KR102580373B1 - 프로테우스 미라빌리스에 대한 길항 작용 및 신경퇴행성 질환에 대한 우수한 효과를 갖는 신규한 균주 및 이의 용도 - Google Patents
프로테우스 미라빌리스에 대한 길항 작용 및 신경퇴행성 질환에 대한 우수한 효과를 갖는 신규한 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 웨이셀라 시바리아 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) 균주 및 이를 포함하는 조성물은 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)에 대한 항균 활성뿐만 아니라 신경독성 유도 신경세포 사멸에 대한 보호능, 알파-시누클레인 (α-synuclein) 응집에 대한 억제능 및 안전성을 가짐으로써, 우수한 신경퇴행성 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 동물용 사료 조성물로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 웨이셀라 시바리아 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)에 대한 항균 활성 및 신경퇴행성 질환에 대한 우수한 효과를 갖는 신규한 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 노인 인구의 급증과 더불어 다양한 신경퇴행성 질환 환자의 증가로 이에 대한 치료와 예방에 관심이 고조되고 있다. 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)은 신경 세포의 기능 감소 또는 소실로 인해 운동장애, 기억장애, 인지장애 등 여러 가지 병증을 유발하는 질병이다. 신경 세포는 신경계 질환에서뿐만 아니라 정상 성인의 뇌에서도 매일 많은 숫자가 죽어가며, 노화에 따라서 죽는 신경 세포수는 기하급수적으로 증가한다.
신경퇴행성 질환에 속하는 주요 질병으로는 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병 등이 있고, 현재까지 상기 질환의 발병기전이 완전히 밝혀지지 않았다. 알츠하이머병의 치료제로는 아세틸콜린에스테라제 억제제 또는 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 수용체 길항제 등이 사용되고 있고, 파킨슨병의 치료제로 L-dopa, 도파민 작용제, MAO-B 억제제, 또는 COMT 억제제 등이 사용되고 있으며, 헌팅턴병의 치료제로 도파민 D2 수용체 등이 있으나, 상기 치료제들은 모두 신경전달 과정을 타깃하는 것이므로 상기 치료제들을 이용한 방법은 근본적인 치료가 아닌 증상을 완화시키는 것에 불과하다. 따라서 근본적인 치료가 가능한 신규 약물이 지속적으로 요구되어 있다.
한편, 뇌와 장은 서로 긴밀하게 연결되어 상호작용을 하고 있으며, 장에 존재하는 장내 미생물은 장내 환경의 항상성을 유지하고 뇌의 신경전달물질의 생성에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 장내 미생물의 변화는 비만, 당뇨병 등의 대사성 질환뿐만 아니라 우울증, 자폐증 등의 정신질환, 및 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경퇴행성 질환과도 연관성이 있음이 밝혀지고 있다.
더불어 파킨슨 환자의 변에서 엔테로박테리아 계통(Enterobacteriaceae family) 균주의 증가와 파킨슨병의 연관성에 관한 임상 보고가 있으며, 특히 한국 등록특허 제10-1860566호에서는 파킨슨병 동물 모델에 엔테로박테리아 계통에 속하는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균주가 존재하고, 상기 프로테우스 미라빌리스 균주가 파킨슨병의 유발에 직접적으로 관여하는 것을 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 프로테우스 미라빌리스 균주의 생육을 억제하는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 발견하고, 상기 균주의 신경퇴행성 질환에 대한 우수한 개선 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성, 신경세포 사멸에 대한 보호능 및 알파-시누클레인 응집에 대한 억제능을 갖는 웨이셀라 시바리아 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 웨이셀라 시바리아 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 웨이셀라 시바리아 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 웨이셀라 시바리아 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903), 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054), 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014), 웨이셀라 시바리아 200022 (Weissella cibaria 200022), 웨이셀라 시바리아 SFL001 (Weissella cibaria SFL001), 웨이셀라 시바리아 FCK913 (Weissella cibaria FCK913), 웨이셀라 시바리아 JJW001 (Weissella cibaria JJW001), 웨이셀라 시바리아 SLW6932 (Weissella cibaria SLW6932), 웨이셀라 시바리아 P8 (Weissella cibaria P8), 웨이셀라 시바리아 P9 (Weissella cibaria P9) 및 웨이셀라 시바리아 P26 (Weissella cibaria P26) 균주를 포함하며, 바람직하게는 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903), 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054), 및 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014)를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 동물용 사료 조성물은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하며, 신경독성 유도 신경세포 사멸에 대한 보호 효과 및 알파-시누클레인(α-synuclein) 응집에 대한 억제 효과를 갖는다.
본 발명의 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 동물용 사료 조성물은 항생제 내성, 항생제 내성 유전자, 독성 유전자, 용혈 (hemolytic) 활성, 뮤신 분해능, 젤라틴 액화능, 우레아제 (urease) 활성, 인돌 생성능, 베타-글루쿠로니다아제 (α-glucuronidase) 활성, 세포 독성, 복합담즙산 분해 (bile salt deconjugation) 활성, 및 생체아민 생성능으로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상의 활성을 나타내지 않아 안전성을 갖는다.
본 발명의 상기 퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질 및 뇌졸중을 포함하며, 바람직하게는 파킨슨병일 수 있다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903) 균주 (기탁번호: KCCM13224P)를 제공한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054) 균주 (기탁번호: KCCM13225P)를 제공한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014) 균주 (기탁번호: KCCM13226P)를 제공한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 조성물을 신경퇴행성 질환을 갖는 대상에 투여하는 것을 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료의 용도를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 신규한 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 조성물은 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성뿐만 아니라 신경독성 유도 신경세포의 사멸에 대한 보호능, 알파-시누클레인 응집에 대한 억제능 및 안전성을 가짐으로써, 우수한 신경퇴행성 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 동물용 사료 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 뇌신경세포에서 웨이셀라 시바리아 균주에 의한 세포 생존율을 나타낸다.
도 2는 장분비세포에서 웨이셀라 시바리아 균주에 의한 알파-시누클레인 정도를 나타낸다.
도 3은 장분비세포에서 웨이셀라 시바리아 균주의 사균체에 의한 농도별 알파-시누클레인 정도를 나타낸다.
도 4는 웨이셀라 시바리아 SPW2014 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 웨이셀라 시바리아 SGW054 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 웨이셀라 시바리아 CHK903 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 웨이셀라 시바리아 균주의 β형 용혈 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 웨이셀라 시바리아 균주의 뮤신 분해 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 웨이셀라 시바리아 균주의 젤라틴 액화 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 웨이셀라 시바리아 균주의 우레아제 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 웨이셀라 시바리아 균주의 인돌 생성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 웨이셀라 시바리아 균주의 세포 독성 확인을 위한 세포생존율을 나타낸다.
도 13은 웨이셀라 시바리아 균주의 쓸개즙산염 가수분해효소 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 14는 웨이셀라 시바리아 균주의 생체아민 검출을 위한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 2는 장분비세포에서 웨이셀라 시바리아 균주에 의한 알파-시누클레인 정도를 나타낸다.
도 3은 장분비세포에서 웨이셀라 시바리아 균주의 사균체에 의한 농도별 알파-시누클레인 정도를 나타낸다.
도 4는 웨이셀라 시바리아 SPW2014 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 웨이셀라 시바리아 SGW054 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 웨이셀라 시바리아 CHK903 균주의 E-test 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 웨이셀라 시바리아 균주의 β형 용혈 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 웨이셀라 시바리아 균주의 뮤신 분해 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 웨이셀라 시바리아 균주의 젤라틴 액화 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 웨이셀라 시바리아 균주의 우레아제 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 웨이셀라 시바리아 균주의 인돌 생성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 웨이셀라 시바리아 균주의 세포 독성 확인을 위한 세포생존율을 나타낸다.
도 13은 웨이셀라 시바리아 균주의 쓸개즙산염 가수분해효소 활성 확인 실험 결과를 나타낸다.
