KR102532121B1 - 돌미나리 추출물 및 항혈전제를 포함하는 항혈전용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돌미나리 추출물 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돌미나리 추출물 및 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하며, 단독투여시 및 다른 항혈전제의 조합에 비해서도 탁월한 혈전 생성 억제 작용을 나타내는 항혈전용, 또는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

돌미나리 추출물 및 항혈전제를 포함하는 항혈전용 조성물{Composition for inhibiting thrombosis comprising extract of Oenanthe Javanica and clopidogrel or pharmaceutically acceptable salt thereof}
본 발명은 돌미나리 추출물 및 항혈전제를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돌미나리 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항혈전용, 또는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
심혈관계 질환은 심장 관련 질환(심근경색, 고혈압, 심부전, 부정맥, 동맥경화)과 혈관 질환(뇌졸중, 말초혈관 질환)을 포함하는 질환으로 세계 보건기구(WHO)의 통계에 따르면, 현대 과학과 의학의 눈부신 발전에도 불구하고 지난 30년간 꾸준히 발병율과 유병율이 증가한 질환으로 보고되었으며, 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 심장 순환기 계통 질환에 의한 사망률이 전체 사망률의 30% 내외로 매우 높은 비율을 차지하는 치명적인 질환의 일종이다. 이러한 심혈관계 질환의 발병율과 사망률의 증가는 경제성장과 생활양식의 서구화와 더불어 고지방식 등 식생활의 변화, 스트레스 증가, 수명연장에 따른 인구의 고령화, 운동부족 등에서 주로 기인하고 있다. 이러한 질병 자체 및 그 질병 발생 후 심각한 신체적, 사회적 후유증으로 인하여 국민 의료비 과다지출과 삶의 질 저하가 초래되는 것이 심혈관계 질환의 심각한 문제점으로 지적되고 있는 실정이다. 따라서, 이와 같은 심혈관계 질환에 대한 문제점이 점차 중요하게 인식되면서 전 세계적으로 이들 질환의 발병기전 연구와 더불어 예방 및 치료에 대한 연구에 많은 투자가 이루어지고 있는 바, 혈액순환 개선 효과를 가진 새로운 항혈전 제제의 개발을 위한 연구의 일환으로, 항응고 활성 혹은 피브린 용해 활성을 나타내는 새로운 소재의 발굴을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 이러한 그 동안의 순환기질환 관련 약제 연구와 개발에도 불구하고 심혈관계 질환의 유병율과 발병율은 전 세계적으로 꾸준히 증가하는 추세인 바, 이제는 관련 질환에 대한 치료제 개발과 함께 심혈관계 발병을 억제, 예방할 수 있는 활성물질 및 식품소재 개발의 필요성이 절실히 대두되고 있는 실정이다.
한편, 혈전은 혈액 인자의 응집물로서, 주로 혈소판 및 피브린의 응집물로 이루어지며, 통상적으로 혈관의 과도한 출혈을 막기 위하여 형성된다. 혈소판이 내피하층의 표면과 접촉하는 경우 혈전을 생성시켜 혈관계를 차단하는 반응이 개시되는데 이러한 과정을 지혈이라고 하고, 상기 과정은 상처 부위에서 과도한 출혈을 막는데 매우 중요하다. 동맥 혈전은 국소 폐색에 의한 심각한 질환을 야기하는 반면, 정맥 혈전은 주로 원거리 폐색, 또는 색전을 야기한다. 따라서, 혈소판 응집억제 또는 혈전용해 작용을 하는 의약은 혈전, 색전과 관련이 있는 질병들 즉, 심근경색, 협심증, 혈전성 정맥염, 동맥색전증, 관상 및 뇌동맥혈전증, 말초혈관 또는 심부정맥혈전증, 임의 혈관의 동맥혈전증, 정맥혈전증, 허혈성 뇌경색, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 뇌색전증, 신장색전증, 혈전색전증 및 지주막하 출혈 후의 병적 증상, 경피적 관상동맥 성형술(PTCA) 및 스텐트(stent) 삽입 시의 혈전 생성, 스텐트 설치 후의 재협착, 카테터 혈전성 폐색 또는 재폐색, 급성 관 상동맥증후군, TIA(일과성 뇌허혈 발작 또는 급성 뇌혈관 증후군), 심부전증, 허혈성 병인에 의한 가슴통증, X 증후군, 진성당뇨병의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 이러한 혈관을 막는 기전에는 혈액응고 기전과 혈전형성 기전이 존재한다. 혈액응고 기전은 용해성 피브리노젠이 난용성 피브린으로 변화되어 혈액이 응고되는 것으로, 주개시자로는 외인성 인자인 조직인자(TF; tissue factor)와 외인성 인자인 VIIa인자(factor VIIa)가 있다. 각 단계에서 여러 가지 응고 인자를 활성화시켜 섬유소 응고(fibrin colt; cross-linked fibrin molecule)가 형성되고, 이때 트롬빈이 생성되는데 이 물질이 강한 혈소판 활성물질로 활성화 인자 방출을 자극하게 된다. 혈전형성 기전은 손상된 혈관 내피 노출시 혈소판이 콜라겐에 부착되고, 서로 활성화에 의해 점성의 젤라틴 덩어리를 형성하는 것이므로, 정상적인 혈관 내피 세포에 생기는 것이 아니라 손상된 혈관으로부터의 출혈을 막기 위한 자발적인 과정이다.
