CN102755317A - 一类2-吲哚酮衍生物及其药用盐用于制备抗氧化药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，具体而言，本发明涉及2-吲哚酮类化合物衍生物及其药用盐用于制备抗氧化剂的药物用途。对该类化合物的药理学实验表明，该类化合物可通过稳定Nrf2蛋白质稳定性，激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路，上调SOD、NQO1、HO-1、γ-GCS等基因的表达，增强SOD活性，进而增强细胞抗氧化能力。该类化合物可对氧化应激损伤剂6-OHDA诱导的神经母细胞SH-SY5Y细胞死亡具有明显的防护作用，即对模拟脑神经细胞的SH-SY5Y细胞具有抗氧化损伤保护作用。此外，该类化合物还可有效防护双氧水诱导的肝细胞损伤，抑制辐射诱导的细胞死亡及染色体畸变。说明该类化合物在对抗氧化应激损伤、保护脑细胞组织抗氧化中具有积极作用，可以预期其用于制备该类药物的用途。

Description

一类2-吲哚酮衍生物及其药用盐用于制备抗氧化药物的用途

技术领域

本发明涉及一类2-吲哚酮衍生物及其药用盐作为抗氧化应激损伤剂在药物中的应用，属于医药技术领域。 

背景技术

氧化应激是多种高度活化的分子对DNA，蛋白或脂类造成损伤的细胞毒性过程，各种氧化刺激或亲电子试剂均可诱导氧化应激反应，并造成胞内ROS的增高，导致多种疾病如肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病等的发生。机体在氧化应激条件下自发产生的细胞保护反应是由抗氧化蛋白及II相解毒酶来完成的。这些细胞保护基因的表达受到其启动子区的ARE元件及可与ARE结合的Nrf2转录因子调控。Nrf2/ARE信号通路是目前研究最为深入也是机体最主要的抗氧化信号通路，可诱导各种抗氧化蛋白及II相解毒酶的表达，对细胞行使保护作用(Annu Rev Pharmacol Toxicol 47，89-116(2007).)。Nrf2敲除的小鼠在暴露于亚硝胺致癌物BBN时，膀胱癌发生率显著增加，抗癌药物Oltipraz可以Nrf2依赖的方式诱导肝脏及膀胱组织中II相解毒酶的表达，II相解毒酶通过促进BBN的葡萄糖醛酸化，显著降低尿液中终致癌物N2亚硝基胺的浓度，从而显著降低Nrf2野生型小鼠膀胱癌的发生，而对Nrf2敲除小鼠无此保护作用(Cancer Res 64，6424-31(2004))。此外，Nrf2敲除小鼠对高氧诱导的肺部损害及苯并芘诱导的肿瘤生成也高度敏感(Am J Respir Cell Mol Biol 26，175-82(2002).)。Kensler T W等人(Annu Rev Pharmacol Toxicol.，2007，47：89～116)总结了在神经毒剂及致癌剂存在下，Nrf2缺失小鼠与野生型小鼠的差异性(表1)，表明Nrf2缺失小鼠与野生型小鼠相比，对各种刺激具有更强的敏感性。对Nrf2敲除小鼠进行基因表达检测发现，Nrf2的表达下调导致其下游调控的II相解毒酶及抗氧化蛋白的表达明显下调，进一步证实了Nrf2通过诱导细胞保护基因表达行使防御功能。研究表明Nrf2介导的ARE调控基因的活化在多种动物模型疾病如Huntington’s，Parkinson’s，中风及肺气肿等的治疗中起好的作用(Ann Pharmacother 39，2065-72(2005))。 

表1在急性和慢性的毒性条件下，Nrf2缺失小鼠与野生型小鼠相比，具有更强的敏感性。 

Keap1-Nrf2-ARE通路的诱导剂被认为可以作为一种化学预防策略，来预防多种疾病。Satoh T(J Neurochem，2008，104：1116～1131)等人发现，鼠尾草酸(carnosic acid)，一种儿茶酚类的亲电子试剂，可以激活ARE通路，保护PC12细胞避免高浓度谷氨酸的毒性作用，在动物体内的中脑动脉闭塞再灌注模型中可以有效的保护脑组织。Li J(Toxicol Sci.，2005，83(2)：313～328)等人发现具有抗氧化功能的食品添加剂tBHQ，可以激活ARE通路，诱导II相酶的表达，保护人神经干细胞，减轻H₂O₂介导的细胞毒性。CDDO-Im是三萜类化合物中最强的诱导剂之一。它能够非常有效的减少黄曲霉毒素在大鼠体内导致的肝癌发生(Cancer Res.，2006，66(4)：2488～2494)。在1μmol/kg大鼠体重的剂量下，CDDO-Im可以将肿瘤发生前的肝部病灶减少85％，在最高剂量100μmol/kg大鼠体重的剂量下，可以减少99％。在1-100μmol/kg的范围内，CDDO-Im可以抑制40％-90％的黄曲霉毒素-DNA复合物的形成。一种天然来源的绿茶多酚类化合物EGCG可以Nrf2/ARE信号通路依赖的方式保护Aβ诱导的海马神经元的损害，此外，该化合物抗癌、抗动脉粥样硬化、抗炎及抗衰老作用都是基于它强有力的抗氧化活性(Curr Cancer Drug Targets，2006，6：711～727)。以上研究表明，通过各种途径活化Nrf2/ARE信号通路可对由于氧化应激导致的多种疾病的抗氧化治疗具有长远的意义。 

