KR102576346B1 - ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신 제형 - Google Patents

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Abstract

장외 병원성 대장균(extra-intestinal pathogenic Escherichia coli; ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 구체적으로, 다수의 환경 스트레스를 견딜 수 있는, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합된 대장균 항원 다당류를 함유하는 다가 백신이 개시된다.

Description

ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신 제형
본 발명은 장외 병원성 대장균(extra-intestinal pathogenic Escherichia coli; ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 실시 형태는 다수의 환경 스트레스를 견딜 수 있는 운반 단백질에 공유 결합된 대장균 다당류 항원의 콘쥬게이트를 함유하는 다가 백신에 관한 것이다.
장외 병원성 대장균(ExPEC)은 인간에 있어서 가장 일반적인 그람(gram)-음성 병원체이며, 위장관 외부에서 다양한 감염을 야기할 수 있는데, 이는 다양하고 심각한 질환을 초래하여 유의한 이환율 및 사망률로 이어질 수 있다. ExPEC 균주들 사이에서의 다제 내성 증가는 치료의 장애물이며, ExPEC 감염과 연관된 건강관리 비용의 증가 및 입원 횟수 및 사망의 증가를 초래한다.
따라서 ExPEC에 대한 백신이 긴급하게 필요하다. 표면 리포다당류의 구성요소인 O-항원은 유망한 백신 표적으로 확인되었으며, 현재 개발 중인 글리코콘쥬게이트 백신에서 항원으로 이용된다(예를 들어, 문헌[Poolman and Wacker, 2016, J. Infect. Dis. 213: 6-13] 참조).
현재 개발 중인 ExPEC에 대한 글리코콘쥬게이트 백신은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 엑소단백질 A(EPA)와 같은 운반 단백질에 각각이 커플링된 상이한 혈청형의 ExPEC의 O-글리칸을 포함한다(예를 들어, 국제 공개 제2015/124769호, 및 국제 공개 제2017/035181호 참조). 대장균 혈청형 O25B, O1A, O2 및 O6A의 O-글리칸을 포함하는 이러한 백신은 예를 들어 2상 임상 시험을 진행 중이다(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02546960).
본 발명자는 기존의 ExPEC 백신 제형 (25 mM 트리스(Tris) pH 7.4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl)이 단기 보관(2~8℃에서) 및 사용 중 안정성에 대해서는 허용가능하지만, 냉동/해동시 및 교반 스트레스 하에서는 강건하지 않음을 알아냈다. 우발적인 냉동, 우발적인 가열, 및 교반(예를 들어, 보관 또는 수송 동안)은 ExPEC 제형의 제품 완전성(integrity)에 해로운 영향을 미친다. 큰 집단에서의 사용용으로 의도된 의약품, 예컨대 ExPEC에 대한 글리코콘쥬게이트 백신에 있어서, 저온에서 대량으로 냉동될 수 있고, 해동 후, 사용 전에 약 2~8℃에서 보관될 수 있는(즉, 원료 의약품이 대규모, 장기 보관용으로 냉동되지만 사용 중인 완제 의약품은 약 2~8℃에서 보관되어서, 적어도 1회의 냉동-해동 사이클이 제품에 필연적인) 제형을 갖는 것이 유익하다. 또한, 본 제형은 바람직하게는 여러 가지 물질과 상용성이기도 해서, 제품(예를 들어, 글리코콘쥬게이트)은 여러 가지 포맷(예를 들어, 백, 병, 바이알, 사전 충전 주사기, 및/또는 적용가능한 디바이스)으로 보관될 수 있다.
다수의 환경 스트레스(예를 들어, 냉동/해동, 교반, 승온, 광 노출, 금속 산화제 노출 등)를 견뎌 내서 조성물의 더 긴 안정성 및 더 긴 보관 수명으로 이어질 수 있고, 바람직하게는 다수의 프로세싱(예를 들어, 용기) 물질과 상용성인, ExPEC에 대한 백신 제형이 본 기술 분야에서 필요하다. 환경 스트레스에서 생긴 열화 경로들 중 임의의 것은 생물학적 활성의 저하를 초래할 수 있고, 잠재적으로 또한 제형의 성분의 부산물 또는 유도체를 형성함으로써 ExPEC 백신의 독성의 증가 및/또는 면역원성의 변경으로 이어질 수 있다. 따라서, 넓은 범위의 조건에 걸쳐 안정성을 보장하는 글리코콘쥬게이트 백신을 위한 강건한 제형을 찾는 데 맞춤화된 접근법이 필요하다. 완충제 유형, pH, 및 특수 부형제가 선택되고, 특정적으로 조합되고, 후속적으로, 세심하게 최적화되어서 글리코콘쥬게이트 백신이 화학적으로, 물리적으로, 그리고 생물학적으로 안정하게 유지되게 하는 것이 필요할 것이다. 달라질 수 있는 모든 요인을 고려하여, ExPEC에 대한 글리코콘쥬게이트 백신을 제형화하기 위한 최적의 조건을 찾는 것은 도전하기에 부담이 되고, 우수한 제형의 조성은 선험적으로 예측가능하지 않다.
따라서, 백신 조성물이 다수의 환경 스트레스를 견뎌 내서 향상된 안정성 및 더 긴 보관 수명을 가질 수 있음을 보장하는, ExPEC에 대한 글리코콘쥬게이트 백신의 제형이 본 기술 분야에서 필요하다. 본 발명의 목표는 그러한 제형을 제공하는 것이다.
ExPEC에 대한 글리코콘쥬게이트 백신을 위한 2가지의 새로운 제형이 제공되며, 이는 냉동/해동, 교반 스트레스, 열적 스트레스, 및 금속 유도된 산화 스트레스시에 향상된 안정화 효과를 백신 조성물에 제공하고, 상기 제형은 부가적으로, 다양한 프로세싱(예를 들어, 용기) 물질들과 상용성이다. 이러한 개선된 제형은 (우발적인) 냉동 또는 가혹한 교반(이는 제품 완전성에 해로운 영향을 미칠 수 있으며 그에 따라 효능에 해로운 영향을 미칠 수 있음)이 일어날 수 있는 완제 의약품 및 원료 의약품 둘 다의 보관 또는 수송 동안 이용될 수 있다. 부가적으로, 본 신규 제형은 열적 스트레스에 대한 향상된 안정성을 글리코콘쥬게이트 ExPEC 백신에 제공하였으며, 따라서 넓은 범위의 온도 및 조건에서의 완제 의약품 및 원료 의약품의 보관, 취급 및 수송과 관련하여 넓은 상업적 응용을 가질 수 있다.
적어도 하나의 대장균 O 항원 다당류(여기서, 상기 적어도 하나의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 3% 내지 8% (w/v)의 소르비톨; 5 내지 15 mM의 메티오닌; 5 내지 20 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 소르비톨의 농도는 4% 내지 6% (w/v)이다. 바람직한 실시 형태에서, 메티오닌의 농도는 8 내지 12 mM이다. 바람직한 실시 형태에서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도는 8 내지 15 mM이다. 바람직하게는, 조성물은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 독립적으로 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 4% 내지 6% (w/v)의 소르비톨; 8 내지 12 mM의 메티오닌; 8 내지 15 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 다가 면역원성 조성물이다.
적어도 하나의 대장균 O 항원 다당류(여기서, 상기 적어도 하나의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 3% 내지 12% (w/v)의 수크로스; 0.1 내지 1.5 mM의 EDTA; 5 내지 20 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 조성물이 또한 본원에서 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 수크로스의 농도는 3% 내지 10% (w/v)이다. 바람직한 실시 형태에서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도는 8 내지 15 mM이다. 바람직하게는, 조성물은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 3% 내지 10% (w/v)의 수크로스; 0.1 내지 1.5 mM의 EDTA; 8 내지 15 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 다가 면역원성 조성물이다.
특정 실시 형태에서, 대장균 O25B, O1A, O2, 및 O6A 항원 다당류는 1:1:1:1 또는 2:1:1:1의 중량비로 존재한다.
특정 실시 형태에서, 소르비톨의 농도는 5% (w/v)이다.
특정 실시 형태에서, 수크로스의 농도는 8% (w/v)이다.
특정 실시 형태에서, 메티오닌의 농도는 10 mM이다.
특정 실시 형태에서, EDTA의 농도는 1 mM이다.
특정 실시 형태에서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도는 10 mM이며, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 pH는 7.0이다.
특정 실시 형태에서, 계면활성제의 농도는 0.02% (w/v)이다. 바람직한 실시 형태에서, 계면활성제는 친수성 헤드(OH-기) 및 긴 소수성 테일(탄소-사슬, 이는 탄소 사슬 내에 적어도 약 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 130개 이상의 탄소를 포함할 수 있음)로 구성된다. 바람직한 실시 형태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제는 F-68, PS20, PS40, PS60, 및 PS80으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제는 PS80이다.
