KR101321754B1 - 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
특히 급성 및 만성 관절염의 공통 증상으로서의 염증 및 통증을 억제하는 효능과 만성 관절염 증상으로서의 운동 장애를 개선할 수 있는 효능을 보유하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
또한 부가적으로 연골 조직 및 활막 조직에 독성이 없어서 관절 구조의 보호 유지가 가능하도록 하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 급성 관절염 동물모델, 만성 류마티스 관절염 동물모델 및 만성 골관절염 동물모델을 이용하여 실험한 결과에 기반한, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물{A COMPOSITION FOR TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS AND OSTEOARTHRITIS}

본 발명은 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

특히 급성 및 만성 관절염의 공통 증상으로서의 염증 및 통증을 억제하는 효능과 만성 관절염 증상으로서의 운동 장애를 개선할 수 있는 효능을 보유하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

또한 부가적으로 연골 조직 및 활막 조직에 독성이 없어서 관절 구조의 보호 유지가 가능하도록 하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 급성 관절염 동물모델, 만성 류마티스 관절염 동물모델 및 만성 골관절염 동물모델을 이용하여 실험한 결과에 기반한, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

관절염은 관절에 염증 및 통증이 발생되는 질환으로서, 주요하게 골관절염(Osteoarthritis, degenerative arthritis) 및 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 나눌 수 있다.

골관절염은 퇴행성 관절염으로 불리우기도 하는데, 특정한 기질적 원인이 없이 주로 노년에 많이 발생되며 만성적으로 진행되면 관절구조의 변형으로 보행 장애 등의 운동 장애를 수반하게 된다.

골관절염은 주로 관절연골(cartilage)의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 발생된다.

그 기전을 살펴보면, 골관절염이 진행될 때 TNF-α, IL-1 등의 염증성 사이토카인(cytokine)의 생성이 증가하고 콜라게네이즈(collagenase), 스트로멜라이신(stromelysin) 등과 같은 MMPs의 분비가 증가되어 관절연골의 파괴가 이루어지게 된다. 또한 MMPs는 IL-1, TNF-α 등을 유도시키게 되는데 이로 인하여 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다.

여기에서, MMPs(matrix metalloproteinases)는 연골손상에 주요하게 관여하는 요소로서, 콜라겐분해효소(collagenases), 젤라틴분해효소(gelatinases), 스트로멜리신 (stromelysins), 멤브레인형(membrane-type) MMPs와 그 외 몇 개의 MMPs 그룹으로 나눌 수 있다.

류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 염증성 질환으로서, 자가면역현상이 주요 기전으로 알려져 있다.

증상을 살펴보면, 관절 활막(synovial membrane) 조직에 염증이 발생되면서, 대식세포, 수상세포 및 T 림프구, B 림프구 등이 활막 조직으로 이동하고, 그 결과 관절액이 증가하여 관절이 부으면서 통증이 나타나게 된다.

이러한 염증이 지속되면서 염증성 활막조직이 증생(hyperplasia)하게 되면 뼈와 연골을 파괴하여 관절 구조가 변형되고 운동 장애가 발생된다.

연구결과에 의하면, 류마티스 관절염 환자에게서 염증성 사이토카인이 활막 섬유세포와 연골세포에서 콜라겐 분해효소 및 중성 프로테아제(protease)를 생산하고 생산된 이들 효소들은 콜라겐과 프로테오글라이칸(proteoglycan)을 파괴하여 관절연골을 파괴시키는 것으로 알려져 있다.

정리하여 보면, 관절염이 발생되면 관절 염증, 염증으로 인한 열감 및 부종, 관절 통증이 발생되며, 관절염 증상이 지속되면서 결국 연골과 골조직이 파괴되어 관절구조의 변형 및 운동 장애를 유발하게 된다.

따라서 급성 및 만성 관절염의 공통 증상으로서의 염증 및 통증을 억제하면서, 만성 증상으로서의 운동 장애를 개선 또는 치료할 수 있는 약물이 절실한 상황이다. 또한 부가적으로 연골 조직 및 활막 조직에 독성이 없는 기능도 갖추어서 관절 구조의 보호 유지가 가능하도록 하는 약물이 절실한 상황이다.

