KR102602486B1 - 신형 천연 단백질 및 그의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고등 영장류 동물의 분비형 단백질 sDSS1에 관한 것이다. sDSS1 단백질은 비효소 조건 하에서 산화 단백질과 결합하여 폴리머를 형성하거나 A β 폴리펩티드와 결합하여 A β 올리고머 형성을 저하시킬 수 있고, 산화 단백질, A β 올리고머, Amylin 올리고머, 당화 단백질이 유발하는 세포독성을 차폐시킬 수 있다. 상기 단백질은 산화 단백질, 당화 단백질, A β 단백질 누적, Amylin 단백질 누적 또는 기타 유사 특징의 병원성 단백질 생성 또는 누적으로 인한 질환을 예방 및 치료하는 데 사용할 수 있다.

Description

신형 천연 단백질 및 그의 응용{NOVEL NATURAL PROTEIN AND APPLICATION THEREOF}
본 발명은 신형 천연 단백질 및 그의 응용에 관한 것으로서, 상기 단백질은 쓰레기 단백질(junk proteins)의 과도한 생성 또는 누적으로 인한 질환을 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
정상적인 생리활동 중 유기체는 대량의 쓰레기 단백질을 생산하는데, 여기에는 산화 단백질, 당화 단백질 및 일부 이상 절단 단백질(폴리펩티드) 등이 포함된다. 유기체는 쓰레기 단백질을 청소하는 다양한 메커니즘을 기반으로 정상적인 생리 기능을 유지한다. 그러나 노화 또는 질환은 쓰레기 단백질을 과도하게 생성시키거나 유기체가 쓰레기 단백질을 청소하는 능력을 저하시킬 수 있기 때문에, 이로 인하여 대량의 쓰레기 단백질이 누적될 수 있다. 쓰레기 단백질은 세포 내 또는 세포 외에 비정상적으로 누적되어 일련의 질환을 유발하는 핵심 메커니즘인데, 전형적인 질환에는 만성 신장병, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 헌팅턴병(Huntington's disease), 당뇨병 합병증 등[1-5]이 포함된다. 순환기관 중 산화 단백질, 당화 단백질 또는 기타 쓰레기 단백질의 누적은 유기체 노화의 중요한 원인 중 하나[6-7]이다.
연구를 통해 증명된 바에 따르면, 혈청 중 AOPP(advanced oxidation protein products)가 신장 세포를 손상시키는 것은 만성 신장병의 주요 발병기전이며, 혈청 중 AOPP는 췌장 β세포의 예정된 사멸을 유발할 수도 있다[3, 8]. β 아밀로이드 단백질(β-amyloid protein)에 있어서, A β 단백질이 조직 내에서 생성되고 이에 대한 청소 균형 상실로 인한 독성 단백질의 진행성 누적이라고 가정한다면, 이로 인한 시냅스 기능 이상, 뉴런 사망은 AD를 유발하는 주요 원인이다[9].
Amylin 단백질은 일부 당뇨병 환자의 췌도 조직에 이상 응집 현상을 일으킬 뿐만 아니라 뇌조직의 반점(plaque)에 존재할 수도 있으며, 당뇨병과 신경퇴행성 질환의 진전과 밀접한 관계가 있다[10, 11]. 연구 결과를 기반으로 일부 질환 모형 상에서, 예를 들어 항체[12], 폴리펩티드[13] 또는 소분자 약물[14]을 이용하여, AD 모형 동물 중 A β 응집 또는 생성을 차단하여 신경조직 반점이 형성되는 것을 감소시킴으로써 동물 인지 수준을 향상시킬 수 있다. 상기 결과는 약물을 통하여 이러한 병원성 단백질의 생성, 응집을 억제하거나 병원성 단백질 청소를 촉진시켜 병원성 단백질 누적을 줄이는 것은 상기와 같은 질환을 예방 또는 치료하는 중요한 방법이라는 것을 설명해 준다.
앞서 연구에서 밝혀진 바에 따르면, 세포 내 산화 스트레스가 발생할 때, DSS1(deleted split hand/split foot 1) 단백질을 진핵생물 가운데 고도의 보수적 소분자 단백질로 사용하면, 효소 반응과 ATP 소모 조건 하에서 공유원자가에 의해 산화 단백질 상에 수식될 수 있는데, 이러한 수식은 산화 단백질이 세포 내에서 분해되도록 매개한다[15]. DSS1 유전자는 세포사를 유도하는 것 외에도, 고발현 DSS1 단백질의 세포는 산화 스트레스 또는 항종양 약물이 유도하는 세포자멸에 대해 현저한 저항성을 나타낸다[16]. 이 결과는 DSS1 단백질이 세포의 산화 단백질 청소 과정에서 중요한 역할을 하며 세포의 생존에 상당히 핵심적인 기능을 한다는 것을 말해 준다.
상기에서 언급한 참고문헌은 이하와 같다.
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최신 연구에서 우리(발명자)는 고등 영장류(진원아목(Anthropoidea)) 게놈에 새로운 아형(subtype) DSS1 단백질이 존재하는 것을 발견했으며, 이를 분비형 DSS1 단백질(secretary DSS1, sDSS1)이라고 명명했다. sDSS1은 최초로 발견한 DSS1 단백질 아형으로, 서열과 성질 및 기능 측면에서 DSS1과 상당히 유사하다. 그러나 혈액과 뇌척수액에 분비될 수 있으며, 성질이 더욱 활발하고, 에너지를 소모하는 효소 반응 필요 없이 혈청 또는 완충액 중의 산화 단백질과 폴리머를 형성하거나, 또는 A β 단백질과 결합해 A β 올리고머의 형성을 억제할 수 있다. sDSS1 단백질을 배지에 첨가하면 산화 단백질, A β 올리고머, amylin 올리고머, 당화 단백질로 인한 세포독성을 차폐시키고 세포활력을 보호할 수 있다. 따라서, 우리는 이러한 신형 단백질 sDSS1이 산화 단백질, 당화 단백질, A β, amylin 및 기타 유사 특징의 병원성 단백질로 인한 질환을 예방 및 치료하는 데 사용될 잠재력이 있다고 판단하였다.
구체적인 기술방안은 이하와 같다.
본 발명의 신형 천연 단백질 sDSS1은 인간이 포함된 진원아목 동물에 존재하는 천연 단백질 sDSS1이며, 여기에서, 인간 유래 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1과 같다.
바람직하게는, 상기 진원아목 동물에는 침팬지, 보노보, 고릴라, 수마트라오랑우탄, 북부흰뺨긴팔원숭이, 금빛원숭이, 붉은털원숭이, 아누비스개코원숭이, 앙골라콜로부스, 검댕맹거베이, 드릴개코원숭이, 북부돼지꼬리마카크가 더 포함된다. 여기에서, 침팬지의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5와 같고, 보노보의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6과 같고, 고릴라의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7과 같고, 수마트라오랑우탄의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:8과 같고, 북부흰뺨긴팔원숭이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:9와 같고, 금빛원숭이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10과 같고, 붉은털원숭이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11과 같고, 아누비스개코원숭이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12와 같고, 앙골라콜로부스의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:13과 같고, 검댕맹거베이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:14와 같고, 드릴개코원숭이의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15와 같고, 북부돼지꼬리마카크의 천연 단백질 sDSS1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16과 같다.
바람직하게는, 상기 천연 단백질 sDSS1은 N단 58개 아미노산 서열과 C단 31개 아미노산 서열로 나누고, 여기에서, 인간 유래 sDSS1 단백질 N단의 58개 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3과 같고, 인간 유래 sDSS1 단백질 C단의 31개 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2와 같다. 두 구간 서열의 특징에 있어서, N단 58개 아미노산 서열은 3개 또는 3개 이상 연속 배열된 산성 아미노산 서열을 포함하고, 각 연속 배열된 산성 아미노산 서열 단편에 포함되는 산성 아미노산 수량은 10개보다 많지 않고, 다른 연속 배열된 산성 아미노산 서열 사이의 간격 길이는 4개 아미노산을 초과하지 않고, 각각의 이러한 간격 중에는 적어도 하나의 소수성 아미노산이 존재하고, pH값은 4.5보다 높지 않고, N단 58개 아미노산으로 구성되는 서열의 산성 아미노산 수량은 10보다 적지 않다. N단 58개 아미노산 서열을 기초로 하는 제58번째 아미노산 이후의 C단 아미노산 서열은 전체적으로 소수성에 편향되고, C단 31개 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열 중의 소수성 아미노산 수량은 10개보다 적지 않다.
아미노산 분류의 범위는 이하와 같다.
소수성 아미노산: 알라닌(alanine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 발린(valine), 시스테인(cysteine), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine);
중성 아미노산: 트레오닌(threonine), 글리신(glycine), 세린(serine), 히스티딘(histidine), 글루타민(glutamine);
산성 아미노산: 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 프롤린(proline), 아스파라긴(asparagine).
염기성 아미노산: 아르지닌(arginine), 라이신(lysine).
바람직하게는, 진원아목 동물의 sDSS1 단백질에 포함되는 C단 아미노산의 일반식은 이하와 같다.