现已发现多种Keap1-Nrf2-ARE通路诱导剂，包括化学合成和天然食物中提取的化合物，包括：异硫氰酸酯，烯烃，苯二胺等种类。但是这些化合物的结构完全不同，表明该通路的激活非常复杂，同时也提示发掘新结构的抗氧化药物仍然有很大空间。 

2-吲哚酮衍生物最早被报道是作为酪氨酸激酶抑制剂，具有抗肿瘤活性，最近我们还发现该类化合物可通过抑制HGF/c-Met活性(中国发明专利，申请号：200710099670.3公开号：CN101314584A)抑制肿瘤细胞侵袭和转移。但对于该类化合物在抗氧化中的活性，目前尚无任何报道。 

发明内容

本发明提供了2-吲哚酮衍生物在抗氧化药物中的用途。本发明发现该类化合物可通过稳定Nrf2蛋白质稳定性，激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路，上调SOD(superoxide dismutase)、NQO1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1)、HO-1(heme oxygenase 1)、γ-GCS(γ-glutamylcysteine synthetase)等抗氧化相关基因的表达，增强SOD活性，进而增强细胞抗氧化能力。该类化合物可对氧化应激损伤剂6-OHDA(6-Hydroxydopamine hydrobromide)诱导的神经母细胞SH-SY5Y细胞死亡具有明显的防护作用，即对模拟脑神经细胞的SH-SY5Y细胞具有抗氧化损伤保护作用。此外，该类化合物还可有效防护双氧水诱导的肝细胞损伤，抑制辐射诱导的细胞死亡及染色体畸变。说明该类化合物在对抗氧化应激损伤、保护脑细胞组织抗氧化中具有积极作用，可以预期其用于制备该类药物的用途。 

附图说明

图1：2-吲哚酮衍生物对Nrf2/ARE信号通路具有激活作用； 

图2：2-吲哚酮衍生物上调Nrf2蛋白质水平； 

图3：2-吲哚酮衍生物增强Nrf2蛋白质稳定性； 

图4：2-吲哚酮衍生物抑制Keap1对Nrf2蛋白质的降解； 

图5：2-吲哚酮衍生物抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞死亡； 

图6：2-吲哚酮衍生物抑制双氧水诱导的肝细胞L02损伤； 

图7：2-吲哚酮衍生物抑制辐射诱导的细胞损伤； 

图8：2-吲哚酮衍生物抑制辐射诱导的染色体畸变； 

图9：2-吲哚酮衍生物在20μM浓度以下对细胞无明显毒性。 

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，描述本发明的具体实验方法，但并不以此限定本发明，本发明的内容不局限于此。通过下列实验证明2-吲哚酮衍生物通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路，抑制氧化应激(氧化应激损伤剂、辐射诱导等)诱导的细胞损伤，提示该类衍生物在制备抗氧化药物中的用途。 

实施例1：将2-吲哚酮衍生物(合成方法参见中国发明专利申请号：200710099670.3公开号：CN101314584A)溶于DMSO，制备成10mM贮存液。 

实施例2：将2-吲哚酮衍生物药用盐溶于水，制备成10mM贮存液。 

实施例3：采用人胚肾细胞株HEK293细胞，培养在DMEM+10％灭活胎牛血清(FBS)的标准生长培养基中。将ARE-Luc报告基因按照本领域常规方法转染入细胞，该报告基因载体的报告系统为荧光素酶报告基因，上游存在ARE反应元件，通过检测荧光素酶活性，可以评价Nrf2/ARE信号通路的活化程度。HEK293转染ARE-Luc载体后8小时，加入2-吲哚酮衍生物处理(4种衍生物结构如图1A所示)，24小时后检测荧光素酶活性。如图1B所示，这些衍生物均可激活Nrf2/ARE信号通路，其中以PMID的活性为最佳。下面的实验均以PMID为例。进一步发现PMID可以剂量依赖的方式激活Nrf2/ARE信号通路(图1C)。利用实时定量PCR方法检测PMID处理HEK293细胞8小时后的基因表达变化，结果如图1D所示，PMID可明显上调抗氧化基因如SOD，NQO1，HO-1，γ-GCS等的表达。进一步利用NQO1启动子的荧光素酶报告基因载体，证实PMID可以增强NQO1启动子的活性(图1E)。为证实SOD的表达上调是有活性，利用SOD活性检测试剂盒(sigma公司试剂盒)，发现PMID处理的HEK293细胞中SOD活性也是明显增加的。该结果表明2-吲哚酮衍生物可激活Nrf2/ARE信号通路，通过上调抗氧化基因的表达，增强细胞抗氧化能力。 