이하에서, 본 발명에 사용된 천연물들에 대하여 간략하게 설명하고자 한다.

해동피(Kalopanacis Cortex)는 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 낙엽교목인 엄나무(Kalopanax pictus Nakai) 및 그 동속식물인 당음나무 (Kalopanax pictus Nakai var. chinensis Nakai), 털음나무 (Kalopanax pictus Nakai var. magnificus Nakai), 가는잎 음나무 (Kalopanax pictus Nakai var. maximowiczii Nakai)의 수피이다.

해동피의 구성성분으로는 13 내지 30%의 탄닌 성분, 글루코스, 칼로톡신 (Kalotoxin), 칼로사포닌 (Kalosaponin), 리리오덴드린 (Liriodendrin), 헤더라제닌 (Hederagenin), 아라비노즈(ArabiNOSe), 벤조산 (Benzoic acid), 아미노산 (Amino acid), 디-만니톨 (d-Mannitol) 및 폴리아세틸렌계 화합물들이 알려져 있으며, 주성분으로는 사포닌, phenolic 배당체 등 성분이 알려져 있다.

해동피는 민간에서 신경통, 관절염, 요통, 창(瘡) 및 설사, 치통, 당뇨, 강장 등에 널리 사용하고 있다.

모과(Chaenomelis Fructus)는 장미과(Rosaceae)에 속한 낙엽관목인 모과나무(Chaenomeles sinensis Koehne) 또는 명자나무(Chaenmeles speciosa Nakai)의 성숙한 열매이다.

모과의 구성성분으로는 사포닌, 사과산, 주석산, 구연산, 비타민 C, 플라보노이드, 탄닌 등이 알려져 있다.

한방에서는 모과가 비위를 조화시키며 습을 제거하는 약물로 인식되어 급성 위장병, 각기병, 근육통, 관절염, 신경통에 효험있는 약재로 처방되고 있다. 또한 진해, 거담, 폐렴, 기관지염 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

내복자(Raphani Semen)는 십자화과(Cruciferae)에 속한 1년생 또는 2년생 무우(Raphanus sativus L.) 또는 동속식물의 종자이다.

내복자의 구성성분으로는 지방유, 정유가 함유되어 있는데 정유에는 methylthiole 등이 함유되어 있고 지방유에는 다량의 erucic acid, linoleic acid 와, glycerinsinapic acid의 에스테르 등이 함유되어 있다.

내복자는 기를 통하게 하고 체한 것을 내려가게 하는 효능이 있어서 복부창만, 트림, 위산과다, 설사 등에 주로 사용한다. 식욕부진을 치료하고, 오래된 담, 오래된 기침을 멈추게 하는 효과가 있다고 알려져 있다.

창출(Atractylodis Rhizoma)은 국화과(Compositae)에 속하는 여러해살이 초본식물인 가는잎삽주 Atractylodes lancea DC. 또는 만주삽주 A. chinensis Koidzumi의 근경이다.

약효성분으로는 정유가 5∼9％ 들어 있는데, 주성분은 아트락티롤(Atractylol), 히네솔(Hinesol), 베타유데스몰(β-Eudesmol) 등이 들어 있다. 약의 맛은 쓰고 약간 매우며 약성은 따뜻하다.

효능은 건위작용이 현저한데, 위장 안에 습기가 과다하게 쌓여서 일어나는 소화장애와 위장기능허약증상을 치료하는 데 탁월한 반응을 나타낸다. 또한 비타민 A가 다량 함유되어 있어서 야맹증에도 쓰인다.

부자(Aconiti Lateralis Preparata Radix)는 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속한 다년생 초본인 오두 Aconitum carmichaeli Debx.의 자근(子根)을 가공한 것이다.

부자의 성분으로는 알카로이드 성분으로 hypaconitine, aconitine, mesacontine, talatisamine 등이 알려져 있다. 또한 디터펜(Diterpene)계의 알카로이드로서 aconitine, mesaconitine, hypaconitine, jesaconitine은 독성이 강하다고 알려져 있다.