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31;
X1은 중성 아미노산이고, X2는 소수성 아미노산이고, X3와 X4는 각각 소수성 아미노산이고, X5는 소수성 아미노산이고, X6은 소수성 아미노산이고, X7은 소수성 아미노산이고, X8은 소수성 아미노산이고, X9는 소수성 아미노산이고, X10은 산성 아미노산이고, X11은 중성 아미노산이고, X12는 소수성 아미노산이고, X13은 소수성 아미노산이고, X14는 중성 아미노산이고, X15는 소수성 아미노산이고, X16은 소수성 아미노산이고, X17은 소수성 아미노산이고, X18은 소수성 아미노산이고, X19는 염기성 아미노산이고, X20은 산성 아미노산이고, X21은 염기성 아미노산이고, X22는 중성 아미노산이고, X23은 염기성 아미노산이고, X24는 소수성 아미노산이고, X25는 소수성 아미노산이고, X26은 중성 아미노산이고, X27은 소수성 아미노산이고, X28은 소수성 아미노산이고, X29는 소수성 아미노산이고, X30은 소수성 아미노산이고, X31은 소수성 아미노산이다.
C단 31개 아미노산 서열 중에는 40% 또는 40% 이상의 상동성 아미노산 서열이 있고, 상기 서열과 인간 유래 sDSS1 단백질 C단의 아미노산 서열은 폴리펩티드 중에서의 성질과 발휘하는 기능이 같거나 유사하다.
일종의 폴리펩티드 서열에 있어서, 상기 방안의 신형 천연 단백질 sDSS1의 N단 58개 아미노산 서열과 C단 31개 아미노산 서열을 기초로 구축한 폴리펩티드 서열은,
1) 상기 폴리펩티드 서열의 N단 58개 아미노산으로 구성되는 서열은 40% 또는 40% 이상의 유사성이 있고, C단 아미노산 서열은 40% 또는 40% 이상의 유사성이 있는 단백질이 있고, 상기 단백질은 인간 유래 천연 단백질의 성질과 기능이 같거나 유사하고; 또는
2) 인간 유래 천연 단백질 중의 폴리펩티드 서열의 N단 58개 아미노산으로 구성되는 서열, 또는 40% 또는 40% 이상의 유사 서열을 기초로, C단 또는 N단에 다른 아미노산 서열을 융합하고, 융합에 사용되는 아미노산 서열은 인간 유래 천연 단백질 중의 C단 31개 아미노산 서열과 같거나 유사한 성질을 구현하고, 같거나 유사한 기능을 발휘할 수 있으며, 수식 후의 단백질은 인간 유래 천연 단백질 sDSS1과 같거나 유사한 기능을 발휘할 수 있는 단백질이고; 또는
3) 상기 방안의 신형 천연 단백질 sDSS1 중의 C단 폴리펩티드 서열을 이용하여 다른 천연 또는 비(非)천연 폴리펩티드 서열을 융합하여 수득한 단백질이다.
일종의 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 방안의 신형 천연 단백질 sDSS1의 완전 서열 또는 일부 서열과 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 상기 단백질 자체, 캐리어 단백질, 항체 또는 기타 임의 아미노산 서열과 연결되어 형성되는 단백질 복합체이다.
일종의 복합체에 있어서, 상기 복합체는 상기 방안의 신형 천연 단백질 sDSS1의 완전 서열 또는 일부 서열, 상기 방안의 폴리펩티드 서열, 상기 방안의 융합 단백질 중의 일부 또는 전체 복합을 포함한다.
바람직하게는, 상기 복합체는 폴리펩티드/단백질과 약학적으로 응용 가능한 약물 캐리어를 연결하여 형성하는 복합체이다.
바람직하게는, 상기 캐리어는 마이크로스피어/캡슐, 리포솜, 마이크로에멀젼, 나노입자, 자성입자와 겔 중의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
일종의 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있다.
바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열과 RNA 서열을 포함한다.
일종의 세포에 있어서, 상기 세포는 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 발현한다.
바람직하게는, 상기 세포는 임의 포유동물의 줄기 세포, 전구체 세포 또는 성체 세포이다.
바람직하게는, 상기 포유동물은 사람, 수마트라오랑우탄, 원숭이, 말, 소, 양, 돼지, 당나귀, 개, 토끼, 고양이, 큰 쥐 또는 작은 쥐이다.
바람직하게는, 상기 세포는 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 초대 배양에서 유래하는 줄기 세포, 모세포에서 분화된 다능성 또는 단능성 줄기 세포를 포함한다.
일종의 발현계에 있어서, 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열의 뉴클레오타이드 서열을 생물체에 도입하고, 생물체에서 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 발현한다.
바람직하게는, 상기 발현계는 진핵 발현 플라스미드 벡터, 아데노바이러스(adenovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), CRISPR/Cas 기술 및 기타 가능한 유전자 편집 기술을 포함한다.
바람직하게는, 상기 생물체는 사람, 수마트라오랑우탄, 원숭이, 말, 소, 양, 돼지, 당나귀, 개, 토끼, 고양이, 큰 쥐, 작은 쥐, 닭, 오리 또는 거위이다.
일종의 약물에 있어서, 상기 약물은 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 주요 표적으로 삼으며, 사용 후 유기체 내 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다.
바람직하게는, 상기 약물은 화학 소분자 약물, 단백질/폴리펩티드 약물 또는 핵산 약물, 나노약물이다.
바람직하게는, 상기 핵산 약물은 siRNA, microRNA, 안티센스 올리고 뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), 트리플 DNA와 핵산 중의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
일종의 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 방법은 이하 단계를 포함한다.
S1 발현 벡터 구축: 코딩 가능한 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열의 뉴클레오타이드 서열을 플라스미드 내에 삽입하고, 세균 또는 효모균 세포 내에 도입하거나, 또는 코딩 가능한 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열의 뉴클레오타이드 서열을 곤충 세포, 포유동물 세포 게놈 내에 삽입한다.
S2 단백질 발현: S1 중의 상기 개조 세균, 효모균, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에 대하여 확대 배양을 진행하고, 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 포함하는 배양액 또는 세포 용해물을 수집한다.
S3 단백질 정제: S2에서 수득한 배양액 또는 세포 용해물에 대하여 거친 여과 및 정제를 진행하여 단백질을 수득한다.
일종의 단백질의 생산 방법에 있어서, 화학적 합성 기술을 이용하여 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 생산한다.
일종의 단백질의 생산 방법에 있어서, 체외 리보솜을 이용하여 발현계는 상기 방안의 단백질 또는 상기 방안의 폴리펩티드 서열을 생산한다.
일종의 상기 방안의 단백질, 폴리펩티드 서열, 융합 단백질, 복합체, 뉴클레오타이드 서열, 세포, 발현계, 약물은 질환 진단, 예방 및 치료 중의 응용.
바람직하게는, 상기 질환은 병원성 단백질/폴리펩티드의 과도한 생성 또는 누적으로 인한 질환을 말한다.
바람직하게는, 상기 병원성 단백질/폴리펩티드는 산화, 당화 단백질 산물, 아밀로이드 전구체 단백질 및 그 스플라이싱된 변형체, 섬 아밀로이드 폴리펩티드 및 그 스플라이싱된 변형체, 및 기타 산화 단백질, 당화 단백질, 아밀로이드 단백질, 섬 아밀로이드 폴리펩티드와 유사한 특징을 가진 병원성 단백질/폴리펩티드이다.
바람직하게는, 상기 질환 진단은 상기 방안의 단백질 전부 또는 일부 아미노산 서열 발현 수준, mRNA 수준, 유전자 복제 수량의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는, 상기 예방은 유전자 개조, 핵산 도입, 약물 주사/복용, 세포 이식, 조직 이식 중의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는, 상기 치료는 유전자 개조, 핵산 도입, 약물 주사/복용, 세포 이식, 조직 이식 중의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 특징 및/또는 유익한 효과는 이하와 같다.
1. 본 발명에서 제공하는 신형 천연 단백질 sDSS1에 있어서, 전형적인 인간 유래 sDSS1 단백질 폴리펩티드 서열은 MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAED WAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRATVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC이다(SEQ ID NO:1 참조). 생물 정보학 분석 결과에 따르면, 상기 단백질은 진원아목 동물이 가진 일종의 천연 단백질이다.
2. 본 발명에 있어서, 생물 정보학 분석 및 세포 실험에서 검증된 바에 따르면, 폴리펩티드 sDSS1 탄소단 31개 아미노산 서열은 신호 펩티드이고, 이들은 상기 단백질의 성질과 분비 특성에 대하여 핵심적인 역할을 한다. C단 31개 아미노산 서열은 TVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC이다(SEQ ID NO:2 참조).
3. 본 발명의 sDSS1 단백질은 산화 단백질, 당화 단백질, A β 단백질, amylin 단백질과 결합하여 이러한 독성 단백질이 응집해 유도되는 세포독성을 차단시켜 준다. 따라서 이러한 독성 단백질 및 기타 유사 특징을 가진 병원성 단백질이 과도하게 생성되거나 과도하게 누적됨으로 인해 유발되는 질환을 치료할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있다.