이러한 혈전을 제거하는 약물로는 혈전용해제와 항혈소판제가 있다. 혈전용해제는 플라스미노겐(plasminogen)으로부터 세린 단백분해효소 플라스민(serin protease plasmin)의 형성을 촉매하여 혈전을 신속히 분해하는 약물로, 스트렙토키나아제(streptokinase), 유로키나아제(urokinase), APSAC, t-PA 등이 있고, 3군의 물질에 의해 조절되는 항혈소판제는 혈소판 외부에서 생성되어 혈소판 막 수용체와 작용하는 약물인 카테콜라민(catecholamine), 콜라겐, 트롬빈, 프로스타사이클린(prostacyclin); 혈소판 내부에서 생성되어 막 수용체와 작 용하는 약물인 ADP, PGD2, PGE2, 세로토닌(serotonin); 및 혈소판 내부에서 생성되어 혈소판 내부에서 작용하는 물질은 프로스타글란딘 엔도퍼록사이드(prostaglandin endoperoxide), 트롬복산 A2(TXA2), cAMP, cGMP, Ca 2+ 가 있다. 항혈소판제에는 또한 칼슘 이온운반체(ionophore)로서 세포막에 결합하여 세포 외의 칼슘을 세포 내로 칼슘 통로를 만들어 응집을 유발시키는 약물인 A23187과, 트롬복산 A2 유사물질(thromboxane A2 analog)로 트롬복 산 수용체 (thromboxane receptor; TP)에 작용하여 트롬복산과 같은 효과를 나타나게 하는 U46619가 있다. 그러나 현재까지 개발된 혈전용해제 또는 항혈소판제는 지혈과다억제, 불임, 소화기 장애 등의 여러 부작용을 야기하는 문제점을 가지고 있는바, 작용의 다른 메커니즘, 증가된 효능 및 낮은 독성을 가지는 새로운 항혈전용 생리활성 화합물 및 약물에 대한 연구는 매우 필요하다
이에 본 발명자들은, 돌미나리 추출물과 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 복합적으로 투여하는 경우 각각의 성분을 단독투여한 경우보다도 더 우수한 항혈전 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
[비특허문헌 1] 최성훈. Oenanthe javanica 추출물의 항혈소판 작용과 유효성분의 탐색에 관한 연구. 인제대학교 이학석사학위 논문, 2004년 1월 [비특허문헌 2] Joong-Seok Kim 외. Journal of Clinical Neuroscience. 2004, Vol. 11(6), pp. 600-602
따라서, 본 발명의 목적은 돌미나리(Oenanthe javanica) 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항혈전용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌미나리 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 혈전 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 돌미나리(Oenanthe javanica) 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항혈전용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 돌미나리(Oenanthe javanica) 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 항혈전용 또는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효성분으로서 돌미나리 추출물, 및 항혈전제로서 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함한다.
