing ability in a 3-hydroxypropionic acid-containing medium. Manufacturing step; And (b) reacting the prepared 2,4-dihydroxy-butanoic acid with paraoxonase to produce 2-hydroxy-gamma-butyrolactone. It relates to a method for producing gamma-butyrolactone.
  • the PCR product and the pET-22 (b) + vector were each treated with the above restriction enzymes and then linked to prepare pET-22 (b) + _ PFL.
  • DNA sequencing (Macrogen, Korea) was performed to confirm that the PFL gene was successfully inserted into the pET-22 (b) + / PFL vector.
  • PFL-AE-F 5'-AAA ACA TAT GTC AGT TAT TGG TCG CAT TC: SEQ ID NO: 8 incorporating appropriate restriction enzyme (NdeI and XhoI) cleavage sites for cloning on -22 (b) +) PCR was performed using PFL-AE-R: 5'-TTT TCT CGA GGA ACA TTA CCT TAT GAC C-3 ': SEQ ID NO: 9).
  • the PCR product and the pET-22 (b) + vector were each treated with the above restriction enzymes and then linked to prepare pET-22 (b) + _ PFL-AE.
  • DNA sequencing (Macrogen, Korea) was performed to confirm that the PFL-AE gene was successfully inserted into the pET-22 (b) + / PFL-AE vector.
  • Example 3 Expression and Purification of pET-22 (b) + / PFL and pET-22 (b) + / PFL_AE
  • Plasmid PET-22b (+) / PFL was transformed with E. coli BL21 (DE3) host strain. The culture was incubated in the LB / Amp medium to OD 600 at 0.7, and then the temperature was lowered to 16 ° C. to induce the expression of PFL by adding IPTG at a final concentration of 1 mM. After an additional 12 hours of incubation, the cells were harvested by centrifugation.
  • BL21 (DE3) / PET-22b (+) / PFL cells were dissolved in buffer (pH 8.0) (3 mL / g wet weight) containing 50 mM NaH 2 PO 4, 10 mM imidazole and 250 mM NaCl, and lysozyme (0.5 mg / mL ), PMSF (1 mM) and trace amounts of DNAse and RNase were added. After incubation at 30 ° C. for 1 hour with gentle stirring, the suspension was centrifuged at 9000 g for 30 minutes.
  • PFL-AE-His6 cultured PET-22b (+) / PFL_AE in Escherichia coli BL21 (DE3) host strain, and cultured under the same conditions as PET-22b (+) / PFL host cell, followed by adding IPTG. After further incubation at ° C to induce expression, cells were obtained by centrifugation, and PFL-AE-His6 was obtained by the same method as PFL-His6.
  • PFL activation reactions were performed in an anaerobic chamber (Coy Laboratories, CAM-12 detector) with oxygen concentration maintained at 0 ppm. All reagents were completely degassed before starting the reaction.
  • PFL activated mix contains 150 mM MOPs, pH 8.0, 10 mM Sodium Oxamate, 10 mM DTT, 100 ⁇ l (1.26 mg / mL) PFL-AE, 200 ⁇ l (0.63 mg / mL) PFL, 0.2mM AdoMet, 0.5mM Fe (SO4) 2 (NH 4) 2 and 50 ⁇ M 5-deazariboflavin were added in order to mix, and then the samples were irradiated with a 500 W halogen lamp in the anaerobic chamber to initiate activation. The activation sample was kept about 20 cm away from the lamp and after 45 minutes of irradiation, PFL activity was measured.
  • PFL activity analysis was performed in an anaerobic chamber (Coy Laboratories, CAM-12 detector) with oxygen concentration maintained at 0 ppm in a sealed quartz cuvette. PFL activity was measured using formic acid dehydrogenase (Candida Boidinii) coupled enzymes.
  • a solution containing 150 mM MOPs, pH 8.0, 30 mM NAD +, 10 mM CoA, 0.1 mg BSA, 10 mM sodium pyruvate, 5 ⁇ L (50 U / mL) formic acid dehydrogenase in a total volume of 1000 ⁇ L was used.
  • PFL activity was analyzed by adding 50 ⁇ L of activated PFL to the coupling assay mix and monitoring the rate of NADH production at 340 nm, and the results are shown in Table 1.
  • PFL Enzymes / Variants pyruvate 2-keto-4-hydroxy butyrate Remarks Wild type 25 0 A273G 20 12 Y324G 0 15 Y324A 0 13 Y324I 0 11 Y324F 0 10 Y273G: Y324A 0 0 Y324V nd nd Insoluble Y324S nd nd Insoluble Y324L nd nd Insoluble
  • 1 U is defined as the enzyme activity that produces 1 ⁇ mole of NADH per minute
  • the H6-labeled lactate dehydrogenase (LDH) gene (SEQ ID NO: 5) at the C-terminus was chemically synthesized by GenScript (USA) for insertion into the pUC57 vector and designed to include an NdeI restriction site at the N terminus of the LDH gene
  • GenScript USA
  • the C-terminal site was to include the EcoRI restriction enzyme site.