4. 본 발명의 sDSS1 단백질은 대장균 발효를 통해 생산한다. 코딩한 sDSS1 단백질의 뉴클레오타이드를 pET151D 플라스미드 내에 도입하고, sDSS1 발현과 동시에 그 질소단이 하나의 6-his 라벨과 하나의 V5라벨을 융합하여 정제와 웨스턴 블로팅(western blotting) 검출에 사용한다. 단백질은 대장균 내에서 발현되며, 니켈-NTA 겔 칼럼을 이용하여 1차 정제를 진행한 후, SDS-PAGE를 이용하여 겔 절단 및 정제를 진행한다. 절단한 His-V5-sDSS1 단백질을 함유한 겔 스트립을 전이 완충용액을 함유한 투석백(dialysis bag)에 담고, 전기장의 구동 하에서 단백질을 겔에서 이동시켜 투석백 내에 수집한다. SDS 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔 전기영동 분석 단백질 순도는 생물 실험이 가능한 수준에 도달한다.
5. 본 발명은 분자 실험을 통해 sDSS1 단백질이 혈청 중 산화 단백질, 완충액 중 산화 단백질과 결합하여 폴리머를 형성하거나, A β 단백질과 결합하여 A β 올리고머 형성을 감소시킬 수 있다는 것이 검증되었다.
6. 본 발명은 세포 실험을 통해 sDSS1 단백질이 배지 중 산화 단백질, 당화 단백질, A β 올리고머, amylin 올리고머로 인한 세포독성을 효과적으로 차폐시켜 세포활력을 유지할 수 있다는 것이 증명되었다.
결론적으로, 본 발명은 신형 천연 sDSS1 단백질에 관한 것으로서, 생물 정보학, 분자 생물학, 세포 생물학의 3개 측면의 연구를 통해 sDSS1 단백질의 생물학 성질과 활성을 증명했다. sDSS1 단백질은 배지 중 산화 단백질, 당화 단백질, A β 올리고머, amylin 올리고머로 인한 세포독성을 효과적으로 차폐시켜 세포활력을 유지시킬 수 있다. sDSS1 단백질은 고등 영장류 동물 자체가 가진 단백질이므로 임상 사용 시 면역 반응의 문제를 면할 수 있다. 따라서 본 발명은 산화 단백질, 당화 단백질, A β 단백질, amylin 폴리펩티드 및 기타 유사 특징을 가진 병원성 단백질의 과도한 생성 또는 과도한 누적으로 인한 관련 질환을 예방 및 치료하는 신형 후보 약물을 제공하며, 이는 생물의학 상으로 응용할 수 있는 중요한 전망을 가진다.
이하에서는 도면을 통하여 본 발명을 더욱 상세하고 완전하게 설명하며, 이하 도면은 본 발명의 보호범위를 한정하지 않는다.
도 1a: sDSS1 유전자는 DSS1 유전자의 새로운 아형이며, 인간 DSS1 유전자 cDNA(NM_006304.1, 509bp)와 인간 sDSS1 유전자 cDNA(AK309241.1, 1195bp)를 비교하여 양자에 중첩 영역이 있는 것을 나타내며, 중첩 영역 핵산 서열은 분석을 거쳐 N단 58개 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
도 1b: Clustal X2.1 소프트웨어를 이용하여 영장목 13개 물종의 sDSS1 단백질 아미노산 서열에 대하여 비교를 진행한 결과, sDSS1 단백질 아미노산 서열이 고도의 보수성을 나타냈으며, N단 58개 아미노산 서열이 완전히 같고, C단 31개 아미노산 서열은 소량의 위치에만 점 돌연변이가 출현하였다.
도 2a: 플라스미드 형질도입(plasmid transfection) 293T 세포에 있어서, 24h 후 GFP 단백질 분포를 관찰하였다. 대조 세포(GFP) 내 녹색 형광이 뚜렷하게 빛나고, 용액 내 배경은 어두웠다. sDSS1과 GFP 킬레이트 단백질(sDSS1-GFP) 또는 sDSS1 단백질 C단 31개 아미노산 서열과 GFP 킬레이트 단백질(sDSS1-c-GFP)의 배양물 용액에서 현저한 녹색 형광 신호가 관찰되었으나, 세포 내 형광은 확산되어 강도가 줄어들었다. 이는 GFP 단백질이 sDSS1 단백질 또는 sDSS1 단백질 C단 서열에 따라 분비되어 세포 외로 나갔다는 것을 설명해 준다.
도 2b: 막 분사 웨스턴 블로팅 방법으로 형질전환 세포 배지를 검출한 결과에 따르면, sDSS1-GFP와 sDSS1-c-GFP군 배지에서 GFP 신호가 검출되었으며, 블랭크 대조(blank)와 GFP 대조군에서는 현저한 신호가 검출되지 않았다. 이는 sDSS1 단백질이 분비 단백질이며, C단 31개 아미노산 서열이 신호 펩티드라는 것을 증명해 준다.
도 3a: sDSS1 단백질 C단 폴리펩티드 서열 특이성 항체(항원 서열: sDSS1 단백질의 C단 31개 아미노산 서열)를 이용하여 인간 혈청(human serum) 또는 뇌척수액(human cerebral spinal fluid, CSF) 샘플에서 sDSS1 신호를 검출할 수 있다. Human CSF 샘플은 노인에서 유래하고, a 혈청 샘플은 극렬한 운동 후의 청년 혈청에서 유래하고, b, c, d 혈청 샘플은 휴지 상황에 있는 청년 혈청에서 유래한다.
도 3b: PCR 방법을 이용하여 인간 뇌 별아교모세포종(U-87MG)에서 sDSS1 유전자 특이의 mRNA 서열(확장 산물은 293bp)을 검출할 수 있으며, DSS1 유전자를 대조한다(확장 산물은 238bp).
도 4a 내지 도 4b: 쿠마시 블루 염색(Coomassie Blue staining)에서 sDSS1 단백질 생산과 정제 과정에서 목적 단백질의 함량이 나타났다. 도 4a에 있어서, 양성 대장균 복제 균주를 선택하여 확대 배양하고, IPTG를 첨가한 후 sDSS1 단백질의 발현을 유도하였으나, 유도한 세포 중 목적 단백질의 발현양이 극히 적었다. 도 4b에 있어서, 니켈-NTA 겔 칼럼 1차 정제 후 농축한 용해물과 정제한 후의 목적 단백질 함량을 검출하였으며, a 채널은 정제한 sDSS1 단백질을 나타내고, b 채널은 1차 정제한 세포 용해액을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d: 생화학 실험과 세포 실험에서 sDSS1 단백질이 산화 단백질과 결합하여 산화 단백질의 독성을 차폐시킬 수 있다는 것이 증명되었다. 도 5a에 있어서, 정제한 0.72㎍ sDSS1 단백질과 다른 비율의 혈청 단백질을 혼합한 후 인큐베이션을 진행하고, V5 결합 단백질(V5-HRP)을 이용하여 sDSS1 단백질을 검출한 결과, sDSS1 단백질과 혈청의 산화 단백질이 대분자의 단백질 복합체를 형성하였다. 도 5b에 있어서, AOPP(200㎍/mL)과 다른 농도의 정제한 sDSS1 단백질을 4℃에서 함께 하룻밤 동안 인큐베이션을 진행하고, 산물은 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후 쿠마시 블루 염색을 진행한 결과, sDSS1 단백질과 AOPP가 대분자의 복합체를 형성할 수 있으며, sDSS1 단백질 농도 증가에 따라 복합체 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 도 5c에 있어서, 배지에 10% 산화된 혈청을 첨가하자 세포 증식이 현저하게 저하되었으며, 배지 중 sDSS1 단백질이 산화된 혈청이 가져오는 세포독성을 차폐시킬 수 있는 것으로 나타났다. 도 5d에 있어서, 무혈청 배지에 100㎍/mL AOPP 단백질을 첨가하자 세포 활력이 저하되었으며, 같은 농도의 sDSS1 단백질을 첨가하자 세포 활력을 만회할 수 있었으며, 100㎍/mL BSA는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 t-test 양방 검증 분석과 ANOVE 분석 검증을 병행하였다. **, p-value < 0.01.
도 6a 내지 도 6e: sDSS1 단백질은 A β 올리고머 형성을 감소시키며, A β 올리고머로 인한 세포독성과 세포사를 감소시킨다. 도 6a에 있어서, 다른 비율의 sDSS1 단백질과 10㎍ A β 단백질을 혼합한 후 인큐베이션을 진행하고, A β 항체 검출을 진행한 결과, sDSS1 단백질과 A β은 공유원자가 결합의 고분자량 단백질 복합체를 형성하며, 이러한 결합은 세포독성이 있는 A β 올리고머의 형성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 도 6b에 있어서, V5 결합 단백질(V5-HRP)은 sDSS1 단백질을 검출하며, 그 결과에 따르면 sDSS1 단백질과 A β가 단백질 복합체를 형성하는 것으로 나타났다. 도 6c에 있어서, 배지에 A β 올리고머를 첨가하여 세포독성을 유발하기 때문에 세포 활력이 저하되었으나, sDSS1 단백질은 A β 올리고머로 인한 세포독성을 완전히 차폐시킬 수 있다. 도 6d에 있어서, 세포사 실험에 따르면, sDSS1 단백질을 배양액에 첨가하면 A β 올리고머로 인한 SH-SY5Y 세포의 초기 사멸과 후기 사멸을 현저하게 저하시킬 수 있기 때문에, 독성 단백질이 세포에 미치는 영향을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 도 6e에 있어서, sDSS1 단백질은 A β 올리고머가 작은 쥐 신경 줄기 세포(NSCs)에 미치는 독성도 감소시킬 수 있다. 데이터는 t-test 양방 검증 분석과 ANOVE 분석 검증을 병행하였다. **, p-value < 0.01.
