KR102563887B1

KR102563887B1 - 골다공증의 예방 및 개선용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102563887B1
Application number: KR1020220109309A
Authority: KR
Inventors: 최영진
Original assignee: 최영진
Priority date: 2022-08-30
Filing date: 2022-08-30
Publication date: 2023-08-04

Abstract

본 발명의 한 실시예에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물은, 당귀, 석곡, 속단, 천궁, 황기, 진피, 녹각, 우슬, 죽여, 나복자, 그리고 물푸레를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

Description

골다공증의 예방 및 개선용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR IMPROVING OSTEOPOROSIS}

골다공증의 예방 및 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.

파골세포와 조골세포의 형성 속도에 균형이 깨져서, 골의 재흡수가 골의 재생보다 빠르게 되면, 뼈의 증가보다 더 빠른 속도로 뼈 손실이 발생하여, 뼈의 크기가 감소하게 되는데, 이러한 뼈의 신진대사성 질환을 골다공증(Osteoporisis)이라 한다.

흔히, 골다공증은 점차적으로 골 조직의 석회가 감소되면서, 골밀도가 낮아져 결국 골수강(骨髓腔)이 넓어지고 상태를 말하는데, 골수강이 넓어진 상태가 계속 진행되어, 뼈가 약해지면서 작은 충격에도 쉽게 골절(骨折)이 되는 증상이 나타나며, 요통, 견통, 등결림, 관절통 및 무기력 증상이 나타난다.

골다공증은 남성보다는 여성이, 특히 폐경기 여성에서 발생되기 쉽고, 몸이 비교적 작고 마른 체격에, 고령, 골다공증 가족력이 있는 사람, 과음, 흡연자, 각종 성인병을 가진 사람에게서 잘 발생되는 것으로 알려져 있다.

관련된 선행문헌으로는 당귀, 천궁 및 단삼 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 여성의 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 출원번호 제10-2020-0002489호가 있다.

한국공개특허 제10-2020-0107778호

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 파골세포의 분화를 억제시키기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 골다공증을 예방 또는 개선시키기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 1회 복용량을 감소시키기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 사용자의 복약 거부감을 감소시키기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 부작용을 최소화하기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 제조 비용을 절감시키기 위한 것이다.상기 과제 이외에도 구체적으로 언급되지 않은 다른 과제를 달성하는 데 본 발명에 따른 실시예가 사용될 수 있다.

여기서, 혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 당귀는 18 ~ 22 중량부, 석곡은 14 ~ 18 중량부, 속단은 10 ~ 14 중량부, 천궁은 6 ~ 10 중량부, 황기는 6 ~ 10 중량부, 진피는 2 ~ 6 중량부, 녹각은 8 ~ 12 중량부, 우슬은 2 ~ 6 중량부, 죽여는 2 ~ 6 중량부, 나복자는 2 ~ 6 중량부, 물푸레는 2 ~ 6 중량부일 수 있다.

약학 조성물은 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽제, 현탁제, 유제, 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 약제는 전술한 약학 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은, 당귀, 석곡, 속단, 천궁, 황기, 진피, 녹각, 우슬, 죽여, 나복자, 그리고 물푸레를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 한 실시예에 따른 약학 조성물은 파골세포의 분화를 억제시킬 수 있고, 골다공증을 예방 또는 개선시킬 수 있으며, 1회 복용량을 감소시킬 수 있고, 사용자의 복약 거부감을 감소시킬 수 있으며, 부작용을 최소화 할 수 있고, 제조 비용을 절감시킬 수 있다.

도 1a는 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 비교예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 비교예 2에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 비교예 3에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1e는 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.
도 3a 및 도 3b는 비교예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.
도 4a 및 도 4b는 비교예 2에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.
도 5a 및 도 5b는 비교예 3에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.
도 6a 및 도 6b는 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.

첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 도면부호가 사용되었다. 또한 널리 알려져 있는 공지기술의 경우 그 구체적인 설명은 생략한다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

명세서 전체에서, "조성물"은 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.

골다공증은 노화 등으로 인해 조골세포와 파골세포의 불균형이 발생하여 파골 속도가 빨라짐으로써 발생하고, 실시예들에 따른 약학 조성물은 파골세포의 분화 억제를 통해 골다공증을 예방 또는 개선시키는 데 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명은, 골다공증의 예방 및 개선에 효과가 탁월한 새로운 조성에 관한 것이다.