부자는 신장의 양기를 보하며 강심작용이 있다. 각종 만성질환에 따른 양기쇠약, 전신과 사지관절마비, 냉감, 만성궤양, 곽란, 설사 등에 쓰인다. 약리작용으로 심장근육수축, 혈압상승, 항염, 진통, 항한랭작용, 면역증강작용, 뇌하수체 및 부신피질 흥분작용, 혈당강하작용 등이 보고되었다.

본 출원인은 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 안출하였고, 그 소재로서 상기 서술한 해동피, 모과, 내복자, 창출, 부자를 이용하고 있는바 이하 간략하게 이들 소재와 관련된 선행기술을 살펴본다.

먼저, 대한민국 공개특허공보 10-2011-0016825호에는 오미자, 황금 및 해동피의 혼합 추출물을 유효 성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다. 또한 대한민국 공개특허공보 특2003-0091405호에는 해동피의 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있다.

또한 대한민국 공개특허공보 10-2011-0038631호에는 모과, 우슬, 오가피, 계피, 진교, 위령선, 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 속단 및 방풍의 추출물을 유효성분으로 함유하는 연골재생, 통증 억제 및 부종 억제용 조성물이 기재되어 있다.

또한 대한민국 공개특허공보 10-2009-0074475호에는 12~13가지 소재를 이용한 한방생약 관절치료제의 제조방법이 기재되어 있는데 창출이 언급되어 있다.

정리하여 보면, 해동피, 모과 및 창출은 관절염 예방 또는 치료 소재로서 언급되고 있으나 주로 다른 소재들과의 혼합 추출을 통해서 이용되고 있는 상황이며, 본 발명에서 사용하는 내복자 및 부자에 대해서는 관절염과 관련된 선행기술은 발견되지 않았다.

본 발명은 급성 및 만성 관절염의 공통 증상으로서의 염증 및 통증을 억제하는 효능과 만성 관절염 증상으로서의 운동 장애를 개선할 수 있는 효능을 보유하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은, 부가적으로 연골 조직 및 활막 조직에 독성이 없어서 관절 구조의 보호 유지가 가능하도록 하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은, 급성 관절염 동물모델, 만성 류마티스 관절염 동물모델 및 만성 골관절염 동물모델을 이용하여 실험한 결과에 기반한, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은, 해동피 350~450 중량부, 모과 350~450 중량부, 정제부자 50~150 중량부, 내복자 150~250 중량부, 창출 50~150 중량부의 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은, 1) 해동피 350~450 중량부, 모과 350~450 중량부, 정제부자 50~150 중량부를 추출한 제1 추출물과 내복자 150~250 중량부, 창출 50~150 중량부를 추출한 제2 추출물을 혼합한 추출물이거나, 2) 해동피 350~450 중량부, 모과 350~450 중량부, 정제부자 50~150 중량부, 내복자 150~250 중량부, 창출 50~150 중량부의 혼합 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 연골세포 및 활막세포에 대한 세포독성이 없고, 관절염 환자에 대한 소염 및 진통 효능이 있고, 만성 관절염 환자의 운동 장애를 개선하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 추출물의 추출용매는 40~60 중량% 주정이며, 제2 추출물의 추출용매는 물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 추출물의 추출 횟수, 제2 추출물의 추출 횟수 및 혼합 추출물의 추출 횟수는 각각 2회 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 상기 기재된 추출물을 농축 및 건조하여 제조한 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 건조엑스 제제를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 상기 기재된 추출물에 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가하여 제형화한 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 약학적 제제를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물은, 류마티스 관절염 및 골관절염을 개선 또는 치료할 수 있는 효능을 보유하고 있다.

특히 급성 관절염 동물모델, 만성 류마티스 관절염 동물모델 및 만성 골관절염 동물모델을 이용하여 실험한 결과에 기반한 효능을 기초로 하고 있다는 점에서 현저한 효과를 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 급성 및 만성 관절염의 공통 증상으로서의 염증 및 통증을 억제하는 효능과 만성 관절염 증상으로서의 운동 장애를 개선할 수 있는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 연골 조직 및 활막 조직에 독성이 없어서 관절 구조의 보호 유지가 가능하도록 하는 효능을 보유하고 있다.