미나리(Oenanthe javanica)는 미나리과에 속하는 다년생 초본식물로 수생 또는 호습성이면서 줄기는 길게 진흙 속에서 뻗고 7, 8월에 흰 꽃이 피고 타원형의 열매를 맺는다. 꽃차례는 잎과 마주나며 5 내지 15개의 작은 꽃자루로 갈라지고 각각 10 내지 25개의 꽃이 달린다. 줄기 밑 부분에서 가지가 갈라져 옆으로 퍼지고 가을에 기는줄기의 마디에서 뿌리가 내려 번식한다. 줄기는 털이 없고 향기가 있으며 높이가 20 내지 50 cm 이며, 잎은 어긋나고 길이가 7 내지 15 cm 이고, 1 내지 2회 깃꼴겹이고 잎자루는 위로 올라갈수록 짧아진다. 작은 잎은 달걀 모양이고 끝이 뾰족하고 가장자리에 톱니가 있는 특징을 갖는다. 상기 미나리 중에서 밭에서 자라는 야생 미나리를 돌미나리라고 부르며, 일반 미나리와 영양학적으로 차이는 없으나 향이 다소 진하다.
상기 돌미나리는 그 형태에 특별한 제한이 없이 추출물 분야에서 추출물을 얻기 위하여 통상적으로 이용되는 형태를 모두 포함한다. 또한 상기 추출물은 추출용매로 추출한 용매 추출물, 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획한 분획물 또는 상기 분획물에 크로마토그래피를 수행하여 수득한 정제물일 수 있다. 상기 추출용매는 천연물 추출에 사용될 수 있는 물, 염화나트륨 수용액, 유기용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 염화나트륨 수용액, 에틸아세테이트, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분지형 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매, 탄소수 3 내지 5의 케톤 등의 중성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 90(v/v)%의 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 더욱 바람직하게는 50 내지 80(v/v)% 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 분획용매는 물, 탄소수 1 내지 탄소수 5의 직쇄 또는 분지형 알코올, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 바람직한 하나의 양태에서, 본 발명의 돌미나리 추출물은 돌미나리를 에탄올로 추출한 조 추출물의 에틸아세테이트 분획일 수 있다. 상기 돌미나리 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 불순물을 제거한 돌미나리에 추출용매를 가하고 추출과정을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 추출과정은 냉침추출법, 온침추출법, 가압추출법, 환류추출법 또는 초음파 분쇄 추출법일 수 있다. 상기 돌미나리 추출물의 분획물의 제조는 상기 추출법으로 제조한 추출물 즉, 조추출물 또는 조추출액에 분획용매를 가한 후에 분획용매의 극성에 따라 분획물을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 분획물을 수득하는 방법은 층분리에 의한 분리법 또는 분획법으로 수행할 수 있다. 상기 분획물의 정제를 위한 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC) 등의 다양한 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 추출, 분획과정 또는 정제과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 돌미나리 추출물은 통상적 방법으로 건조된 추출물의 건조물과 통상적 방법으로 농축된 추출물의 농축물, 상기 추출물, 건조물 또는 농축물의 희석액을 포함하는 의미로 사용된다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 돌미나리 건초 5kg을 세척 및 세절하여, 35L의 주정(95(v/v)%) 에탄올 수용액을 가하여 70℃에서 5 시간 동안 1차로 추출하고, 1차 추출 후 상기 1차 추출과 동일한 조건에 따라 5 시간 동안 15L의 주정을 사용하여 2 및 3차 추출을 수행하였다. 추출이 완료된 후 이를 회수하고 4℃ 냉장보관하였다. 상기 추출물을 100mesh로 거른 후에, 10㎛ 필터지로 여과하였고, 이를 다시 4℃ 냉장보관하였고, 이를 농축시켜(5ℓ/1hr) 본 발명에 따른 돌미나리 추출물을 제조하였다. 이러한 구체적인 돌미나리 추출물의 일 제조예의 흐름도를 도 4에 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 다른 하나의 유효성분으로서 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함한다.
이중 클로피도그렐은 화학명이 메틸(+)-(S)-α-(o-클로로페닐)-6,7-디히드로티에노[3,2-c]피리딘-5(4H)-아세테이트 (우선성 광학이성체)로서, 혈소판 억제 활성을 가짐으로써 아테롬성경화증 및 심장 마비와 같은 혈관 질환에의 한 허혈성 발작(ischemic events)을 방지한다. 클로피도그렐은 혈소판 응집을 억제함으로써 항혈전 효과가 있어 동맥경화, 뇌졸중, 심근경색, 말초동맥폐쇄증과 같이 각종 혈관성질환의 예방과 치료에 유용하다. 클로피도그렐은 염으로서 염산염, 황산수소염, 브롬산염, 타우로콜린산염 등이 알려져 있으며, 현재 임상에서는 클로피도그렐 황산수소염(또는 황산염으로 칭해지기도 한다, C16H16ClNO2S·H2SO4) 형태로 사용되고 있다. 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있는 클로피도그렐의 약학적으로 허용가능한 염은 황산수소염일 수 있다.