또한, 실시예들에 따른 약학 조성물은 천연 약재를 기반으로 하여 인체에 무해하고 안전성이 우수하며, 독성을 나타내지 않는 복수의 재료를 포함함으로써 부작용이 최소화될 수 있다.

실시예들에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물은, 당귀(當歸, Angelicae Gigantis Radix), 석곡(石斛, Dendrobium monile), 속단(續斷, Phlomis umbrosa), 천궁(川芎, Cnidii Thizoma), 황기(黃耆, Astragalus membranaceus), 진피(陳皮, Citri Unshius Pericarpium), 녹각(鹿角, Cervi Cornu), 우슬(牛膝, Achyranthis Radix), 죽여(竹茹, Phyllostachyos Caulis), 나복자(萊, Raphani Semen), 그리고 물푸레(秦皮, Fraxinus rhynchophylla Hance)를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

종래의 골다공증 예방 또는 개선을 위한 약학 조성물은 당귀, 천궁, 황기, 인삼, 구기자 등을 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다. 이러한 종래의 약학 조성물은, 약 200 μg/ml 을 초과하는 고농도의 추출물이 포함된 경우에는 파골세포 분화 억제 기능이 발현되지만, 상대적으로 저농도의 추출물이 포함되었을 경우에는, 파골세포 분화 억제 기능이 충분히 구현되지 않을 수 있다.

실시예들에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물은, 약 200 ㎍/ml 이하의 저농도에서도 탁월한 파골세포 분화 억제능이 발현될 수 있고, 이로 인해, 적은 양의 혼합 한약재를 사용하는 경우에도 충분한 골다공증 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있다. 실시예들에 따른 혼합 한약재는 죽여, 나복자 및 물푸레를 모두 포함하고, 죽여, 나복자 및 물푸레의 추출물이 상승 효과를 일으켜 파골세포 분화 억제능을 증폭시킬 수 있다. 또한, 실시예들에 따른 혼합 한약재는 우슬과 진피를 함께 포함함으로써, 파골세포 분화 억제능을 더욱 향상시키고, 약 200 ㎍/ml 이하 농도의 약학 조성물의 골다공증 예방 및 개선 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

죽여, 나복자 및 물푸레 각각은 종래, 골다공증에 관한 효능이 전혀 알려져 있지 않은 재료이지만, 실시예들에 따른 약학 조성물에 포함되어 파골세포 분화 억제능을 증폭시킬 수 있다. 우슬과 진피 또한 종래 골다공증에 관한 효능이 전혀 알려져 있지 않은 재료에 해당하지만, 실시예들에 따른 약학 조성물에 포함되어 파골세포 분화 억제능을 발현시킬 수 있다

혼합 한약재에서, 당귀, 석곡, 속단, 천궁, 황기, 진피, 녹각, 우슬, 죽여, 나복자, 그리고 물푸레가 함께 사용됨으로써, 상승 작용이 발생할 수 있고, 이로 인해 파골세포 분화가 더욱 효과적으로 억제될 수 있고, 골다공증에 대한 예방 및 개선 효과가 더욱 우수해질 수 있다.

또한, 혼합 한약재가 죽여, 나복자 및 물푸레를 동시에 포함함으로써, 약학 조성물에서 추출물의 농도가 약 200 ㎍/ml 이하인 경우에도, 매우 우수한 파골세포 분화 억제능이 발현될 수 있다. 또한, 혼합 한약재가 우슬과 진피를 함께 포함함으로써, 골다공증 예방 및 개선 효과가 더욱 향상될 수 있다.

또한, 혼합 한약재가 죽여, 나복자 및 물푸레를 동시에 포함하여, 저농도의 약학 조성물로도 골다공증 치료, 예방, 개선 효과를 높임으로써, 1회 복용량을 감소시킬 수 있어, 사용자들의 복약 거부감을 줄일 수 있고, 소화불량 등 부작용의 발생 가능성을 크게 감소시킬 수 있으며, 제조 비용이 절감될 수 있어 경제성이 향상될 수 있다.