  • the pUC57 vector containing the d-LDH gene was amplified using E. coli DH5 ⁇ cells (RBC Bioscience, Taiwan) and isolated using LaboPass TM Plasmid Mini Purification Kit (Cosmo Genetech, South Korea). Plasmid pET-22b (+) containing the LDH and MDH genes, respectively, digested with corresponding restriction enzymes and linked with NdeI-EcoRI treated pET-22b (+) vectors (Novagen, USA) -LDH / MDH vectors were transformed into E. coli DH5 ⁇ cells. The pET-22b (+)-LDH / MDH vector was then also transformed with E. coli BL21 ( ⁇ DE3) (RBC Bioscience, Taiwan), an expression host.
  • LB medium (10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g sodium chloride) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin was transferred to E. coli transformants containing pET-22b (+)-LDH / MDH cultured on a plate. After incubation overnight, the cells were inoculated in fresh LB medium (150 mL) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and shaken at 37 to 200 rpm. In order to induce the expression of LDHs and MDHs when the OD 600 reached 0.6-0.8, 1.0 mM IPTG was added and then incubated at 25 ° C. and 200 rpm for 4 hours.
  • SDS-PAGE was performed by Laemmli method using 5% stacking gel and 10% separation gel. In the same system, gels except SDS were used for native PAGE. 5% stacking gel and 10% separation gel were used as digestion gels.
  • the reaction mixture for enzyme activity determination was 60 mM Hepes (pH 7), 50 mM potassium chloride, 5 mM MgCl 2 and 0.25 mM NADH (optionally 5 mM fructose-1,6-bisphosphate) and appropriate amounts of purification LDH enzyme and MDH enzyme.
  • PFL mutant recombinant microorganism prepared by the method of Example 3 and Example 5, LDH introduced recombinant microorganism and PFL variant and LDH introduced recombinant microorganism using 150mL LB medium containing 50 mg / L kanamycin, After incubation at 180 rpm for 42 hours to maintain for 42 hours, a culture medium was obtained and 2-hydroxy-gamma-butyrolactone was analyzed by HPLC.
  • Agilent HPLC 1200 was used, and the column was observed using an Aminex HPX-87H column, 0.01% formic acid aqueous solution as a solvent, and a retention time of 8.2 min at a flow rate of 0.4 ml / min and a DAD detector with 210 nm. It was.
  • 2-hydroxy-gamma-butyrolactone can be prepared from 3-hydroxypropionic acid and formic acid through a biosynthetic route through enzymes.

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Abstract

본 발명은 생합성 경로를 통하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산으로부터 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 포름산(formic acid)으로부터 효소를 통한 생합성 경로를 통해 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.

Description

2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법
본 발명은 생합성 경로를 통하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산으로부터 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하이드록시부티로락톤(hydroxybutyrolactone)은 포토레지스트, 금속 표면의 코팅재료, 제약, 농약, 조미료 및 향료 등의 중간물질로 널리 활용되는 물질이다.
이 중, (S)-3-하이드록시부티로락톤은 콜레스테롤 강하약, (S)-카르니틴, 안티 HIV 프로테아제 억제약, 광범위한 항생제를 포함한 다양한 약품의 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다. (S)-3-하이드록시부티로락톤은 Hollingsworth 공정으로 제조될 수 있다(미국등록특허 5,374,773).
(R)-3-하이드록시부티로락톤 또는 (R)-3,4-디하이드록시 부티르산 감마 락톤은 다양한 약품 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다. 또한 이것은 건강식품 첨가제 및 강장제 보충물, 다양한 신경 시스템 및 대사 장애의 치료를 포함한 여러 용도에 사용되는 성분 및 천연 발생 비타민인 L-카르니틴으로 전환될 수 있다. (R)-3-하이드록시부티로락톤은 4-연결 L-헥소스를 갖는 출발물질을 사용할 필요가 있으므로 Hollingsworth 공정으로 제조될 수 없는데, 이러한 출발물질은 알려져 있지 않다. 즉 (R)-3-하이드록시부티로락톤의 상업적 가치가 있는 직접 합성루트는 없다. 이에 따라, 3-하이드록시부티로락톤의 경우 제조시 카이랄성이 치우쳐져 있다.