도 7: Amylin 올리고머를 배지에 첨가하여 세포 독성을 유발시켜 세포 활력을 저하시켰으나, sDSS1 단백질을 첨가하면 세포 활력을 만회하여 세포 존속을 촉진시킬 수 있다. 데이터는 t-test 양방 검증 분석과 ANOVE 분석 검증을 병행하였다. **, p-value < 0.01.
도 8: 400㎍/mL 당화 단백질로 인한 세포 활력 저하는 sDSS1 단백질에 의하여 만회할 수 있으며, sDSS1 단백질 농도 증가에 따라(100에서 200㎍/mL) 만회 효과는 더욱 강해진다. 400㎍/mL BSA 단백질은 대조군으로 사용되었다. 데이터는 t-test 양방 검증 분석과 ANOVE 분석 검증을 병행하였다. **, p-value < 0.01.
도 9a: SAMP8 작은 쥐의 측뇌실(ventricle)에 바이러스를 주사하는 조작 방법과 바이러스 주사 위치를 도시하였다.
도 9b: 5개월령 조기노화 작은 쥐 SAMP8의 대뇌 측뇌실에 아데노바이러스를 주사한 후(좌우 반뇌 각 1μL바이러스액), 동물 생존 상황을 지속적으로 관찰하였다. 그 결과, 시간이 지남에 따라 발현 sDSS1 단백질 아데노바이러스를 주사한 작인 쥐의 수술 후 생존률이 현저하게 대조군 작은 쥐(발현 GFP 단백질)보다 높게 나타났다. 데이터는 ANOVE 분석을 이용하여 분석하였다. **, p-value < 0.01.
이하에서는, 실시예를 통해 본 발명의 바람직한 기술방안을 보다 상세히 설명하며, 이는 본 발명의 보호범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 모든 보호범위는 특허청구범위를 기준으로 한다.
이하 실시예에서 사용한 실험방법은 특별한 설명이 없는 경우 통상적인 실시방법으로 본다.
이하 실시예에 있어서, sDSS1 단백질은 자체 생산하였으며 순도가 생물실험 수준에 도달하는 것으로 검증하였고, 기타 재료와 시약은 모두 상업적인 경로를 통하여 획득할 수 있다.
실시예 1: sDSS1 단백질은 영장목 동물이 가진 분비형 단백질이다.
생물 정보학 분석 도구:
미국 국가생물기술정보센서(National Center of Biotechnology Information, NCBI) 유전자그룹 데이터베이스; Nucleotide blast tool(NCBI); Align sequences nucleotide blast tool(NCBI), Translate tool(SIB Bioinformatics Resource Portal); Clustal X2.1: Multiple Sequence Alignment(EMBL-EBI); SecretomeP 2.0(CBS prediction service); WoLF PSORT II.
생물 실험 방법:
1. 세포 배양: 293T 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구매하였으며, 세포 배양은 90% 기본 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)(Life technology사 C#12500062)와 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)(Gibco사 C#10100-147)을 함유하는 세포배지에서 세포배양상자(온도 37℃, 습도 95%, CO2 농도 5%)에 넣고 배양하였고, 격일마다 1회 계대배양하였다.
2. 세포 형질전환: 293T 세포는 각 3x105 오리피스(orifice)에 따라 6 오리피스 플레이트에 접종하고, 1.5mL 세포 배지를 첨가하고, 세포 부착 12시간 후 플라스미드 형질전환을 시작하였다. 진핵 발현 플라스미드 pCMV-C-Flag를 채택하며, 삽입하는 발현 sDSS1 단백질 핵산 서열은 SEQ ID NO:17에서 도시하는 바를 참조한다. 플라스미드 2500ng는 750μL Opti-MEM Medium (Life technology C#31985062) 로 희석하여 균일하게 혼합하고, 10μL 형질전환 시약 Lip2000(Invitrogen사 C#12566014)는 750μL Opti-MEM Medium로 희석하여 균일하게 혼합하고, 희석한 플라스미드 용액을 희석한 형질전환 시약에 점적하고, 균일하게 혼합한 후 상온에서 5분간 인큐베이션을 진행하였다. 6 오리피스 플레이트 중의 세포 배지를 흡수하고, PBS를 이용하여 세포를 1회 세정한 후, 인큐베이션을 마친 형질전환 작업액으로 바꾼다. 세포는 지속적으로 배양상자에서 배양하고, 24 내지 48시간 동안 세포 중 형광 단백질 발현을 관찰하였다.
3. 막 분사 단백질 웨스턴 블로팅 실험: PVDF 막은 메탄올로 활성화하여 건조시키고, 각각 대조 배지와 다른 형질전환 세포 배지를 막 상에 점적하였다. 막이 건조될 때까지 기다린 후, PVDF 막은 순서대로 1% BSA 봉쇄, 제1단계 항체(Rabbit-anti-GFP)(Cell signal technology사 C#2956) 인큐베이션, 제2단계 항체(Goat-anti-rabbit HRP 항체)(Zsbio, ZDR-5403) 인큐베이션을 완료하였다. 막은 PBST를 이용하여 3회 세정하고, 발광액(Zsbio, ZLI-9017)을 사용해 현상하고 X레이 필름을 이용하여 스트립을 노출시켰다.
결과 분석:
인간 게놈 중 shfm1 유전자에 대하여 생물 정보학적 분석을 진행할 때, 우리는 상기 유전자에 여러 개의 전사물이 있는 것을 발견하였다(NCBI 데이터베이스 중 shfm1 유전자 정보를 참조, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7979). 공통 코딩 DSS1 단백질 서열의 하나의 mRNA 서열(NM_006304.1, 509bp) 외에도 하나의 더 간 mRNA 서열(AK309241.1, 1195bp)이 있다. 짧은 mRNA 서열과 긴 mRNA 서열에는 256bp 중복 서열만 있으며(도 1a), 핵산 서열 분석을 거쳐, Translate tool을 이용하여 중복 서열 코딩 가능 DSS1 단백질 N단 58개 아미노산 서열을 획득한다. 긴 mRNA 서열은 89개 아미노산의 폴리펩티드 서열을 코딩한다. 폴리펩티드 서열 비교를 통해 알 수 있듯이, 긴 mRNA 코딩의 폴리펩티드 서열과 DSS1 폴리펩티드 서열은 N단 58개 아미노산의 중첩 영역이 있으며, 31개 아미노산의 가변 영역이 별도로 있다. 우리는 이 새로운 폴리펩티드를 분비형 DSS1 단백질(secretory DSS1, sDSS1)이라 명명하며, 폴리펩티드 서열은 이하와 같다.
DSS1(Homo sapiens):
MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAEDWAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRAELEKHGYKMETS(SEQ ID NO:4 참조)
s-DSS1 (Homo sapiens):
MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAEDWAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRATVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC(SEQ ID NO:1 참조)
NCBI 데이터베이스 중 이미 서열 분석을 마친 영장목 동물 게놈과 기타 모형 동물 게놈에 대한 선별 조사를 통하여, 우리는 진원아목 동물의 게놈에만 유사한 긴 mRNA 서열이 존재한다는 것을 발견하였으며, 인간 유래 sDSS1 단백질과 유사한 폴리펩티드 서열을 획득하였는데, 이는 표 1에서 도시하는 바와 같다. 이러한 폴리펩티드 서열 비교 결과에서 알 수 있듯이, sDSS1 단백질 서열이 고도로 보수적이고, N단 59개 아미노산 서열이 완전히 동일하며, C단 나머지 아미노산 서열은 소량의 점 돌연변이만 있었다.
2종의 분비 단백질 분석 예측 소프트웨어 Wolf PSORT와 SecretomeP 2.0을 이용하여 sDSS1 단백질 아미노산 서열을 분석하였으며, 예측 결과에서 sDSS1 단백질이 세포 외에 위치하고, 여러 종의 감정한 분비형 단백질과 유사하며 예측되는 것이 분비 단백질로 나타났다(표 2). 여기에서, Wolf PSORT 소프트웨어의 분석 결과에 따르면, sDSS1 단백질의 신호 펩티드 절단 부위(Cleavage site)는 58 내지 59 아미노산 사이에 위치하였다.