따라서, 실시예들에 따른 약학 조성물은, 골다공증에 효능이 있는 것으로 알려진 종래의 조성과 상이한 새로운 조성을 통해, 파골세포 분화 억제 및 골다공증 예방/개선에 매우 우수한 효과를 나타낸다.

혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 당귀는 약 18 ~ 22 중량부, 석곡은 약 14 ~ 18 중량부, 속단은 약 10 ~ 14 중량부, 천궁은 약 6 ~ 10 중량부, 황기는 약 6 ~ 10 중량부, 진피는 약 2 ~ 6 중량부, 녹각은 약 8 ~ 12 중량부, 우슬은 약 2 ~ 6 중량부, 죽여는 약 2 ~ 6 중량부, 나복자는 약 2 ~ 6 중량부, 물푸레는 약 2 ~ 6 중량부일 수 있다. 이러한 범위 내에서, 약학 조성물의 파골세포 분화를 억제시키는 효과가 더욱 향상될 수 있고, 골다공증에 대한 예방 및 개선 효과가 더욱 향상될 수 있으며, 각 구성 성분들의 결합으로 인한 상승 효과가 더욱 향상될 수 있다.

또한, 혼합 한약재가, 죽여 약 2 ~ 6 중량부, 나복자 약 2 ~ 6 중량부, 물푸레 약 2 ~ 6 중량부를 함께 포함하여 상승 효과를 나타냄으로써, 약학 조성물에서 추출물의 농도가 약 200 ㎍/ml 이하인 경우에도, 매우 우수한 파골세포 분화 억제능이 발현될 수 있다. 보다 구체적으로는, 약학 조성물에서 추출물의 농도가 약 40 ~ 110 ㎍/ml 범위에 있는 경우에도, 파골세포 분화 억제능이 극대화될 수 있다.

혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 당귀는 20 중량부, 석곡은 16 중량부, 속단은 12 중량부, 천궁은 8 중량부, 황기는 8 중량부, 진피는 4 중량부, 녹각은 10 중량부, 우슬은 4 중량부, 죽여는 4 중량부, 나복자는 4 중량부, 물푸레는 4 중량부일 수 있다. 이러한 범위 내에서, 약학 조성물의 파골세포 분화를 억제시키는 효과가 극대화될 수 있고, 저농도 추출물을 포함하는 약학 조성물의 경우에도 매우 우수한 골다공증에 대한 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 각 구성 성분들의 결합으로 인한 상승 효과가 극대화될 수 있다.

약학 조성물은 독성이나 부작용을 거의 갖지 않는 혼합 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하므로, 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용될 수 있다.

한편, 약학 조성물은 전술한 성분들 이외의 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.

혼합 한약재 추출물을 포함하는 약학 조성물을 제조하기 위하여, 통상의 기술자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 혼합 한약재를 준비하는 단계 및 열수 추출하는 단계가 수행된다.

열수 추출은, 예를 들어, 80 ~ 140 ℃에서 2 ~ 3시간 동안 수행될 수 있고, 이러한 범위 내에서, 추출물 구성 성분에 대한 파괴 또는 열화 없이 추출이 효과적으로 이루어질 수 있다. 이 때, 물의 중량은 혼합 한약재 중량 대비 약 5 ~ 10 배가 사용될 수 있다.

다음으로, 열수 추출된 추출액을 멤브레인 필터로 여과하는 단계가 수행된다. 이때, 멤브레인 필터의 평균 기공(pore) 크기는 약 0.5 ~ 0.7 ㎛ 일 수 있고, 이러한 범위 내에서 불순물을 효과적으로 제거할 수 있고, 추출물을 효과적으로 수득할 수 있다.

이후, 여과된 추출물은 동결 건조되어 분말 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 다양한 제형을 가질 수 있다.

실시예에 따른 약학 조성물은 골다공증 예방 또는 개선용 약제로 사용될 수 있고, 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 어느 수단으로라도 환자에 투여될 수 있고, 투여 제형에는 특별한 제한은 없지만, 환자의 연령, 성별 또는 질환의 경중에 따라 결정될 수 있다.