한편, 2번 탄소 위치에 하이드록시기(수산화기, OH)가 치환된 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 포토레지스트를 위한 수지 및 금속 표면의 코팅을 위한 재료로 이용될 수 있는 중요한 중간체이다. 특히 (R) 또는 (S) 형태의 이성질체를 가지는 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 포토레지스트, 금속 표면의 코팅재료의 중간체 뿐만 아니라 제약, 농약, 조미료 및 향료의 중간물질로도 활용된다.
그러나, 2-하이드록시-감마-부티로락톤은 현재까지 화학공정을 통하여 합성될 뿐, 생합성경로를 통하여 생물학적으로 합성되는 방법은 개발되고 있지 않고있다.
이에, 본 발명자들은 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 원료로 하여, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생화학적으로 합성하는 생합성 경로를 개발하고, 상기 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들이 도입된 재조합 미생물을 이용하는 경우, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생합성할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 이용한 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법을 제공한다.
도 1 ~도 6은 본 발명에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 7은 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 8은 PFL 도입 변이체, LDH 도입 변이체 및 PFL 및 LDH 도입 변이체의2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명에서는 종래 화학적인 합성방법으로만 합성되었던 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 방법으로 생합성하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 일 양태에서는 3-하이드록시프로피온산과 CoA(Coenzyme A)이 제1효소(E1)에 의하여, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)으로 전환되는 단계, 상기 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산(formic acid)을 제2효소(E2)로 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)을 얻는 단계, 상기 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 상기 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 통하여, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하였다. 여기서, 상기 제1효소는 ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)이고, 상기 제2효소는 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)이며, 상기 제3효소는 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 이고, 상기 제4효소는 파라옥소나제(paraoxonase)인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에서는 상기 제2효소로, 피루베이트 포메이트 라이에에즈를 사용하고, 상기 효소의 활성을 높이기 위하여, 변이체를 제조하였다.
따라서, 본 발명에서는 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는 상기 제3효소인 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)로 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 락테이트 디하이드로게나아제는 Geobacillus stearothermophilus 유래 또는 Lactococcus lactis 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생성능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 미생물은 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 유전자 또는 α-케토글루타레이트세미알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 대장균을 사용할 수 있다(대한민국 등록특허 10-1069016 참조).
도 1 및 도 2는 일 실시예에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 3-하이드록시프로피온산이 준비된다. 3-하이드록시프로피온산은 포도당과 같은 당류 또는 글리세롤과 같은 탄소원을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산(개미산, formic acid)을 생산할 수 있도록 한 미생물로부터 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계에 대해서는 후술한다.
우선, 3-하이드록시프로피온산에 제1효소(E1)를 접촉시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제1효소(E1)는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈로, 3-하이드록시프로피온산과 CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 인산염(phosphate)을 생성물질로 하는 효소로, 반응시 ATP를 소모한다.
일 실시예에 따르면, 제1효소(E1)는 ATP를 소모하고 ADP 및 오쏘인산염(orthophosphate, Pi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 1 참조) 또 다른 실시예에 따르면, 제1효소(E1)는 ATP를 소모하고 AMP 및 파이로인산염(pyrophosphate, PPi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 2 참조) 제1효소(E1)의 효소번호(Enzyme Commission number, EC)는 EC 6.2.1.36일 수 있다.
이후, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA에 포름산과 제2효소(E2)를 접촉시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산을 얻는 단계가 수행된다. 포름산은 포도당과 같은 당류 또는 글리세롤과 같은 탄소원을 이용하여 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물로부터 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이 때 제2효소(E2)는 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제로, 아세틸-CoA와 포름산을 반응물질로, 피루브산(pyruvate)과 CoA를 생성물질로 하는 효소이다. 즉 제2효소(E2)에 의해 3-하이드록시-프로피오닐-CoA의 1번 탄소에 결합되어 있던 CoA가 떨어져 나가고, 포름산이 결합하여 4-하이드록시-2-옥소부타노익산이 생성된다. 제2효소(E2)의 효소번호는 EC 2.3.1.54일 수 있다.
이후, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제3효소(E3)는 2-옥소부티레이트 탈수소효소로, NAD(P)H를 조효소로 하여 4-하이드록시-2-옥소부타노익산의 탈수소 반응을 일으켜 2,4-디하이드록시부타노익산과 NAD(P)+를 생성한다. 제3효소(E3)의 효소번호는 EC 1.1.1.27일 수 있다.
이후, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 접촉시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제4효소(E4)는 파라옥소나제(paraoxonase)로, 2,4-디하이드록시부타노익산을 고리화하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는다. 제4효소(E4)의 효소번호는 EC 3.1.8.1일 수 있다.
제1효소(E1), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제1 내지 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 3-하이드록시프로피온산에 CoA을 제1효소(E1)를 이용하여 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)로 전환하는 단계, 포름산과 CoA를 제5효소(E5)를 반응시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA와 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA(4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA)를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA을 제3효소(E3)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA을 제7효소(E7)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산을 제4효소(E4)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계를 포함한다(도 3 및 도 4).