또한, 실로스타졸은 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)-부톡시]-3,4- 디히드로카르보스티릴이며, 포스포디에스테라제 저해작용, 항종양 작용, 항고혈압 작용, 소염 작용뿐만 아니라 높은 혈소판 응집 억제 작용을 나타내므로, 포스포디에스테라제 저해제뿐만 아니라 항혈전제, 뇌순환 개선제, 소염제, 항종양제, 항고혈압제, 항천식제로서 널리 이용되고 있는 약물이다. 실로스타졸의 약리학적으로 허용가능한 염은 실로스타졸을 약리학적으로 허용가능한 산과 반응시켜 용이하게 제조할 수 있다. 약리학적으로 허용가능한 산으로는, 예를 들어, 염산, 황산, 인산, 브롬화수소산과 같은 무기산, 및 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산과 같은 유기산이 포함된다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 돌미나리 추출물 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 투약자의 필요에 따라 증감할 수도 있고, 식생활, 영양 상태, 혈전의 진행 정도 등과 같이 다양한 인자에 따라 적절하게 증감할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물 내에서 돌미나리 추출물과 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중량비는 200:1 내지 1:200, 바람직하게는 100:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 또는 비경구(예를 들어, 피부, 정맥, 근육 내, 피하) 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제, 연고제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 혼합 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 예를 들어, 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 체중, 천식으로 인한 기관지 또는 폐의 손상 정도, 질환의 진행 정도 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 혈소판의 응집을 효과적으로 저해하여 탁월한 항혈전 효과를 나타내어 항혈전용 조성물 및 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 혈전 질환은 심근경색, 협심증, 혈전성 정맥염, 동맥색전증, 관상동맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 심부정맥혈전증, 동맥혈전증, 정맥혈전증, 허혈성 뇌경색, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸중, 만성동맥폐색증, 폐경색, 뇌색전증, 신장색전증, 혈전색전증, 지주막하출혈 후의 병적 증상, 경피적 관상동맥 성형술(PTCA) 또는 스텐트 (stent) 삽입 시의 혈전 생성, 스텐트 설치 후의 재협착, 카테터 혈전성 폐색 또는 재폐색, 급성 관상동맥증후군, TIA(일과성 뇌허혈 발작 또는 급성 뇌혈관 증후군) 및 심부전증으로 이루어진 군 으로부터 선택된 1종 이상인 것을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 돌미나리 추출물 및 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항혈전용, 또는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은,
a) 돌미나리 추출물을 제조하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 제조된 돌미나리 추출물 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가제를 혼합하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 제조된 혼합물을 제형화하여 제제를 제조하는 단계를 포함하는, 항혈전용, 또는 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 제조방법에서, 단계 a)에서는 앞서 조성물에 관하여 언급된 다양한 추출용매 및 추출방법을 사용하여 돌미나리 추출물을 제조할 수 있다. 또한 단계 b)와 같이 제제의 구성성분들을 혼합한 후, 유동성의 증가, 제제의 함량 균일성 확보 등을 위해 추가적으로 체에 사과하는 공정 등을 통해 적절한 크기로 펠렛이나 과립화할 수 있다. 이때, 이와 같이 제조된 혼합물들의 펠렛 또는 과립은 추가로 제형화 전에 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가제와 더 혼합될 수도 있다.
상기 단계 c)에서 단계 b)에서 제조된 혼합물을 제형화시키는 방법은 공지의 제제 제조시 사용되는 것이면 어떠한 방법이든 사용가능하나, 일반적으로 정제의 경우 타정기에 균일한 양의 혼합물을 투입하여 타정하는 방식에 의해 제조될 수 있는데, 일반적으로 정제의 제조시에 사용되는 직접 압축 성형(직접 타정법, direct compression), 습식 과립법(wet granulation) 또는 건식 과립법(dry granulation)을 제한없이 사용할 수 있다. 나아가, 캡슐제의 경우 적절한 크기의 젤라틴 캡슐과 같은 공캡슐 내에 원하는 함량의 단계 b)의 혼합물을 균일하게 투입하여 제조할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 돌미나리 추출물 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함께 포함함으로써 다른 항혈전제들 간의 조합에 비해 탁월한 상승적인 혈전 생성 억제 효과를 나타내어, 항혈전제 및 혈전 질환의 예방 또는 치료제로서 제약 산업에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 돌미나리 추출물과 클로피도그렐 병용투여시의 혈전형성에 의해 경동맥을 통한 혈류 중단시까지의 시간(Time to occlusion, TTO)를 나타낸 그래프이다. 상기 도 1에서, Clo 1은 클로피도그렐 1mg/kg를 의미하며, Clo 2는 클로피도그렐 2mg/kg를 의미한다.