도 14는 웨이셀라 시바리아 균주의 생체아민 검출을 위한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 신규한 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria)는 비교적 최근에 발견된 유산균으로, 발효 식품을 포함한 여러 식품에서 발견된다. 우리나라의 김치에서 주로 발견되며, 김치의 우점종 중 하나로 김치의 발효 초기에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 비교적 적은 양의 유산을 생성하며 기능성 세포 외 다당류를 생성하는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명의 웨이셀라 시라비아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903), 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054), 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014), 웨이셀라 시바리아 200022 (Weissella cibaria 200022), 웨이셀라 시바리아 SFL001 (Weissella cibaria SFL001), 웨이셀라 시바리아 FCK913 (Weissella cibaria FCK913), 웨이셀라 시바리아 JJW001 (Weissella cibaria JJW001), 웨이셀라 시바리아 SLW6932 (Weissella cibaria SLW6932), 웨이셀라 시바리아 P8 (Weissella cibaria P8), 웨이셀라 시바리아 P9 (Weissella cibaria P9) 또는 웨이셀라 시바리아 P26 (Weissella cibaria P26)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903) 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13224P).
본 발명의 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054) 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13225P).
본 발명의 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014) 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13226P).
본 발명의 웨이셀라 시바리아 200022 (Weissella cibaria 200022), 웨이셀라 시바리아 SFL001 (Weissella cibaria SFL001), 웨이셀라 시바리아 FCK913 (Weissella cibaria FCK913), 웨이셀라 시바리아 JJW001 (Weissella cibaria JJW001), 웨이셀라 시바리아 SLW6932 (Weissella cibaria SLW6932), 웨이셀라 시바리아 P8 (Weissella cibaria P8), 웨이셀라 시바리아 P9 (Weissella cibaria P9) 및 웨이셀라 시바리아 P26 (Weissella cibaria P26) 균주는 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성 및 신경퇴행성 질환에 대한 우수한 효과를 가지며, 배양조건, 보존조건, 복원조건 및 생존시험조건은 하기와 같다.
<배양조건>
- 배지조성: MRS (1.0 % peptone, 1.0 % beef extract, 0.4 % yeast extract, 2.0 % glucose, 0.5 % sodium acetate trihydrate, 0.1 % polysorbate 80, 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate, 0.2 % triammonium citrate, 0.02 % magnesium sulfate heptahydrate, 0.005 % manganese sulfate tetrahydrate)
- 배양 온도: 37℃
- 배지 pH: pH 6.2
- 배양 시간: 24시간
- 산소 요구성: 통성혐기성
- 액체 정치 배양
<보존조건>
- 동결 건조
- 분산제: 조성 10% skim milk, pH 6.8, 살균조건 121℃, 15분
- 진공도: 5 ~ 10 mmHg
- 동결 온도: -40 ~ -50℃
<복원조건>
- 복원제: 조성 MRS 배지, pH 6.2, 살균조건 121℃, 15분
- 복원 온도: 37℃
<생존시험조건>
- PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 동결 건조된 균체 분말을 현탁한 후 15분 정치 후 MRS 액체 배지와 MRS agar plate에 접종한 후 37 ℃에서 24시간 배양
일 실시태양에서, 상기 웨이셀라 시바리아 균주는 김치 또는 감귤에서 분리된 것일 수 있다.
상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질 및 뇌졸중일 수 있으며, 바람직하게 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성, 신경독성 유도 신경세포 사멸에 대한 보호능, 알파-시누클레인 응집에 대한 억제능 및 안전성을 갖는다.
상기 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)는 그람 음성 막대균으로서 엔테로박테리아 계통(Enterobacteriaceae faimily)에 속하며, 염증을 유발하는 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)를 생합성하는 균주로 알려져 있다. 또한, 한국 등록특허 제10-1860566호에 개시된 바와 같이 프로테우스 미라빌리스는 파킨슨병의 유발에 직접적으로 관여하는 것이 입증되었다.
상기 신경독성 또는 신경독소는 뉴런, 시냅스 또는 신경계에 대해 전체로서 특이적으로 작용하는 독소로, 뇌 구조에 손상을 일으켜 만성 질환을 유도하는 물질이다. 신경독소는, 예를 들어 아드레날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 흥분독소 및 다른 신경독소를 포함한다. 아드레날린성 신경독소의 예는 N-(2-클로로에틸)-N-에틸-2-브로모벤질아민 히드로클로라이드를 포함하고, 콜린성 신경독소의 예는 아세틸에틸콜린 머스타드 히드로클로라이드를 포함한다. 도파민성 신경독소의 예는 6-히드록시도파민 HBr(6-OHDA), 1-메틸-4-(2-메틸페닐)-1,2,3,6-테트라히드로-피리딘 히드로클로라이드, 1-메틸-4-페닐-2,3-디히드로피리디늄 퍼클로레이트, N-메틸-4-페닐-1,2,5,6-테트라히드로피리딘 HCl(MPTP), 1-메틸-4-페닐피리디늄 아이오다이드(MPP+), 파라콰트 및 로테논을 포함하고, 흥분독소의 예는 NMDA 및 카인산을 포함한다. 상기 MPTP, MPP+, 파라콰트, 로테논 및 6-OHDA는 동물 모델에서 파킨슨병 유사 증상을 유도하는 것으로 알려져 있다.
상기 알파-시누클레인(α-synuclein)은 뇌세포 사이에 신경전달을 돕는 단백질로, 이 단백질의 과다발현이 파킨슨병을 일으키는 주요 원인이라는 것이 알려져 있다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 웨이셀라 시바리아 균주 및 상기 신경퇴행성 질환에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 균주는 배양액, 사균체, 내부인자 또는 균체인 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 분말, 과립, 정제, 피복정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 현탁액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 좌제, 에멀전제, 페이스트제(pastes), 연고제, 크림제, 로션제, 산제, 분무제 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 상기 제제화를 위해 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 등의 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 웨이셀라 시바리아 균주 및 상기 신경퇴행성 질환에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 균주는 배양액, 사균체, 내부인자 또는 균체인 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품, 유제품, 발효제품 또는 식품 첨가물일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 액제, 페이스트, 겔, 또는 젤리 등의 형태를 포함하며, 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명은 웨이셀라 시바리아 균주 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물을 제공한다.
상기 웨이셀라 시바리아 균주 및 상기 신경퇴행성 질환에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 균주는 배양액, 사균체, 내부인자 또는 균체인 것일 수 있다.
상기 동물 사료용 조성물, 사료용 조성물 또는 사료는 동물에게 주는 먹이로서, 동물의 생명을 유지하고 동물을 사육하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 동물 사료용 조성물은 사료를 섭취하는 개체(동물)가 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "개선"은 조성물의 투여로 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
프로테우스 미라빌리스(
Proteus mirabilis
)에 항균 활성을 나타내는 유산균 스크리닝
총 987종의 유산균을 대상으로 프로테우스 미라빌리스에 항균 활성을 나타내는 유산균을 선별하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
1-1. 유산균의 배양과 배양 상등액 제조
딥 프리저(Deep freezer, -80℃)에 보관중인 유산균을 해동하여 MRS agar 배지에 생육시킨 후 생성된 콜로니(colony)를 새로운 MRS agar 배지(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 계대배양하였다. 계대배양한 유산균의 콜로니를 1 mL의 MRS broth에 접종하여 37 ℃에서 20시간 배양한 후 14,000Xg에서 5분간 원심분리하여 배양 상등액을 확보하였다.
1-2. 프로테우스 미라빌리스의 배양
프로테우스 미라빌리스 균주((주)메타센테라퓨틱스)를 nutrient broth(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 접종하여 37 ℃에서 20시간 동안 200 rpm에서 진탕 배양하여 배양액을 제조하였다.
1-3. 1차 스크리닝: Top agar를 이용한 페이퍼 디스크 방법에 의한 항균활성 측정
Nutrient 배지에 0.8% agar를 첨가하여 top agar를 제조하고 오토클레이브(autoclave)하였다. 프로테우스 미라빌리스 배양액을 100 μL 첨가한 후 nutrient agar 배지에 오버레이하였다. 여기에 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc; Advantec, Diameter: 6 mm)를 올려 놓고 유산균 배양 상등액 10 μL를 적하한 후 37 ℃에서 20시간 배양하여 생성된 프로테우스 미라빌리스의 생육 저지환의 지름을 측정하였다.