도 4를 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산에 제1효소(E1)를 접촉시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제1효소(E1)는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈로, 3-하이드록시프로피온산과 CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 인산염(phosphate)을 생성물질로 하는 효소로, 반응시 ATP를 소모한다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계와는 별도로, 포름산에 CoA와 제5효소(E5)를 접촉시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제5효소(E5)는 포름산과 CoA를 반응물질로 하고, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하여 포르밀-CoA를 얻는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)이다.
일 실시예에 따르면, 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)는 ATP를 소모하고 ADP 및 오쏘인산염(orthophosphate, Pi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 3 참조) 또 다른 실시예에 따르면, 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)는 ATP를 소모하고 AMP 및 파이로인산염(pyrophosphate, PPi)을 생성하는 효소일 수 있다. (도 4 참조) 제1효소(E1) 및 제5효소(E5)의 효소번호는 각각 EC 6.2.1.36, EC 6.2.1.1일 수 있다.
이후, 생성된 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제6효소(E6)는 티올레이즈(thiolase)이고, 효소번호는 EC 2.3.1.9일 수 있다.
이후, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 제3효소(E3)는 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)로, NAD(P)H를 조효소로 하여 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA의 탈수소 반응을 일으켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA와 NAD(P)+를 생성한다. 제3효소(E3)의 효소번호는 EC 1.1.1.27일 수 있다.
이후, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA에 제7효소(E7)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제7효소(E7)는 티오에스터라제(thioesterase)이고, 이에 의해 2,4-디하이드록시부타노일-CoA의 1번 탄소에 결합된 CoA가 떨어져나가고, 하이드록시기(OH)가 결합하여 2,4-디하이드록시부타노익산이 생성된다. 제7효소(E7)의 효소번호는 EC 3.1.2.X일 수 있다.
이후, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 접촉시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제4효소(E4)는 파라옥소나제(paraoxonase)로, 2,4-디하이드록시부타노익산을 고리화하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는다. 제4효소(E4)의 효소번호는 EC 3.1.8.1일 수 있다.
제1효소(E1), 제5효소(E5), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제1효소(E1), 제5효소(E5), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.
본 발명에서 제2효소인 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제를 이용하여 개미산 (formate)와 3-hydroxypropionate-CoA를 반응시킬 경우, 2-keto-4-hydroxy butyrate이 생성된다. 제3효소인 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 이용하여 2-keto-4-hydroxy butyrate 환원이 일어난다.
본 발명의 또다른 양태에서는 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 도 5에 나타내었다.
도 5에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법은, 3-하이드록시프로피온산과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)을 제8효소(E8)와 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산을 제2효소(E2)와 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)을 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 포함한다.
도 5를 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산과 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제8효소(E8)는 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세테이트(acetate)를 생성물질로 하는 효소이다. 제8효소(E8)의 효소번호는 EC 2.8.3.8일 수 있다.
이후, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산을 제2효소(E2)로 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산을 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노익산에 제3효소(E3)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산을 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 차례로 수행된다. 제2 내지 제4효소(E4)의 반응 메커니즘은 상술한 바와 같다.
제8효소(E8), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제8효소(E8), 제2효소(E2), 제3효소(E3) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양태에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 합성 경로를 도 6에 나타내었다.
도 6에 따른 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법은, 3-하이드록시프로피온산과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA(3-hydroxy-propionyl-CoA)를 얻는 단계, 포름산에 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 제8효소(E8)를 반응시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포르밀-CoA을 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA(4-hydroxy-2-oxobutanoyl-CoA)를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA을 제3효소(E3)와 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA와 제7효소(E7)를 반응시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계 및 2,4-디하이드록시부타노익산을 제4효소(E4)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤(2-hydroxy-gamma-butyrolactone)을 얻는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
도 6을 참조하면, 준비된 3-하이드록시프로피온산에 제8효소(E8)를 반응시켜 3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 이 때 제8효소(E8)는 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA를 반응물질로, 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 아세테이트(acetate)를 생성물질로 하는 효소이다. 제8효소(E8)의 효소번호는 EC 2.8.3.8일 수 있다.
3-하이드록시-프로피오닐-CoA를 얻는 단계와는 별도로, 포름산에 아세틸-CoA와 제8효소(E8)를 접촉시켜 포르밀-CoA(formyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 즉 제8효소(E8)는 양 단계에서 모두 기능할 수 있다.