생물 정보학적 분석 결과에 의거하여, 상기 단백질 모든 서열 또는 C단 31개 아미노산 서열(58 아미노산 이후의 31개 아미노산 서열)을 각각 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)과 연결하여 293T 세포(sDSS1-GFP, sDSS1-c-GFP) 중에 발현하였다. 그 결과, 용액 중에 녹색 형광이 출현하고 배경이 발광하였으며 세포 내 형광이 흐리고 어두운 것을 관찰할 수 있었다. 대조군(GFP) 용액에 형광이 없었으며 배경이 아주 어둡고 세포 내 형광이 선명하게 밝았다(도 2a). 막 분사 웨스턴 블로팅 방법을 이용하여 세포 배지를 검출한 결과, sDSS1-GFP와 sDSS1-c-GFP 그룹의 세포 배지에서 GFP 신호가 검출되었으며, 대조군(GFP)에서는 신호가 검출되지 않았다(도 2b). 상기 결과를 종합하면, sDSS1 단백질이 일종의 분비 단백질이며 세포 내에서 합성하여 세포 외로 분비될 수 있고, sDSS1 단백질의 C단 31개 아미노산 서열이 신호 펩티드의 기능을 발휘한다는 것이 설명된다.
실시예 2: sDSS1 단백질은 천연 단백질이다.
1. 인간 혈청과 뇌축수액 샘플 처리: 신선한 인간 전혈(human whole blood)을 수집하고, 10 내지 20분간 실온에서 정치한 후, 30분간 3500g 원심분리를 진행하고, 상청액을 취하여 인간 혈청으로 사용한다. 혈청에 10mM β 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 첨가하고, 균일하게 혼합한 후 끓는 수조에서 10분간 처리하고, 냉각한 후 10분간 12000g 고속 원심분리를 진행하고, 상청액을 취하여 1/5 체적의 5x 로딩 완충액과 혼합한다. 병원에서 얻은 신선한 뇌척수액을 아이스박스에 넣어 운송하여 당일 처리한다. 신선한 뇌척수액은 곧바로 5x loading buffer와 혼합한 후 곧바로 샘플로 제작하여 로딩에 사용한다.
2. 단백질 웨스턴 블로팅(western blotting) 실험: 제조한 15μL로딩 샘플을 로딩 구멍에 넣고, 4% 내지 12% 사전제작 겔(Life technology사 C#NP0321bOX)은 단백질을 분리한 후 PVDF 막 상에 전이시킨다. 막은 제1단계 항체(Rabbit-anti-sDSS1)(항원 서열: sDSS1 단백질의 C단 31개 아미노산 서열) 인큐베이션을 진행하여 PBST 용액으로 3회 세정하고, 제2단계 항체(Goat-anti-rabbit HRP 항체) 인큐베이션을 진행하여 PBST를 이용하여 3회 세정한다. 완료 후 발광액을 사용해 현상하고 X레이 필름을 이용하여 스트립을 노출시켰다.
3. 세포 배양: 인간 뇌 별아교모세포종(U87-MG 세포)는 ATCC에서 구매하였고, 세포 배양은 90% 기본 배지 DMEM과 10% 소태아혈청 FBS를 함유하는 완전 세포 배지에서 세포배양상자(온도 37℃, 습도 95%, CO2 농도 5%)에 넣고 배양하였고, 격일마다 1회 계대배양하였다.
4. PCR 실험: U87-MG 세포를 수집한 후 신속하게 세포를 용해시키고, 하나의 총 RNA 추출 시약 키트(QIAGEN, 51304)를 이용하여 세포 용해액에서 총 RNA를 추출하고, RNA 샘플은 계속해서 1U/μL DNase I를 이용해 실온에서 15분간 처리하고 잔여 게놈 DNA를 제거한다. 수득한 RNA 샘플은 cDNA 합성 시약 키트(TransGen Biotech, AT301)를 이용해 모두 cDNA로 전환 합성하고 템플릿 샘플로 삼아 후속 PCR 실험을 진행한다. PCR 반응은 20μL 반응계를 채택하며, 여기에는 10μL PCR사전 혼합 시약(PCR Taq Mixture)(Omega bio-tek, TQ2200), 0.5μL cDNA 템플릿(3.5㎍/mL), 0.5μL프라이머, 9μL초순수가 포함되고, 균일하게 혼합한 후 PCR 반응을 시작하였다. DSS1 cDNA 프라이머에 있어서, 포워드 프라이머(forward primer)는 GCAGACAGTCGAGATGTCAGAG이고, 리버스 프라이머(reverse primer)는 TTCTTCTGGATGCTATGAAGTCTCC이다. sDSS1 cDNA 프라이머에 있어서, 포워드 프라이머는 GCAGACAGTCGAGATGTCAGAG이고, 리버스 프라이머(reverse primer)는 TGATGATCTGTTAACAGCAGAGG이다. PCR 반응 프로세스에 있어서, 94℃에서 10분간 순환 반응을 40회 진행하며, 여기에는 94℃ 10s, 62℃ 20s, 72℃ 20s가 포함된다. 순환 종료 후 계속해서 72℃ 10분간 진행한 후 4℃에서 보존하고 3% 아가로스 겔[0.05% SYBR Green Stain (Thermo Fisher, 4472903)]을 이용하여 PCR 산물 중의 DNA 함량을 전기영동 검출한다.
결과 분석:
sDSS1 특이성 항체를 이용하여, 인간 뇌척수액 또는 혈청에서 sDSS1 단백질의 신호를 검출할 수 있으며, 다른 개체에서 유래한 혈청 샘플에서 다른 신호 모델이 나타났고, 운동 후의 개체 혈청 중 sDSS1 신호가 휴지 상태 하의 개체보다 현저하게 높게 나타났다(도 3a). U87-MG 세포 내에서 sDSS1 유전자의 mRNA 신호를 검출할 수 있으며, PCR 확대 산물의 유전자 서열 분석 결과는 데이터베이스의 서열과 완전히 동일하였다(도 3b). 상기 결과는 sDSS1 단백질이 천연 단백질이며 인간 뇌척수액과 혈청에 존재한다는 것을 설명해 준다.
실시예 3: sDSS1 단백질의 소량 제조
실험방법:
1. sDSS1 단백질 제조: 토탈 유전자 합성(total gene synthesis) 코딩 인간 sDSS1 단백질의 뉴클레오타이드 단편(SEQ ID NO:17 참조)을 pET151D 중 Hisx6-V5 라벨 후면에 삽입하였다. 그 후 플라스미드를 발현 균주 BL21(DE3) 내에 전입시켰다. 대장균 내에 발현 Hisx6-V5-sDSS1 단백질을 용합하고, 니켈-NTA 겔 칼럼을 이용하여 1차 정제를 진행한 후, SDS-PAGE를 이용하여 겔 절단 및 정제를 진행하였다. 절단한 His-V5-sDSS1 단백질을 함유한 겔 스트립을 전이 완충용액을 함유한 투석백에 담고, 전기장의 구동 하에서 단백질을 겔에서 이동시켜 투석백 내에 수집하였다. 단백질을 500μL 가량까지 농축시키고, PBS 용액 중 4도 투석을 4회 진행하며 각 회는 200ml이다.
2. SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동: 정제 제조한 sDSS1 단백질 또는 세균 용해액 단백질과 5x 로딩 완충액을 혼합한 후, 끓는 수조에서 10분간 처리하고, 10분간 12000g 고속 원심분리를 진행하고, 상청액을 취하여 분석에 사용하였다. 4% 내지 12% 사전제작 겔을 이용해 단백질을 분리한 후 쿠마시 블루 염색액으로 스트립을 1시간 동안 염색한 후, 탈색액을 이용해 실온에서 하룻밤 동안 탈색시켰다. 탈색 완료 후 스트립 상의 띠를 관찰하고 촬영하여 보존하였다.
결과 분석:
양성 대장균 복제 균주를 선택하여 확대 배양하고, 세균 성장의 대수기에 IPTG를 이용하여 세균 세포 발현 목적 단백질을 자극하기 시작하였다. 세균을 용해하고, 목적 단백질의 발현 수준을 검출한 결과, IPTG 자극 후 세균 세포 발현 sDSS1 단백질의 수준이 현저하게 상승하였으며, 스트립 도면 상에서 현저한 단백질 띠를 확인할 수 있었다(도 4a). 세균 용해액은 니켈-NTA 겔 칼럼을 거쳐 1차 정제한 후, 농축액 중 목적 단백질이 최대치로 농축되었고(b 채널), 불순 단백질 함량은 감소하였다. 계속 정제하면 순도가 최대치인 sDSS1 단백질을 얻을 수 있으며(a 채널)(도 4b), 후속적인 생물 실험에 사용될 수 있다. 정제한 후의 sDSS1 단백질은 BCA 단백질 정량을 거쳐 최종 농도가 0.72mg/ml이며 4도에서 보존하였다.