특정 실시 형태에서, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
특정 실시 형태에서, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
특정 실시 형태에서, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
특정 실시 형태에서, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물을 제조하는 방법도 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, EPA 운반자에 공유 결합된 적어도 하나의 대장균 O 항원, 물, 완충액용 염(즉, 인산(이)수소나트륨 및 인산(이)수소칼륨[즉, Na2HPO4 및 KH2PO4 또는 NaH2PO4 및 K2HPO4]), 장성 조절제(즉, 소르비톨 또는 수크로스), 산화방지제(즉, 장성 조절제가 소르비톨인 경우 메티오닌; 장성 조절제가 수크로스인 경우 EDTA), 및 계면활성제(예를 들어, PS80)를 용기에 첨가하는 단계, pH를 원하는 pH(즉, 6.5 내지 7.5, 예를 들어 7.0)까지 조정하는 단계, 및 이러한 성분들을 혼합하여서 본 발명에 따른 액상 제형을 생성하는 단계를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물의 제조 방법은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 물; 인산칼륨; 인산나트륨; 소르비톨; 메티오닌; 및 PS80을 용기에 첨가하는 단계, pH를 6.5~7.5(예를 들어, 7.0)까지 조정하는 단계, 및 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 최종 농도가 5~20 mM(예를 들어,10 mM)(이때 pH는 6.5~7.5(예를 들어, 7.0)임)이 되고, 소르비톨의 최종 농도가 3~8%(예를 들어, 5%) (w/v)가 되고, 메티오닌의 최종 농도가 5~15 mM(예를 들어, 10 mM)이 되고, PS80의 최종 농도가 0.01~0.08%(예를 들어, 0.02%) (w/v)가 되도록 각각의 성분을 혼합하는 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 조성물의 제조 방법은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 물; 인산칼륨; 인산나트륨; 수크로스; EDTA; 및 PS80을 용기에 첨가하는 단계, 각각의 성분을 혼합하는 단계, 및 pH를 6.5~7.5(예를 들어, 7.0)까지 조정하는 단계(수크로스의 최종 농도가 3~12%(예를 들어, 8%) (w/v)가 되고, EDTA의 최종 농도가 0.1~1.5 mM(예를 들어, 1 mM)이 되고, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 최종 농도가 5~20 mM(예를 들어, 10 mM)(이때 pH는 6.5~7.5(예를 들어, 7.0)임)이 되고, PS80이 0.01~0.08%(예를 들어, 0.02%) (w/v)가 되도록)를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 액상 조성물로 제공된다. 액상 조성물이란, 조성물이 2~8℃에서 액체 형태로 존재하며, 바람직하게는 2~8℃에서 보관됨을 의미한다.
특정 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃, 25℃, 또는 40℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃에서 보관되고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 25℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 이상 동안 안정하다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 냉동 제형으로 제공된다. 냉동 제형이란, 조성물이 약 -18° 이하, 예를 들어 약 -20℃, -40℃, -60℃, -70℃, -80℃ 또는 그 사이의 임의의 온도, 또는 이보다 더 낮은 온도에서 보관될 때 고체 형태로 존재함을 의미한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 조성물에 존재하는 장성 조절제에 따라 -40℃ 또는 -60℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 -70℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 수크로스를 포함하며, -40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 소르비톨을 포함하며, -60℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 소르비톨 또는 수크로스를 포함하며, -70℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 안정하다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 염화나트륨을 포함하지 않는다.
특정 실시 형태에서, 조성물 중 각각의 O-항원 다당류의 농도는 약 1 내지 200 μg/mL, 예를 들어 약 2 내지 100 μg/mL, 예를 들어 약 4 내지 50 μg/mL이다. 이의 특정 실시 형태에서, 조성물 중 각각의 O-항원 다당류에 있어서 다당류:운반 단백질 비는 약 1:10 내지 약 1:2, 예를 들어 약 1:5 내지 1:2이다.
전술한 [발명의 내용]과, 다음의 본 출원의 바람직한 실시 형태의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태에 한정되지 않음이 이해될 것이다.
도면에서,
도 1a~도 1c는 PS20, PS80, 및 F68이 다음의 테스트 조건 하에서 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 냉동/해동 유도된 응집을 방지할 수 있지만 소르비톨은 상기 응집을 방지할 수 없음을 나타낸다: PS20, PS80, F68 및 소르비톨을 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형에 첨가하고, 냉동/해동 유도된 스트레스를 가하였다.
도 1a는 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 크로마토그램의 적분법을 나타낸다.
도 1b는 냉동/해동 전후의 실험의 결과를 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 1c는 전체 피크 적분시 프리피크(pre-peak) 1의 백분율 값을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 2는 12주의 장기간 동안 40oC를 가할 때 제형 26 및 제형 28의 SEC-HPLC 크로마토그래피 프리피크 1의 백분율을 종래의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형과 직접(head-to-head) 비교하는 그래프를 나타낸다: 직립(↑) 및 역(↓) 바이알 배향 둘 다를 조사하였으며, 제형 26 및 제형 28은 열적 스트레스(40℃)를 가할 때 종래의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형에 비하여 증가된 안정성을 보여주었다.
도 3은 3가지의 상이한 농도의 텅스텐 추출물(HW, MW, LW)에 노출시키고 40℃에서 4주 동안 보관할 때 종래의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형과 비교하여 제형 26 및 제형 28의 프리피크 1의 동향을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 4는 PETG 및 PC 플라스틱 물질과 접촉하고 있는 종래의 제형과 비교하여 제형 26 및 제형 28의 교반 스트레스 전후의 실험 결과를 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다(T0은 대조구, 즉, 교반 스트레스가 없는 것임).
다양한 공보, 논문 및 특허가 배경기술에, 그리고 명세서 전체에 걸쳐 인용되거나 기술되며; 이들 참고문헌은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 물질, 디바이스, 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 대상의 임의의 것이나 전부가 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 기술의 일부를 형성한다고 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본원에서 사용되는 특정 용어는 명세서에 제시되는 의미를 갖는다.
본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술되는 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치는 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 수치는 전형적으로 열거된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수 및 소수값을 포함하는, 그 범위 내의 모든 가능한 하위범위, 모든 개별 수치를 명확히 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "포함하고 있다", "포함하고 있는", "갖다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 이의 임의의 다른 변형은 기재된 정수 또는 정수들의 군을 포함함을 의미하고, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제하는 것을 의미하지는 않으며, 비-배타적이거나 개방형인 것으로 의도됨이 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 그 요소에만 한정될 필요는 없으며, 명백히 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품 또는 장치에 내재하는 것이 아닌 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 명백히 반대로 기재되지 않는 한, "또는"은 포괄적인 또는을 지칭하며 배타적인 또는을 지칭하는 것이 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 어느 하나에 의해 충족된다: A는 참이고(또는 존재하고) B는 거짓임(또는 존재하지 않음), A는 거짓이고(또는 존재하지 않고) B는 참임(또는 존재함), 및 A 및 B 둘 다가 참임(또는 존재함).
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은 "~으로 이루어지다" 또는 변형, 예컨대 "~으로 이루어진다" 또는 "~으로 이루어진"이라는 용어는 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 포함함을 나타내며, 추가의 정수 또는 정수들의 군은 명시된 방법, 구조, 또는 조성물에 부가될 수 없음을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은 "~으로 본질적으로 이루어지다" 또는 변형, 예컨대 "~으로 본질적으로 이루어진다" 또는 "~으로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 포함함을 나타내며, 명시된 방법, 구조, 또는 조성물의 기본적이거나 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 열거된 정수 또는 정수들의 군을 선택적으로 포함함을 나타낸다.
바람직한 발명의 구성요소의 치수 또는 특성을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약", "대략적으로", "일반적으로", "사실상" 등의 용어는 기술된 치수/특성이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니며 기능적으로 동일하거나 유사한 이로부터의 사소한 변화를 배제하는 것이 아님이 또한 이해되어야 하는데, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같다. 최소한, 수치 파라미터를 포함하는 그러한 언급은, 본 기술 분야에서 용인되는 수학적 및 공업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 오차 또는 기타 계통 오차, 제조 공차 등)를 이용할 경우 최하위 유효 숫자를 변화시키지 않는 변화를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "O 다당류", "O-항원", "O 항원", "O-항원 다당류", "O-다당류 항원", 및 약어 "OPS"는 전부 그람-음성균의 O 항원을 지칭하는데, 이는 리포다당류(LPS)의 구성요소이고 그람-음성균의 각각의 혈청형 또는 혈청(아)형에 특이적이다. 대개, O 항원은 2개 내지 7개의 당 잔기의 반복 단위(RU)를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, RU는 생물학적 반복 단위(BRU)와 같게 설정된다. BRU는 생체 내에서 합성되는 O-항원의 RU를 설명한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "콘쥬게이트" 및 "글리코콘쥬게이트"는 전부 운반 단백질(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA))에 공유 결합된 대장균 O 항원을 함유하는 콘쥬게이션 생성물을 지칭한다. 콘쥬게이트는 숙주 세포에서 제조된 콘쥬게이션 생성물인 바이오콘쥬게이트일 수 있으며, 여기서, 숙주 세포 기구(machinery)는 O 항원 및 운반 단백질을 생성하고, O 항원을 예를 들어 N-결합을 통하여 운반 단백질에 결합시킨다. 콘쥬게이트는 또한 다른 수단에 의해, 예를 들어 단백질 및 당 항원의 화학적 결합에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 실시 형태에서 대장균 O 항원은 O1A, O2, O6A, 및 O25B를 포함하며, 이는 국제 공개 제2015/124769호 및 국제 공개 제2017/035181호에 개시되어 있다. 이들 참고문헌 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 다른 대장균 O 항원도 예를 들어 특이적 O1A, O2, O6A 및/또는 O25B 항원에 더하여 사용될 수 있으며, 예를 들어 대장균 O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O25, O73, O75 및 O153 혈청형 또는 이의 혈청아형 유래의 O 항원을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원료 의약품"은 개별적인 글리코콘쥬게이트(대장균 O 항원 다당류가 EPA 운반 단백질에 공유적으로 커플링된 것, 예를 들어 대장균 O25B O 항원이 EPA에 공유적으로 커플링된 것)의 벌크 생성물을 지칭하는데, 이는 대상체에게 최종적으로 투여되는 생성물보다 더 높은 농도로 존재한다. 원료 의약품은 글리코콘쥬게이트를 정제하기 위하여 하류 공정을 완결한 후 생성될 수 있다. 원료 의약품은 예를 들어 본 발명의 제형화 완충제 중에 더 농축된 형태로, 예를 들어 냉동 상태로, 예를 들어 -70℃에서 보관될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "완제 의약품"은 대상체에게 투여하기 위한 최종 형태의 글리코콘쥬게이트 제형을 지칭한다. 완제 의약품은 모든 글리코콘쥬게이트들(다가 백신의 경우 대장균 O 항원 다당류들이 EPA 운반 단백질에 커플링된 것, 4가 백신의 경우, 예를 들어 O25B, O1A, O2 및 O6A가 각각 개별적으로 EPA 운반 단백질에 커플링된 것, 및 선택적으로, 백신의 결합가가 증가되는 경우 더 많은 대장균 O 항원들이 EPA 운반 단백질에 커플링된 것)을 함유한다. 전형적으로, 완제 의약품은 각각의 글리코콘쥬게이트들의 원료 의약품들을 혼합하고, 필요할 경우 제형화 완충제로 희석하여서 백신의 표적 용량이 생성되게 함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 제형의 완제 의약품은 2~8℃에서 보관될 수 있으며, 상기 온도에서 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 안정한 채로 남아 있다.