도 1은 글루코사민-HCl 처리군, 글루코사민-설페이트 처리군 및 셀레콕시브 처리군에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 2는 HPL-1 처리군에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 3은 활막세포주 sw982 세포에서 HPL-1을 24시간 배양했을 때의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 4는 활막세포주 sw982 세포에서 HPL-1을 48시간 배양했을 때의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 5는 HPL-1의 클로로포름 분획 및 에틸아세테이트 분획에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 6은 급성 관절염 유발시 HPL-1의 소염 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 급성 관절염 유발시 기계성 이질통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 급성 관절염 유발시 기계성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 급성 관절염 유발시 열성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 만성 류마티스 관절염 유발시 HPL-1의 소염 효능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 만성 류마티스 관절염 유발시 기계성 이질통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 만성 류마티스 관절염 유발시 기계성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 13은 만성 류마티스 관절염 유발시 열성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.
도 14는 만성 골관절염 유발시 보행장애 개선 효능을 나타낸 그래프이다.
도 15는 만성 골관절염 유발시 보행장애 개선 효능을 나타낸 그래프이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물

본 발명의 실시예로서의 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물의 제조방법은 다음과 같다.

1) 해동피 350~450 중량부를 기준으로, 모과 350~450 중량부, 정제부자 50~150 중량부, 내복자 150~250 중량부, 창출 50~150 중량부를 준비한다.

해동피, 모과 및 정제부자를 혼합한 후에 40~60 중량% 주정으로 1회 추출하여 제1 추출물을 제조한다. 여기에서, 추출 시간은 2~4시간 동안이다.

내복자 및 창출을 혼합한 후에 물로 1회 추출하여 제2 추출물을 제조한다. 여기에서, 추출 시간은 추출시 2~4시간 동안이다.

제1, 제2 추출물을 각각 25 um 필터로 여과한 후에 혼합하여 혼합물을 제조한다.

상기 혼합물을 유효성분으로 하여 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제조하되, 상기 혼합물을 60 ℃ 이하에서 감압 농축 및 건조하여 건조엑스 제재로 제공될 수 있다.

설계조건에 따라, 제1 추출물 또는 제2 추출물을 제조시에 2회 이상 추출하도록 변경될 수 있으며, 감암 농축 및 건조 과정과는 다른 방법으로 혼합물을 처리하여 다양한 제형으로 제공할 수 있음은 물론이다. 또한 제1 추출물 제조과정에서, 40~60 중량% 주정 추출 후에 다른 종류의 유기용매 분획 추출을 추가로 이용할 수도 있다.

2) 해동피 350~450 중량부를 기준으로, 모과 350~450 중량부, 정제부자 50~150 중량부, 내복자 150~250 중량부, 창출 50~150 중량부를 준비한다.

해동피, 모과, 정제부자, 내복자 및 창출을 혼합한 후에 40~60 중량% 주정 또는 물로 1회 추출하여 혼합 추출물을 제조한다. 여기에서, 추출 시간은 2~4시간 동안이다.

상기 혼합 추출물을 유효성분으로 하여 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제조하되, 상기 혼합 추출물을 25 um 필터로 여과한 후, 60 ℃ 이하에서 감압 농축 및 건조하여 건조엑스 제재로 제공될 수 있다.

설계조건에 따라, 혼합 추출물을 제조시에 2회 이상 추출하도록 변경될 수 있으며, 감암 농축 및 건조 과정과는 다른 방법으로 혼합 추출물을 처리하여 다양한 제형으로 제공할 수 있음은 물론이다. 또한 혼합 추출물 제조과정에서, 40~60 중량% 주정 추출 후에 다른 종류의 유기용매 분획 추출을 추가로 이용할 수도 있다.

3) 1) 또는 2) 방법으로 제조된 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형 제형으로 제공한다.

여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.

상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 실시예에 따른 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 실시예에 따른 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

제조예 1. 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물

본 발명의 제조예로서 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물의 제조법은 다음과 같다.