도 2는 본 발명에 따른 돌미나리 추출물과 클로피도그렐 병용투여시의 혈전 무게를 측정한 그래프이다. 상기 도 2에서, Clo 1은 클로피도그렐 1mg/kg를 의미하며, Clo 2는 클로피도그렐 2mg/kg를 의미한다.
도 3은 다양한 추출 용매로 추출한 본 발명에 따른 돌미나리 추출물과 다양한 항혈전제의 조합에 따른 혈소판 응집 저해능을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 돌미나리 추출물의 일 제조예를 도시한 흐름도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 제조예 1: 돌미나리 물 추출물, NaCl 추출물 및 에탄올 추출물의 제조
본 발명에 따른 돌미나리 추출물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법에 따라, 돌미나리 물 추출물, 돌미나리 NaCl 추출물 및 에탄올 추출물을 제조하였다.
우선 물 및 0.15M NaCl 추출물의 경우, 돌미나리 건초 5kg를 각각 물 및 0.15M NaCl 용액을 35L 사용하여, 90℃에서 17시간 동안 1차 추출하였다. 나아가, 1차 추출 후 동일한 조건에서 동일한 추출용매 15L를 사용하여 3시간 동안 2차 추출하였다. 추출된 추출물을 회수하고 4℃ 냉장보관한 후 이를 100mesh 체로 체과한 후 10㎛ filter로 여과하였다. 이후 여과된 여과액을 원심분리 (4,500rpm 30분)한 후 여과지로 거르고 이를 4℃ 냉장보관하고, 동결건조시켰다(50ℓ/5day).
에탄올 추출물은, 돌미나리 건초 5kg을 세척 및 세절하여, 35L의 주정(95(v/v)%) 에탄올 수용액을 가하여 70℃에서 5 시간 동안 1차로 추출하고, 1차 추출 후 상기 1차 추출과 동일한 조건에 따라 5 시간 동안 15L의 주정을 사용하여 2 및 3차 추출을 수행하였다. 추출이 완료된 후 이를 회수하고 4℃ 냉장보관하였다. 상기 추출물을 100mesh로 거른 후에, 10㎛ 필터지로 여과하였고, 이를 다시 4℃ 냉장보관하였고, 이를 농축시켜(5ℓ/1hr) 본 발명에 따른 돌미나리 추출물을 제조하였다. 이러한 구체적인 돌미나리 추출물의 일 제조예의 흐름도를 도 4에 나타내었다.
2. 제조예 2: 돌미나리 추출물의 분획물 제조
상기 제조예 1에서 제조된 돌미나리 물 추출물, NaCl 추출물, 에탄올 추출물을 사용하여 돌미나리 추출물의 다양한 용매 분획을 제조하였다. 구체적으로 제조예 1에서 제조된 돌미나리 추출물의 농축액을 물에 현탁시켜, 현탁액과 동량의 클로로포름을 첨가하여 혼합시킨 후 4 시간 정도 층을 분리시켰으며 이 과정을 2번 더 반복하였다. 분리된 물 분획물에 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합시킨 후, 4 시간 정도 층을 분리시켰으며 이 과정을 2번 더 반복하였다. 또한, 분리된 물 분획물에 동량의 부탄올을 첨가하여 혼합시킨 후 4 시간 정도 층을 분리시켰으며 이 과정을 2번 더 반복하였다. 분리된 각 분획물을 이후 농축시켜(5ℓ/h) 각각의 용매 분획물을 제조하였으며, 이의 흐름도를 도 4에 나타내었다.
3. 실험예 1: 래트 동맥혈전 모델(rat arterial thrombosis model) 을 이용한 돌미나리 추출물의 항혈전 효능 평가
본 발명에 따른 조성물의 유효성분 중 하나인 돌미나리 추출물과, 공지의 항혈전제 4종의 단독 및 병용투여시의 항혈전 효능을 확인하기 위하여, FeCl3-유도 경동맥 혈전증 질환 래트 모델을 이용하여 동물 실험을 진행하였다.