실시예 4: sDSS1 단백질과 산화 단백질 반응 및 산화 단백질의 세포독성 차폐
실험방법:
1. 산화 혈청과 sDSS1 단백질 반응: 신선한 인간 혈액을 30분간 3500g 원심분리시키고, 상층 혈청을 취하여 후속 실험에 사용하였다. 실험 중 10μL sDSS1 단백질 용액(0.72mg/mL) 중에서 각각 10, 20, 50 및 100μL의 산화 혈청과 혼합하고, sDSS1과 혈청 단백질 질량비는 대략 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000으로 하고, 별도로 20μM Fenton시약(FeSO4와 H2O2를 1:1의 질량비로 혼합)을 첨가하여 균일하게 혼합한 후, 4℃에서 빛을 피하여 하룻밤 동안 인큐베이션을 진행하였다. 두 번째 날, 10μL Ni-NTA 자성 구슬을 이용하여 각 반응 중인 His-V5-sDSS1을 분리시켰다. 반응액과 자성 구슬을 2시간 동안 4도 혼합하고, 마그네틱 프레임을 이용해 자성 구슬을 관벽 상에 부착시켜 액체를 흡수하였다. 1ml PBST를 첨가하고 관을 마그네틱 프레임 상에서 취하며 진동 세정을 반복한 후 마그네틱 프레임이 자성 구슬을 흡착하여 PBST를 흡수해 가는데, 이를 4회 반복하며 마지막에 50μL의 50mM EDTA를 함유한 TBS를 이용해 단백질을 용출시키고, 용출액은 동일 체적 2x SDS 용액을 첨가하며, 100℃에서 10분간 처리하고 10분간 12000g 원심분리를 진행하며 상청액을 취하여 검출에 사용하였다. 상청액과 5X 로딩 완충액을 혼합하고, 100℃에서 10분간 가열하며, 제조한 샘플은 단백질 웨스턴 블로팅 실험에 사용하였다.
2. 산화 소태아혈청과 AOPP 제조: 10mL 소태아혈청은 10mM NaCIO를 첨가하여 1시간 동안 처리하고, 산화한 혈청은 3000Da 투석백을 이용하여 PBS 용액에서 연속 24시간 투석을 진행하며, 투석 기간 8시간마다 1회 액을 교체한다. 처리를 마친 혈청 용액에 1mM 비타민 C(Vc)를 첨가하여 참여한 산화제를 철저하게 제거하였다. BCA 단백질 정량법으로 단백질 농도를 검출하였다. 두 가지 방법을 이용하여 산화 단백질의 함량을 검출하였으며, 클로라민(chloramine) T 방법으로 측정한 산화 혈청 중 다이티로신(dityrosine) 값은 75.31μM/mg 단백질이고(미처리 혈청은 15.5㎛ol/mg 단백질), 2, 4-디니트로페닐히드라진(2,4-dinitrophenylhydrazine) 방법으로 측정한 카르보닐기 함량은 16.33nmol/mg 단백질이었다(미처리한 혈청은 13.68nmol/mg 단백질).
10mg 혈청 단백질은 먼저 160mM NaCIO로 1시간 처리하고, 산화 단백질은 3000Da 투석백을 이용하여 PBS 용액에서 연속 24시간 투석을 진행하며, 투석 기간 8시간마다 1회 액을 교체한다. 처리를 마친 후기 AOPP는 먼저 BCA 단백질 정량법으로 단백질 농도를 검출하였다. 클로라민 T 방법으로 측정한 AOPP 중 다이티로신 값은 54.21㎛ol/mg 단백질이고(미처리한 BSA는 14.55㎛ol/mg 단백질), 2, 4-디니트로페닐히드라진 방법으로 측정한 카르보닐기 함량은 1042.57nmol/mg 단백질이었다(미처리한 BSA는 10.26nmol/mg 단백질).
3. AOPP와 sDSS1 단백질 반응: 150μL 반응계에 30㎍ AOPP 단백질(200㎍/mL)을 첨가하고, 별도로 각각 15㎍(100㎍/mL), 30㎍(200㎍/mL), 60㎍(400㎍/mL) sDSS1 단백질을 첨가하고, 무균 PBS 용액을 이용하여 여분의 체적을 보충하였다. 용액을 균일하게 혼합한 후, 4℃ 환경에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 샘플에 5x 로딩 완충액을 첨가하고, 100℃에서 10분간 가열 처리하며, 처리한 샘플은 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 쿠마시 블루 염색을 이용하여 띠를 표시하였다.
4. 단백질 웨스턴 블로팅 실험: 반응이 완료된 단백질 혼합물을 5x loading buffer와 혼합한 후, 끓는 수조에서 10분간 두고 western blotting 분석에 사용하였다. 구체적인 방법은 전술한 바와 같다. 사용한 항체는 V5-HRP 항체(1:5000 희석)이다.
5. 세포계 배양: 인간 신경모세포종 세포(SH-SY5Y)는 기초 배지 DMEM에서 성장시켜 10% 소태아혈청을 첨가하며, 세포는 격일마다 1회 계대배양하였다.
6. 세포 활력 검출: sDSS1 단백질이 산화 혈청의 세포독서에 미치는 효과를 검출하기 위하여, SH-SY5Y 세포는 104 세포 각 오리피스에 따라 96 오리피스 플레이트에 접종하고, 200μL완전 배지로 하였다. 12시간 이후 완전 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 DMEM 각 오리피스 200μL로 교체하였다. 24시간 동안 지속 처리한 후, DMEM 용액을 10% 산화 혈청과 20㎍/mL sDSS1 단백질을 함유한 10% 산화 혈청의 배지 각 오리피스 200μL로 교체하였다. 48시간 동안 지속 처리한 후, 96 오리피스 플레이트 중 오래된 배지를 버리고 각 오리피스에 100μL의 희석한 CCK-8 작업액(1:20 희석)을 첨가하여(동인화학(同仁化學), CK04), 세포 활력 변화를 검출하였다. 동일 농도의 BSA군을 첨가하여 대조군으로 사용하였다.
sDSS1 단백질의 AOPP로 인한 세포독성에 대한 보호 효과를 검출하기 이하여, SH-SY5Y 세포는 2X104 세포 각 오리피스에 따라 96 오리피스 플레이트에 접종하고, 12시간 이후 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 배지로 교체하였다. 24시간 동안 지속 처리한 후, 100㎍/mL AOPP 단백질을 함유한 무혈청 배지로 교체하고, 처리군은 동시에 100㎍/mL sDSS1 단백질을 첨가하고, 각 오리피스는 200μL로 하였다. 96 오리피스 플레이트는 계속하여 48시간 처리한 후 CCK-8 시약 키트를 이용해 세포활력 변화를 검출하였다.
결과 분석:
혈청 중 대량의 단백질이 함유되었는데, 주로 혈청알부민이었다. Fenton 시약의 작용 하에서 혈청 중의 단백질이 산화되었으며, 산화 산물은 sDSS1과 반응하여 복합체를 형성하였다. 대조군에서 sDSS1 단백질 단량체를 볼 수 있었으며 현저한 단백질 응집 현상은 일어나지 않았다. 실험군에서 혈청과 공동 인큐베이션을 진행하여 대량의 고분자량 단백질 복합체가 형성되었는데, 이러한 복합체는 SDS-PAGE에 의하여 분리되지 못했다(도 5a). 상기 결과는 sDSS1 단백질이 혈청 중 산화 단백질과 결합할 수 있다는 것을 설명해 준다. 세포독성 실험에서 대조군 혈청과 비교할 경우 10% 산화 단백질을 첨가하면 세포증식과 세포활력을 현저하게 억제할 수 있으며, 배지 중에 20㎍/mL sDSS1 단백질이 포함되면 산화 단백질의 세포독성을 만회할 수 있는 것으로 나타났다(도 5b).
계속해서 sDSS1과 AOPP 단백질을 혼합하면, sDSS1과 AOPP 단백질이 결합하여 복합체를 형성하는 것을 볼 수 있었으며, 이러한 복합체는 SDS-PAGE에 의해 분리되지 못하였다. 반응계 중 sDSS1 단백질 농도가 증가함에 따라, 복합체가 현저하게 증가하였다(도 5c). 세포 실험에서 AOPP는 세포에 대하여 현저한 세포독성을 유발하고 세포 활력을 저하시켰으나, 동일 농도의 sDSS1는 AOPP의 세포독성을 완전하게 차폐시킬 수 있었다(도 5d). 상기 결과를 종합하면, sDSS1는 세포가 산화 혈청이나 AOPP의 세포 독성의 영향을 받지 않도록 보호할 수 있다.