숫자와 함께 사용될 때 "약"이라는 용어는 언급된 숫자의 ±1, ±5 또는 ±10% 내의 임의의 숫자를 지칭한다.
O 항원이 단백질 운반체에 공유 결합될 때, O 항원의 유효한 양 또는 투여량은 콘쥬게이트 중 O 항원 다당류 모이어티만을 기반으로 하여 계산된다.
ExPEC 또는 ExPEC 감염과 연관된 질환은 요로 감염, 수술 부위 감염, 균혈증, 복부 또는 골반 감염, 폐렴, 병원내 폐렴, 골수염, 봉와직염, 신우신염, 창상 감염, 뇌수막염, 신생아 뇌수막염, 복막염, 담관염, 연조직 감염, 화농성 근염, 패혈성 관절염, 및 패혈증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 2가지 이상의 요법제를 투여하는 것의 맥락에서, "병용하여"라는 용어는 1가지 초과의 요법제의 사용을 지칭한다. "병용하여"라는 용어의 사용은 요법제들을 대상체에게 투여하는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제1 요법제(예를 들어, 본원에 개시된 조성물)는 대상체에게 제2 요법제(예를 들어, 본원에 개시된 조성물, 또는 또 다른 요법제, 예를 들어, 항생제를 포함하는 치료제)의 투여 전에, 제2 요법제의 투여와 함께, 또는 제2 요법제의 투여 후에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유동물을 지칭하며, 비영장류(예를 들어, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 토끼, 래트 또는 마우스) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지 또는 인간)를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 동물이다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. "대상체" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합하며, 조성물에 포함된 ExPEC O-항원에 대한 면역 반응을 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 대상체에서의 그 항원 또는 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 지칭한다.
대장균 O 항원 다당류를 포함하는 조성물
하나의 일반적인 양태에서, 본 발명은 대장균의 임상적 단리체 중에서 주로 발견되는 O-항원 혈청형을 함유하는 다가 백신에 관한 것으로서, 이는 백신에 함유된 O-항원 혈청형을 갖는 ExPEC에 의해 야기되는 질환의 예방을 위한 능동 면역을 제공하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 대장균 O25B 항원 다당류를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 조성물은 대장균 O1A, O2, 및/또는 O6A 항원 다당류를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 국제 공개 제2015/124769호 및 국제 공개 제2017/035181호에 개시된 대장균 O1A, O2, O6A 및 O25B 항원 다당류를 포함한다. 이들 참고문헌 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 다른 또는 추가의 대장균 O 항원 다당류가 조성물에 존재한다. 이러한 대장균 O 항원 다당류는 대장균 O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O25, O73, O75 및 O153의 혈청(아)형으로부터의 O 항원을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 필요에 따라, 본 조성물은 다수의 대장균 혈청형에 대한 면역 보호를 제공하기 위하여, 1가지 초과의 추가의 대장균 O 항원, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20가지 이상의 추가의 대장균 O 항원을 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 조성물 및 방법은 대장균 O25B 항원 및 하나 이상의 추가의 대장균 O 항원과 관련될 수 있다. 대장균 O 항원의 예는 대장균 O25B, O1A, O2 및 O6A 항원을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대장균 O25B 항원"은 대장균 O25B 혈청형에 특이적인 O 항원을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 대장균 O25B 항원은 하기 화학식 O25B'의 구조를 포함한다:
[화학식 O25B']
여기서, 화학식 O25B'에서의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 화학식 O25B'에서의 n은 10 내지 20의 정수이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대장균 O1A 항원"은 대장균 O1A 혈청형에 특이적인 O 항원을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 대장균 O1A 항원은 하기 화학식 O1A'의 구조를 포함한다:
[화학식 O1A']
여기서, 화학식 O1A'에서의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다. 일 실시 형태에서, 화학식 O1A'에서의 n은 7 내지 15의 정수이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대장균 O2 항원"은 대장균 O2 혈청형에 특이적인 O 항원을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 대장균 O2 항원은 하기 화학식 O2'의 구조를 포함한다:
[화학식 O2']
여기서, 화학식 O2'에서의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다. 일 실시 형태에서, 화학식 O2'에서의 n은 8 내지 16의 정수이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대장균 O6 항원"은 대장균 O6 혈청형에 특이적인 O 항원을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 대장균 O6 항원은 대장균 O6A이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대장균 O6K2 항원" 또는 "대장균 O6Glc 항원"으로도 지칭되는 "대장균 O6A 항원"은 대장균 O6A 혈청형에 특이적인 O 항원을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 대장균 O6A 항원은 하기 화학식 O6A'의 구조를 포함한다:
[화학식 O6A']
.
여기서, β 1, 2 결합은 β2 결합으로도 명명되며, 화학식 O6A'에서의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다. 일 실시 형태에서, 화학식 O6A'에서의 n은 8 내지 18의 정수이다.
본 발명의 조성물 중 대장균 O 항원 다당류는 운반 단백질에 공유 결합되며(때때로 "콘쥬게이션된" 것으로 지칭됨), 본 발명의 운반 단백질은 피. 아에루기노사 외독소 A, 바람직하게는 이의 무독화 변이체이다(EPA; 예를 들어, 문헌[Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61]; 국제 공개 제2015/124769호 참조). 운반 단백질과 O 항원 다당류의 조합물은 글리코콘쥬게이트로 지칭된다. 전형적으로, 조성물 중의 각각의 대장균 혈청형으로부터의 O 항원은 별개의 운반 단백질에 공유 결합되며, 즉, 조성물이 4가지의 O 항원 다당류를 포함할 경우, 이들 각각은 별개로, 그리고 독립적으로 EPA 운반 단백질에 커플링되며, 따라서 조성물은 4가지의 상이한 글리코콘쥬게이트를 포함한다. 글리코콘쥬게이트를 제조하는 하나의 방법으로는 바이오콘쥬게이션에 의한 것이 있으며, 여기서, 숙주 세포 기구는 O 항원 및 운반 단백질을 생성하고 O 항원을 예를 들어 N-결합을 통하여 운반 단백질에 결합시킨다(예를 들어, 대장균 O 항원 O25B, O1A, O2 및 O6A 다당류의 EPA 운반 단백질에의 바이오콘쥬게이트의 제조에 대해서는 국제 공개 제2015/124769호 참조). EPA에 있어서, 다양한 무독화 단백질 변이체가 문헌에 기술되었으며, 이는 운반 단백질로 사용될 수 있었다. 무독화(또는 비-독성) EPA는 ADP 리보실화 활성이 결여된 임의의 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A를 지칭한다. 야생형 EPA의 리보실화 활성은 EPA의 대략 아미노산 400 내지 613에 위치하며, 예를 들어, 야생형 EPA로부터 위치 553의 아미노산인 글루탐산을 결실시키거나, 야생형 EPA에서 위치 426의 히스티딘을 타이로신으로 치환하면 EPA 분자가 무독화된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 야생형 EPA의 아미노산 400~613 내의 다른 아미노산을 예를 들어 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환에 의해 변경하여 ADP 리보실화 활성을 제거할 수 있고 이와 함께 독성을 제거할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, EPA 운반 단백질은 무독화 변이체이다. 비제한적이고 예시적인 특정 실시 형태에서, EPA 운반 단백질은 서열 번호 1로 개시된 아미노산 서열(무독화 EPA의 실시 형태임), 또는 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 서열 번호 1에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산의 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 선택적으로, 하기에 기술된 바와 같은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상의 재조합적으로 도입된 글리코실화 콘센서스 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 글리코실화 부위의 도입은 EPA 단백질의 일차 구조 내의 어디에서든 글리코실화 콘센서스 서열(예를 들어, Asn-X-Ser(Thr)(여기서, X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음); 또는 바람직하게는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기서, X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(서열 번호 2)(예를 들어, 국제 공개 제2006/119987호 및 국제 공개 제2015/124769호 참조))의 삽입에 의해 성취된다. 바람직한 실시 형태에서, EPA 운반 단백질은 아미노산 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기서, X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(서열 번호 2)을 갖는 하나 이상의 재조합적으로 도입된 N-결합 글리코실화 콘센서스 부위를 포함한다. 특정 실시 형태에서, EPA 운반 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 그러한 도입된 콘센서스 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, EPA는, 예를 들어 글리코콘쥬게이트가 고전적인 콘쥬게이션 화학을 이용하여 제조될 경우, 그러한 도입된 N-결합 글리코실화 콘세서스 부위를 포함하지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제5,370,872호; 문헌[Cryz et al, 1990, Infection and Immunity 58: 373-377] 참조).