여기서, 경구투여를 위한 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환제 등의 제형일 수 있다. 또한 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 겔제, 에어로졸 등의 제형일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제일 수 있고, 또는 멸균 주사제제의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

실시예에 따른 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제로는 락토즈(lactose), 덱스트로즈(dextrose), 수크로스(sucrose), 솔비톨(solbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말티톨(maltitol), 전분, 아카시아 고무, 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 실리케이트(calcium silicate), 셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)등의 물질이 사용될 수 있다. 붕해제로는, 예를 들어, 전분 글리콜산 나트륨(Sodium starch glycolate), 크로스포비돈(crospovidone), 알긴산(alginic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘(carboxymethyl cellulose calcium), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(carboxymethyl cellulose sodium)), 키토산(chitosan), 구아검(guar gum), 저치환된 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(magnesium aluminum silicate) 등이 이용될 수 있다.

약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제는, 예를 들어, 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈(povidone), 콜로이달 이산화규소(colloidal silicon dioxide), 인산수소칼슘(calcium hydrogen phosphate), 락토스(lactose), 만니톨(mannitol), 아라비아검(Arabic gum), 히드록시프로필 셀룰로오스, 전분 글리콜 산나트륨, 카르나우바 납(carbauba wax), 스테아린산(stearic acid), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산 알루미늄(aluminum stearate), 스테아린산 칼슘(calcium stearate), 백당, 엿, 덱스트로스(dextrose), 소르비톨(sorbitol), 탈크(talc) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 약학 조성물 전체를 기준으로 약 0.1 내지 약 90 중량부 포함될 수 있다.

약학 조성물은 투여를 위해서 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상이 혼합되어 사용될 수 있다.

이하에서는, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

당귀 20 g, 석곡 16 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g, 우슬 4 g, 진피 4 g, 녹각 10 g, 죽여 4 g, 나복자 4 g, 물푸레 4 g을 포함하는 혼합 한약재를 준비한다.

이러한 혼합 한약재에 약 747 mL 의 증류수를 첨가한 후, 약 2 시간 동안 둥근 플라스크에서 열수 추출을 진행한다.

열수 추출액은 여과지(Whatman no. 3, Maidstone, UK)로 여과한 후 동결건조 하여 추출물을 수득한다.

이러한 추출물은 실험에 사용되기 전까지 약 -20 ℃로 유지되는 냉동고에서 보관되고, 실험에 사용되기 직전에 멸균 필터 (pore size 0.22mm)를 이용해 멸균한다.

비교예 1

당귀 20 g, 천궁 20 g, 황기 8 g, 인삼 8 g, 구기자 8 g, 만삼 8 g, 토사자 4 g, 속단 4 g, 석곡 4 g, 보골지 4 g, 합환피 4 g, 녹용 4 g을 포함하는 혼합 한약재를 준비한다.

이러한 혼합 한약재에 약 960 mL 의 증류수를 첨가한 후, 약 2 시간 동안 둥근 플라스크에서 열수 추출을 진행한다.

이러한 비교예 1에 따른 추출물은, 골다공증에 효능을 갖는 것으로 알려져 있는 종래의 조성에 해당한다.

비교예 2

혼합 한약재가 당귀 16 g, 석곡 16 g, 녹각교 16 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g을 포함하고, 혼합 한약재에 증류수 약 760 mL를 첨가하는 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하고, 보관 및 멸균한다.

비교예 3

혼합 한약재가 당귀 16 g, 석곡 16 g, 녹각교 8 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g을 포함하고, 혼합 한약재에 증류수 약 680 mL를 첨가하는 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하고, 보관 및 멸균한다.

비교예 4

혼합 한약재가 석곡 16 g, 녹각교 16 g, 당귀 8 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g을 포함하고, 혼합 한약재에 증류수 약 680 mL를 첨가하는 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하고, 보관 및 멸균한다.

실험예 1 - 파골세포 전구 세포 독성 실험

RAW 264.7 세포 배양

대식세포주인 Murine RAW 264.7 세포는 100 π dish에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% P/S가 혼합된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 실험에 사용한 모든 세포는 약 95 %의 습도, 약 37°C의 온도, 그리고 약 5 % CO₂ 환경인 CO₂배양기에서 배양하였다.