实施例4：2-吲哚酮衍生物可促进Nrf2蛋白质的积累。利用HEK293细胞，进行PMID(10μM PMID)的处理，不同时间点提取总蛋白进行Western blotting检测(方法与本领域常规方法一致)，发现PMID处理可促进Nrf2蛋白质积累，具有时间-效应相关性(图2A)。进一步利用不同剂量的PMID进行处理HEK293细胞，2小时后提取细胞总蛋白进行Western blotting检测，发现PMID可以剂量依赖的方式促进Nrf2蛋白质的积累(图2B) 

实施例5：2-吲哚酮衍生物增强Nrf2蛋白质的稳定性。利用10μM PMID处理HEK293细胞，不同时间点提取细胞总RNA，进行实时定量PCR检测，发现PMID并不上调Nrf2 mRNA的水平(图3A)。利用CHX处理HEK293细胞内源Nrf2蛋白质的合成，发现PMID处理可降低Nrf2蛋白质的降解速度，增强其稳定性(图3B)。图3C是图3B的量化图。 

实施例6：2-吲哚酮衍生物可抑制Keap1对Nrf2的泛素化降解。鉴于Keap1是Nrf2的负调控蛋白质，可通过促进Nrf2蛋白质发生泛素蛋白酶体降解，进而抑制该信号通路的活化。将ARE-Luc及Keap1表达载体共转染HEK293细胞后，进行PMID处理，发现PMID化合物可明显逆转Keap1对ARE报告基因的抑制作用(图4A)。敲低内源性Keap1与Nrf2(图4B)，PMID激活ARE报告基因的活性丧失(图4C)，表明PMID是通过Keap1及Nrf2分子来发挥作用。进一步利用泛素化检测试验(本领域常规方法)，发现PMID可抑制Keap1对Nrf2的泛素化修饰(图4D)，免疫沉淀采用Nrf2蛋白质抗体，Western blotting所用抗体如图所示。 

实施例7：2-吲哚酮衍生物可抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞生长抑制。SH-SY5Y为人神经母细胞，培养方法为RPI1640+10％FBS。6-OHDA为本领域常用的神经细胞损伤毒剂，可通过诱导细胞内活性氧自由基(ROS)增高对神经细胞具有损伤作用。PMID预处理SH-SY5Y细胞2小时后，暴露于6-OHDA中，经过 48小时，计数细胞数目，结果如图5A所示，PMID预处理可抑制细胞数目的减少，这种保护作用具有剂量-效应相关性(图5B) 

实施例8：2-吲哚酮衍生物可抑制双氧水诱导的肝细胞损伤。采用人正常肝细胞株L02细胞，双氧水可明显促进L02细胞的死亡，引起细胞生长抑制。PMID在不同剂量预处理L02细胞2小时后，暴露于700μM的双氧水9小时，去除双氧水后继续培养24小时，MTS方法检测细胞的增殖情况。如图6所示，PMID预处理可抑制双氧水诱导的细胞损伤。 

实施例9：2-吲哚酮衍生物可抑制辐射诱导的细胞增殖抑制。采用人宫颈癌细胞株Hela细胞，照射剂量如图所示，采用不同剂量的PMID进行预处理，不同时间点MTS方法检测细胞的增殖情况。结果如图7所示，0.1μM的PMID预处理可机制辐射诱导的细胞增殖抑制。 

实施例10：2-吲哚酮衍生物可抑制辐射诱导的染色体畸变。采用正常人外周血细胞，照射剂量为1Gy的60Co照射源。PMID预处理不同时间后，进行照射，24小时后收取细胞固定，检测染色体畸变情况。结果如图8所示，PMID在1μM预处理11小时可抑制1Gy照射诱导的人外周血细胞中的染色体畸变。 

实施例10：2-吲哚酮衍生物对细胞生长无明显毒性作用。采用人结肠细胞株IEC6细胞，人正常肝细胞株L02，人宫颈癌细胞株Hela及正常人外周血细胞，检测PMID不同浓度处理后对细胞增殖的影响，结果如图9所示，在20μM以下，化合物无明显毒性，而其活性浓度为1-10μM，提示该化合物毒性较小。 

Claims (2)

1.2-吲哚酮衍生物及其药用盐作为抗氧化药物的用途

2.2-吲哚酮衍生物及其药用盐作为低剂量辐射防护药物的用途

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