총 987종의 유산균을 대상으로 프로테우스 미라빌리스의 생육 저지환의 지름을 측정한 결과, 대부분의 유산균주는 프로테우스 미라빌리스에 대한 생육 저해 활성을 나타내지 않았고, 일부 유산균주만이 생육 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 프로테우스 미라빌리스의 생육 저지환의 지름이 10 mm 이상을 나타내는 50종의 유산균을 항균활성이 우수한 균주로 판단하여 선별하였다.
1-4. 2차 스크리닝: McFarland 용액을 이용한 페이퍼 디스크 방법에 의한 항균활성 측정
상기 1차 스크리닝에서 선별된 유산균 50종을 대상으로 McFarland 용액을 이용한 페이퍼 디스크 방법에 의해 유산균 배양 상등액의 항균활성을 3회 반복하여 측정하였다. McFarland 용액을 이용한 페이퍼 디스크 방법은 지시균주(Proteus mirabilis)의 세포 농도를 일정하게 유지할 수 있기 때문에 지시균주의 세포 수 차이에 의한 항균활성 오차를 줄일 수 있는 방법이다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 총 50종의 유산균을 대상으로 프로테우스 미라빌리스의 생육 저지환의 지름을 측정한 결과, Weissella cibaria 균주들은 다른 균주와 비교하여 현저히 우수한 효과를 나타내었다. 특히, Weissella cibaria CHK903 균주가 16 mm로 가장 우수한 평균값을 나타내었고, Weissella cibaria SGW054 및 Weissella cibaria SPW2014 균주가 14 mm로 우수한 평균값을 나타내었다. 또한, Weissella cibaria 200022, Weissella cibaria SFL001, Weissella cibaria JJW001, Weissella cibaria SLW6932 및 Weissella cibaria P26 균주가 13 mm로, Weissella cibaria FCK913, Weissella cibaria P8 및 Weissella cibaria P9 균주가 12 mm로 우수한 평균값을 나타내었다.
| 유산균 | 균주 No. | 생육 저지환의 지름(mm) | ||||
| Top agar 방법 | McFarland 방법 | |||||
| 1st | 2nd | 3rd | Mean | |||
| Weissella cibaria | 200022 | 10 | 10 | 16 | 13 | 13 |
| Weissella cibaria | SFL001 | 10 | 10 | 14 | 14 | 13 |
| Weissella cibaria | CHK903 | 15 | 15 | 14 | 18 | 16 |
| Weissella cibaria | FCK913 | 10 | 10 | 14 | 13 | 12 |
| Weissella cibaria | JJW001 | 10 | 10 | 14 | 15 | 13 |
| Weissella cibaria | SGW054 | 11 | 11 | 16 | 16 | 14 |
| Weissella cibaria | SLW6932 | 10 | 10 | 15 | 15 | 13 |
| Weissella cibaria | SPW2014 | 11 | 11 | 18 | 14 | 14 |
| Weissella cibaria | P8 | 10 | 10 | 13 | 12 | 12 |
| Weissella cibaria | P9 | 11 | 11 | 12 | 14 | 12 |
| Weissella cibaria | P26 | 12 | 12 | 15 | 12 | 13 |
상기 1차(Top agar 방법) 및 2차(McFarland 방법) 스크리닝 결과에 있어서, 공통적으로 생육 저지환의 지름이 10 mm 이상의 mean 값을 나타내는 균주 중 지시균주의 세포 수 차이에 의한 항균활성 오차를 줄일 수 있는 McFarland 방법에 의한 결과에서 높은 값을 갖는 것을 최종 선별의 기준으로 삼아 생육 저지환의 지름이 14 mm 이상의 가장 높은 mean 값을 나타낸 균주 3종을 선별하였다.
따라서, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, Weissella cibaria CHK903, Weissella cibaria SGW054 및 Weissella cibaria SPW2014 균주를 프로테우스 미라빌리스에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내는 균으로 선정하였고, 하기의 실시예에서 상기 3개의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로 추가의 실험을 수행하였다.
또한, 상기 Weissella cibaria CHK903 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였고(기탁번호: KCCM13224P), Weissella cibaria SGW054 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였으며(기탁번호: KCCM13225P), Weissella cibaria SPW2014 균주는 한국미생물보존센터에 2022년 8월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13226P).
| 유산균 | 균주 No. | 생육 저지환의 지름(mm) | 출처 |
| Weissella cibaria | CHK903 | 16 | 부추김치 |
| Weissella cibaria | SGW054 | 14 | 갓김치 |
| Weissella cibaria | SPW2014 | 14 | 감귤 |
추가로, 하기 표 3의 72종의 유산균을 대상으로 실험한 결과, 하기 균주는 프로테우스 미라빌리스의 생육 억제 효과를 나타내지 않아, Weissella cibaria가 다른 균주와 비교하여 현저히 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
| 유산균 | 균주 No. |
| Aerococcus urinaeequi | SLA2732 |
| Aerococcus urinaeequi | SAA371 |
| Enterococcus casseliflavus | SLE4331 |
| Enterococcus casseliflavus | SLE4333 |
| Enterococcus faecalis | JGE004 |
| Enterococcus faecalis | DDE005 |
| Enterococcus faecalis | SAE271 |
| Enterococcus faecium | SLE3232 |
| Enterococcus lactis | SGE022 |
| Enterococcus lactis | SLE3331 |
| Enterococcus raffinosus | SLE4332 |
| Enterococcus raffinosus | SAE411 |
| Enterococcus raffinosus | SAE415 |
| Staphylococcus xylosus | SLS5832 |
| Staphylococcus xylosus | STA111 |
| Staphylococcus xylosus | SLS3733 |
| Staphylococcus xylosus | SLS5831 |
| Staphylococcus xylosus | SLS5832 |
| Staphylococcus xylosus | SLS1632 |
| Staphylococcus xylosus | SLS1634 |
| Staphylococcus xylosus | SAS572 |
| Staphylococcus xylosus | SAS573 |
| Staphylococcus xylosus | SAS575 |
| Staphylococcus xylosus | SAS231 |
| Staphylococcus xylosus | SAS232 |
| Staphylococcus xylosus | SAS241 |
| Staphylococcus xylosus | SAS251 |
| Staphylococcus xylosus | SAS262 |
| Staphylococcus xylosus | SAS273 |
| Staphylococcus xylosus | SAS113 |
| Staphylococcus xylosus | SAS114 |
| Staphylococcus xylosus | SPS2512 |
| Staphylococcus xylosus | SPS5814 |
| Staphylococcus xylosus | SPS1111 |
| Staphylococcus xylosus | SPS1114 |
| Staphylococcus warneri | STA503 |
| Staphylococcus warneri | SLS1731 |
| Staphylococcus warneri | SLS1734 |
| Staphylococcus warneri | SLS1735 |
| Staphylococcus warneri | SLS1831 |
| Staphylococcus warneri | SLS2031 |
| Staphylococcus warneri | SLS2433 |
| Staphylococcus warneri | SLS3731 |
| Staphylococcus warneri | SLS3833 |
| Staphylococcus warneri | SLS3834 |
| Staphylococcus warneri | SAS621 |
| Staphylococcus warneri | SAS633 |
| Staphylococcus warneri | SAS261 |
| Staphylococcus warneri | SAS351 |
| Staphylococcus warneri | SLS2521 |
| Staphylococcus sciuri | STA302 |
| Staphylococcus sciuri | STA1203 |
| Staphylococcus pasteuri | SLS1732 |
| Staphylococcus pasteuri | SLS1736 |
| Staphylococcus pasteuri | SLS3732 |
| Staphylococcus pasteuri | SLS3831 |
| Staphylococcus hominis | SLS1633 |
| Staphylococcus epidermidis | DDS001 |
| Staphylococcus epidermidis | SLS1733 |
| Staphylococcus epidermidis | SLS2032 |
| Staphylococcus epidermidis | SLS2033 |
| Staphylococcus epidermidis | SAS272 |
| Carnobacterium divergens | SAC583 |
| Carnobacterium divergens | SPC5811 |
| Vagococcus carniphilus | SLV1832 |
| Vagococcus carniphilus | SAV182 |
| Vagococcus carniphilus | SAV183 |