3-1. 실험용 시약 및 시료
본 발명에 따른 돌미나리 추출물은 제조예 2에서 제조된 돌미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획을 사용하였고, 클로피도그렐, 실로스타졸, 은행잎 엑스(Ginko biloba extract) 등은 자체적으로 제조하여 사용하였다. FeCl3, 아라비아검(Arabic gum)과 아스피린(Aspirin)은 Sigma-Aldrich(용인, 한국)로부터 구입하였다. 모든 시료는 5% 아라비아검에 현탁시켜 동물실험을 진행하였다.
3-2. 실험동물 및 실험군
SD rat (웅성, 6주령)은 Orientbio사 (서울, 한국)으로부터 구입하였고, 건국대학교 RIC 센터 실험동물실에서 1주 이상 적응시킨 후, 최소 18시간 절식시킨 후 실험에 사용하였다.
실험군은 총 8군으로 하기와 같이 나누고, 각 군마다 래트는 질환모델의 특성상 정확한 효능평가를 위해 7마리로 편성하였다.
1) 단독 투여 시험 (5개 실험군):
Control(1개군): 5% 아라비아검(Arabic gum, 용매투여군)
약물군(2개군): Clopidogrel 1, 2 mg/kg (양성 대조물질)
본 발명에 따른 돌미나리 추출물(2개군): 돌미나리 추출물 50 및 100 mg/kg
2) 복합제 투여 시험 (3개 실험군):
돌미나리 추출물 50 mg/kg + Clopidogrel 1 mg/kg (2 set)
돌미나리 추출물 100 mg/kg + Clopidogrel 1 mg/kg
3-3. 실험방법
JH Cho 등 (Thrombosis Research 100: 97-107, 2000), JH Cho 등 (Thromb Haemost 86: 1512-1520, 2001), KD Kurz 등 (Thrombosis Research 60:269-280, 1990) 에 의한 방법을 참고하여 제작하여 이를 이용하여 경동맥 혈전 동물(래트) 모델을 제작하여, 하기와 같은 구체적인 방법에 의해 상기 혈전 동물 모델에서 FeCl3-유도된 혈전에 의한 경동맥 혈류 중단 시까지의 시간(TTO, time to occlusion) 및 경동맥내 생성된 혈전의 무게를 측정하였다.
1) 시험물질, 용매, 양성 대조물질 등을 체중 대비 일정 용량 rat에 경구투여한다.
2) 경구 투여 약 40 분후 Rat의 체중에 맞춰서 마취제를 투여한다 (pentobarbital Na 60 ㎎/㎏을 복강 주사).
3) 래트를 종이테이프로 heating pad 상의 실험대에 고정하고 어깨선이 이어지는 목 부근을 절개한다 (실험동안 열 발생 lamp를 이용하여 Rat의 체온이 37±0.5℃가 유지되도록 한다).
4) Tracheotomy (기관절개)를 실시한다 (기도 확보).
5) 가위로 작게 절개한 후 그 다음부터는 두 개의 forcep을 이용하여 근육을 찢어 들어가면서 좌측 경동맥을 조심스럽게 노출시킨다.
6) 혈관에 붙은 지방 조직을 제거하고 혈관 양끝을 둘러싼 근육을 더 절개하여 작은 핀셋을 혈관 밑에 넣어 고정시킨다 (핀셋을 끼운 상태에서도 혈관이 눌리지 않게 한다).
7) 좌경동맥의 혈관 아래에 parafilm (1×3 ㎝)를 위치시킨다 (flow probe를 고정하는 역할).
8) 0.9% saline으로 좌경동맥을 세척한 후 Transonic flow probe를 혈관에 끼운다.
9) Transonic flow probe를 경동맥에 끼운 후 Transonic flow 측정기와 연결하고 혈류가 제대로 모니터링 되는지 확인한다.
10) FeCl3를 놓을 곳과 probe 사이에 filter paper를 둘둘 말아서 혈관 위에 놓아둔다.
11) Filter paper (Whatman No.1) disc (1×2 ㎜) 를 20% FeCl3 (in 0.9% NaCl)용액에 흠뻑 적신다.
12) 시료를 경구투여한 후 1시간이 지난 후, filter paper disc를 probe의 하행방향에서 혈관 윗부분에 부착하며, 이때부터 10분 후에 filter를 제거한다.