해동피, 모과, 정제부자를 4 : 4 : 1의 중량비로 혼합한 후에 50% 주정으로 2회 추출하여 제1 추출물을 제조한다. 여기에서, 추출 시간은 1회 추출시 3시간 동안이다.

내복자 및 창출을 2 : 1의 중량비로 혼합한 후에 물로 2회 추출하여 제2 추출물을 제조한다. 여기에서, 추출 시간은 1회 추출시 3시간 동안이다.

제1, 2 추출물을 각각 25 um 필터로 여과한 후에 혼합하여 혼합물을 제조한다.

상기 혼합물을 60 ℃ 이하에서 감압 농축 및 건조하여 건조엑스를 제조한다.

실험예 1. 연골 세포에서의 세포 독성

먼저, 실험예 1 내지 실험예 7에서는 상기 제조예 1에서 제조된 혼합물을 시료로 이용하여 실험이 수행되었음을 밝혀둔다.

또한 실험예 1 내지 실험예 7 및 도면에 기재 또는 표기되어 있는 'HPL-1' 또는 'HPL-01'은 본 출원인이 내부 실험과정에서 임시적으로 붙인 기호명으로서 상기 제조예 1에서 제조된 혼합물을 지칭함을 밝혀둔다.

1-1. 실험 과정

정상세포인 293T 세포와 랫 연골세포(chondrocyte), 사람 연골세포주 (HTB-94)를 이용하여 글루코사민-HCl(Glucosamine-HCl), 글루코사민-설페이트((Glucosamine-sulfate), 셀레콕시브(celecoxib), HPL-1의 안전성을 MTT 어세이(assay)로 확인하였다.

1-2. 실험 결과

도 1은 글루코사민-HCl 처리군, 글루코사민-설페이트 처리군 및 셀레콕시브 처리군에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.

도 2는 HPL-1 처리군에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.

관찰 결과, 글루코사민-HCl 처리군, 글루코사민-설페이트 처리군 및 HPL-1 처리군에서는 모두 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 셀레콕시브 처리군에서는 10 ug/mL 에서부터 세포 독성이 관찰되었다.

특히 본 발명의 제조예 1에 따른 HPL-1 처리군에서는 200ug/ml 까지 세포 독성이 나타나지 않았다.

실험예 2. 활막 세포에서의 보호 효능

2-1. 실험 과정

(1) 사람 활막세포주 sw982 세포에 대한 HPL-1의 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CCK-8 어세이(assay)를 실행하였다. CCK-8 어세이는 통상적으로 수행되는 방법대로 실행되었다.

HPL-1을 농도별(1, 10, 50, 100, 200, 500 ug/ml)로 24시간 및 48시간 배양하였을 때의 결과를 대조군과 비교하였다.

(2) HPL-1의 정확한 활막세포 활성 억제능을 평가하기 위해서 복합물질에 의한 방해요인을 제거할 경우가 있으므로, HPL-1을 클로로포름(CHCl3) 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획(fraction)을 취하여 일정농도(10, 100, 200, 400 ug/ml)로 24시간 및 48시간 배양하여 비교하였다.

2-2. 실험 결과

(1) 도 3은 활막세포주 sw982 세포에서 HPL-1을 24시간 배양했을 때의 세포 독성을 나타낸 결과이다. 도 4는 활막세포주 sw982 세포에서 HPL-1을 48시간 배양했을 때의 세포 독성을 나타낸 결과이다.

HPL-1을 농도별(1, 10, 50, 100, 200, 500 ug/ml)로 24시간 배양했을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았으며, HPL-1 처리 후 48시간 배양한 세포들에서도 세포독성이 나타나지 않았다. 따라서 HPL-1의 활막세포 활성이 미치는 영향을 평가함에 있어서 최대 500 ug/ml 농도까지 적용 가능할 것으로 판단된다.

(2) 도 5는 HPL-1의 클로로포름 분획 및 에틸아세테이트 분획에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.

HPL-1의 모든 분획에서 10, 100, 200 ug/ml 농도를 처리한 경우에서는 대조군과 비교하여 모든 분획에서 세포독성을 보이지 않았으며, 단지 농도 의존적으로 세포증식을 억제하는 것을 확인하였다. 이는 관절염 증상으로서 염증성 활막 조직들이 증식되는 것을 억제하는 효능을 시사한다고 볼 수 있다.