| Vagococcus carniphilus | SAV184 |
| Vagococcus carniphilus | SAV185 |
| Vagococcus carniphilus | SAV263 |
| Vagococcus fluvialis | SAV181 |
| Wautersiella sp. | HBW103 |
[실시예 2]
웨이셀라 시바리아 균주의 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성 확인
세계김치연구소(KCKM) 및 종균협회(KCCM)로부터 분양받은 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 프로테우스 미라빌리스에 대한 항균 활성을 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
MRS agar 배지(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 생육시킨 유산균 콜로니(colony)를 1 mL의 MRS broth에 접종하여 37 ℃에서 20시간 정치배양한 후 14,000Xg에서 5분간 원심분리하여 배양 상등액을 제조하였다. 프로테우스 미라빌리스 균주를 nutrient broth(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 접종하여 37 ℃에서 20시간 동안 200 rpm에서 진탕 배양하여 배양액을 제조하였다. Nutrient agar 배지에서 생성된 프로테우스 미라빌리스의 콜로니를 saline 용액(0.85 % NaCl)에 현탁하여 탁도가 0.5 McFarland standard solution의 탁도와 동일하도록 하여 세포의 농도가 1.5 x 108 CFU/mL가 되도록 조정하였다. 이 용액 50 μL를 nutrient agar 배지에 도말한 후 paper disc(Advantec, Diameter: 6 mm)를 올려 놓고 유산균 배양 상등액 10 μL를 적하한 다음 37 ℃에서 20시간 배양하여 생성된 프로테우스 미라빌리스의 생육 저지환의 지름을 측정하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 유산균 | 균주 No. | 생육 저지환의 지름(mm) |
| Weissella cibaria | KCKM 0331 | 12.5±0.7 |
| Weissella cibaria | KCKM 0332 | 11.0±0.0 |
| Weissella cibaria | KCKM 0334 | 15.0±1.4 |
| Weissella cibaria | KCKM 0339 | 11.0±1.4 |
| Weissella cibaria | KCKM 0342 | 13.5±0.7 |
| Weissella cibaria | KCKM 0344 | 14.5±0.7 |
| Weissella cibaria | KCKM 0350 | 12.0±1.4 |
| Weissella cibaria | KCKM 0358 | 11.0±1.4 |
| Weissella cibaria | KCKM 0360 | 10.5±0.7 |
| Weissella cibaria | KCKM 0361 | 12.0±0.0 |
| Weissella cibaria | KCCM 41287 | 14.0±1.4 |
| Weissella cibaria | KCCM 42079 | 15.7±0.5 |
| Weissella cibaria | KCCM 43206 | 15.7±0.5 |
| Weissella cibaria | KCCM 43207 | 12.7±0.5 |
| Weissella cibaria | CHK903 | 12.8±1.1 |
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 CHK903 균주뿐만 아니라 나머지 14종의 웨이셀라 시바리아 균주 모두 생육 저지환의 지름이 10 mm 이상으로 나타났다.
따라서, 웨이셀라 시바리아 균주는 프로테우스 미라빌리스에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 3]
뇌신경세포에서 신경독성 유도 신경세포 사멸에 대한 보호능 평가
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 분화한 SH-Sy5y 세포(뇌신경세포)에서 파킨슨병 유도 독성인 MPP+에 의한 신경세포 사멸에 대한 보호능을 평가하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
SH-sy5y 세포주를 96웰 플레이트의 각 웰에 1 X 104 개의 개수로 분주하고 7일간 레티노산(retinoic acid) 처리를 통해 도파민 신경세포 형질이 나타나도록 분화시켰다. 이후 기존의 배지를 제거하고 다양한 농도의 시료가 첨가된 0.5% 우태혈청 DMEM 배지로 교환하였고, 4시간 후 MPP+ 신경 독성을 1 mM 농도로 세포에 처리하여 44시간 동안 추가 배양하였다. 이후 배지에 WST-1 용액을 처리하고 2시간 동안 배양하여 환원반응을 유도한 다음 ELISA 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실험 결과를 통한 세포 생존율을 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.
| 세포 생존율 | 대조군 대비 % | MPP+ 대비 % | S.E.M. | ||
| 대조군 | 100.00 | - | 1.64 | ||
| MPP+ | 52.98 | 100.00 | 4.23 | ||
| Weissella cibaria SPW2014 (WC-SPW) |
배양액 | 1 x 102 | 57.98 | 109.43 | 4.73 |
| 1 x 103 | 58.23 | 109.91 | 6.54 | ||
| 1 x 104 | 57.38 | 108.3 | 7.34 | ||
| 사균체 | 1 x 102 | 52.57 | 99.23 | 8.54 | |
| 1 x 103 | 52.39 | 98.89 | 6.44 | ||
| 1 x 104 | 50.72 | 95.73 | 6.68 | ||
| 내부인자 | 1 x 102 | 53.65 | 101.26 | 7.16 | |
| 1 x 103 | 43.17 | 81.48 | 6.27 | ||
| 1 x 104 | 42.03 | 79.33 | 4.55 | ||
| 균체 | 1 x 102 | 48.55 | 91.64 | 8.58 | |
| 1 x 103 | 44.62 | 84.23 | 8.58 | ||
| 1 x 104 | 48.19 | 90.97 | 3.1 | ||
| Weissella cibaria SGW054 (WC-SGW) |
배양액 | 1 x 102 | 65.86 | 124.31 | 5.7 |
| 1 x 103 | 66.67 | 125.83 | 9.78 | ||
| 1 x 104 | 53.26 | 100.52 | 6.5 | ||
| 사균체 | 1 x 102 | 65.79 | 124.17 | 4.23 | |
| 1 x 103 | 66.32 | 125.18 | 11.76 | ||
| 1 x 104 | 57.59 | 108.71 | 6.43 | ||
| 내부인자 | 1 x 102 | 55.25 | 104.29 | 4.37 | |
| 1 x 103 | 48.46 | 91.47 | 3.05 | ||
| 1 x 104 | 50.9 | 96.07 | 5.09 | ||
| 균체 | 1 x 102 | 55.9 | 105.51 | 3.68 | |
| 1 x 103 | 60.11 | 113.45 | 11.44 | ||
| 1 x 104 | 48.41 | 91.37 | 3.69 | ||
| Weissella cibaria CHK903 (WC-CHK) |
배양액 | 1 x 102 | 58.7 | 110.79 | 6.27 |
| 1 x 103 | 59.14 | 111.62 | 4.83 | ||
| 1 x 104 | 57.4 | 108.35 | 6.94 | ||
| 사균체 | 1 x 102 | 64.18 | 121.14 | 6.75 | |
| 1 x 103 | 54.49 | 102.85 | 12.38 | ||
| 1 x 104 | 55.26 | 104.3 | 10.13 | ||
| 내부인자 | 1 x 102 | 59.2 | 111.74 | 10.35 | |
| 1 x 103 | 45.31 | 85.53 | 4.11 | ||
| 1 x 104 | 42.53 | 80.28 | 4.97 | ||
| 균체 | 1 x 102 | 62.92 | 118.77 | 5.29 | |
| 1 x 103 | 47.07 | 88.84 | 8.36 | ||
| 1 x 104 | 47.43 | 89.52 | 4.16 | ||
상기 표 5 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주의 배양액, 사균체 및 균체의 다양한 농도에서 대조군과 비교하여 보다 높은 세포 생존율을 나타내었다. 또한, 상기 웨이셀라 시바리아 균주의 다양한 농도에서 MPP+ 유도 사멸 정도보다 5% 이상 높은 세포 생존율을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 신경독성(MPP+)에 의한 신경세포 사멸에 대한 우수한 보호 효과를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 4]
장분비세포에서 프로테우스 미라빌리스 유도 알파-시누클레인 응집에 대한 억제능 평가 1
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, STC-1 세포(장분비세포)에서 프로테우스 미라빌리스가 유도하는 알파-시누클레인(α-synuclein) 응집에 대한 억제능을 평가하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
STC-1 세포주를 60 mm 배양 플레이트에 1 X 106 개의 개수로 분주하고, 48시간 경과 후 기존의 배지를 제거하고 평가 시료 및 PM 사균체가 첨가된 DMEM 배지로 교환하였으며, 다시 48시간 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 단백질 가수분해효소 억제제가 포함된 1 x PBS에 용해 후 12000 rpm으로 10분간의 원심분리를 통해 상등액과 펠렛을 분리하였다. 남은 펠렛을 이용하여 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 2회에 나누어 전기영동 시킨 후에 알파-시누클레인 1차 항체(α-synuclein)를 넣고 4 ℃에서 방치시켰다. 12시간 이후 2차 항체(HRP conjugate)를 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후 ECL로 감광하여 필름을 현상하였다. 하우스키핑 단백질로는 분자량이 43kDa인 β-엑틴(β-actin)을 사용하여 비교하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 6 및 도 2에 나타내었다.
