KR102599579B1 - 콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents
콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 고초균(Bacillus subtilis)을 이용하여 제조한 금화규 발효물을 나노화 처리하여, 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 또는 피부 미백 효과가 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 대비 증진되는 것을 확인하였으므로 관련 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 전 세계적으로 이너뷰티(Inner Beauty) 열풍이 불고 있다. 이너뷰티는 내면(Inner)의 아름다움(Beauty)을 위한 식품 또는 먹는 화장품을 통해, 기존의 바르는 화장품처럼 피부의 겉만 일시적으로 좋게하는 것이 아니라, 생활습관 및 식습관을 개선하여 근본적인 건강 및 피부 문제를 해결하는 것을 의미한다. 대표적인 제품군으로는 히알루론산(피부 속 수분을 유지시켜 주는 성분), 콜라겐(피부 탄력과 노화방지에 효과적인 성분) 및 비타민을 포함하는 제품, 디톡스 주스 등이 있다. 이너뷰티는 미용기능식품(Nutricosmetics)으로 불리며, 외부로부터 영양을 공급받는 아우터 뉴트리션(Outer Nutrition)에 반대되는 이너 뉴트리션(Inner Nutrition)의 중요성이 강조되면서 화장품과 식품의 중간 형태로 이너뷰티 개념이 등장하였다. 2018년 8월에 시장전문기관인 Technavio에서 세계 이너뷰티 시장의 향후 전망에 대해 연평균 성장률 5.3%를 예상한다고 보고한 바 있다.
이너뷰티 제품은 일반 식품과 달리 인체 안전성과 기능성을 중시하고 있어, 주요 원료에 대한 중요성이 확대되고 있으므로, 일일섭취량 안전성 여부, 독성 여부, 섭취 시 주의사항 등 건강기능식품의 안전지침을 반영하여 건강기능식품에 준하는 제품 개발에 대한 연구가 필요하다. 현재 이너뷰티 제품의 소재로 해외 수입 원료가 주로 활용되고 있어, 이에 다양한 국내 천연물 소재의 개발을 위한 활발한 연구 개발이 필요한 실정이다.
한편, 금화규(Hibiscus manihot)는 아욱과의 한해살이풀로, 중국이 원산지이고 밭에서 재배하며 닥풀 또는 황촉규라고도 한다. 한방에서 꽃을 황촉규화, 뿌리를 황촉규근, 종자를 황촉규자라는 약재로 쓴다. 황촉규화는 통증 때문에 소변을 잘 못보는 증세를 치료하고 종기, 화상에 외용한다고 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제1857528호에서는 '금화규 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1951156호에서는 '금화규가 함유된 비누의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 금화규 비누'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 미세 비드(bead)를 이용한 나노화 공정을 통해 금화규 발효물의 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 또는 피부 미백 효과가 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 나노화 처리한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 피부 주름개선 또는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노화 처리한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 피부 주름개선 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 물, 금화규 꽃 분말 및 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 접종하여 발효하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 처리하는 단계;를 포함하는 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 콜라겐, 아미노산, 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 고초균(Bacillus subtilis)을 이용하여 제조한 금화규 발효물을 나노화 처리하여, 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 또는 피부 미백 효과가 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 대비 증진되는 것을 확인하였으므로 관련 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 단백질 함량을 측정한 결과이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 단백질 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 2는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 아미노산 함량을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 아미노산 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 3은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 콜라겐 함량을 측정한 결과이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 콜라겐 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 4는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% BHT는 양성 대조군으로 사용한 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)이다. *, ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.01% BHT 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 자유 라디칼 소거 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 5는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 폴리페놀(A) 및 플라보노이드(B) 함량을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. **, ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 6은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% IDM은 양성 대조군으로 사용한 인도메타신(indomethacin)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% IDM 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 리폭시게나아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 7은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 엘라스타아제 저해 활성을 분석한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% US는 양성 대조군으로 사용한 우르솔산(ursolic acid)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% US 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 엘라스타아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 8은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% ABT는 양성 대조군으로 사용한 알부틴(arbutin)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% ABT 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 티로시나아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 2는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 아미노산 함량을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 아미노산 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 3은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 콜라겐 함량을 측정한 결과이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 