특정 실시 형태에서, 대장균 O-항원은 약 1:20 내지 20:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:10 내지 3:1의 다당류:단백질의 중량/중량비로 운반 단백질에 공유 결합된다. 바이오콘쥬게이트에 대한 특정한 비제한적 실시 형태에서, 다당류/단백질의 비는 O-항원 혈청형에 따라 각각의 바이오콘쥬게이트에 있어서 약 0.1 내지 0.5이다(즉, 다당류:단백질은 약 1:10 내지 1:2, 예를 들어 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 또는 그 사이의 임의의 값이다).
특정한 비제한적 실시 형태에서, 대장균 O 항원 다당류는 각각의 O 항원 다당류에 있어서 약 1 내지 200 μg/mL, 예를 들어, 약 2 내지 100 μg/mL, 예를 들어 약 4 내지 50 μg/mL, 예를 들어 약 4 내지 48 μg/mL, 예를 들어 약 8 내지 48 μg/mL, 예를 들어 약 4 내지 32 μg/mL, 예를 들어 약 8 내지 32 μg/mL, 예를 들어, 8, 16, 20, 또는 32 μg/mL 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 2가지의 대장균 O 항원 다당류의 조성물에서, 각각의 O 항원 다당류는 조성물 중 O 항원 다당류들의 각각의 조합에 있어서 1:1 내지 1:2, 또는 그 사이의 임의의 값의 중량비로 존재한다.
특정한 비제한적 실시 형태에서, O-항원 다당류는 약 4 내지 1000 μg/mL, 예를 들어 약 10 내지 500 μg/mL, 예를 들어 약 20 내지 250 μg/mL, 예를 들어 약 24 내지 120 μg/mL의 전체 O-항원 다당류의 농도로 조성물에 존재한다.
특정한 비제한적 실시 형태에서, 조성물 중 EPA 운반 단백질의 총 농도는 예를 들어 약 40 내지 2000 μg/mL, 예를 들어 약 100 내지 1500 μg/mL, 예를 들어 약 200 내지 1200 μg/mL, 예를 들어 약 250 내지 600 μg/mL일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 조성물은 1:1:1:1의 중량비의 O25B, O1A, O2 및 O6A 항원 다당류를 포함하며, 여기서, O 항원 다당류 각각은 EPA 운반 단백질에 공유 결합된다. 또 다른 실시 형태에서, 조성물은 2:1:1:1의 중량비의 대장균 O25B, O1A, O2 및 O6A 항원 다당류를 포함하며, 여기서, O 항원 다당류 각각은 EPA 운반 단백질에 공유 결합된다. 이러한 실시 형태 각각에서, O25B 항원 다당류는 비제한적 예로서, 약 8, 16, 또는 32 g/mL의 농도로 존재할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 ExPEC 감염의 치료 및 예방에서 유용하다. 특정 실시 형태에서, EPA 운반 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 것에 더하여, 본원에 개시된 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용가능한"이라는 용어는 동물에서의, 더 구체적으로 인간에서의 사용용으로 미국 약전 또는 다른 일반적 공인 약전에 열거되거나 미국 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 것을 의미한다. 제약상 허용가능한 담체의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같은 "담체"라는 용어는 희석제, 아쥬반트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클(이와 함께 제약 조성물이 투여됨)을 지칭한다. 본 발명의 조성물 중 물은 바람직하게는 주사용 물이다.
본원에 제공된 조성물은 계면활성제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 계면활성제는 친양쪽성인 유기 화합물이며, 이는 계면활성제가 소수성 기(그의 테일) 및 친수성 기(그의 헤드) 둘 다를 포함함을 의미한다. 바람직한 실시 형태에서, 계면활성제는 친수성 헤드(OH-기를 포함함) 및 긴 소수성 테일(탄소-사슬, 이는 탄소 사슬 내에 적어도 약 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 130개 이상의 탄소를 포함할 수 있음)로 구성된다. 본 발명에 따른 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 본 발명의 조성물에 적합한 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 20(PS20), 폴리소르베이트 40(PS40), 폴리소르베이트 60(PS60), 폴리소르베이트 80(PS80), 및 플루로닉(Pluronic)® F-68(F-68)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, 계면활성제는 PS80이다. 특정 실시 형태에서, 조성물 중 계면활성제는 0.01% (중량/부피(w/v)) 내지 0.2% (w/v)의 농도로 제공된다. 특정 실시 형태에서, 조성물 중 계면활성제는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 제공된다. F-68이 계면활성제인 실시 형태에 있어서, 그 농도는 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 0.2%이다. PS20, PS40, PS60, 또는 PS80이 계면활성제인 실시 형태에 있어서, 그 농도는 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.08%, 예를 들어 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 또는 그 사이의 임의의 값이다.
본원에 제공된 조성물은 특정 pH를 갖는 완충제를 추가로 포함한다. 본 발명에 따르면, 조성물은 인산칼륨/인산나트륨 완충제를 포함한다. 이러한 완충제의 농도 범위는 예를 들어 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 8 mM 내지 약 15 mM, 약 8 mM 내지 약 13 mM, 약 9 mM 내지 약 11 mM일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 완충제는 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 제공된다. 특정 실시 형태에서, 완충제 농도는 약 8 mM 내지 약 15 mM이다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 10 mM의 농도의 완충제를 포함한다. 이러한 완충제의 pH 범위는 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.1일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 pH는 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서 완충제의 pH는 7.0이다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 10 mM의 농도 및 7.0의 pH의 인산칼륨/인산나트륨 완충제를 포함한다.
인산칼륨/인산나트륨 완충액은 예를 들어 K2HPO4(2염기성) 또는 KH2PO4(1염기성)로부터의 칼륨 및 Na2HPO4(2염기성) 또는 NaH2PO4(1염기성)로부터의 나트륨을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제는 1염기성 인산칼륨(KH2PO4) 및 2염기성 인산나트륨(Na2HPO4)을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제는 2염기성 인산칼륨(K2HPO4) 및 1염기성 인산나트륨(NaH2PO4)을 포함한다. 1염기성 포스페이트 화학종과 2염기성 포스페이트 화학종 사이의 몰비([H2PO4]-/[HPO4]2-)는, 반대 이온에 상관없이, 5.13 내지 0.52의 범위이다.
본원에 제공된 조성물은 장성 조절제(때때로 ‘안정화제'로도 지칭됨)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 장성 조절제는 다른 부형제에 따라 수크로스 또는 소르비톨 중 어느 하나이며, 이는 본원에 정의된 바와 같다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 수크로스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 약 3% 내지 약 12% (w/v), 약 3% 내지 약 11% (w/v), 약 3% 내지 약 10% (w/v), 약 4% 내지 약 10% (w/v), 약 5% 내지 약 9% (w/v), 약 6% 내지 약 9% (w/v)의 범위의 농도의 수크로스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 수크로스는 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 약 3% 내지 약 10%의 농도의 수크로스를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 8%의 농도의 수크로스를 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 소르비톨을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 약 3% 내지 약 8% (w/v), 약 3% 내지 약 7% (w/v), 약 4% 내지 약 6% (w/v)의 농도의 소르비톨을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 약 4% 내지 약 6% (w/v)의 농도의 소르비톨을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도의 소르비톨을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 5%의 농도의 소르비톨을 포함한다.
본원에 제공된 조성물은 산화방지제를 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 산화방지제는 본원에 기술된 바와 같이, 다른 부형제에 따라 EDTA 또는 메티오닌이다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 EDTA를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.2 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.1 mM의 농도의 EDTA를 포함한다. 특정 실시 형태에서, EDTA는 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 1.0 mM의 농도의 EDTA를 포함한다. EDTA를 포함하는 본 발명의 조성물은 수크로스를 또한 포함한다. 다른 실시 형태에서, 조성물은 메티오닌을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 6 mM 내지 약 14 mM, 약 7 mM 내지 약 13 mM, 약 8 mM 내지 약 12 mM, 약 9 mM 내지 약 11 mM의 농도의 메티오닌을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 약 8 mM 내지 약 12 mM의 농도의 메티오닌을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 메티오닌은 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 10 mM의 농도의 메티오닌을 포함한다. 메티오닌을 포함하는 본 발명의 조성물은 소르비톨을 또한 포함한다.