| 알파-시누클레인 집계 | 대조군 | Proteus mirabilis | Weissella cibaria SPW2014 (WC-SPW) |
Weissella cibaria SGW054 (WC-SGW) |
Weissella cibaria CHK903 (WC-CHK) |
|
| 배양액 | 대조군 대비 % | 100.00 | 150.20 | 88.60 | 74.35 | 58.36 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 58.99 | 49.51 | 38.86 | |
| S.E.M | 18.48 | 14.47 | 7.41 | 7.67 | 14.43 | |
| 사균체 | 대조군 대비 % | 100.00 | 140.96 | 92.73 | 71.32 | 56.85 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 65.79 | 50.60 | 40.34 | |
| S.E.M | 16.31 | 10.58 | 7.78 | 3.26 | 5.66 | |
| 내부인자 | 대조군 대비 % | 100.00 | 187.44 | 112.20 | 91.23 | 72.43 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 59.85 | 48.67 | 38.64 | |
| S.E.M | 9.17 | 14.03 | 16.34 | 15.54 | 3.94 | |
| 균체 | 대조군 대비 % | 100.00 | 154.30 | 88.53 | 68.77 | 75.13 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 57.37 | 44.56 | 48.69 | |
| S.E.M | 7.35 | 6.85 | 11.96 | 4.57 | 10.79 | |
상기 표 6 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주의 배양액, 사균체, 내부인자 및 균체 모두에서 대조군과 비교하여 보다 적은 알파-시누클레인을 나타내었다. 또한, 프로테우스 미라빌리스와 비교하여 알파-시누클레인의 응집이 최대 약 61 %의 수준으로 개선되는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 프로테우스 미라빌리스가 유도하는 알파-시누클레인 응집에 대한 우수한 억제 효과를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 5]
장분비세포에서 프로테우스 미라빌리스 유도 알파-시누클레인 응집에 대한 억제능 평가 2
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, STC-1 세포(장분비세포)에서 프로테우스 미라빌리스가 유도하는 알파-시누클레인(α-synuclein) 응집에 대한 사균체의 농도별 억제능을 평가하기 위하여 상기 실시예 4와 같은 방법으로 수행하였고, 그 결과를 하기 표 7 및 도 3에 나타내었다.
| 알파-시누클레인 집계 | 대조군 | Proteus mirabilis | 1 x 104 | 1 x 105 | 1 x 106 | |
| Weissella cibaria SPW2014 (WC-SPW) |
대조군 대비 % | 100 | 159.74 | 77.57 | 77.86 | 64.96 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 48.56 | 48.74 | 40.67 | |
| S.E.M | 9.47 | 19.55 | 11.86 | 5.45 | 5.34 | |
| Weissella cibaria SGW054 (WC-SGW) |
대조군 대비 % | 100 | 159.74 | 96.84 | 75.51 | 74.89 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 60.62 | 47.27 | 46.88 | |
| S.E.M | 9.47 | 19.55 | 17.74 | 13.38 | 8.36 | |
| Weissella cibaria CHK903 (WC-CHK) |
대조군 대비 % | 100 | 159.74 | 116.22 | 89.99 | 88.19 |
| PM 대비 % | - | 100.00 | 72.75 | 56.34 | 55.21 | |
| S.E.M | 9.47 | 19.55 | 15.04 | 27.12 | 41.98 | |
상기 표 7 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주의 사균체는 용량 의존적으로 알파-시누클레인의 응집을 감소시키는 것으로 나타났으며, 프로테우스 미라빌리스와 비교하여 알파-시누클레인의 응집이 최대 약 59 %의 수준으로 개선되는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 프로테우스 미라빌리스가 유도하는 알파-시누클레인 응집에 대한 우수한 억제 효과를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 6]
안전성 평가 1: 항생제 내성 및 독성
유산균이 항생제 내성 유전자를 가지고 있으면 세균 감염 시 항생제의 효과가 나타나지 않을 수 있어 위험하고, 장 내에서는 항생제 내성 유전자의 전이가 일어날 수 있으므로 미생물이 가진 항생제 내성의 특성을 파악하는 것은 무엇보다 중요하다.
6-1. 항생제 내성(E-test)
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 항생제 내성을 평가하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
MRS agar 플레이트(plate)에서 생육한 균주의 콜로니(colony)를 취하여 MRS broth에 접종한 후 37 ℃에서 20시간 배양한 후 배양액 100 μL를 3 McFarland standard(0.03% barium chloride, 5.97% sulfuric acid)의 탁도와 동일한 탁도로 조정하여 항생물질이 첨가되지 않은 MRS agar 플레이트에 도말하였다. 상기 플레이트 위에 한 종류의 E-test 스트립(strip)을 가운데 위치시키고 37 ℃에서 72시간 동안 배양한 후 저해환이 지시하는 스트립 끝의 숫자를 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)로 정하였다. 조사한 항생제는 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등 총 9종이었고, 각 항생물질의 MIC cut-off 값은 Jeong & Lee(2015)가 제안한 값을 적용하여 평가하였다.
상기 실험 결과는 도 4 내지 도 6에 나타내었고, 측정한 MIC 값(μg/mL)을 하기 표 8에 나타내었다.
| 항생제 | Cut-off 값 | Weissella cibaria SPW2014 | Weissella cibaria SGW054 | Weissella cibaria CHK903 |
| 암피실린 | 2.00 | 0.25 | 0.19 | 0.25 |
| 반코마이신 | n.r.* | - | - | - |
| 젠타마이신 | 32.00 | 1.5 | 2.00 | 3.00 |
| 카나마이신 | n.a.** | 8.00 | 6.00 | 16.00 |
| 스트렙토마이신 | 64.00 | 12.00 | 8.00 | 8.00 |
| 에리트로마이신 | 1.00 | 0.19 | 0.19 | 0.125 |
| 클린다마이신 | n.a. | 0.016 | 0.016 | 0.016 |
| 테트라사이클린 | 16.00 | 1.50 | 2.00 | 1.50 |
| 클로람페니콜 | 8.00 | 3.00 | 1.50 | 2.00 |
| *n.r., not required, **n.a., not available | ||||
상기 표 8, 및 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주의 MIC 값은 Cut-off 값보다 낮은 값을 나타내었다. 반코마이신의 경우, 웨이셀라 속을 비롯한 많은 유산균 종들이 내재 내성을 지니고 있어 내성 여부를 평가하지 않았으며, 카나마이신의 경우, 상기 웨이셀라 시바리아 균주가 6 ~ 16 μg/mL 범위를 나타내었는데, 대부분의 유산균의 Cut-off 값이 16 μg/mL 이상이므로 보다 낮은 값을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 클린다마이신의 경우, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 0.016 μg/mL로 매우 낮은 MIC 값을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 항생제 내성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
6-2. 항생제 내성 유전자
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 항생제 내성 유전자 유무를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
항생제 내성 유전자는 암피실린(blaZ, bla), 클로람페니콜(catA, cat), 클린다마이신(Inu(A), Inu(B)), 에리트로마이신(ereA, ereB, Erm(B), Erm(B)-1, Erm(C)), 젠타마이신(aac(6')-aph(2''), aac(6')-aph(2''La)), 카나마이신(aph(3’)-I, aph(3’)-III), 스트렙토마이신(aadA, aadE, ant(6)), 테트라사이클린(tet(M), tet(M)-1, tet(K), tet(K)-1, tet(K)-2, tet(Q)), 반코마이신(vanE, vanX) 유전자를 선정하여 분석하였다.