그 외, sDSS1 단백질에는 산화 단백질의 반응이 있으며, 2종의 단백질은 모두 산화 단백질과 긴밀하게 결합할 수 있고, 이러한 결합력은 고농도의 SDS에 저항할 수 있는데 이는 공유원자가와 같은 상호 작용을 한다. 다른 점은, DSS1와 산화 단백질 결합의 과정에 하나의 ATP 효소의 협조가 필요한데[Zhang et al, 2014], 우리가 증명한 바에 따르면 sDSS1과 산화 단백질의 긴밀한 결합에는 ATP가 필요하지 않다. 즉 ATP 효소의 참여가 필요하지 않다. DSS1과 sDSS1의 아미노산 서열 비교에서 알 수 있듯이, 상기 두 종류의 단백질 1 내지 58위치의 아미노산 서열은 완전히 동일하나, DSS1의 59 내지 70위치 아미노산 서열과 sDSS1의 59 내지 89위치 아미노산 서열은 완전히 다르다. 따라서, DSS1과 sDSS1의 산화 단백질과 긴밀하게 결합하는 특성은 아미노산 서열 공유의 기여, 즉 앞 58 아미노산 서열에서 유래하는 것으로 추론된다. sDSS1은 DSS1의 특성과 달리, ATP 효소에 매개에 의존하지 않고 산화 단백질과 긴밀하게 결합하는데, 이는 sDSS1의 독특한 아미노산 서열, 즉 59 내지 89위치의 C단 아미노산 서열에 기인한다. 결론적으로, sDSS1와 같이 ATP 효소 매개에 의존하지 않고 산화 단백질과 긴밀하게 결합할 수 있는 특성은 앞 58개 아미노산 서열과 뒤 31개 아미노산 서열의 유기적인 결합에 기인한다.
실시예 5: sDSS1 단백질은 A β올리고머 형성을 저하시키고 A β올리고머의 세포독성을 감소시킨다.
실험 방법:
1. 세포계 배양: 인간 신경모세포종 세포(SH-SY5Y)는 기초 배지 DMEM에서 성장시켜 10% 소태아혈청을 첨가하며, 세포는 격일마다 1회 계대배양하였다.
2. 신경 줄기 세포 배양: 신경 줄기 세포(neural stem cell, NSC)는 P2 작은 쥐 뇌조직에서 유래하며, 초대 부유배양의 신경 줄기 세포는 2회 계대배양 후 독성 검출 실험에 사용되며, 신경 줄기 세포는 줄기 세포 배지에서 배양되고, 여기에는 88% DMEM/F12 기초 배지(Gibco, C#12500-062), 10% Proliferation supplementary 첨가물(Stem cell technology, C#05701), 2%BSA(Sigma, C#V900933), 10ng/mL Heparin(Sigma, C#H3149), 10ng/mL bFGF(Roche, C#11104616001), 20ng/mL EGF(BD Bioscience, C#354010)이 포함된다.
3. A β와 sDSS1 단백질 반응: A β 단백질(Human, 1-42) 동결건조 분말은 ChinaPeptides(蘇州强耀生物科技有限公司)에서 제공하였다. 2mg A β동결건조 분말은 20μL DMSO 를 이용하여 L을 용해하고, 계속하여 PBS를 이용하여 2mg/mL로 희석하였다. -20℃에서 냉동 보관하였다. 반응계 중 먼저 첨가하는 300μL PBS용액 중 10㎍ A β와 sDSS1 단백질의 몰비는 1:1, 1:5, 1:10으로 혼합하고, 혼합한 후 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션을 진행하였다. 인큐베이션을 마친 반응물에 5X 로딩 완충액을 첨가하고, 100℃에서 10분간 처리하여 웨스턴 블로팅 분석에 사용하였다.
4. A β 단백질 사전 처리: A β는 기초 배지(pH 7.2)를 이용하여 A β 저장액을 1000㎍/mL까지 희석시키고, A β 희석액은 4℃에서 24시간 인큐베이션을 진행한 후 형성되는 올리고머를 세포 실험에 사용하였다. 후속 실험에서 A β의 농도는 항상 인큐베이션 전의 단백질 농도에 따라 표시하였다.
5. 단백질 웨스턴 블로팅 실험: 처리한 반응물은 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 계속해서 western blotting 분석에 사용하며, 구체적인 방법은 전술한 바와 동일하다. 사용한 항체는 V5-HRP 항체(1:5000 희석), A β 항체(Cell signal technology, 9888), 2차 항체(Goat-anti-rabbit HRP 항체)이다.
6. 세포 활성 검출: SH-SY5Y 세포는 2X104 세포 각 오리피스에 따라 96 오리피스 플레이트에 접종하고, 부착 12시간 후 오래된 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 배지로 교체하고, 계속해서 24시간 처리한 후 오래된 배지는 A β와 sDSS1 단백질을 포함하는 DMEM 용액으로 교체하였다. 세포는 계속해서 48시간 처리한 후 CCK-8 시약 키트를 이용하여 세포활력 수준을 검출하였다.
7. 세포사 검출: 세포사 검출 시약 키트는 동인화학상하이(AD10)에서 구매하였다. SH-SY5Y 세포는 3X105 세포 각 오리피스에 따라 6 오리피스 플레이트에 접종하고, 부착 12시간 후 오래된 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 DMEM 용액으로 교체하고, 계속해서 24시간 처리한 후 A β 또는 A β와 sDSS1 단백질을 포함하는 용액으로 교체하였다. 세포는 계속해서 48시간 처리한 후 사멸 시약 키트를 이용하여 세포사 수준을 검출하였다. 모든 용액과 세포를 수집하고 원심분리하여 상청액을 버렸다. 400μL사멸 시약 키트에서 제공하는 염색 완충액을 이용하여 세포를 다시 부유시키고, 그 중의 185μL세포 현탁액을 흡수하여 후속 검출에 사용하였다. 세포 현탁액에 5μL Annexin V 염색액을 첨가한 후 균일하게 혼합하고, 세포는 37℃에서 10분간 인큐베이션을 진행하였다. 계속해서 10μL PI 염색액을 첨가하여 균일하게 혼합한 후 유세포 분석기를 이용하여 세포사 수준을 검출하였다.
신경 줄기 세포는 먼저 6 오리피스 플레이트에 부착 배양하고, 오리피스 플레이트는 먼저 0.025% Laminin을 이용하여 적어도 2시간 처리한 후, 무균 PBS를 이용하여 6회 세정하여 이후 사용을 위해 준비하였다. 신경 줄기 세포는 단세포로 제작한 후 3x105 오리피스에 따라 6 오리피스 플레이트에 접종하고, 세포 부착 24시간 후 후속 실험에 사용하였다.
결과 분석:
인큐베이션을 거쳐, A β 단백질은 현저한 응집 현상을 보였으며, 10-20KD 사이에서 크기가 다른 단백질 응집체를 형성하였다. 문헌에 공개된 자료에 따르면, 이러한 A β 올리고머는 A β로 인한 세포독성의 주요 출처이다. sDSS1 단백질을 첨가하여 A β와 함께 인큐베이션을 진행한 후, sDSS1 단백질은 A β 단백질과 응집하여 대분자량의 복합체(분자량이 20KD보다 높음)를 형성할 수 있고, 10-20KD 사이에 형성되는 올리고머는 현저하게 감소하였다(도 6a). sDSS1 단백질 농도 증가에 따라 A β 올리고머 생성이 현저하게 억제되었다. sDSS1 단백질 신호를 검출할 때, 복합체가 sDSS1 단백질과 A β 단백질 반응으로 형성되는 것을 확정할 수 있으며(도 6b), SDS-PAGE에 의하여 열리지 않는다.
계속해서 sDSS1 단백질의 A β로 인한 세포독성에 대한 차폐 효과를 검출하였다. 세포활력 검출 실험에서 사전 처리한 A β 올리고머를 첨가한 후 세포활력이 현저하게 저하되었다. 배양액에 sDSS1 단백질을 첨가한 후, SH-SY5Y 세포활력이 현저하게 회복되었고 세포활력이 대조군보다 높았다(도 6c). 세포사 검출 실험에서 A β 올리고머는 배양액 첨가 후 SH-SY5Y 세포 또는 신경 줄기 세포의 세포사가 유도되었으나, 배양액에 sDSS1 단백질을 첨가하자 세포의 초기 사멸과 후기 사멸을 현저하게 저하되었다(도 6d, 도 6e). 상기 결과에 의거하여, sDSS1 단백질은 A β 단백질과 결합하여 A β 올리고머 형성을 저하시킬 수 있기 때문에 A β 단백질로 인한 세포독성을 완화시킬 수 있다.
실시예 6: sDSS1 단백질은 amylin 올리고머의 세포독성을 저하시킨다.
실험 방법:
1. 세포계 배양: 인간 신경모세포종 세포(SH-SY5Y)는 기초 배지 DMEM에서 성장시켜 10% 소태아혈청을 첨가하며, 세포는 격일마다 1회 계대배양하였다.
2. amylin 단백질 사전 처리: amylin 단백질(Human) 동결건조 분말은 ChinaPeptides에서 제공하였다. 2mg A β 동결건조 분말은 10mM 아세트산나트륨 용액(pH 5.5)을 이용하여 2mg/mL로 용해하고, -20℃에서 냉동 보관하였다. 기초 배지(pH 7.2)를 이용하여 amylin 저장액을 1mg/mL까지 희석하고, amylin 희석액을 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션을 진행하여 형성한 올리고머는 세포 실험에 사용하였다. 후속 실험 중 amylin의 농도는 항상 인큐베이션 전의 단백질 농도에 따라 표시하였다.