이후, 생성된 3-하이드록시-프로피오닐-CoA 및 포르밀-CoA를 반응물질로 하는 제6효소(E6)를 통해 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA를 얻는 단계, 4-하이드록시-2-옥소부타노일-CoA에 제3효소(E3)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노일-CoA(2,4-dihydroxy-butanoyl-CoA)를 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노일-CoA에 제7효소(E7)를 접촉시켜 2,4-디하이드록시부타노익산(2,4-dihydroxy-butanoic acid)을 얻는 단계, 2,4-디하이드록시부타노익산에 제4효소(E4)를 접촉시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 얻는 단계가 차례로 수행된다. 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)의 반응 메커니즘은 상술한 바와 같다.
제8효소(E8), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)는 재조합된 유전자로부터 발현된 재조합 효소일 수 있다. 상기 효소들을 발현할 미생물로는 예컨대 대장균, 효모, 코리네균 등 다양한 숙주미생물을 이용할 수 있다. 즉 제8효소(E8), 제6효소(E6), 제3효소(E3), 제7효소(E7) 및 제4효소(E4)가 발현될 수 있도록 유전자 조작된 미생물에, 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 외부에서 투입하여 효소 반응을 일으켜, 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 만약 3-하이드록시프로피온산과 포름산을 생산할 수 있도록 한 미생물을 사용하는 경우, 저가의 당류 및 글리세롤을 이용하여 바로 목적산물인 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 생산할 수 있다.
도 7은 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계를 나타낸 도면이다.
상술한 실시예들 중 어느 하나에 있어서, 3-하이드록시프로피온산을 준비하는 단계는, 포도당(glucose)의 해당과정(glycolysis)을 통해 얻을 수 있는 피루브산(pyruvic acid)에 제9효소(E9)를 접촉시켜 아세틸-CoA(acetyl-CoA)를 얻는 단계, 아세틸-CoA에 제10효소(E10)를 접촉시켜 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 얻는 단계, 말로닐-CoA에 제11효소(E11)를 접촉시켜 말론산(malonic acid)을 얻는 단계, 말론산에 제12효소(E12)를 접촉시켜 말로네이트-세미알데하이드(malonate-mialdehyde)를 얻는 단계 및 말로네이트-세미알데하이드에 제13효소(E13)를 접촉시켜 상기 3-하이드록시프로피온산을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
도 7을 참조하면, 포도당의 해당과정을 통해 얻을 수 있는 피루브산에 제9효소(E9)를 접촉시켜 아세틸-CoA를 얻는 단계가 수행된다. 제9효소(E9)는 피루베이트 포르메이트 리아제(pyruvate formate lyase)로, 피루브산과 CoA를 반응물로, 아세틸-CoA와 포르메이트(formate) 또는 포름산을 생성물로 하는 효소이다. 제9효소(E9)의 효소번호는 EC 2.3.1.54일 수 있다.
이후, 아세틸-CoA에 제10효소(E10)를 접촉시켜 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 얻는 단계가 수행된다. 제10효소(E10)는 말로닐-CoA 카르복시-리아제(malonyl-CoA carboxy-lyase)로, 이산화탄소(CO2)와 아세틸-CoA를 반응물로, 말로닐-CoA를 생성물로 하는 효소이다. 제10효소(E10)의 효소번호는 EC　4.1.1.9일 수 있다.
이후, 말로닐-CoA에 제11효소(E11)를 접촉시켜 말론산(malonic acid)을 얻는 단계가 수행된다. 제11효소(E11)는 말로네이트-CoA 트랜스퍼라아제(malonate-CoA transferase)로, 말로닐-CoA와 아세테이트를 반응물로, 말론산과 아세틸-CoA를 생성물로 하는 효소이다. 제11효소(E11)의 효소번호는 EC　2.8.3.3일 수 있다.
이후, 말론산에 제12효소(E12)를 접촉시켜 말로네이트-세미알데하이드(malonate-mialdehyde)를 얻는 단계가 수행된다. 제12효소(E12)는 말로네이트-세미알데하이드 탈수소효소(malonate-semialdehyde dehydrogenase)이다. 제12효소(E12)의 효소번호는 EC 1.2.1.15일 수 있다.
이후, 말로네이트-세미알데하이드에 제13효소(E13)를 접촉시켜 3-하이드록시프로피온산을 얻는 단계가 수행된다. 제13효소(E13)는 3-하이드록시프로피오네이트 탈수소효소(3-hydroxypropionate dehydrogenase)이다. 제13효소(E13)의 효소번호는 EC 1.1.1.59일 수 있다.