유산균의 genomic DNA는 Bioneer사의 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 분리하였다. PCR은 HotStart® Premix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 My Cycler™(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 반응시켰다. 균주의 genomic DNA 0.1 μg을 주형(template) DNA로 사용하였으며, 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)는 각각 300 nM이 되도록 첨가하였다. 얻어진 PCR 산물은 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 실시하여 분석하였다. 전기영동 완충용액으로는 0.5 배의 TAE 완충용액(40 mM Tris-acetate, pH 8.0, 1 mM EDTA)을 사용하였으며 0.5 μg/mL의 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 첨가한 1.5%(w/v) agarose 수평 gel을 사용하여 시료의 1/10배량의 10×gel loading 완충용액(0.25% bromophenol blue, 40%(w/v) sucrose)을 가한 DNA 용액을 100 V에서 30 ~ 40분간 전기영동한 후 254 nm 파장의 자외선 조명 하에서 관찰하였다. 사진촬영은 UV-filter와 orange filter가 장착된 Bio-Rad Gel Doc XR+ gel documentation system을 사용하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
| 항생제 | 유전자 | 프라이머 서열 (5'→3') | 검출 여부 |
| 암피실린 | blaZ | ACTTCAACACCTGCTGCTTTC TAGGTTCAGATTGGCCCTTAG |
X |
| bla | CATARTTCCGATAATASMGCC CGTSTTTAACTAAGTATSGY |
X | |
| 클로람페니콜 | catA | GGATATGAAATTTATCCCTC CAATCATCTACCCTATGAAT |
X |
| cat | TTAGGTTATTGGGATAAGTTA GCATGRTAACCATCACAWAC |
X | |
| 클린다마이신 | Inu(A) | GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGG GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGATC |
X |
| Inu(B) | CCTACCTATTGTTTGTGGAA ATAACGTTACTCTCCTATTTC |
X | |
| 에리트로마이신 | ereA | AACACCCTGAACCCAAGGGACG CTTCACATCCGGATTCGCTCGA |
X |
| ereB | AGAAATGGAGGTTCATACTTACCA CATATAATCATCACCAATGGCA |
X | |
| Erm(B) | GAAAAGGTACTCAACCAAATAAGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC | X | |
| Erm(B)-1 | CATTTAACGACGAAACTGGCGGAACATCTGTGGTATGGCG | X | |
| Erm(C) | TCAAAACATAATATAGATAAAGCTAATATTGTTTAAATCGTCAAT | X | |
| 젠타마이신 | aac(6')-aph(2'') | CCAAGAGCAATAAGGGCATA CACTATCATAACCACTACCG |
X |
| aac(6')-aph(2''La | CAGAGCCTTGGGAAGATGAAG CCTCGTGTAATTCATGTTCTGGC |
X | |
| 카나마이신 | aph(3')-I | AACGTCTTGCTCGAGGCCGCG GGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCG |
X |
| aph(3')-III | GCCGATGTGGATTGCGAAAA GCTTGATCCCCAGTAAGTCA |
X | |
| 스트렙토마이신 | aadA | ATCCTTCGGCGCGATTTTG GCAGCGCAATGACATTCTTG |
X |
| aadE | ATGGAATTATTCCCACCTGA TCAAAACCCCTATTAAAGCC |
X | |
| ant(6) | ACTGGCTTAATCAATTTGGGGCCTTTCCGCCACCTCACCG | X | |
| 테트라사이클린 | tet(M) | GGTGAACATCATAGACACGC CTTGTTCGAGTTCCAATGC |
X |
| tet(M)-1 | GTTAAATAGTGTTCTTGGAG CTAAGATATGGCTCTAACAA |
X | |
| tet(K) | TCGATAGGAACAGCAGTACAGCAGATCCTACTCCTT | X | |
| tet(K)-1 | TTAGGTGAAGGGTTAGGTCCGCAAACTCATTCCAGAAGCA | X | |
| tet(K)-2 | TTATGGTGGTTGTAGCTAGAAAAAAGGGTTAGAAACTCTTGAAA | X | |
| tet(Q) | AGCGTCAAAGGGGAATCACTATCCCGGCGGGGTTGGCAAATA | X | |
| 반코마이신 | vanE | TGTGGTATCGGAGCTGCAG GTCGATTCTCGCTAATCC |
X |
| vanX | TCGCGGTAGTCCCACCATTCGTT AAATCATCGTTGACCTGCGTTAT |
X |
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 총 26종류의 항생제 내성 유전자가 검출되지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 항생제 내성 유전자를 가지지 않는 것을 확인하였다.
6-3. 독성 유전자
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 독성 유전자 유무를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
독성 유전자는 젤라티네이스(gelE), 사이톨리신(cylA, cylB, cylM), 응집 물질(agg, asa1) 유전자를 선정하여 분석하였고, 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
| 독성인자 | 유전자 | 프라이머 서열 (5'→3') | 검출 여부 |
| 젤라티네이스 (gelatinase) |
gelE | ACCCCGTATCATTGGTTT ACGCATTGCTTTTCCATC |
X |
| 사이톨리신 (cytolysin) |
cylA | TGGATGATAGTGATAGGAAGT TCTACAGTAAATCTTTCGTCA |
X |
| cylB | ATTCCTACCTATGTTCTGTTA AATAAACTCTTCTTTTCCAAC |
X | |
| cylM | CTGATGGAAAGAAGATAGTATTGAGTTGGTCTGATTACATTT | X | |
| 응집 물질 (aggregation substance) |
Agg | AAGAAAAAGAAGTAGACCAAC AAACGGCAAGACAAGTAAATA |
X |
| Asa1 | GCACGCTATTACGAACTATGA TAAGAAAGAACATCACCACGA |
X |
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 독성 유전자가 검출되지 않았다.
따라서, 본 발명의 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 독성 유전자를 가지지 않는 것을 확인하였다.
결국, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 항생제 내성을 나타내지 않으며, 항생제 내성 유전자 및 독성 유전자를 가지지 않아, 안전한 것을 알 수 있다.
[실시예 7]
안전성 평가 2: 용혈 활성(hemolytic activity)
균주가 용혈 활성을 가지고 있으면 숙주의 적혈구를 파괴시키므로 이를 확인하여 안전성을 평가해야 한다.
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 용혈 활성을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균 및 양성 대조군으로 사용한 스트렙토코커스 파이오제네스 (Streptococcus pyogenes) KCCM 11873을 5% sheep blood를 포함한 MRS 배지에 획선도말(streaking)한 후 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 콜로니(colony) 주위에 클리어헤일로(clear halo)가 형성되면 β형 용혈(β-hemolysis) 활성을 가진 미생물로 분류한다.
상기 실험 결과를 도 7에 나타내었고, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 클리어존(clear zone)이 형성되지 않은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 용혈 활성을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 8]
안전성 평가 3: 뮤신(mucin) 분해능
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 뮤신 분해능을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균의 종배양액을 30 mL의 basal MRS 배지(글루코스가 없는 MRS 배지), 0.3%의 뮤신(mucin) (type III, Sigma)을 포함한 basal MRS 배지, 1%의 글루코스(glucose)를 포함한 basal MRS 배지, 1%의 글루코스 및 0.3%의 뮤신을 포함한 basal MRS 배지에 1% 접종하고, 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 8시간과 24시간에 배양액을 샘플링하여 spectrophotometer로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 생육도를 측정하였고, pH meter기로 pH를 측정하여 미생물의 생육에 따른 pH 변화를 확인하였다. 뮤신 분해능이 있을 경우, 뮤신을 탄소원으로 이용하여 균주 생육에 따라 pH가 감소된다.