대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 5% (w/v)의 소르비톨; 10 mM의 메티오닌; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 본질적으로 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다. 또한, 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20가지의 다른 대장균 O 항원 다당류(여기서, 각각의 O 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 8% (w/v)의 수크로스; 1 mM의 EDTA; 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(7.0의 pH); 및 0.02%의 PS80으로 이루어진 조성물이 제공된다.
본원에 개시된 조성물은 선택적으로, 보존제, 예컨대 수은 유도체 티메로살, 페녹시에탄올, 또는 파라벤을 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시 형태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 0.001% 내지 0.01%의 티메로살을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)은 아쥬반트를 포함하거나, 아쥬반트와 병용하여 투여된다. 본원에 개시된 조성물과 병용하여 투여하기 위한 아쥬반트는 상기 조성물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, "아쥬반트"라는 용어는 본원에 개시된 조성물과 함께 또는 이의 일부로 투여되는 경우 바이오콘쥬게이트에 대한 면역 반응을 증대시키고/시키거나 향상시키고/시키거나 촉진하지만, 아쥬반트 화합물이 단독으로 투여되는 경우에는 바이오콘쥬게이트에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 아쥬반트는 예를 들어 림프구 모집, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함하는 몇몇 기작에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물은 바이오콘쥬게이트 및 부형제 외에는 아쥬반트를 포함하지 않고/않거나 바이오콘쥬게이트 및 부형제 외에는 아쥬반트와 병용하여 투여되지 않는다(바이오콘쥬게이트 또는 부형제가 내인성 아쥬반트 특성을 포함하는 경우, 이는 무시되며, 이러한 실시 형태에서 추가의 외인성 아쥬반트는 첨가되지 않는다).
아쥬반트의 구체적인 예는 알루미늄 염(명반)(예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 및 황산알루미늄), 3 데(De)-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL)(영국 특허 제2220211호 참조), MF59(노바티스(Novartis)), AS03(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), AS04(글락소스미스클라인), 이미다조피리딘 화합물(국제 공개 제2007/109812호 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(국제 공개 제2007/109813호 참조) 및 사포닌, 예컨대 QS21(문헌[Kensil et al., Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995]); 미국 특허 제5,057,540호 참조)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 아쥬반트로는 수중유 에멀젼(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩유)(선택적으로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A와 조합됨)이 있다(문헌[Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91] 참조). 또 다른 아쥬반트로는 CpG가 있다(문헌[Bioworld Today, Nov. 15, 1998]).
특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물은 대상체로의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 본원에 개시된 조성물은 예를 들어 근육내, 피하, 비경구, 경구, 비강내, 피내, 경피, 결장직장, 복강내, 기관내, 국소, 직장 또는 폐 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물은 근육내 주사에 의한 투여에 유용하다. 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물은 피내 투여될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 조성물은 피부를 통하여 전달될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 제형의, 본원에 상세하게 기술된 4가지 콘쥬게이트(즉, 대장균 혈청형 O25B, O1A, O2, 또는 O6A로부터의 O-항원을 나타냄) 중 적어도 하나를 포함하는 원료 의약품 조성물이 또한 본원에서 제공된다. 상기 4가지 콘쥬게이트들 중 단지 하나 또는 이들의 하위세트를 포함하는 그러한 조성물들은 예를 들어 벌크 항원을, 예를 들어 최종 완제 의약품으로 배합하기 전 원료 의약품으로서 보관하는 데 유용할 수 있으며, 상기 4가지 콘쥬게이트 전부를 포함하는 완제 의약품 조성물에 대하여 기술된 유용한 안정성 특성을 공유할 수 있다.
방법/용도
본 발명의 조성물은 예를 들어 필요로 하는 대상체에서 ExPEC에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역 반응은 필요로 하는 대상체에서 ExPEC와 연관된 질환을 예방하거나 치료하는 데 효과적이다. 본 방법은 본 발명에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본원에 제공된 조성물은 용기에 보관될 수 있다. 적합한 용기는 백, 바이알, 주사기, 병, 및 시험관을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시 형태에서, 주사기에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖춘 바이알이 본원에 개시된 조성물들 중 임의의 것을 포함한다. 본원에 제공된 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리(예를 들어, 붕규산염 유리), 금속, 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리카르보네이트)으로 형성될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 용기는 예를 들어 제I형 붕규산염 유리의 바이알이다. 다른 실시 형태에서, 용기는 루어락(luer lock) 또는 스테이크형(staked) 바늘 중 어느 하나를 갖춘 유리 주사기이다. 다른 실시 형태에서, 용기는 플라스틱 물질, 예컨대 폴리카르보네이트(PC) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜(PETG)의 바이알 또는 주사기이며, 상기 물질은 예를 들어 본 발명에 따른 원료 의약품과 상용성인 것으로 밝혀졌다. 바이알은 선택적으로, 예를 들어 플루오로중합체 필름(예를 들어 플루오로텍(Flurotec[에틸렌 테트라플루오로에틸렌(EFTE)] 또는 테플론(Teflon)[플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP)])으로 코팅된 (클로로/브로모)부틸 고무로부터의 고무 마개를 함유할 수 있다. 다른 물질 및 용기 유형이 또한 사용될 수 있으며, 본 발명의 제형과의 상용성은 본 발명의 개시 내용을 기반으로 하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 원료 의약품은 폴리카르보네이트 용기, 예를 들어 병에 보관된다. 특정 실시 형태에서, 원료 의약품은 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜 용기, 예를 들어 병에 보관된다. 특정 실시 형태에서, 완제 의약품은 유리 용기, 예를 들어 바이알에 보관된다.
본원에 제공된 제형은 조성물 중 글리코콘쥬게이트의 안정성을 향상시킨다. 일반적으로, 안정하다는 것은 조성물이 보관시에 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지함을 의미한다. 바람직하게는, 조성물은 보관시에 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 그의 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및 생물학적 활성은 본원에 개시된 방법 및 본 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 조성물은, 본원에서 실시예에 기술된 바와 같이, 0의 시점과 비교하여 크기 배제 크로마토그래피 HPLC 프리피크(글리코콘쥬게이트의 응집을 나타냄)의 5% 이하의 변화가 있을 경우, ‘안정한' 것으로 간주된다(그리고 상응하는 제형은 ‘안정화' 제형으로 간주된다). 예를 들어, 기존의 ExPEC 백신 조성물(25 mM 트리스(pH 7.4) 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl 중)은 40℃에서의 8주에서 5% 초과의 프리피크 증가를 나타내며, 따라서 이 온도에서 8주에서 안정하지 않고, 반면에 본 발명의 조성물은 40℃에서의 12주 후 5% 미만의 프리피크 증가를 나타내며 따라서 이 온도에서 적어도 12주 동안 안정하다. 본 발명의 조성물은 유리 용기에서 2~8℃에서 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 안정하다. 또한 본 발명의 조성물은 플라스틱 용기에서 25℃에서 적어도 7일 동안 안정한데, 이는 이러한 조건 하에서 ExPEC 글리코콘쥬게이트 생성물의 프로세싱을 허용한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 액상 조성물로 제공된다. 액상 조성물이란, 조성물이 2~8℃일 때, 바람직하게는 2~8℃에서 보관될 때 액체 형태로 존재함을 의미한다. 선택적으로, 본 액상 조성물은 예를 들어 열적 스트레스 조건 하에서 가속화 안정성 테스트를 위하여 25℃에서 또는 40℃에서 보관된다.