콜라겐 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 4는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% BHT는 양성 대조군으로 사용한 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)이다. *, ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.01% BHT 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 자유 라디칼 소거 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 5는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 폴리페놀(A) 및 플라보노이드(B) 함량을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. **, ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 나노화 처리한 금화규 발효물의 폴리페놀 또는 플라보노이드 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 6은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% IDM은 양성 대조군으로 사용한 인도메타신(indomethacin)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% IDM 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 리폭시게나아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 7은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 엘라스타아제 저해 활성을 분석한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% US는 양성 대조군으로 사용한 우르솔산(ursolic acid)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% US 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 엘라스타아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
도 8은 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과로, 증류수 처리군 대비(%)로 나타내었다. 0.1% ABT는 양성 대조군으로 사용한 알부틴(arbutin)이다. ***은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물에 비해 0.1% ABT 또는 나노화 처리한 금화규 발효물의 티로시나아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, ***은 p<0.001이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노화 처리한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 피부 주름개선 또는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 금화규는 바람직하게는 금화규 꽃인 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항산화, 항염증, 피부 주름개선 또는 피부 미백용 건강기능식품 조성물에서, 상기 나노화 처리한 금화규 발효물은 금화규 꽃 분말에 고초균(Bacillus subtilis) 배양액을 접종하여 20~40℃에서 1~5일 동안 발효한 후, 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하여 획득한 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 30℃에서 3일 동안 발효한 후, 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 40℃에서 2시간 또는 4시간 동안 나노화 처리하여 획득한 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 '나노화(nanorization)'는 발효물 내 입자를 나노 크기로 분쇄하는 것으로, 바람직하게는 미세 비드(bead)을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 대비 단백질 함량, 아미노산 함량, 콜라겐 함량, 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 효과 또는 피부 미백 효과가 증진되었다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 나노화 처리한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 피부 주름개선 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 물, 금화규 꽃 분말 및 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 접종하여 발효하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 처리하는 단계;를 포함하는 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 항산화 활성, 항염 활성, 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물은
(a) 물 100 중량부에 대하여 0.5~1.5 중량부의 금화규 꽃 분말 및 0.5~1.5 중량부의 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 5~15%(v/v) 농도로 접종하여, 20~40℃에서 1~5일 동안 발효하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,
바람직하게는
(a) 물 100 중량부에 대하여 1 중량부의 금화규 꽃 분말 및 1 중량부의 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 10%(v/v) 농도로 접종하여, 30℃에서 3일 동안 발효하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 40℃에서 2시간 또는 4시간 동안 나노화 처리하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 나노화 처리한 금화규 발효물의 제조
본 발명에 사용된 금화규는 충청북도 청주시 소재의 ㈜고운블랙에서 구입한 금화규 꽃 분말을 사용하였다. 증류수 100㎖에 금화규 꽃 분말 1g과 포도당 1㎖을 첨가한 후, 오토클레이브(autoclave)를 이용하여 121℃에서 15분 동안 멸균하여 금화규 꽃 멸균액을 준비하였다. TSB(tryptic soy broth) 배지에서 1일 동안 전배양한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 91157) 균주의 배양액을 상기 금화규 꽃 멸균액에 10%(v/v)로 접종하고, 30℃에서 3일 동안 발효하여 금화규 발효물을 제조하였다. 상기 금화규 발효물을 미세 비드(bead)를 사용한 Nano Max Mill(ARMSTEC) 장치에서 40℃로 2시간 및 4시간 동안 입자를 분쇄하여, 나노화 처리한 금화규 발효물을 제조하였다.
비교예로서, TSB(tryptic soy broth) 배지에서 1일 동안 전배양한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 91157) 균주의 배양액을 상기 금화규 꽃 멸균액의 10%(v/v)로 접종하고, 30℃에서 3일 동안 발효하였고, 원심분리한 후 상등액을 회수하여 금화규 발효물을 제조하였다.
실시예 1. 나노화 처리한 금화규 발효물의 특성 분석
(1) 당도 및 pH 측정
나노화 처리한 금화규 발효물의 당도와 pH를 각각 측정하였다. 당도는 총 가용성 고형물(total soluble solids, Brix) 함량을 당도계(Hand refractormeter, Germany)로 측정하여 나타내었고, pH는 pH 미터기(SevenCompactTM pH/Ion S220, Switzerland)를 이용하여 3회 측정한 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물과 다른 특성을 나타내는 것을 확인하였다(표 1).
| 실험군 | pH | 당도 |
| 금화규 발효물 | 8.78 | 6.8 |
| 2시간 나노화 처리한 금화규 발효물 | 8.87 | 6.7 |
| 4시간 나노화 처리한 금화규 발효물 | 9.04 | 6.7 |
(2) 단백질 함량 측정
BCA(bicinchoninic acid)를 이용한 단백질 정량법을 통하여 나노화 처리한 금화규 발효물 내의 단백질 함량을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 단백질 함량이 높은 것을 확인하였다(도 1).