13) FeCl3를 혈관에 부착한 후 60분 동안 유량계를 통해 경동맥 혈류량을 측정하면서 경동맥의 carotid patency (개방상태)를 지속적으로 모니터링 한다.
14) 실험 후 혈관 clamp를 이용하여 filter pater disc 부착 근처의 충분한 길이의 혈관 조각을 수술실로 묶어 분리하여 혈관 내에 생성된 혈전의 무게를 측정한다.
3-4. 통계학적 분석
모든 결과는 Mean±SEM 으로 나타냈으며, One-way ANOVA 와 Dunnett's Multiple Comparison Test 및 Student's unpaired t test (one-tailed)에 의해 유의적 차이를 p<0.05 수준에서 분석하였다.
3-5. 결과
래트 경동맥 혈전모델을 이용하여 시료 및 양성 대조물질의 단독 또는 병용투여시, 혈전관련 2개의 parameter (time to occlusion, TTO, min; thrombus weight, mg)에 대한 효과를 하기 표 1 및 도 1, 2에 나타내었다.
1) 염화철 용액에 의한 혈전증 유발
페노바르비탈(Pentobarbital)로 마취된 래트에서 경동맥을 염화철(20%)로 포화된 filter paper 조각(1x2 mm)에 10분간 노출시켰을 때, 혈전형성에 의해 경동맥을 통한 혈류 중단시까지의 시간(time to occulsion, TTO, min)이 15.1 분, 염화철 자극이 가해진 부위의 경동맥 내 형성된 혈전무게가 2.1mg 으로 관찰되어 염화철에 의한 혈관내피 손상으로 인해 경동맥내에 혈전이 잘 유발되었음을 알 수 있다.
2) 본 발명에 따른 돌미나리 추출물 및 양성 대조물질의 단독투여 효과
양성 대조물질로 사용된 클로피도그렐은 1 또는 2 mg/kg 용량으로 경구투여 하였을 때, 용매투여군에 비해 용량의존적으로 TTO를 증가시키고 혈전무게를 감소시키는 경향을 보였다(고용량 투여군: p<0.05 versus 용매투여군; 도 1 및 2, 및 하기 표 1 참조).
본 발명에 따른 돌미나리 추출물은 50 및 100 mg/kg 용량으로 경구투여 하였을 때, 용매투여군에 비해 TTO를 증가시키고 (저 및 고용량 투여군: p<0.05 versus 용매투여군), 혈전무게를 감소시키는 경향을 보였다 (고용량투여군: p<0.05 versus 용매투여군, 도 1 및 2, 표 1 참조).
대조군 클로피도그렐
1mg/kg 		클로피도그렐
2mg/kg 		돌미나리
EtOH-EA 분획
50mg/kg 		돌미나리
EtOH-EA 분획
100mg/kg 		돌미나리
EtOH-EA 분획
50mg/kg+
클로피도그렐
1mg/kg
(1차) 		돌미나리
EtOH-EA 분획
50mg/kg+
클로피도그렐
1mg/kg
(2차) 		돌미나리
EtOH-EA 분획
100mg/kg+
클로피도그렐
1mg/kg
TTO 66.8% 100% 195.1% 123.5% 123.0% 118.1% 121.2% 160.6%
혈전
무게 		116.7% 100% 22.2% 94.4% 88.9% 61.1% 66.7% 77.8%
3) 본 발명에 따른 돌미나리 추출물과 Clopidogrel의 병용투여에 따른 효과
TTO에 대한 작용
본 발명에 따른 돌미나리 추출물(50, 100 mg/kg) 각 용량을 Clopidogrel 1 mg/kg 용량과 동시에 병용투여 하였을 때는, 돌미나리 추출물 50 mg/kg과 병용투여시는 돌미나리 추출물 단독투여시와 비슷한 정도의 TTO를 나타내었으며, Clopidogrel 단독투여시보다는 TTO가 길게 나타나는 경향을 보였다. 반면, 돌미나리 추출물 100 mg/kg과 병용투여시는 돌미나리 추출물 단독투여시 또는 Clopidogrel 단독투여시 보다 TTO가 길게 나타나는 경향을 보였다(도 1 및 2, 표 1 참조).