이렇게 3-하이드록시프로피온산을 얻은 이후에는, 상술한 합성 경로를 따라 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 3-하이드록시-프로피오닐-CoA과 포름산(formic acid)을 반응시켜 4-하이드록시-2-옥소부타노익산(4-hydroxy-2-oxobutanoic acid)으로 전환할 수 있는 효소로 피루베이트 포메이트 라이에에즈를 선택하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피루베이트 포메이트 라이에에즈의 273번째 아미노산과 324번째 아미노산을 변이시킨 변이체를 제조하고, 효소활성을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (a) 상기 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1: His-tagged 야생형 PFL 유전자 클로닝
His6 친화성 태그를 갖는 피루베이트 포메이트 라이에에즈(PFL, pyruvate formate lyase; Gene ID : 12877393, 서열번호 2)를 클로닝하기 위하여, 대장균 DH5α 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 pET-22 (b) + 에 클로닝하기 위하여 적절한 제한효소(각각 NdeI 및 XhoI) 절단부위를 혼입시킨 프라이머 쌍 (센스, 5'-AAAACAATATGTCCGACTTAATGAAAA GTTAGC:서열번호 6와 안티센스, 5'- TTT TCT CGA GCA TAG ATT GAG TGA AGG TAC GAG -3':서열번호 7)을 이용하여, PCR을 수행하였다. PCR 산물과 pET-22(b)+ 벡터(Novagen, USA)을 상기 제한효소로 각각 처리한 후 연결시켜, pET-22(b)+_PFL을 제조하였다. DNA 시퀀싱(Macrogen, Korea)을 수행하여, pET-22(b)+/PFL벡터에 PFL 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.
실시예 2: His-tagged PFL_AE 유전자 클로닝
His6 친화성 태그를 갖는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 활성화 효소(PFL-AE; pyruvate formate lyase activating enzyme; Gene ID:917728, 서열번호 4)를 클로닝하기 위하여, 대장균 DH5α 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 pET-22 (b) + 에 클로닝하기 위하여 적절한 제한효소(각각 NdeI 및 XhoI) 절단부위를 혼입시킨 프라이머 쌍 (PFL-AE-F:5'-AAA ACA TAT GTC AGT TAT TGG TCG CAT TC:서열번호 8와 PFL-AE-R: 5'- TTT TCT CGA GGA ACA TTA CCT TAT GAC C -3':서열번호 9)을 이용하여, PCR을 수행하였다. PCR 산물과 pET-22(b)+ 벡터(Novagen, USA)을 상기 제한효소로 각각 처리한 후 연결시켜, pET-22(b)+_PFL-AE를 제조하였다. DNA 시퀀싱(Macrogen, Korea)을 수행하여, pET-22(b)+/PFL-AE벡터에 PFL-AE 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.
실시예 3: pET-22 (b)+/PFL 및 pET-22 (b)+/PFL_AE의 발현 및 정제
플라스미드 PET-22b(+)/ PFL을 대장균 BL21(DE3) 숙주 균주로 형질전환시켰다. 배양액을 LB/Amp 배지에서 OD600에서 0.7이 되도록 배양한 후, 온도를 16℃로 낮추어 1mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 PFL의 발현을 유도하였다. 추가적으로 12시간 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하였다. BL21(DE3)/PET-22b(+)/ PFL 세포를 50mM NaH2PO4, 10mM 이미다졸 및 250mM NaCl을 함유하는 버퍼(pH 8.0) (3 mL/g 습윤중량)에 용해시키고, 리소자임(0.5mg/mL), PMSF(1mM) 및 미량의 DNAse 및 RNase를 첨가하였다. 완만하게 교반하면서 30℃에서 1 시간 인큐베이션 한 후, 현탁액을 9000g에서 30분간 원심분리하였다. 상등액(5mL)을 50mM NaH2PO4, 10mM 이미다졸 및 250mM NaCl (pH 8)의 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 컬럼(1mL, Qiagen) 상에 로딩하였다. 컬럼을 50mM NaH2PO4, 20mM 이미다졸 및 250mM NaCl, pH 8에서 세척한 후, PFL-His6을 50mM NaH2PO4, 250mM 이미다졸 및 250mM NaCl, pH 8에서 용출시켰다.
PFL-AE-His6은 PET-22b(+)/ PFL_AE을 대장균 BL21(DE3) 숙주균주를 배양하여, PET-22b(+)/ PFL 숙주세포와 동일한 조건에서 배양하여, IPTG를 첨가한 후, 20℃에서 추가 배양하여 발현을 유도하고, 원심분리로 세포를 수득한 후, PFL-His6와 동일한 방법으로 PFL-AE-His6을 수득하였다.