(3) 아미노산 함량 측정
닌하이드린(Ninhydrin)을 이용한 아미노산 정량법을 통하여 나노화 처리된 금화규 발효물 내의 아미노산(시스틴, 메티오닌, 세린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 시트룰린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 아미노뷰티르산, 히스티딘, 오르니틴, 리신, 암모니아 및 아르기닌) 총 함량을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 아미노산 함량이 높은 것을 확인하였다(도 2).
(4) 콜라겐 함량 분석
나노화 처리한 금화규 발효물 내의 콜라겐 함량을 측정하였다. 검은색 평판( black flat-bottom) 96웰 플레이트에 0, 15, 30 및 50㎍/㎖ 콜라겐과 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 나노화 처리한 금화규 발효물을 각각 20㎕ 분주한 후, Digest Mix 30㎕를 넣고 혼합하여 호일로 감싼 뒤, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 그 다음, 염색 시약 40㎕을 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 현상액(developer) 10㎕를 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 흡수 파장은 375 nm이고 발광 파장은 465 nm로 하는 조건으로 형광 강도를 측정하였으며, 하기 식에 따라 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 콜라겐 함량이 높은 것을 확인하였다(도 3).
실시예
2. 항산화 활성 분석
(1) DPPH 자유 라디칼 소거능 분석
항산화 활성은 Blois 등의 방법에 따라 분석하였다. 에탄올 100㎖에 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 16㎎을 녹인 후 증류수 100㎖을 혼합하여 와트만 여과지(Whatman filter paper, NO.2)에 여과시켜 DPPH 반응용액을 만들었다. DPPH 자유 라디칼 소거 활성은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 나노화 처리한 금화규 발효물 각각 0.4㎖에 상기 DPPH 반응용액 4.6㎖을 넣어 잘 혼합한 후 암실에서 30분간 반응시켜 분광광도계(Hitachi U-2900, Japan)로 528 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래 식에 대입하여 산출하였다. 이때, 합성 항산화제 0.1% BHT(Butylated hydroxytoluene)를 양성 대조군으로 이용하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거 활성(%)=[1-(A/B)×100]
A : 528 nm에서 시료 첨가된 DPPH 용액의 흡광도
B : 528 nm에서 시료 무첨가 DPPH 용액의 흡광도
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 자유 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인하였다(도 4).
(2) 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 분석
폴리페놀(polyphenol)은 대표적인 항산화 물질 중 하나로, 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA를 보호하고 세포 구성 단백질 및 효소를 보호한다. 플라보노이드(flavonoid)는 식물 유래 폴리페놀 계열의 화합물로, 항산화, 항염, 항암 등의 효과가 있다고 알려져 있다.
총 페놀성 화합물 측정 어세이(Total phenolic compounds measuring assay) 및 총 플라보노이드 화합물 측정 어세이(Total flavonoids compounds measuring assay)를 이용하여 나노화 처리한 금화규 발효물 내의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인하였다(도 5).
이상의 결과를 통해, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 항산화 활성이 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예
3. 항염 활성 분석
리폭시게나아제(lipoxygenase)는 정상적인 세포에서는 활성이 미비하지만, 염증이 유발되면 류코트리엔(leukotrienes) 물질의 증가로 인해 활성이 증가한다. 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 나노화 처리한 금화규 발효물 각각 100㎕에 200mM 보레이트 완충액(borate buffer, pH 9.0) 1㎖을 넣은 후, 기질인 리놀렌산(linoleic acid, 0.6 mM/㎖ in ethanol) 2㎖을 추가하여 혼합한 후 234 nm에서 보정값을 측정하였다. 이후, 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 나노화 처리한 금화규 발효물 각각에 10,000unit/㎖의 리폭시게나아제 100㎕를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 234 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 0.1% 인도메타신(indomethacin, IDM)을 사용하였으며, 리폭시게나아제 억제 활성(%)은 다음과 같은 식에 의해 산출하였다.