RAW 264.7 세포 내 독성 측정

RAW 264.7 세포 5,000 개를 96-well plate에 분주한 후, CO₂ 배양기에서 약 24 시간 동안 안정화했다. 안정화 후 배지를 버리고 각각 배양액에 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 또는 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물이 첨가된 배양액으로 교환하여 약 24 시간 동안 배양하였다.

그 후 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) solution 처리 후, ELISA machine으로 약 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표기하였다. 실험 결과는 도 1a 내지 도 1e에 도시하였다.

실험예 2 - 파골세포 분화 억제 실험

RAW 264.7 세포 배양

TRAP 염색 및 TRAP 활성 측정

RAW 264.7 세포 5,000 개를 24-well plate에 분주한 후 CO₂ 배양기에서 약 24 시간 동안 안정화했다. 안정화 후 배지를 버리고, 파골세포 유도 인자인 Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) (100 ng/ml), 그리고 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3 및 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물을 각각 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 농도 별로 첨가된 배양액으로 교환하여 5 일 간 배양하였다. 실험하는 동안 2 일 마다 같은 배지로 교체하였다.

한편, 양성 대조군(control)의 경우, 안정화된 배지를 버리고, RANKL (100 ng/ml)과 alendronate(ALN) 12.5 uM, 25 uM, 50 uM이 첨가된 배양액으로 교환하여 5일간 배양했다. 실험하는 동안 2일마다 같은 배지로 교체했다.

분화 종료 후, 10 % formalin을 이용해 세포를 약 10 분간 고정했다. 이후, 파골세포 마커인 TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase)의 염색법 kit에 기재된 설명서에 따라, 약 1시간 동안 다핵의 파골세포 염색을 진행했다. 염색된 세포는 광학 도립 현미경을 이용해 촬영되었다. 파골세포는 붉은색을 띠고, 3개 이상의 핵을 갖는 세포를 파골세포로 간주하였다.

분화된 배지를 사용하여 TRAP 활성(TRAP activity)을 분석하기 위해, 분화 배지를 새로운 96-well plate에 약 50 μL씩 분주하였다. 이후 TRAP solution (4-Nitro phenyl phosphate disodium salt hexahydrate 4.93 mg, 0.5 M acetate 850 μL 및 tartrate acid solution 150 μL)을 같은 양으로 분주해서 약 37 ℃에서 약 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 0.5 M NaOH를 약 50 μL 투입하여 반응을 종료시키고, ELISA machine으로 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

본 실험예 2에서 얻은 결과는 평균치 ± 표준오차(Mean ± SEM)의 형식으로 나타내었으며, analysis of variance (ANOVA)로 분석하고 Dunnett's multiple comparison test를 실시하여 사후 검증하였다. P < 0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험 결과는 도 2a 내지 도 6b, 그리고 표 1에 나타내었다.

구분	N	대조군	실시예 1			비교예 1			비교예 2
구분	N	대조군	50	100	200	50	100	200	50	100	200
TRAP 활성 (Mean±SE)	0.21± 0.00	1.47± 0.13	1.23± 0.19	0.84± 0.10	0.44± 0.03	0.97± 0.09	0.57± 0.04	0.29± 0.02	1.16± 0.15	0.83± 0.09	0.47± 0.02
유의성(P<0.05)	-	0.00	0.36	0.02	0.00	0.03	0.00	0.00	0.18	0.01	0.00
구분	Normal	대조군	비교예 3			비교예 4
구분	Normal	대조군	50	100	200	50	100	200
TRAP 활성 (Mean±SE)	0.21± 0.00	1.47± 0.13	1.21± 0.14	0.82± 0.08	0.44± 0.03	1.07± 0.14	0.76± 0.07	0.41± 0.02
유의성(P<0.05)	-	0.00	0.22	0.01	0.00	0.10	0.01	0.00

상기 실험예 1과 실험예 2의 결과에 대하여 아래에서 설명한다.

도 1a 내지 도 1e는 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 그리고 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 전구 세포 독성 실험(실험예 1)의 결과를 나타내는 그래프들이다.

파골세포 전구 세포(실험예에서 RAW 264.7 세포)의 세포 생존률이 정상군 대비 80% 이하의 값을 나타낼 때, 독성이 보이는 것으로 간주한다.