경동맥 혈전무게에 대한 작용
돌미나리 추출물 (50, 100 mg/kg) 각 용량을 Clopidogrel 1 mg/kg 용량과 동시 병용투여 하였을 때는, 돌미나리 추출물 50 mg/kg과 병용투여시는 돌미나리 추출물 단독투여시 및 clopidogrel 단독투여시와 비교하여 혈전무게 감소효과를 나타내었으며 (도 1 및 2, 표 1 참조). 돌미나리 추출물 100 mg/kg과 병용투여시는 돌미나리 추출물 단독투여시 또는 Clopidogrel 단독투여시 보다 혈전무게가 감소하는 경향을 보였다.
4. 실험예 2: 추출물별 혈소판 응집 저해능 평가
PRP 및 WP의 light transmission을 0%,platelet poor plasma (PPP), suspension buffer의 light transmission을 100%로 해서 혈소판의 응집 정도에 따른 light transmission을 측정하였다. 측정방법은 Watson et al (“Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase does not impair primary activation of human platelets,” Biochem J. 1996 Aug 15; 318(Pt 1): 207212)에 기재된 방법을 사용하였다.
구체적으로 하기의 평가방법에 따라 수행하였고, 이때 사용되는 농축 혈소판은 1/7로 희석하여 37℃에서 2시간 이내 사용하였으며, 돌미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 돌미나리 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 돌미나리 0.15 NaCl 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 클로피도그렐, 실로스타졸, 아스피린을 각각 샘플로 사용하였다.
평가방법
1. Chrono-Log사의 four-channel aggregometer를 세팅 (예열 30분, 37℃)
2. PRP 4개 channel에 Plastic cuvettes에 stir bars를 넣고 혈소판 희석액(483㎕)을 넣고 가온(37℃)시킴. PPP칸에 Plastic cuvette과 suspension buffer 500㎕를 투입
3. aggregometer 작동 및 Baseline 설정
- Standard인 Ascorbic acid 1mg을 DMSO 1ml로 준비 한다.
4. 시료 및 응집제 첨가
- 1번 channel에 Control, 2,3,4번 channel에 시료 첨가 후, 약 1분 반응
- 응집제 처리 및 5분간 측정
5. 결과저장
- "Set Start and Stop Time" 선택하여 응집시작 및 종결 지점 지정
- "Compute slop and amplitude" 선택하여 slop와 amplitude 확인
상기 혈소판 응집 저해능 확인 시험에 관한 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 돌미나리 추출물의 분획물 중에서는 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 추출물이 단독투여시뿐 아니라 클로피도그렐, 실로스타졸 또는 아스피린과 병용투여시에도 가장 탁월한 혈소판 응집 저해능을 나타냈음을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 돌미나리(Oenanthe javanica) 추출물; 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하고, 상기 돌미나리 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물, 또는 상기 추출물의 분획물인 것인, 항혈전용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 돌미나리 추출물은 돌미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것인, 항혈전용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 클로피도그렐의 약학적으로 허용가능한 염은 황산수소염인 것인, 항혈전용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대한 상기 돌미나리 추출물의 중량 비율(돌미나리 추출물 : 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상)은 200 : 1 내지 1 : 200 인 것인, 항혈전용 조성물.
  8. 돌미나리(Oenanthe javanica) 추출물; 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하고, 상기 돌미나리 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물, 또는 상기 추출물의 분획물인 것인, 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물로서,
    상기 혈전 관련 질환은 심근경색, 협심증, 혈전성 정맥염, 동맥색전증, 관상동맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 심부정맥혈전증, 동맥혈전증, 정맥혈전증, 허혈성 뇌경색, 뇌경색, 뇌졸중, 만성동맥폐색증, 폐경색, 뇌색전증, 신장색전증, 혈전색전증, 경피적 관상동맥 성형술(PTCA) 또는 스텐트(stent) 삽입 시의 혈전 생성, 스텐트 설치 후의 재협착, 카테터 혈전성 폐색 또는 재폐색, 급성 관상동맥증후군, 및 TIA(일과성 뇌허혈 발작 또는 급성 뇌혈관 증후군) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 혈전 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 삭제
  10. a) 돌미나리 추출물을 제조하는 단계;
    b) 상기 단계 a)에서 제조된 돌미나리 추출물; 및 항혈전제인 클로피도그렐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 실로스타졸 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 혼합하는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)에서 제조된 혼합물을 제형화하여 제제를 제조하는 단계를 포함하는, 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 제조방법.
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