실시예 4: PFL 활성화 및 PFL 활성분석
PFL 활성화 반응은 산소 농도가 0ppm으로 유지되는 혐기성 챔버(Coy Laboratories, CAM-12 검출기)에서 수행하였다. 반응을 시작하기 전에 모든 시약을 완전히 탈기시켰다. PFL 활성화 믹스는 150mM MOPs, pH 8.0, 10mM 소듐 옥사메이트, 10mM DTT, 100㎕ (1.26 mg / mL) PFL-AE, 200㎕ (0.63 mg/mL) PFL, 0.2mM AdoMet, 0.5mM Fe(SO4)2 (NH4)2 및 50μM 5-deazariboflavin을 순서대로 첨가하여 혼합한 후, 혐기성 챔버 내에서 샘플을 500W 할로겐 램프로 조사하여 활성화를 개시 하였다. 활성화 샘플은 램프로부터 약 20cm 거리로 유지시켰으며, 45분간 조사 후, PFL 활성을 측정하였다.
PFL 활성 분석은 밀봉된 석영 큐벳에서 산소 농도가 0ppm으로 유지되는 혐기성 챔버 (Coy Laboratories, CAM-12 검출기)에서 수행되었다. PFL 활성은 포름산 탈수소효소(Candida Boidinii) 커플링된 효소을 사용하여 측정하였다. 커플링 분석 믹스로는 총 부피 1000μL에 150mM MOPs, pH 8.0, 30mM NAD+, 10mM CoA, 0.1mg BSA, 10mM sodium pyruvate, 5μL(50U / mL) 포름산 탈수소효소를 함유하는 용액을 사용하였다. PFL 활성은 커플링 분석 믹스에 활성화된 PFL 50μL을 첨가하고 340nm에서 NADH의 생성속도를 모니터링하여 분석하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
PFL 또는 그 변이체의 활성
PFL 효소/변이체 pyruvate 2-keto-4-hydroxy butyrate 비고
Wild type 25 0
A273G 20 12
Y324G 0 15
Y324A 0 13
Y324I 0 11
Y324F 0 10
Y273G:Y324A 0 0
Y324V nd nd 불용성
Y324S nd nd 불용성
Y324L nd nd 불용성
nd: not determined
1 U는 1분에 1μmole의 NADH를 생성하는 효소활성으로 정의함
실시예 5: His-tagged LDHs, MDHs 플라스미드의 클로닝 및 LDHs의 발현
C- 말단에서 H6로 표지된 LDH(lactate dehydrogenase) 유전자(서열번호 5)는 pUC57 벡터에 삽입되도록 GenScript (USA)에서 화학적으로 합성하였으며, LDH 유전자의 N 말단에 NdeI 제한효소 부위를 포함하도록 설계하였으며, C 말단 부위는 EcoRI 제한 효소 부위를 포함하도록 하였다.
d-LDH 유전자를 포함하는 pUC57 벡터를 대장균 DH5α세포(RBC Bioscience, 대만)를 사용하여 증폭시키고, LaboPassTM Plasmid Mini Purification Kit (Cosmo Genetech, 대한민국)을 사용하여 단리하였다. LDH 유전자 또는 MDH 유전자를 상응하는 제한효소로 절단하고 NdeI-EcoRI 처리된 pET-22b(+) 벡터(Novagen, USA)와 각각 연결하고, LDH 유전자와 MDH 유전자를 포함하는 플라스미드 pET-22b(+)-LDH/ MDH 벡터를 대장균 DH5α 세포로 형질전환시켰다. 이후, pET-22b(+)-LDH/ MDH 벡터도 발현 숙주인 E. coli BL21 (λDE3)(RBC Bioscience, 대만)으로 형질전환시켰다.
소규모 실험을 위해, 플레이트에서 배양한 pET-22b(+)-LDH/MDH를 함유한 대장균 형질전환체를 100μg / mL 암피실린을 함유하는 5mL의 LB 배지(10g 트립톤, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g)에 접종하여 하룻밤 배양한 후, 100㎍/mL 암피실린을 함유한 새로운 LB 배지(150 mL)에 접종하고 37에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. OD600이 0.6-0.8에 이르렀을 때 LDHs와 MDHs의 발현을 유도하기 위하여, 1.0 mM IPTG를 첨가한 후, 25℃, 200rpm에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 원심분리 (13,000 × g, 30 분 및 4 ℃)에 의해 수확하고, 상층액을 따라 내고, 펠릿을 제조업자의 지침에 따라 BugBuster Master Mix (Novagen, USA)에 재현탁하였다. 생성 된 현탁액을 25℃에서 30분 동안 온화하게 흔들어 주면서 배양하였다. 현탁액을 13,000 × g에서 30분 동안 4℃에서 원심 분리하여 가용성 및 불용성 분획으로 분리 하였다. LDH 또는 MDH는 H6 친화성 크로마토그래피 (Ni-NTA 컬럼, Qiagen, USA)를 사용하여 재조합 LDH 또는 MDH를 정제하였다.