그러나 400g/ml 농도를 처리한 경우에서는 클로로포름 분획에서 시간이 지남에 따라 세포독성 방향으로 증상이 일부 나타났으나 48시간 배양시에도 75% 정도의 생존율을 보여주었다.

실험예 3. 동물 모델에서의 급성 관절염 유발시의 소염 효능

3-1. 실험 준비

8주령의 수컷 SD 랫에게 지모산(zymosan)을 200 ul (20 mg/ml) 오른쪽 발바닥으로 피내투여하여 지모산 유발형 급성 관절염 모델을 제작하였다. 이는 사람의 급성 (류마티스) 관절염과 유사한 동물모델로서 염증과 통증을 동반하는 모델이다.

여기에서, 지모산은 효모의 세포벽조분획의 회백색 분말로, 글루칸(58%), 만난(18%) 등의 다당류, 단백질, 키틴류, 당지질 및 회분을 포함한 혼합물이다. 물에는 불용이지만 균일하게 분산된다. 원래는 보체 제3성분을 불활성화하는 효모성분에 대해 명명하였다. 오래 전부터 보체 제2경로(프로페루딘계)의 활성화, 망내계를 부활화하는 물질로서 주목받고 있다.

3-2. 실험 과정

실험군을 지모산과 vehicle을 투여한 군(n=9), 지모산과 HPL-1 100 mg/kg을 투여한 군(n=6) 및 지모산과 셀레콕시브(celexocib) 100 mg/kg을 투여한 군(n=6) 총 3군으로 설정하였으며, 지모산과 셀레콕시브의 투여군은 양성대조군으로서 설정되었다.

각 실험군에서 지모산을 제외한 약물들은 지모산 투여 1시간전에 경구 투여하였으며, 실험군에 지모산을 투여한 후 3 시간이 경과한 후에 랫의 발목부종(paw edema)의 부피를 관찰하여 발목부종의 억제 효능을 실험하였다.

3-3. 실험 결과

도 6은 급성 관절염 유발시의 HPL-1의 소염 효능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, vehicle 투여군에서는 부종의 부피가 약 1.5ml 가량으로 측정되었다. 반면 HPL-1 100 mg/kg 투여군에서는 부종의 부피가 약 1.0ml로, vehicle 투여군과 비교했을 때 현저히 부피가 작았다.

또한 셀레콕시브 100 mg/kg 투여군의 부종의 부피는 vehicle 투여군의 부피보다 작았으나, HPL-1 100 mg/kg의 투여군의 부종의 부피보다 컸다.

즉 HPL-1이 부종을 억제하는 효능을 갖는 약물인 양성대조군(셀레콕시브)보다 소염 효능이 더 좋았음을 확인할 수 있다.

실험예 4. 동물 모델에서의 급성 관절염 유발시의 진통 효능

4-1. 실험 준비

실험예 3-1과 동일한 과정으로 실행되었다.

4-2. 실험 과정

실험군을 지모산과 vehicle을 투여한 군(n=9), 지모산과 HPL-1 100 mg/kg을 투여한 군(n=6) 및 지모산과 셀레콕시브(celexocib) 100 mg/kg을 투여한 군(n=6) 총 3군으로 설정하였으며, 지모산과 셀레콕시브의 혼합 투여군은 양성대조군으로서 설정되었다.

각 실험군에서 지모산을 제외한 약물들은 지모산 투여 1시간전에 경구 투여하였으며, 실험군에 지모산을 투여한 후 5시간 동안 지모산 투여에 의한 관절염으로 유발되는 이질통(allodynia) 및 과민통(hyperalgesia)을 평가하여 진통 효능을 실험하였다.

실험군에 기계적 자극을 가하여 회피시의 자극의 문턱값을 측정하고, 열적 자극을 가하여 회피 시간을 측정하였다. 즉 실험군의 관절염 통증이 심해질수록 실험군이 발을 움츠리는 자극의 문턱값이 낮아지고 자극을 견디는 시간이 점점 빨라지는 것을 이용하는 실험이다.

