KR102511953B1 - 단백질 및 펩티드 전달용 입자 - Google Patents

단백질 및 펩티드 전달용 입자 Download PDF

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KR102511953B1
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Abstract

본 발명은 입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 음으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 용액을 수득하는 단계; (ii) 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제2 용액을 수득하는 단계; 및 (iii) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 입자를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 치료용 입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 치료용 단백질을 포함하는 용액을 수득하는 단계; (ii) 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 포함하는 제1 현탁액을 수득하는 단계; 및 (iii) 치료용 단백질의 용액과 제1 현탁액을 혼합하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 개시된 방법들 중 임의의 하나에 의해 제조되는 입자(예를 들어, 치료용 입자)뿐만 아니라 이 같은 입자를 포함하는 조성물, 및 이 같은 입자 및 조성물을 이용하여 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 및 펩티드 전달용 입자
우선권 주장
본 출원은 2016년 8월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/374,639호; 2016년 8월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/371,306호; 및 2016년 8월 1일자로 출원된 미국 가출원 제62/369,412호의 우선권을 주장한다. 상기 전문은 본원에서 참고로 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국국립보건원(NIH) 인가 번호 HL048743, HL061795, GM107618 및 HL108630을 통해 정부 후원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 입자, 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법에 관한 것으로, 특히 치료용 단백질과 같은 치료용 분자를 포함하는 입자에 관한 것이다.
단백질 기반 요법은 질병의 치료에서 중요하다. 따라서, 예를 들어 폐, 비강, 정맥 내, 비경구, 피하 및 경구 경로를 통해 환자에 단백질과 같은 생체 분자를 전달하기 위한 개선된 방법의 개발이 요구되고 있다.
단백질을 전달하기 위한 다수의 입자(예를 들어, 나노입자(NP)) 플랫폼이 개발되어 있다. 그러나 단백질 전달 응용을 위한 기존의 NP의 능력은, 예를 들어 낮은 로딩 효율 및 제어 불가능한 방출 프로파일로 인해 여전히 제한적이다.
임상적 변형(clinical translation)을 구현하기 위해 극복되어야 하는 단백질 기반 치료제의 개발 및 제조에서의 어려움으로 인해 단백질 약제 및 단백질 전달용 나노의학의 임상적 변형이 제약을 받아 왔다. 합성 화학 커플링과 같은 제한 및 균질화, 초음파 처리, 압출 및 용매에 대한 노출과 같은 제형화 매개변수는 종종 생체 분자(예를 들어, 치료용 단백질)의 불활성화를 초래한다. 목적하는 질병 조직에 대한 단백질 치료제의 안전하고 효과적인 전달은 중요한 과제로 남아 있다. 본 발명의 입자, 조성물 및 방법은 이러한 요구를 충족시키는데 도움이 된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 특히 치료용 입자를 제조하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은,
i) 치료용 단백질을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
ii) 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 포함하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 현탁액을 수득하는 단계; 및
iii) 치료용 단백질의 용액 및 제1 현탁액을 혼합하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 치료용 입자를 제조하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은,
i) 치료용 단백질을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
ii) 음으로 하전된 다당류, 양으로 하전된 다당류 및 2가 금속 이온을 포함하는 입자를 포함하며, 이때 양으로 하전된 다당류가 입자의 코어 내의 디카르복실산 링커에 의해 공유결합으로 가교되는 제1 현탁액을 수득하는 단계; 및
iii) 치료용 단백질의 용액과 제1 현탁액을 혼합하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 용액은 수성 용매를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 용매는 물 및 완충 식염수로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 완충 식염수는 둘베코 인산 완충 식염수(DPBS)이다. 일부 실시형태에서, 용액 중의 치료용 단백질의 농도는 약 2 nmol/㎖ 내지 약 30 nmol/㎖이다.
일부 실시형태에서, 제1 현탁액은 수성 용매를 포함한다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는, 입자 중의 단당류 단위에 대한 용액 중의 치료용 단백질의 몰비는 약 0.25:100 내지 약 3:100이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 치료용 단백질의 용액을 제1 현탁액에 첨가함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 혼합은 약 800 rpm으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 혼합은 약 20분 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합이 이루어진 후에 당 알코올의 용액에서 상기 얻어진 고형분을 원심분리하고 현탁하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득한다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합이 이루어진 후에 당 알코올의 용액, DPBS 또는 식염수에서 상기 얻어진 고형분을 원심분리하고 현탁하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득한다.
일부 실시형태에서, 당 알코올의 용액은 수용액이다.
일부 실시형태에서, 당 알코올의 수용액은 약 2.5중량%의 만니톨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 당 알코올의 수용액은 약 5중량%의 만니톨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 입자에서의 치료용 단백질의 혼입 효율은 약 90% 내지 약 100%이다.
일부 실시형태에서, 입자는 나노입자이다.
일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 약 300 ㎚ 내지 약 600 ㎚이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 약 350 ㎚ 내지 약 500 ㎚이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 동적 광산란(DLS) 방법을 이용한 측정에 따르면 약 300 ㎚ 내지 약 500 ㎚이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 코어의 직경은 멸균 여과막에 상기 입자를 통과시켜 측정할 때 약 220 ㎚ 미만이다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 3:1 내지 약 5:1이다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 4:1이다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 음으로 하전된 다당류의 검출 가능한 양은 입자 제조용으로 사용되는 총량에 대해 약 80%이다.