재조합 LDH 및 MDH의 발현 및 순도는 SDS-PAGE 및 native PAGE 방법으로 모니터링 하였다. SDS-PAGE는 5 % 스태킹 겔 및 10 % 분리 겔을 사용하여 Laemmli 방법으로 수행하였다. 동일한 시스템에 SDS를 제외한 겔을 native PAGE에 사용하였다. 5 % 스태킹 겔 및 10 % 분리 겔을 분해겔로서 사용하였다. SDS-PAGE 및 native PAGE 후, 겔을 메탄올/아세트산/물의 45:10:45(v/v)의 혼합물 중 0.1 % Coomasie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich, USA)로 30분 염색 후 메탄올/아세트산/물의 혼합용액(10:10:80(v/v))에서 하룻밤 처리하였다. 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 Bradford 시약 (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 결정하였다.
실시예 6: 2- 케토-4-하이드록시부티레이트를 환원하는 효소활성 측정
효소활성 측정을 위한 반응혼합물은 60 mM Hepes(pH 7), 50mM 칼륨클로라이드, 5 mM MgCl2 및 0.25 mM NADH (선택적으로, 5 mM 프룩토오스 -1,6- 비스포스페이트)및 적절한 양의 정제된 LDH 효소 및 MDH 효소를 포함한다. 반응은 적절한 양의 2- 케토-4-하이드록시부티레이트를 첨가하여 시작하고, 효소 분석은 37℃에서 수행 하였다. 340nm에서 NADH의 흡광도(NADH = 6.22mM-1cm-1)를 측정하였다.
효소 2-keto-4-hydroxy butyrate 환원 효소활성 ( U/mg)
E. coli malate dehydrogenase 0.1
(L)-lactate dehydrogenase of Geobacillus stearothermophilus 50
(L)-lactatedehydrogenase of Lactococcus lactis 15
실시예 7: 본 발명의 변이체를 이용한 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 생성
실시예 3과 실시예 5의 방법으로 제작한 PFL 변이체 도입 재조합 미생물, LDH 도입 재조합 미생물과 PFL 변이체 및 LDH 도입 재조합 미생물을 50 mg/L kanamycin을 포함하는 LB 배지 150mL를 이용하여, 미세호기조건을 유지하기 위하여 180 rpm, 37 ℃에서 42시간 배양한 후, 배양액을 수득하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 생성여부를 HPLC로 분석하였다.
분석방법은 Agilent HPLC 1200를 이용하였으며, 컬럼은 Aminex HPX-87H column, 0.01% Formic acid aqueous solution을 용매로 이용하여 flow rate=0.4 ml/min, DAD detector with 210 nm에서 체류시간 8.2 min 피크를 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 PFL 변이체 도입 재조합 미생물, LDH 도입 재조합 미생물과 PFL 변이체 및 LDH 도입 재조합 미생물을 이용하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성 실험한 결과, PFL 변이체와 LDH 도입 재조합 미생물에서 74 mg/L 2-하이드록시-감마-부티로락톤이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 포름산(formic acid)으로부터 효소를 통한 생합성 경로를 통해 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (16)

  1. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 하는 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 미생물.
  4. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  5. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  6. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자 및 파라옥소나제(paraoxonase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2-하이드록시-감마-부티로락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  7. 다음 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법;
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 수득하는 단계.
  8. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체.
  9. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, A273G, Y324G,Y324A, Y324I, Y324I 및 Y324F로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 피루베이트 포메이트 라이에에즈 변이체인 것을 특징으로 하는 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)는 락테이트 디하이드로게나아제 또는 말토오스 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, ATP를 소모하는 하이드록시-프로피오닐-CoA-신터테이즈(3-hydroxy-propionyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 아데노신삼인산(ATP)을 소모하는 포르밀-CoA 신터테이즈(formyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 유전자 및 티오에스터레이즈(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  13. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 2-케토부틸레이트 포르메이트 리아제(2-ketobutyrate formate lyase)를 코딩하는 유전자 및 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  14. 3-하이드록시 프로피온산 생성능을 가지는 미생물에서, 아실-CoA 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 티올레이즈(thiolase)를 코딩하는 유전자, 2-옥소부티레이트 탈수소효소(2-oxobutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라제(thioesterase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 2, 4-디하이드록시-부타노익산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  15. 다음 단계를 포함하는 2, 4-디하이드록시-부타노익산의 제조방법;
    (a) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 수득하는 단계.
  16. 다음 단계를 포함하는 2-하이드록시-감마-부티로락톤의 제조방법;
    (a) 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 3-하이드록시프로피오닉 산 함유 배지에서 배양하여 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 2, 4-디하이드록시-부타노익산을 파라옥소나제(paraoxonase)와 반응시켜 2-하이드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 단계.
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