리폭시게나아제 억제 활성(%)={1-(b'-b)/(a'-a)}×100
a: 효소 무첨가군
a': 효소 첨가군
b: 효소 무첨가 및 시료 첨가군
b': 효소 및 시료 첨가군
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 리폭시게나아제 억제 활성이 우수한 것을 확인하였고, 양성 대조군인 0.1% 인도메타신보다 리폭시게나아제 억제 활성이 우수한 것을 확인함으로써, 나노화 처리한 금화규 발효물의 항염 효과가 증진된 것을 알 수 있었다(도 6).
실시예 4. 피부 주름개선 활성 분석
본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 피부 미백 활성을 분석하기 위하여 엘라스타아제(elastase) 저해 활성을 측정하였다. 엘라스타제 특이적인 기질인 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 1,300㎕에 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물 각각 100㎕와 0.12M Tris-HCl(pH 8.0) 100㎕를 혼합하여 96웰 플레이트에 분주하고, 엘라스타아제를 20초 간격으로 100㎕씩 분주하여 실온에 10분 반응시킨 뒤, 20초 간격으로 410 nm에서 흡광도를 측정한 후 하기식에 대입하여 엘라스타아제 저해 활성을 산출하였다. 양성 대조군으로는 엘라스타아제 저해제로 알려진 0.1% 우르솔산(ursolic acid)을 사용하였다.
엘라스타아제 저해 활성(%)=[1-(A/B)]×100
A : 시료 처리군의 흡광도
B : 시료 무처리군의 흡광도
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 엘라스타아제 저해 활성이 우수한 것을 확인하였고, 양성 대조군인 0.1% 우르솔산보다 엘라스타아제 저해 활성이 우수한 것을 확인함로써, 나노화 처리한 금화규 발효물이 피부 주름개선 활성이 있음을 알 수 있었다(도 7).
실시예 5. 피부 미백 활성 분석
본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물의 피부 미백 활성을 분석하기 위하여 in vitro 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 저해 활성을 측정하였다. 1.5㎖ 플라스틱 큐벳(plastic cuvette)에 2.5mM L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine) 0.3㎖, 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물 또는 나노화 처리한 금화규 발효물 각각 0.1㎖ 및 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)을 혼합하여 25℃에서 반응시켰다. 이후, 1,380units/㎖ 머쉬룸 티로시나아제(Sigma, USA) 0.05㎖을 넣고 25℃에서 2분간 반응시켜 분광광도계를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정한 후 하기식에 대입하여 티로시나아제 저해 활성을 산출하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성 대조군으로는 티로시나아제 저해제로 알려진 0.1% 알부틴(arbutin)을 사용하였다.
티로시나아제 저해 활성(%)=100-[(A-B)/A]×100
A : 시료가 들어있지 않은 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이
B : 시료가 들어있는 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이
그 결과, 본 발명의 나노화 처리한 금화규 발효물은 나노화 처리하지 않은 금화규 발효물보다 티로시나아제 저해 활성이 우수함을 확인함으로써, 나노화 처리한 금화규 발효물이 피부 미백 활성이 있음을 알 수 있었다(도 8).
Claims (7)
- 금화규 꽃 분말에 고초균(Bacillus subtilis) 배양액을 접종하여 20~40℃에서 1~5일 동안 발효한 후, 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하여 제조한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선 또는 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 금화규 꽃 분말에 고초균(Bacillus subtilis) 배양액을 접종하여 20~40℃에서 1~5일 동안 발효한 후, 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하여 제조한 금화규 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선 또는 피부 미백용 화장료 조성물.
- (a) 물, 금화규 꽃 분말 및 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 접종하여 20~40℃에서 1~5일 동안 발효하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하는 단계;를 포함하는 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물의 제조방법. - 제6항에 있어서,
(a) 물 100 중량부에 대하여 0.5~1.5 중량부의 금화규 꽃 분말 및 0.5~1.5 중량부의 포도당을 혼합하고 멸균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 금화규 꽃 멸균액에 고초균(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 5~15%(v/v) 농도로 접종하여, 20~40℃에서 1~5일 동안 발효하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 발효물을 나노화 장치에서 미세 비드(bead)를 이용하여 30~50℃에서 1~5시간 동안 나노화 처리하는 단계;를 포함하는 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 증진된 나노화 처리한 금화규 발효물의 제조방법.
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| 염유정. 특이환경 유래 Bacillus sp.를 활용한 금화규(Abelmoschus manihot L.) 발효 산물의 항산화 및 항염증 효과 연구. 신라대학교 일반대학원 이학 석사 학위논문. 2021년 2월. 1부.* |
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