도 1a 내지 도 1e를 참조하면, 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 그리고 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물 모두에서, 25 ㎍/ml 내지 200 ㎍/ml 농도에서, 독성이 나타나지 않았다. 따라서, 실험예들에서, 세포 독성으로 인한 파골세포 억제 효과에 대한 우려는 없는 것으로 판단된다.

도 2a 및 도 2b는 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.

도 2a 및 도 2b, 상기 표 1을 참조하면, 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 대조군(control)에 비해 파골세포 수 및 TRAP 활성을 유의미하게 감소시켰다. 파골세포의 수와 TRAP 활성이 농도 의존적으로 감소되었다.

또한, 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 경우, 추출물의 농도가 50 ㎍/ml 인 경우에도, 파골세포의 수와 파골세포의 TRAP 활성이 유의미하게 감소된 것을 확인할 수 있다.

도 3a 및 도 3b는 비교예 2에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.

도 3a 및 도 3b, 상기 표 1을 참조하면, 비교예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 대조군(control)에 비해 파골세포 수와 TRAP 활성을 유의미하게 농도 의존적으로 감소시켰다.

도 4a 및 도 4b는 비교예 2에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이고, 도 5a 및 도 5b는 비교예 3에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이며, 도 6a 및 도 6b는 비교예 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 파골세포 분화능 평가 결과를 나타내는 도면들이다.

도 4a 내지 도 6b, 상기 표 1을 참조하면, 비교예 2 내지 4에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 대조군(control)에 비해, 100 ㎍/ml 및 200 ㎍/ml 농도에서, 파골세포 수와 TRAP 활성이 유의미하게 감소되었다. 다만, 농도 50 ㎍/ml의 경우에는, 파골세포 수와 TRAP 활성이 상대적으로 적게 감소하였다.

표 1에서 유의성을 비교하면, 실시예 1에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물의 50 ㎍/ml 농도에서의 유의성 값이 0.36으로, 비교예들에 비해 큰 값을 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, 100 ㎍/ml 농도의 경우에도, 비교예 1 내지 4의 경우에 비해 큰 유의성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

한편, 실시예에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은, 당귀, 석곡, 속단, 천궁, 황기, 진피, 녹각, 우슬, 죽여, 나복자, 그리고 물푸레를 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

여기서, 혼합 한약재의 전체 중량을 기준으로, 당귀는 20 중량부, 석곡은 16 중량부, 속단은 12 중량부, 천궁은 8 중량부, 황기는 8 중량부, 진피는 4 중량부, 녹각은 10 중량부, 우슬은 4 중량부, 죽여는 4 중량부, 나복자는 4 중량부, 물푸레는 4 중량부일 수 있다. 이러한 범위 내에서, 약학 조성물의 파골세포 분화를 억제시키는 효과가 극대화될 수 있고, 저농도 추출물을 포함하는 약학 조성물의 경우에도 매우 우수한 골다공증에 대한 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 각 구성 성분들의 결합으로 인한 상승 효과가 극대화될 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물에 관한 것으로,
당귀 20 g, 석곡 16 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g, 진피 4 g, 녹각 10 g, 우슬 4 g, 죽여 4 g, 나복자 4 g, 그리고 물푸레 4 g을 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 약학 조성물에서, 상기 추출물의 농도가 50 ㎍/ml일 때의 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 활성도(activity)의 평균값과, 상기 추출물의 농도가 200 ㎍/ml일 때의 TRAP 활성도의 평균값의 차가 0.78 이상인
골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물.
삭제
제1항에서,
상기 약학 조성물은 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽제, 현탁제, 유제, 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형 형태로 제제화된 골다공증 예방 또는 개선용 약학 조성물.
제1항 또는 제3항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 약제.
골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로,
당귀 20 g, 석곡 16 g, 속단 12 g, 천궁 8 g, 황기 8 g, 진피 4 g, 녹각 10 g, 우슬 4 g, 죽여 4 g, 나복자 4 g, 그리고 물푸레 4 g을 포함하는 혼합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 건강기능식품 조성물에서, 상기 추출물의 농도가 50 ㎍/ml일 때의 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 활성도(activity)의 평균값과, 상기 추출물의 농도가 200 ㎍/ml일 때의 TRAP 활성도의 평균값의 차가 0.78 이상인
골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.