여기에서, 발 회피 반응(paw withdrawal latency)실험은 실험군의 발에 기계 자극이나 열 자극을 가하였을시, 실험군의 발에 유발된 관절염으로 인해 생긴 이질통 또는 과민통으로 인하여 실험군이 발을 회피하게 되는 원리를 이용한 것으로써, 이질통 또는 과민통의 경과를 관찰할 수 있는 실험이다.

4-3. 실험 결과

도 7은 급성 관절염 유발시 기계성 이질통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다. 도 8은 급성 관절염 유발시 기계성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다. 도 9는 급성 관절염 유발시 열성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.

도 7을 참조하여 보면, 기계성 자극을 가한 결과, 시간 경과에 따라 모든 실험군에서 자극의 문턱값이 낮아지는 것을 관찰할 수 있는데 이는 관절염의 경과에 따른 통증이 심해지고 있음을 나타낸다.

또한 HPL-1 투여군 및 셀레콕시브 투여군은 vehicle 투여군보다 자극의 문턱값이 높은 것을 보아 모두 진통 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.

특히 HPL-1 투여군은 1시간 및 3시간 경과 후에 양성대조군인 셀레콕시브보다 진통 효능이 보다 높았음을 확인할 수 있다.

도 8을 참조하여 보면, 기계성 자극을 가한 결과, 시간 경과에 따라 vehicle 투여군은 점차 자극의 문턱값이 낮아지고 있음을 알 수 있다.

그러나 HPL-1 투여군은 셀레콕시브 투여군과 거의 유사할 정도로 진통 효능을 보이고 있음을 확인할 수 있다.

도 9를 참조하여 보면, 열성 자극을 가한 결과, 시간 경과에 따라 모든 실험군에서 통증회피 시간이 빨라지고 있음을 알 수 있다.

또한 HPL-1 투여군 및 셀레콕시브 투여군은 vehicle 투여군보다 회피 시간이 느린 것을 볼 때 모두 진통 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.

특히 HPL-1 투여군은 3시간 경과 후에 양성대조군인 셀레콕시브보다 진통 효능이 보다 높았음을 확인할 수 있다.

실험예 5. 동물 모델에서의 만성 류마티스 관절염 유발시의 소염 효능

5-1. 실험 과정

8주령의 수컷 루이스(Lewis) 랫의 오른쪽 발바닥에 CFA(complete Freund's adjuvant[Micobacterium butyricum]) 50 ul (20 mg/ml)를 오른쪽 발바닥에 피내투여하여 CFA 유발형 만성 류마티스 관절염 모델을 준비하고, 왼쪽발에서 나타나는 발목부종에 대한 소염효능을 실험하였다.

5-2. 실험 과정

실험군을 CFA와 vehicle을 투여한 군(n=9) 및 CFA와 HPL-1 100 mg/kg을 투여한 군(n=6)으로 설정하고, vehicle과 HPL-1을 3주간 경구 투여하여 왼쪽발 발목부종의 부피를 관찰하였다.

5-3. 실험 결과

도 10은 만성 류마티스 관절염 유발시의 HPL-1의 소염 효능을 나타낸 그래프이다.

CFA와 vehicle의 투여군 및 CFA와 HPL-1 100 mg/kg의 투여군을 비교한 결과, CFA와 vehicle의 투여군은 시간이 경과할 수록 부종의 부피가 큰 폭으로 증가하는 경향을 보였다.

반면에 CFA와 HPL-1 100 mg/kg의 투여군은 시간이 경과할 수록 부종의 부피가 증가하였으나, 증가폭이 점차 작아지면서 부피 증가가 점차 완화되고 있음을 확인할 수 있다.

이는 HPL-1이 만성 류마티스 관절염에 있어 소염 효능을 보이고 있으며 또한 HPL-1 100 mg/kg 이상을 투여할 시 소염 효능이 보다 증진될 수 있다는 것을 시사한다고 할 수 있다.

실험예 6. 동물 모델에서의 만성 류마티스 관절염 유발시의 진통 효능

6-1. 실험 준비

실험예 5-1과 동일하게 실행하였다.