상기 실험 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 시간이 지남에 따라 글루코스를 포함한 배지와 글루코스 및 뮤신을 포함한 배지에서 흡광도는 증가되고 pH는 감소되는 반면, basal MRS 배지와 뮤신을 포함한 배지에서는 흡광도가 증가되지 않고 pH가 감소되지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 뮤신 분해능을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 9]
안전성 평가 4: 젤라틴 액화능
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 젤라틴 액화능을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
12% 젤라틴이 포함된 MRS 배지가 들어있는 튜브에 유산균을 획선도말(streaking)한 후 37 ℃에서 72시간 동안 배양한 다음 얼음에 30분간 방치하여 젤라틴 액화 능력이 있는지 관찰하였다. 양성 대조군으로는 브레비바실러스 파라브레비스(Brevibacillus parabrevis) KCCM 41421을 사용하였다.
상기 실험 결과를 도 9에 나타내었으며, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 젤라틴 액화능을 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 젤라틴 액화능을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 10]
안전성 평가 5: 우레아제(urease) 활성
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 우레아제 활성을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
우레아제(urease) 활성은 Christensen’s urea agar(0.1g peptone, 0.1 g dextrose, 0.5 g sodium chloride, 0.2 g KH2PO4, 2 g urea, 0.0012 g phenol red, 1.5 g agar, per 100mL)에 균을 접종했을 때 pH의 변화로 판단한다. 유산균과 양성 대조군으로 사용한 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) KCCM 40211을 사면배지에 도말하고, 37 ℃에서 배양한 후 배양 6시간, 24시간, 6일 후 배지 색의 변화를 확인하였다.
상기 실험 결과를 도 10에 나타내었으며, 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 배양 6일 후까지 배지의 색 변화를 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 우레아제 활성을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 11]
안전성 평가 6: 인돌(indole) 생성능
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 인돌 생성능을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균과 양성 대조군으로 사용한 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) ATCC 10536을 Tryptophan medium(10.0 g casein enzyme hydrolysate, 5.0 g NaCl, 1.0 g DLtryptophan, per 1 L)에 접종하여 37 ℃에서 18시간 동안 배양한 후, 배양액에 Kovac’s reagent(10 g p-dimethylaminobenzaldehyde, 150 mL butanol, and 50 mL hydrochloric acid)를 5방울 적하하여 적색으로 변하면 양성균으로 판단하였다.
상기 실험 결과를 도 11에 나타내었으며, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 배양액의 색 변화를 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 인돌 생성능을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 12]
안전성 평가 7: β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 활성
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, β-글루쿠로니다아제 활성을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
β-글루쿠로니다아제 활성은 API ZYM kit(bioMerieux, Marcy l’Etoile, France)를 이용하여 측정하였다. 유산균을 MRS 배지에 접종한 후 37 ℃에서 24시간 배양한 다음 2 mL 멸균 sailne에 희석하여 배양액의 탁도를 McFarland 5-6에 해당하는 탁도로 조정하였다. 이를 API 스트립(strip)에 65 μL 분주하고 37 ℃에서 4시간 배양한 다음 ZYM A와 ZYM B를 한방울씩 적하한 후 5분 뒤 색 변화로 효소활성 유무를 판단하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
| 효소 | Weissella cibaria CHK903 | Weissella cibaria SGW054 | Weissella cibaria SPW2014 |
| 알칼리포스파타아제 (Alkaline phosphatase) |
- | - | - |
| 에스테레이스 (Esterase)(C4) |
- | - | - |
| 에스테레이스리파아제 (Esterase Lipase)(C8) |
- | - | - |
| 리파아제 (Lipase)(C14) |
- | - | - |
| 류신아릴아미다제 (Leucine arylamidase) |
- | - | - |
| 발린아릴아미다제 (Valine arylamidase) |
- | - | - |
| 크리스틴아릴아미다제 (Crystine arylamidase) |
- | - | - |
| 트립신 (Trypsin) |
- | - | - |
| α-키모트립신 (α-Chymotrypsin) |
- | - | - |
| 산성포스파타아제 (Acid phosphatase) |
+ | + | + |
| 나프톨-AS-Bl-포스포하이드롤라아제 (Naphtol-AS-Bl-phosphohydrolase) |
+ | + | + |
| α-갈락토시다아제 (α-Galactosidase) |
+ | + | + |
| β- 갈락토시다아제 (β-Galactosidase) |
- | - | - |
| β-글루쿠로니다아제 (β-Glucuronidase) |
- | - | - |
| α-글루코시다아제 (α-Glucosidase) |
- | - | - |
| β-글루코시다아제 (β-Glucosidase) |
- | - | - |
| N-아세틸-β- 글루코시다아제 (N-Acetyl-β-glucosaminidase) |
- | - | - |
| α-만노시다아제 (α-Mannosidase) |
- | - | - |
| α-푸코시다아제 (α-Fucosidase) |
- | - | - |
상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 β-글루쿠로니다아제 활성을 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 β-글루쿠로니다아제 활성을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 13]
안전성 평가 8: 세포 독성
균주가 독소를 생성할 경우 인체에 유해한 결과를 초래할 수 있으므로 동물세포를 기반으로 한 in vitro 실험을 통해 균주의 세포 독성을 확인해야 한다. EZCYTOX는 water soluble tetrazolium(WST)을 이용하여 살아있는 세포의 양을 측정하는 시약으로서 세포 독성 측정 등에 사용되고 있다. WST는 세포의 탈수소효소(dehydrogenase)와 반응하여 오렌지 색의 수용성 포마잔(formazan)을 생성하는데, WST와 반응하는 탈수소효소는 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 효소로서 살아있는 세포에만 유효하다. 따라서 포마잔의 생성은 살아있는 세포 수와 직선 상관관계를 가지며, 이는 흡광도(450 nm)를 측정함으로써 알 수 있다.
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 세포 독성 유무를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
Caco-2 cell을 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지에 5 × 104 cells/well 들어가도록 96-well 플레이트(plate)에 시딩(seeding)한 다음 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 20시간 배양하였다. 유산균을 MRS broth에서 18시간 정치배양하였고, 양성대조군으로서 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) subsp. pneumoniae KCCM 41433을 nutrient broth에서 18시간 진탕배양한 배양액을 종배양액으로 사용하였다. 유산균주 종배양액을 5 mL MRS 배지에 각각 1% 접종하고 37 ℃에서 3시간 배양한 후 배양액을 20,781Xg에서 1 분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 유산균 세포를 DPBS로 3회 세척한 후 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지 1 mL로 현탁하였다. 현탁한 유산균주를 Caco-2 세포에 감염다중도(multiplicity of infection; MOI, 유산균 생균수/Caco-2 세포수)가 250이 되도록 첨가한 후 37 ℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. 배양 후 DPBS로 3회 세척한 후 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 200 μL/well 첨가한 다음 EZ-CYTOX를 20 μL/well 첨가하고 37 ℃, 5% CO2에서 30분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
상기 실험 결과를 도 12에 나타내었으며, 도 12에 나타낸 바와 같이, MOI 250에서 양성대조군의 세포생존율이 80% 이하인 반면, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 80% 이상의 세포생존율을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 세포 독성을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 14]
안전성 평가 9: 젖산(lactic acid) 생성
젖산(lactic acid)은 L-form과 D-form 2종의 광학이성질체가 있는데, 인체의 경우 L-젖산(L-lactic acid)은 대사가 가능하지만 이성질체인 D-젖산(D-lactic acid)은 대사가 불가능하다. 프로바이오틱스 균주의 경우 L-젖산(L-lactate)을 D-젖산(D-lactate)으로 전환시키는 효소인 DL-젖산 라세미화효소(DL-lactate racemase)를 가지고 있어, 효소 활성이 강한 경우에 신생아, 어린이 및 단장 증후군(short bowel syndrome) 환자에게 D-젖산(D-lactate)이 축적되어 산독증(acidosis)을 유발시킬 수 있다. 이에 WHO는 D-젖산(D-lactic acid)의 일일 섭취량을 100 mg/kg body mass 이하로 권장한 바 있다.