특정 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃, 25℃, 또는 40℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃에서 보관되고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 2~8℃에서 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 25℃에서 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 이상 동안 안정하다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 냉동 조성물로 제공된다. 냉동 조성물이란, 조성물이 약 -18° 이하, 예를 들어 약 -20℃, -40℃, -60℃, -70℃, -80℃ 또는 그 사이의 임의의 온도, 또는 이보다 더 낮은 온도에서 보관될 때 고체 형태로 존재함을 의미한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 조성물에 존재하는 장성 조절제에 따라 -40℃ 또는 -60℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 -70℃에서 보관될 수 있고 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 수크로스를 포함하며, -40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 소르비톨을 포함하며, -60℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 소르비톨 또는 수크로스를 포함하며, -70℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 안정하다. 본 발명의 조성물은 이전에 개시된 종래의 조성물 제형보다 더 안정하도록 설계된다. 조성물의 안정성은 본원에 기술된 방법 및 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법을 이용하면, 본 발명의 조성물은 주어진 온도에서 주어진 기간에 걸쳐, 상기 기간 및 상기 온도에 걸친 종래의 제형의 조성물과 비교하여 더 안정할 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물을 제조하는 방법도 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, EPA 운반자에 공유 결합된 적어도 하나의 대장균 O 항원, 물, 완충액용 염(즉, 인산(이)수소나트륨 및 인산(이)수소칼륨[즉, Na2HPO4 및 KH2PO4 또는 NaH2PO4 및 K2HPO4]), 장성 조절제(즉, 소르비톨 또는 수크로스), 산화방지제(즉, 장성 조절제가 소르비톨인 경우 메티오닌, 장성 조절제가 수크로스인 경우 EDTA), 및 계면활성제(예를 들어, PS80)를 용기에 첨가하는 단계, pH를 원하는 pH(즉, 6.5 내지 7.5, 예를 들어 7.0)까지 조정하는 단계, 및 이러한 성분들을 혼합하여서 본 발명에 따른 액상 제형을 생성하는 단계를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 조성물의 제조 방법은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 물; 인산칼륨; 인산나트륨; 소르비톨; 메티오닌; 및 PS80을 용기에 첨가하는 단계, pH를 7.0까지 조정하는 단계, 및 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 최종 농도가 10 mM(이때 pH는 7.0임)이 되고, 소르비톨이 5% (w/v)가 되고, 메티오닌이 10 mM이 되고, PS80이 0.02% (w/v)가 되도록 각각의 성분을 혼합하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 제형을 제조하는 하나의 비제한적이고 예시적인 방법은 다음과 같다: 약 3.5 리터의 물에 3.3696 g의 KH2PO4 (Mw = 136.09 g/mol), 2.1635 g의 Na2HPO4 (Mw = 141.96 g/mol), 200 g의 소르비톨, 5.9684 g의 메티오닌 (Mw = 149.21 g/mol), 8 mL의 10% (w/v) PS80 스톡(stock)(이는 약 6.73의 pH로 이어짐)을 첨가하고, 이를 후속적으로 10 N NaOH 약 500 μL를 이용하여 표적 pH = 7.0까지 조정하고, 부피를 물로 4 리터까지 조정한다. 소르비톨 및 메티오닌 대신 수크로스 및 EDTA를 포함하는 제형은 유사한 방식으로 제조될 수 있으며, 이는 일반 상식 및 본원에 제공된 정보를 갖고 있는 숙련자에게 명백하다. 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 하나의 가능한 방법으로는, 예를 들어 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 정제 단계 동안 또는 상기 정제 단계 후, ExPEC 글리코콘쥬게이트가 존재하는 임의의 완충제에 대하여 상기에 설명된 바와 같이 제조된 제형을 교환하기 위하여, 예를 들어 접선방향 유동 여과, 여과, 투석, 크기 배제 크로마토그래피 등을 이용한 완충제 교환에 의한 것이 있다. 이러한 완충제 교환 단계는 본원에 제공된 정보를 이용할 경우 당업자에게는 일상적인 것이다.
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
실시 형태
실시 형태 1은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 대장균 O25B, O1A, O2 및 O6A 항원 다당류 4가지 전부(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 3% 내지 8%(바람직하게는 4% 내지 6%) (w/v)의 소르비톨; 5 내지 15 mM(바람직하게는 8 내지 12 mM)의 메티오닌; 5 내지 20 mM(바람직하게는 8 내지 15 mM)의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 면역원성 조성물이다.
실시 형태 2는 대장균 O25B, O1A, O2, 및 O6A 항원 다당류가 1:1:1:1 또는 2:1:1:1의 중량비로 존재하는 실시 형태 1의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 3은 소르비톨의 농도가 5% (w/v)인 실시 형태 1 또는 2의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 4는 메티오닌의 농도가 10 mM인 실시 형태 1 내지 3 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 5는 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도가 10 mM이고, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 pH가 7.0인 실시 형태 1 내지 4 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 6은 계면활성제가 친수성 헤드 및 소수성 테일을 포함하며, 바람직하게는 계면활성제가 F-68, PS20, 및 PS80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 1 내지 5 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 7은 계면활성제가 PS80인 실시 형태 6의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 8은 계면활성제의 농도가 0.02% (w/v)인 실시 형태 7의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 9는 다음을 포함하는 면역원성 조성물이다:
a. 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨);
b. 5% (w/v)의 소르비톨;
c. 10 mM의 메티오닌;
d. 6.19 mM KH2PO4 및 3.81 mM Na2HPO4 완충제(7.0의 pH); 및
e. 0.02% (w/v)의 PS80.
실시 형태 10은 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 대장균 O25B, O1A, O2 및 O6A 항원 다당류 4가지 전부(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨); 3% 내지 12%(바람직하게는 3% 내지 10%) (w/v)의 수크로스; 0.1 내지 1.5 mM의 EDTA; 5 내지 20 mM(바람직하게는 8 내지 15 mM)의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및 0.01% 내지 0.2% (w/v)의 계면활성제를 포함하는 면역원성 조성물이다.
실시 형태 11은 대장균 O25B, O1A, O2, 및 O6A 항원 다당류가 1:1:1:1 또는 2:1:1:1의 중량비로 존재하는 실시 형태 10의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 12는 수크로스의 농도가 8% (w/v)인 실시 형태 10 또는 11의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 13은 EDTA의 농도가 1 mM인 실시 형태 10 내지 12 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 14는 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도가 10 mM이고, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 pH가 7.0인 실시 형태 10 내지 13 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 15는 계면활성제가 친수성 헤드 및 소수성 테일을 포함하며, 바람직하게는 계면활성제가 F-68, PS20, 및 PS80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 10 내지 14 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 16은 계면활성제가 PS80인 실시 형태 15의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 17은 계면활성제의 농도가 0.02% (w/v)인 실시 형태 16의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 18은 다음을 포함하는 면역원성 조성물이다:
a. 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨);
b. 8% (w/v)의 수크로스;
c. 1 mM의 EDTA;
d. 10 mM의 인산칼륨/인산나트륨(예를 들어, 6.19 mM KH2PO4 및 3.81 mM Na2HPO4) 완충제(7.0의 pH); 및
e. 0.02% (w/v)의 PS80.
실시 형태 19는 각각의 O-항원 다당류의 농도가 약 1 내지 200 μg/mL, 바람직하게는 1 내지 100 μg/mL, 더 바람직하게는 2 내지 50 μg/mL, 예를 들어 약 4 μg/mL 내지 32 μg/mL인 실시 형태 1 내지 18 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 20은 각각의 O-항원 다당류에 있어서 다당류:운반 단백질의 (중량:중량) 비가 약 1:10 내지 약 1:2, 예를 들어 약 1:5 내지 약 1:2인 실시 형태 1 내지 19 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 21은 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체 형태의 실시 형태 1 내지 20 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 22는 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나의 면역원성 조성물이다.
실시 형태 23은 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나의 면역원성 조성물의 용도이다.
실시 형태 24는 유리 용기 내의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 25는 폴리카르보네이트 용기 내의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 26은 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜 용기 내의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 27은 바이알 내의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 28은 주사기 내의 실시 형태 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 29는 2~8℃의 온도에서 보관될 때 적어도 6개월, 바람직하게는 적어도 12개월, 더 바람직하게는 적어도 18개월, 더 바람직하게는 적어도 24개월, 더 바람직하게는 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 안정한 실시 형태 1 내지 21 또는 24 내지 28 중 어느 하나에 따른 조성물이다.
실시 형태 30은 EPA 운반 단백질에 공유적으로 커플링된 대장균 O 항원을 포함하는 액상 면역원성 조성물을 안정하게 유지하는 방법으로서, 실시 형태 1 내지 21 또는 24 내지 29 중 어느 하나에 따른 조성물을 2~8℃의 온도에서 적어도 6개월, 바람직하게는 적어도 12개월, 더 바람직하게는 적어도 18개월, 더 바람직하게는 적어도 24개월, 더 바람직하게는 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상 동안 보관하는 단계를 포함하는 방법이다.
실시예
실시예 1: 계면활성제의 첨가는 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 냉동/해동 유도된 응집을 방지한다.
냉동/해동, 교반, 열적 유도 스트레스, 및 금속-유도 산화 스트레스시에 안정화를 돕기 위하여, 어떤 부형제 조합물을 대장균 O25B, O1A, O2, O6A 항원 다당류(각각 독립적으로 별개의 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA)에 공유 결합됨(즉, 총 4가지의 별개의 글리코콘쥬게이트), 이하, ExPEC 글리코콘쥬게이트로 지칭됨)에 첨가할 수 있는지를 결정하기 위하여, 여러 가지 부형제들을 처음의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형(ExPEC 글리코콘쥬게이트, 25 mM 트리스, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(이하, "종래" 제형으로 지칭되는데, 이는 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 2상 임상 시험에서 현재 사용되고 있는 제형임, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02546960)에 첨가하였으며, 생성된 제형을 적절한 방법으로 안정화 증가에 대하여 테스트하였다.
종래 제형(때때로, 본원에서 "대조구"로도 지칭됨)에서, ExPEC 글리코콘쥬게이트는 냉동/해동 유도 스트레스를 가할 때 응집되었다. ExPEC 글리코콘쥬게이트의 응집은 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 프로파일에서 프리피크로 보이며(예를 들어, 도 1a 및 도 1b 참조), 여기서, 프리피크 1은 스트레스를 가할 때 불안정성의 지시자이다.
처음에, 동결방지제(예를 들어, 소르비톨)를 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형에 첨가하고, 후속적인 제형을 테스트하여 냉동/해동 유도 스트레스를 가할 때 안정성이 증가되는지를 결정하였다. 소르비톨의 첨가는 SEC-HPLC로 측정할 경우 냉동/해동 유도 응집으로부터 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 보호하지 않음이 밝혀졌다(도 1b).