3. 세포 활성 검출: SH-SY5Y 세포는 2x104 세포 각 오리피스에 따라 96 오리피스 플레이트에 접종하고, 부착 12시간 이후 오래된 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 배지로 교체하였다. 24시간 동안 지속 처리한 후, 오래된 배지를 버리고 amylin 또는 amylin과 sDSS1 단백질을 포함하는 DMEM 용액으로 교체하였다. 세포는 계속하여 48시간 처리한 후 CCK-8 시약 키트를 이용하여 세포활력 수준을 검출하였다.
결과 분석:
세포 배양액에 10μM 인큐베이션한 amylin 단백질을 첨가하면 현저한 세포독성을 유발할 수 있으며, 동시에 sDSS1 단백질을 첨가하면 amylin 올리고머로 인한 세포독성을 차폐시킬 수 있는데, 세포활력이 심지어 대조군보다도 높았다(도 7). 이는 sDSS1 단백질이 amylin 단백질의 세포 독성을 효과적으로 차폐시킬 수 있다는 것을 설명해 준다.
실시예7: sDSS1 단백질이 당화 단백질의 세포독성을 저하시킨다.
실험 방법:
1. 세포계 배양: 인간 신경모세포종 세포(SH-SY5Y)는 기초 배지 DMEM에서 성장시켜 10% 소태아혈청을 첨가하며, 세포는 격일마다 1회 계대배양하였다.
2. 당화 단백질 제조: 10mg/mL 혈청 단백질과 2.5M 리보스(ribose)를 혼합한 후 37℃ 환경에서 연속 7일간 인큐베이션을 진행하였다. 완료 후 3000Da의 투석백을 이용하여 PBS에서 24시간 투석을 진행하였으며 8시간 간격으로 액을 1회 교체하였다. 당화 단백질 제조를 완료한 후 BCA 단백질 정량으로 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
3. 세포 활성 검출: SH-SY5Y 세포는 2x104 세포 각 오리피스에 따라 96 오리피스 플레이트에 접종하고, 부착 12시간 이후 오래된 배지는 0.5% BSA를 함유한 무혈청 배지로 교체하였다. 24시간 동안 지속 처리한 후, 오래된 배지를 버리고 당화 단백질 또는 당화 단백질과 다른 농도의 sDSS1 단백질을 포함하는 DMEM 용액으로 교체하고, 동일 농도의 BSA군을 첨가하여 대조에 사용하였다. 세포는 계속하여 48시간 처리한 후 CCK-8 시약 키트를 이용하여 세포활력 수준을 검출하였다.
결과 분석:
세포 배양액에 400μg/mL 당화 단백질을 첨가하면 현저한 세포독성을 유발할 수 있으며, 동시에 sDSS1 단백질을 첨가하면 당화 단백질로 인한 세포독성을 저하시킬 수 있고, sDSS1 단백질 농도가 높아짐에 따라 세포활력이 심지어 대조군보다도 높았다(도 8). 이는 sDSS1 단백질이 당화 단백질의 세포 독성을 효과적으로 차폐시킬 수 있다는 것을 설명해 준다.
실시예 8: sDSS1 단백질이 조기노화형 작은 쥐 SAMP의 수술 후 생존기간을 연장시킨다.
실험 방법:
1. 동물 사육: 조기노화형 SAMP8 작은 쥐(5개월령, 수컷)는 베이징 바이탈 리버(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에서 구매하였으며, 동물 사육은 남방모델동물센터(南方模式動物中心)의 청정급 실험동물사육센터에서 진행되었다. 동물에게 충분한 무균수와 표준 작은 쥐 번식 사료를 제공하였으며, 12h/12h 명암 교체 빛을 조사하고 매월 정기적으로 패드 재료와 케이지(cage)를 교체하였으며 매일 정기적으로 동물 생존 상황을 관찰하였다.
2. 아데노바이러스 합성: 발현 sDSS1 단백질의 아데노바이러스는 우리(발명자)가 핵산 서열을 제공하였고(SEQ ID NO:17 참조), 아데노바이러스 구축과 합성은 Cyagen(Guangzhou) Biosciences Inc.에서 완료하였다. 아데노바이러스 프로모터 영역과 전사 영역 서열은 pAV[Exp]-UBC>EGFP:T2a:ORF_363bp, 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 프로모터 서열로 구성된다. 측정한 바에 따르면 바이러스 적정 농도(titer)는 1010PFU/mL보다 컸다. U87-MG 세포와 작은 쥐 신경모세포종 세포(N2a) 감염을 거쳐 검증한 바에 따르면, 아데노바이러스는 고효율로 세포를 감염시키고 sDSS1 단백질을 발현시킬 수 있는 것으로 나타났다. 발현 GFP 단백질의 아데노바이러스(pAV[Exp]-UBC>EGFP)는 대조군으로 삼았다.
3. 뇌 입체 정위 주사: 조기노화형 SAMP8 작은 쥐(6개월령, 수컷)는 800mg/kg 체중에 따라 20% 우레탄(urethane)(생리식염수에 용해시키고, 0.22μm 필터로 불순물과 균을 제거함)을 복강내주사하여 마취시켰다. 작은 쥐 마취 후, 작은 쥐 뇌 입체 정위 기구(Stoelting, 51500) 상에 고정시켜 두개골 수평을 유지하였다. 두부 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고 브레그마(Bregma)를 좌표 시작점으로 삼아 측뇌실 영역(0.58mm, 1.25mm, 1.75mm)에 위치를 정하고, 치과 드릴을 이용해 표기점에 구멍을 뚫었다. 미량주사기(Hamilton 600-2.5μL, 바늘 머리 직경이 0.2mm)에 2μL 바이러스액을 흡수시키고, 동일 좌표 수치에 따라 다시 측뇌실 영역의 위치를 정하였다. 지정 좌표값에 따라 신속하게 바늘을 측뇌실 영역에 넣으며, 평균 200nL/min으로 천천히 바이러스액을 주사하였고, 이는 총 1000nL에 달하였다. 주사 완료 후 바늘을 0.25mm 들어 올릴 때마다 3분가량 바늘 머리가 완전히 뇌조직을 밀어낼 때까지 대기하였다. 다른 측의 측뇌실 영역에 다시 위치를 고정하고 바늘 주입, 주사 및 바늘 들기 단계를 완료하고 1μL 바이러스액을 주사하였다. 주사를 완료한 작은 쥐는 먼저 100U/mL의 임피실린(ampicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 이용하여 두개골 및 주변 조직을 닦은 후 다시 봉합선을 이용하여 피부를 봉합하였다. 작은 쥐에 150μL 항생제를 복강내주사하고 작은 쥐가 깨어날 때까지 복부가 위를 향하도록 케이지에 거치하였다.
결과 분석:
도면은 작은 쥐 측뇌실에 바이러스를 주사하는 기본 조작과 아데노바이러스 주사 위치를 도시한 것이다(도 9a). 여기에서, 발현 sDSS1 아데노바이러스 주사 작은 쥐는 총 2회차이며 총 10마리의 작은 쥐이고, 발현 GFP 아데노바이러스 주사 작은 쥐는 2개 회차이고 총 14마리였다. 아데노바이러스 주사 1개월 이내에 대조군 작은 쥐는 3마리 사망하였으나 실험군 작은 쥐는 1마리가 사망하였다. 8개월 이내에 대조군 작은 쥐는 계속해서 사망하였으나, 실험군은 1마리만 사망하였다(도 9b). 상기 결과를 종합하면, 발현 sDSS1 단백질 아데노바이러스 주사 SAMP8 작은 쥐의 수술 후 생존기간은 대조 바이러스만 주사한 작은 쥐보다 현저하게 길었으며, ANOVA 분석에서 양자는 현저한 차이를 나타냈다(P-value< 0.01).
상기에서 나열한 일련의 상세한 설명은 본 발명의 실시가능한 실시예의 구체적인 설명을 위한 것이며, 이는 본 발명의 보호범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 정신을 기반으로 한 동등한 수준의 실시예 또는 이에 대한 변경은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속한다.
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Claims (31)

  1. 유효량의 분비형 결실된 열지증 1(secretory deleted split hand/split foot 1; sDSS1) 단백질을 포함하는, 병원성 폴리펩티드에 노출된 살아있는 세포를 sDSS1 단백질과 세포외에서 접촉시켜 세포 독성으로부터 상기 세포를 보호하기 위한 조성물로서, 상기 sDSS1 단백질은 고급 산화 단백질 생성물(advanced oxidation protein product: AOPP), 아밀로이드-β, 아밀린(amylin) 및 당화 단백질(glycosylated protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 폴리펩티드에 결합하여 세포를 세포 독성으로부터 보호하고, 상기 sDSS1 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 sDSS1 단백질은 세포외에서 병원성 폴리펩티드와 접촉하여 접합체를 형성하고, 상기 접합체는 병원성 폴리펩티드에 노출된 살아있는 세포를 세포 독성으부터 보호하는 것인, 만성 신장 질환, 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병, 또는 당뇨병 합병증을 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 병원성 폴리펩티드는 AOPP인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어나는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 생체 내(in vivo)에서 일어나는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 병원성 폴리펩티드는 아밀로이드-β인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 병원성 폴리펩티드는 아밀린인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 병원성 폴리펩티드는 당화 단백질인, 조성물.
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