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, D-젖산 생성 유무를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균을 MRS broth에서 37 ℃에서 24시간동안 배양한 후 D-lactate assay kit(Roche)를 이용하여 배양액 중의 L-젖산과 D-젖산의 농도를 측정하였다.
상기 실험 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
| 균주 | D-젖산(mM) | L-젖산(mM) |
| W. cibaria CHK903 | 10.73 | 0.63 |
| W. cibaria SGW054 | 8.27 | 0.84 |
| W. cibaria SPW2014 | 8.77 | 0.31 |
상기 표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 D-젖산을 L-젖산보다 높은 농도로 생산하는 것으로 나타났다. 그러나 유산균은 종에 따라 L-젖산, D-젖산, 또는 L-젖산 및 D-젖산 모두 생산하는 종으로 구분되며, D-젖산을 생산한다는 이유로 위해성이 있다고 판단할 수는 없다.따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 L-젖산 및 D-젖산 모두를 생성하나, 안전성 평가에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
[실시예 15]
안전성 평가 10: 복합담즙산 분해(bile salt deconjugation) 활성
담즙염(bile salt)은 지방을 유화시켜 리파아제(lipase)의 작용을 촉진하여 지방산 분해에 도움을 주며, 프로바이오틱스 균주에 존재하는 쓸개즙산염 가수분해효소(bile salt hydrolase)는 담즙염으로부터 프로바이오틱스 균주를 보호하여 장내 정착을 늘리기도 하지만, 담즙염을 분해(deconjugation)시켜 담즙염의 유화 기능을 없애기 때문에 지방산 분해를 어렵게 한다. 또한, 분해된 담즙염의 경우 다른 장내 미생물의 대사에 의해 독성을 가진 2차 대사산물이 생성될 수도 있다.
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 복합담즙산 분해 활성을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균의 콜로니(colony)를 취하여 0.5% taurodeoxycholic acid(TDCA; bile acid, Sigma)가 첨가된 MRS 배지에 획선도말(streaking) 한 후 혐기조건에서 37 ℃에서 2일간 배양하였다. 쓸개즙산염 가수분해효소(bile salt hydrolase) 활성이 있는 균주의 경우 콜로니 주변에 불투명한 백색의 침전물이 형성된다.
상기 실험 결과를 도 13에 나타내었으며, 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두 콜로니에 불투명한 백색의 침전물이 형성되지 않은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 복합담즙산 분해 활성을 가지지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
[실시예 16]
안전성 평가 11: 생체아민(biogenic amine) 생성
생체아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산작용, 알데하이드와 케톤의 아미노화와 아미노기 전이반응에 의해 주로 생성되는 질소화합물이다. 생체아민은 체내에서 직·간접적으로 신경전달물질로서 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계에도 영향을 미친다. 따라서 생체아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 식품의 안전성 측면에서 생체아민의 분포 및 함량 조사는 매우 중요하나, 우리나라에서는 프로바이오틱스 균주가 생산하는 생체아민에 대한 기준 또는 규격은 설정되어 있지 않다.
상기 표 2의 웨이셀라 시바리아 균주를 대상으로, 생체아민 생성 유무를 확인하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
유산균을 생체아민(biogenic amine)의 전구체인 아르기닌(arginine), 오르니틴(ornithine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan), 리신(lysine), 페닐알라닌(phenylalanine)이 각각 400 ppm 첨가된 MRS broth에 접종한 후 37 ℃에서 20시간 배양하였다. 배양 후 배양 상등액 1 mL에 saturated sodium carbonate solution 500 μL를 가하여 혼합한 다음, 1% dansyl chloride acetone solution 800 μL를 가하여 혼합한 후 마개를 하여 45 ℃에서 1시간 동안 유도체화하였다. 여기에 10% proline solution 500 μL와 diethylether 5 mL를 가하여 10분간 vortex mixer로 완전히 혼합하고 상등액을 취하여 질소가스로 purging하여 건조하였다. 건조물에 acetonitrile 1 mL를 가하여 용해한 후 용해한 액상을 0.22 μm membrane filter로 여과한 것을 시험용액으로 하여 HPLC로 분석하였다. 유도체화된 생체아민은 DIONEX UltiMate 3000 HPLC system(Thermo Scientific, USA)을 이용하여 정량분석하였다.
상기 실험 결과를 도 14에 나타내었으며, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 시바리아 균주 모두에서 아그마틴(agmatine), 히스타민(histamine), β-페닐에틸아민(β-phenylethylamine), 퓨트레신(putrescine), 세로토닌(serotonin), 스페르미딘(spermidine), 트립타민(tryptamine), 티라민(tyramine)이 검출되지 않았다.
따라서, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 생체아민을 생성하지 않아, 안전한 것을 확인하였다.
상기 실시예 6 내지 실시예 16는 식품의약품안전처의 ‘건강기능식품 기능성 원료 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드’(2021.06)에 따라 수행된 것으로, 결국, 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 식품의약품안전처의 프로바이오틱스 안전성 기준을 만족시키는 것을 알 수 있다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(KCCM)
수탁번호 : KCCM13244P
수탁일자 : 20220805
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(KCCM)
수탁번호 : KCCM13225P
수탁일자 : 20220805
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(KCCM)
수탁번호 : KCCM13226P
수탁일자 : 20220805
Claims (18)
- 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 웨이셀라 시바리아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 웨이셀라 시바리아 SPW2014, 웨이셀라 시바리아 200022, 웨이셀라 시바리아 SFL001, 웨이셀라 시바리아 FCK913, 웨이셀라 시바리아 JJW001, 웨이셀라 시바리아 SLW6932, 웨이셀라 시바리아 P8, 웨이셀라 시바리아 P9 및 웨이셀라 시바리아 P26로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 웨이셀라 시바리아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 및 웨이셀라 시바리아 SPW2014로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 신경독성 유도 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 알파-시누클레인 (α-synuclein) 응집에 대한 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 항생제 내성, 항생제 내성 유전자, 독성 유전자, 용혈 (hemolytic) 활성, 뮤신 분해능, 젤라틴 액화능, 우레아제 (urease) 활성, 인돌 생성능, 베타-글루쿠로니다아제 (α-glucuronidase) 활성, 세포 독성, 복합담즙산 분해 (bile salt deconjugation) 활성, 및 생체아민 생성능으로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상의 활성을 나타내지 않아 안전성을 갖는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제10항에 있어서, 웨이셀라 시바리아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 웨이셀라 시바리아 SPW2014, 웨이셀라 시바리아 200022, 웨이셀라 시바리아 SFL001, 웨이셀라 시바리아 FCK913, 웨이셀라 시바리아 JJW001, 웨이셀라 시바리아 SLW6932, 웨이셀라 시바리아 P8, 웨이셀라 시바리아 P9 및 웨이셀라 시바리아 P26로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 웨이셀라 시바리아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 및 웨이셀라 시바리아 SPW2014로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) 균주를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물에 있어서, 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 동물용 사료 조성물.
- 제13항에 있어서, 웨이셀라 시바리아는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 웨이셀라 시바리아 SPW2014, 웨이셀라 시바리아 200022, 웨이셀라 시바리아 SFL001, 웨이셀라 시바리아 FCK913, 웨이셀라 시바리아 JJW001, 웨이셀라 시바리아 SLW6932, 웨이셀라 시바리아 P8, 웨이셀라 시바리아 P9 및 웨이셀라 시바리아 P26로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 웨이셀라 시바리아 균주는 웨이셀라 시바리아 CHK903, 웨이셀라 시바리아 SGW054, 및 웨이셀라 시바리아 SPW2014로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 동물용 사료 조성물.
- 웨이셀라 시바리아 CHK903 (Weissella cibaria CHK903) 균주 (기탁번호: KCCM13224P).
- 웨이셀라 시바리아 SGW054 (Weissella cibaria SGW054) 균주 (기탁번호: KCCM13225P).
- 웨이셀라 시바리아 SPW2014 (Weissella cibaria SPW2014) 균주 (기탁번호: KCCM13226P).
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