그러나, 놀랍게도, 계면활성제(예를 들어, F-68[폴록사머(poloxamer) 188, 또는 플루로닉 F-68로도 공지됨], PS20, 또는 PS80)를 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형에 첨가하면, 냉동/해동 유도 스트레스를 가할 때 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 안정성이 증가되었다. 구체적으로, 계면활성제는 냉동/해동 유도 스트레스에 노출될 때 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 응집을 방지하였다. 0.01% PS-80, 0.01% PS 20, 또는 0.1% F-68(전부 w/v)을 ExPEC 글리코콘쥬게이트에 첨가하면, SEC-HPLC로 측정할 경우 냉동/해동 유도 응집이 방지되었다(도 1b 및 도 1c). 각각의 테스트한 계면활성제(전부 비이온성 계면활성제)는 친수성 헤드(OH-기를 포함함) 및 긴 소수성 테일(탄소-사슬, 이는 탄소 사슬 내에 적어도 약 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 130개 이상의 탄소를 포함할 수 있음)로 구성되었다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 이러한 물리적 특성은 테스트한 계면활성제가 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 냉동/해동 유도 응집을 방지하게 하였다고 믿어진다. 추가 개발에서, PS80을 부형제로 사용하여 냉동/해동 유도 응집을 방지하였으며, 그 이유는 이 특별한 계면활성제가 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 후기 단계 개발에 대한 용이한 구현과 관련된 추가의 장점을 갖기 때문이다.
실시예 2: 완충제, pH 값, 및 장성 조절제에 대한 제형의 평가.
계면활성제가 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 냉동/해동 유도 응집을 방지할 수 있음을 입증한 후, 제형화에 적합한 완충제, pH, 및 장성 조절제를 조사하였다. 후속 실험에서, 장성 조절제로서 NaCl (150 mM) 또는 5% 소르비톨 (w/v)의 존재 하에, 전부 PS80 (0.01% (w/v))을 함유하는 상이한 완충제-pH 조합들을 커버하는 몇몇 제형을 조사하였다. 종래 제형 (25 mM 트리스, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)을 대조구로 사용하였다. ExPEC 글리코콘쥬게이트의 다수의 농도(예를 들어, 각각의 다당류에 있어서 16 또는 8 μg/mL)를 테스트하였지만, 테스트한 제형들의 안정화에 있어서의 농도 차이의 영향을 관찰하지 못하였다(데이터는 예시되어 있지 않음).
냉동/해동, 교반, 광 노출, 및 다양한 온도(예를 들어, 2~8℃, 25℃, 및 40℃)에서의 열적 스트레스를 포함하는 몇몇 스트레스를 이러한 제형에 적용하였다(표 1).
표 2에 기술된 분석 패키지를 이용하여, 히스티딘 함유 제형(pH 7) 또는 인산칼륨 함유 제형(pH 7)이 다른 완충제-pH 조합과 비교하여 더 안정함을 입증하였다(데이터는 예시되어 있지 않음). 또한, 극단적인 pH 값(즉, pH 5.0 및 pH 8.0)에서, ExPEC 글리코콘쥬게이트가 더 많이 응집되는 것으로 보인다. 부가적으로, 장성 조절제로서 소르비톨을 함유하는 제형은 예기치 않게도, 장성 조절제로서 NaCl을 함유하는 제형보다 더 안정함이 관찰되었다. 사실상, NaCl을 함유하는 제형은 40℃에서의 보관 동안 응집에 대하여 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 안정화시킬 수 없음이 관찰되었다. 소르비톨을 장성 조절제로 사용했을 때, ExPEC 글리코콘쥬게이트의 응집은 일어나지 않았으며, 이는 소르비톨이 놀랍게도 안정화 효과를 가짐을 입증하는 것이다. 또한, 극단적인 pH(즉, pH 5.0 및 pH 8.0)에서의 응집은 NaCl 함유 제형과 비교하여 소르비톨 함유 제형에서 감소된다. 이것은 소르비톨이 제형을 더 강건하게 만들고 ExPEC 글리코콘쥬게이트에 안정화 효과를 제공할 수 있게 함을 보여준다(pH의 달라짐이 생성 동안 일어남에도 불구하고).
실시예 3: 안정성에 대한 제형의 평가.
ExPEC 글리코콘쥬게이트의 안정성과 관련하여 최상의 후보 제형을 확인하기 위하여 추가 제형을 설계하였다. 완충제 및 pH에 있어서, 히스티딘을 6.5 및 7.0의 pH에서 평가하고, 단지 인산칼륨 대신, 인산칼륨/인산나트륨 완충제(KH2PO4/Na2HPO4)를 6.5 및 7.0의 pH에서 평가하였다. 칼륨과 나트륨의 조합을 처음의 결과를 기반으로 하여 선택하였으며, 상기 조합은 냉동/해동시에 국소적 pH 완충 능력을 더 잘 커버한다. 완충 시스템의 제조에서 칼륨이 나트륨에 비하여 우세하다(예를 들어, pH = 7.0인 10 mM 인산염 완충제의 경우, 6.19 mM KH2PO4 및 3.81 mM Na2HPO4를 사용함). 장성 조절제로서, 수크로스 (8% (w/v)) 및 소르비톨 (5% (w/v))을 평가하였다. 부가적으로, 산화방지제 EDTA (1 mM) 또는 메티오닌 (10 mM)의 첨가의 영향을 평가하였다. 또한, NaCl의 부재 또는 소르비톨의 존재가 실시예 2에서 관찰된 보호 효과를 제공하는지를, 이들의 조합물(이러한 성분들을 실시예 2에서와 같이 개별적으로 사용할 때와 비교하여 각각 절반의 농도)을 포함하는 제형의 포함에 의해 테스트하였다. 모든 제형은 0.02% (w/v)의 농도의 PS80을 함유하였다.
여러 가지 제형들에 실시예 2에서 설명한 것과 동일한 스트레스 조건을 가하였다. 안정성 데이터의 조합을 기반으로 하여, 각각의 제형의 성능을 평가하고 다음 기준을 기반으로 하여 제외하는 선택 단계를 행하였다: (a) 각각의 온도에 있어서 3개의 시점 중 적어도 2개의 시점에서 RP-HPLC 크로마토그램에서 추가의 포스트피크(post-peak)가 보임; (b) 각각의 온도에 있어서 3개의 시점 중 적어도 2개의 시점에서 SEC-HPLC 크로마토그램에서 프리피크 1이 보임/증가됨; (c) 스트레스(예를 들어, 교반, 냉동/해동, 광 노출)를 가한 후 SEC-HPLC 크로마토그램에서 추가의 포스트피크가 보임; 및 (d) 스트레스(예를 들어, 교반, 냉동/해동, 광 노출)를 가한 후 SEC-HPLC에서 프리피크 1이 보임/증가됨. 본원에서 제형 26 및 제형 28로 명명된 2가지의 특별한 제형이 테스트한 각각의 스트레스 조건을 견디는 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 제공할 수 있음이 밝혀졌다.
제형 26은 10 mM 인산나트륨/인산칼륨 완충제(pH 7.0), 5% (w/v) 소르비톨, 10 mM 메티오닌, 0.02% (w/v) PS-80, 및 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 포함하였다.
제형 28은 10 mM 인산나트륨/인산칼륨(pH 7.0), 8% 수크로스, 1 mM EDTA, 0.02% PS-80, 및 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 포함하였다.
놀랍게도, (i) 소르비톨을 메티오닌과 함께, 또는 (ii) 수크로스를 EDTA와 함께 포함하는 제형이, (a) 소르비톨을 EDTA와 조합한 제형과, (b) 수크로스를 메티오닌과 조합한 제형, 및 (c) 산화방지제가 존재하지 않는 제형을 능가하기 때문에, 장성 조절제와 산화방지제의 특정한 조합이 적절하였다. 또한 놀랍게도, ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형은 바람직하게는 염화나트륨을 함유하지 않음이 밝혀졌다. 제형 26 및 제형 28은 범위들 내에서 달라질 수 있지만, 여전히 ExPEC 글리코콘쥬게이트를 안정화시킬 것으로 예상된다. 표 3은 제형 26 및 제형 28에 있어서 적용가능한 pH 범위 및 부형제 농도 범위를 제공한다.
종래의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형(ExPEC 글리코콘쥬게이트, 25 mM 트리스, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM Kcl)과의 직접 비교를 위하여 확인 연구에서 제형 26 및 제형 28을 추가로 테스트하였다. 직립 및 역 바이알 배향 둘 다를 테스트하여, 최종 용기의 마개와의 접촉의 영향을 평가하였다. 제형 26 및 제형 28은 제안된 농도에서 안전에 대한 우려를 제기하지 않는 부형제로 구성되고/되거나, 허가를 받은 백신에서 사용되고/되거나 비경구 투여용으로 승인된 부형제로서 열거된다. 완충액의 pH 값과 제형 26 및 제형 28을 위한 이러한 부형제들의 조합은 종래의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 제형과 비교하여 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 향상된 안정화 효과에 기여한다. 제형 26 및 제형 28을 위한 이러한 부형제들의 제안된 조합은, 2~8℃ 및 25℃에서 보관시에 예상되는 안정성 경향에 따르면서(데이터는 예시되어 있지 않음), 냉동/해동 및 열적 스트레스시에 ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신의 원료 의약품(DS) 및 완제 의약품(DP)을 보존함이 입증되었다(예를 들어, 도 2). DP에 대하여 테스트한 다당류 농도는 각각의 균주에 있어서 20 μg/mL(총 80 μg/mL)이며, 단백질 농도는 총 300 μg/mL였다. 혈청형 O25B(즉, EPA 운반 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류를 함유함)의 DS에 있어서, 테스트한 다당류 농도는 200 μg/mL이며, 테스트한 단백질 농도는 830 μg/mL였다. 이러한 조성물은 시간이 지나도 안정하였다.