6-2. 실험 과정

실험군을 실험예 5-2와 동일하고 설정하고, vehicle과 HPL-1을 3주간 경구 투여하면서 왼쪽발에서 나타나는 이질통 및 과민통에 대한 진통 효능을 3일 단위로 측정하였다.

6-3. 실험 결과

도 11은 만성 류마티스 관절염 유발시 기계성 이질통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다. 도 12는 만성 류마티스 관절염 유발시 기계성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.도 13은 만성 류마티스 관절염 유발시 열성 과민통 평가를 위한 발 회피 반응 실험에서의 HPL-1의 진통 효능을 나타낸 그래프이다.

도 11 내지 도 13을 참조하여 보면, HPL-1 투여군은 vehicle 투여군보다 현저하게 자극 문턱값 및 회피시간이 높았음을 볼 때 HPL-1의 만성 류마티스 관절염에 대한 진통 효능을 확인할 수 있다.

실험예 7. 동물 모델에서의 만성 골관절염 유발시의 보행장애개선 효능

7-1. 실험 준비

8주령의 SD 수컷 랫의 오른쪽 무릎 전방십자인대 및 내측 반월판을 제거한 후, 강제로 운동을 반복시켜 강제운동유발형 만성 (퇴행성) 골관절염 모델을 준비하였다.

7-2. 실험 과정

실험군은 오른쪽 무릎의 피막만 개봉한 후에 봉합한 Sham 군, 제거수술 후 1일 1회 100 mg/kg씩 HPL-1을 경구투여한 군, 제거수술 후에 vehicle을 투여한 군으로 설정하였고, 40일 동안 지속적으로 보행 양태를 관찰하였다. 여기에서, Sham 군은 수술 과정의 영향을 배제하기 위하여 설정된 군이다.

7-3. 실험 결과

도 14 및 도 15는 만성 골관절염 유발시 보행장애 개선 효능을 나타낸 그래프이다. (동측성(ipsi, ipsilateral로 표기)이란 좌우 대칭 동물에 있어 한 체측에 가해진 작용에 의해 동일체측에 생기는 현상이나 반응을 나타내는 용어이고, 대측성(cont, contralateral로 표기)이란 좌우대칭동물에게 외적 작용이 가해진 체측과 반대쪽 체측에 나타나는 현상이나 반응을 나타내는 용어이다.)

도 14 및 도 15를 참조하면, sham 군은 정상적인 보행을 하고 있는 것으로 나타나서 수술과정의 보행장애에 대한 영향을 배제할 수 있음을 알 수 있다.

또한 실제 제거수술을 수행한 실험군들에서는 수술 후에 점차 보행 장애가 나타나다가 8일경에 가장 극심하게 보행 장애가 나타났음을 알 수 있다.

또한 vehicle 투여군에서는 8일~25일 사이에 점차로 보행장애가 일부 개선되었으나 25일 이후에는 거의 개선된 것이 없으나, HPL-1 투여군에서는 8일~38일 사이에 지속적으로 현저하게 보행장애가 개선되었음을 확인할 수 있다.

Claims (7)

1. 해동피 350~450 중량부, 모과 350~450 중량부 및 정제부자 50~150 중량부를 추출한 제1추출물과 내복자 150~250 중량부 및 창출 50~150 중량부를 추출한 제2 추출물을 혼합한 추출물을 유효성분으로 함유하되,
   상기 추출물은 연골세포 및 활막세포에 대한 세포독성이 없는 효능과, 관절염 환자에 대한 소염 및 진통 효능 및 만성 관절염 환자의 운동 장애를 개선하는 효능을 보유하는, 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 제1 추출물의 추출용매는 40~60 중량% 주정이며, 제2 추출물의 추출용매는 물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 제1 추출물의 추출 횟수, 제2 추출물의 추출 횟수 및 혼합 추출물의 추출 횟수는 2회 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 추출물을 농축 및 건조하여 제조한 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 건조엑스 제제.
   
7. 청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 추출물에 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가하여 제형화한 류마티스 관절염 및 골관절염의 개선 또는 치료를 위한 약학적 제제.
   

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