지금까지, 제형 26 및 제형 28의 완제 의약품은, 2~8℃에서 적어도 6개월 동안, 25℃에서 적어도 6개월 동안 안정성을 나타냈으며, 안정성 연구는 진행 중이다.
실시예 4: 금속 유도된 산화 스트레스에 대한 제형의 평가.
금속 유도된 생성물의 산화에 대한 모델로서 텅스텐의 존재 하에 제형 26 및 제형 28을 ExPEC 글리코콘쥬게이트에 대한 이들의 안정화 효과에 대하여 추가로 평가하였다. 대개 텅스텐 잔류물이 유리 사전-충전 주사기(PFS)의 팁(tip)에 존재하며, 이는 텅스텐 핀을 이용한 팁 형성 공정의 결과이다. PFS에서의 텅스텐 잔류물의 침착은 제조 공정에 의존하며, PFS 제조업자들 사이에서 250~1250 ng/배럴의 범위 내에서 달라질 수 있다. 텅스텐은 PFS에서의 단백질 응집과 연관되었다(문헌[Jiang et al., J. Pharmaceutical Sci. 98(12): 4695-710 (2009)]; 문헌[Seidl et al., Pharmaceutical Res. 29:1454-67 (2012)]). 따라서, 여러 가지 농도의 텅스텐에 노출시킬 때의 제형 26 및 제형 28과 종래 제형의 안정성을 조사하는 한편, 산화적 스트레스 및 ExPEC 글리코콘쥬게이트의 응집 경향을 모니터링하였다. 이 평가에서, 시장에서 현재 입수가능한 PFS에 존재하는 텅스텐 잔류물의 모든 수준을 커버하는 3가지 수준의 텅스텐(고(HW), 중간(MW), 및 저(LW))을 조사하였다. 제형에 적용한 스트레스 조건이 표 4에 요약되어 있다.
제형 26 및 제형 28은, SEC-HPLC 분석으로 입증되는 바와 같이, 시간이 지나도 최저의 양의 ExPEC 글리코콘쥬게이트 응집물을 갖는 것으로 밝혀졌다(안정성을 지시하는 프리피크 1). 4주에서의 프리피크 수준은, 심지어 최고 수준의 텅스텐에 노출될 때에도 T-0에서의 1.0%와 비교하여 단지 3.1%에 도달하였다(주당 평균 0.5%의 증가, 도 3).
이와 같이, 본 발명은 ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신을 위한 2가지의 상이한 개선된 액상 제형을 제공한다. 가장 바람직한 첫 번째 조성물은 ExPEC 글리코콘쥬게이트, 소르비톨, 메티오닌, 인산칼륨/인산나트륨 완충제(pH 7) 및 계면활성제를 포함한다. 두 번째의 바람직한 조성물은 ExPEC 글리코콘쥬게이트, 수크로스, EDTA, 인산칼륨/인산나트륨 완충제(pH 7) 및 계면활성제를 포함한다. 이러한 조성물들은 이전에 개시된 조성물에 비하여, 2~8℃에서의 보관시에, ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신이 본 발명의 새로운 제형에서 더 양호한 안정성 프로파일을 나타낸다는 장점을 가지며, 여기서, 응집 및 분해 생성물 형성이 방지되고, 이는 안정성 지시 분석(SEC-HPLC 및 RP-HPLC)이 나타내는 바와 같다. 새롭게 발명된 제형들 둘 다의 안정화 효과는, 전술한 분석 기술을 이용하여 분석할 때 냉동/해동, 열적 스트레스(40℃), 및 금속 유도 산화 스트레스시에 훨씬 더 명백하다. 이러한 특징은 ExPEC 글리코콘쥬게이트 백신에 있어서의 DS 및 DP 둘 다에 대하여 다수의 보관 및 수송 옵션을 허용한다. 게다가, 금속 유도된 산화 스트레스를 견디는 것과 관련된 개선된 특성은 또한 대안적인 일차 패키징 시스템(예를 들어, 사전충전 주사기 및/또는 적용가능 디바이스)에서의 ExPEC 백신의 장기 보관에서 적용될 수 있다.
실시예 5: 플라스틱 물질과의 상용성에 대한 제형의 평가.
제형 26 및 제형 28을, 다양한 플라스틱 물질, 예컨대 폴리카르보네이트(PC) 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜(PETG)과 접촉하는 ExPEC 글리코콘쥬게이트 원료 의약품(O25B 콘쥬게이트, 테스트한 다당류 농도: 227~242 μg/mL 및 테스트한 단백질 농도: 952~1048 μg/mL)에 대한 이들의 안정화 효과에 대하여 추가로 평가하였다. 플라스틱 물질은, 예를 들어 플라스틱 물질이 조사에 의해 살균된 경우, 단백질 열화와 연관되었다. 제형들을 PETG 및 PC 용기에서 가혹한 교반 스트레스(실온에서 200 rpm에서 24시간) 하에서 안정성에 대하여 테스트하였다. 종래 제형은 PETG 용기에서 이러한 조건 하에서 완전한 열화를 보여주었다. 이와는 대조적으로, SEC-HPLC 분석에 의해 입증되는 바와 같이(도 4 참조, 불안정성에 대한 지시자로서, 프리피크 1을 사용), 제형 26 및 제형 28은 테스트한 PETG 및 PC 용기에서 상기 조건 하에서 안정한 채로 남아 있었다. 게다가, 25℃에서 PC 및 PETG 용기에서 7일 동안 보관한 이러한 제형에서의 원료 의약품의 안정성이 관찰되었다(데이터는 예시되어 있지 않음).
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Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    a. 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 각각 공유 결합된 하나 이상의 대장균(E.coli) O 항원 다당류, 여기서 상기 대장균 O 항원 다당류는 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류를 포함하고, 각각의 O 항원 다당류의 농도는 1 내지 200 μg/mL이며;
    b. 3% 내지 8% (w/v)의 소르비톨;
    c. 5 내지 15 mM의 메티오닌;
    d. 5 내지 20 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및
    e. 0.01% 내지 0.2% (w/v)의, F-68, 폴리소르베이트 20(PS20), PS40, PS60, 및 PS80으로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 소르비톨의 농도는 5% (w/v)인 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 메티오닌의 농도는 10 mM인 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도는 10 mM이며, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 pH는 7.0인 면역원성 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 계면활성제는 PS80이며, PS80의 농도는 0.02% (w/v)인 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    a. 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨);
    b. 5% (w/v)의 소르비톨;
    c. 10 mM의 메티오닌;
    d. 10 mM의 KH2PO4/Na2HPO4 완충제(7.0의 pH);
    e. 0.02% (w/v)의 PS80; 및
    f. 물.
  9. 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    a. 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 각각 공유 결합된 하나 이상의 대장균 O 항원 다당류, 여기서 상기 대장균 O 항원 다당류는 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 및 대장균 O6A 항원 다당류를 포함하고, 각각의 O 항원 다당류의 농도는 1 내지 200μg/mL이며;
    b. 3% 내지 12% (w/v)의 수크로스;
    c. 0.1 내지 1.5 mM의 EDTA;
    d. 5 내지 20 mM의 인산칼륨/인산나트륨 완충제(6.5 내지 7.5의 pH); 및
    e. 0.01% 내지 0.2% (w/v)의, F-68, 폴리소르베이트 20(PS20), PS40, PS60, 및 PS80으로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 수크로스의 농도는 8% (w/v)인 면역원성 조성물.
  12. 제9항에 있어서, EDTA의 농도는 1 mM인 면역원성 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 농도는 10 mM이며, 인산칼륨/인산나트륨 완충제의 pH는 7.0인 면역원성 조성물.
  14. 삭제
  15. 제9항에 있어서, 계면활성제는 PS80이며, PS80의 농도는 0.02% (w/v)인 면역원성 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    a. 대장균 O25B 항원 다당류, 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류(여기서, 각각의 항원 다당류는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A(EPA) 운반 단백질에 공유 결합됨);
    b. 8% (w/v)의 수크로스;
    c. 1 mM의 EDTA;
    d. 10 mM의 KH2PO4/Na2HPO4 완충제(7.0의 pH);
    e. 0.02% (w/v)의 PS80; 및
    f. 물.
  17. 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항 내지 제9항, 제11항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 2~8℃의 온도에서 보관될 때 6개월 이상 동안 안정한 면역원성 조성물.
  18. 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항 내지 제9항, 제11항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 O-항원 다당류에 있어서 다당류:운반 단백질의 비는 1:10 내지 1:2인 면역원성 조성물.
  19. 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항 내지 제9항, 제11항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 4 내지 1000 μg/mL의 총 O-항원 다당류 농도, 및 40 내지 2000 μg/mL의 총 EPA 운반 단백질 농도를 포함하는 면역원성 조성물.
  20. EPA 운반 단백질에 공유적으로 커플링된 대장균 O 항원을 포함하는 액상 면역원성 조성물을 안정하게 유지하는 방법으로서, 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항 내지 제9항, 제11항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 2~8℃의 온도에서 6개월 이상 동안 보관하는 단계를 포함하는 방법.
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