일부 실시형태에서, 입자는 음으로 하전되고, 제타 전위는 약 -35 mV 내지 약 -50 mV이다. 일부 실시형태에서, 입자는 음으로 하전되고, 제타 전위는 약 -40 mV 내지 약 -45 mV이다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 생리 pH에서 음으로 하전되는 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용기는 카르복실산(-C(=O)OH), 설폰산(-S(=O)2(OH) 또는 -SO3H) 및 포스폰산(-P(=O)(OH)2)으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 글리코사미노글리칸이다. 일부 실시형태에서, 글리코사미노글리칸은 헤파린, 황산헤파란, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라탄 및 히알루론산으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 글리칸이다. 일부 실시형태에서, 글리칸은 덱스트란설페이트이다.
일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 생리 pH에서 양으로 하전되는 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용기는 아미노기(-NH2)이다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 폴리글루코사민이다. 일부 실시형태에서, 폴리글루코사민은 키토산이다.
일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 입자의 코어에서 (예를 들어, 공유결합으로) 가교된다.
일부 실시형태에서, 가교제는 디카르복실산이다.
일부 실시형태에서, 디카르복실산은 글루타르산, 말산, 숙신산 및 타르타르산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 가교를 위한 촉매는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 가교 입자는 염 저항에 대해 선택된다.
일부 실시형태에서, 선택은 3배 농축된 DPBS와 함께 배양함으로써 이루어진다.
일부 실시형태에서, 가교 입자는 멸균된다.
일부 실시형태에서, 멸균은 0.22 ㎛ 여과막에 입자의 통과를 수반한다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 치료용 입자 중의 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질 및 음으로 하전된 다당류는 비공유결합으로 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 헤파린 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헤파린 결합 도메인은 치료용 단백질에서 기원한다.
일부 실시형태에서, 헤파린 결합 도메인은 치료용 단백질의 재조합 생성 중에 치료용 단백질에 표지된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 성장 인자, 사이토카인, 항체, 호르몬, 막관통 단백질 및 효소로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGFR), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인은 인터페론, 콜로니 자극 인자, 흉선 기질상 림포포이에틴 및 인터류킨으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 효소는 아갈시다제 베타(agalsidase beta), 이미글루세라아제(imiglucerase), 벨라글루세라아제 알파(velaglucerase alfa), 탈리글루세라아제(taliglucerase), 알글루코시다아제 알파(alglucosidase alfa), 라로니다아제(laronidase), 이두르설파아제(idursulfase), β-글루코-세레브로시다아제(β-gluco-cerebrosidase), 알글루코시다아제-α, 라로니다아제, α-L-이두로니다아제(α-L-iduronidase), 이두르설파아제, 이두로네이트-2-설파타아제(iduronate-2-sulphatase), 갈설파아제(galsulphase), 아갈시다제-β, 인간 α-갈락토시다아제 A, α-1-프로테이나아제, α-1-프로테이나아제 억제제, 췌장 효소, 락타아제, 글리코시드 하이드롤라아제, 리파아제, 아밀라아제, 프로테아제, 아데노신 데아미나아제, 알테플라아제(alteplase), 레테플라아제(reteplase), 테넥테플라아제(tenecteplase), 유로키나제, 콜라게나아제, 인간 데옥시리보뉴클레아제 I, 도르나제-α(dornase-α), 히알루로니다아제, 파파인, 아스파라기나아제, 라스부리카아제(rasburicase), 스트렙토키나아제, 아니스트레플라아제(anistreplase) 및 갈설파아제로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 온코스타틴 M(oncostatin M; OSM), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 골형성 단백질-2(BMP-2), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 리소자임으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 골형성 단백질-2(BMP-2), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 리소자임으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질에 대한 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위 100 nmol 당 약 0.25 nmol 내지 약 3 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질에 대한 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위의 총량에 대해 약 10% 미만이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, SDF-1α에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 3 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, VEGF에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 0.6 nmol 내지 약 1 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 골형성 단백질-2(BMP-2)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, BMP-2에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 0.5 nmol 내지 약 1 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, FGF-2에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 2 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 리소자임이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, 리소자임에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 2 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 입자는 적어도 2개의 치료용 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자는 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α) 및 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자는,
i) 음으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 용액을 수득하는 단계;
ii) 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제2 용액을 수득하는 단계; 및
iii) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 포함하는 현탁액을 수득하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자는,
iii) 음으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 용액을 수득하는 단계;
iv) 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제2 용액을 수득하는 단계;
v) 2가 이온을 포함하는 제3 용액을 수득하는 단계;
vi) 3개의 용액을 혼합하여 입자를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계;
vii) 원심분리에 의해 현탁액 내에서 입자를 침전시키는 단계;
viii) 약 7.0의 pH에서 완충수에서 입자를 현탁하는 단계;
ix) 입자를 디카르복실산, EDC 및 NHS와 혼합하여 입자의 코어에서 양으로 하전된 다당류의 가교를 구현하는 단계;
x) 3배 농축된 DPBS로 염-저항성 가교 입자를 선택하는 단계; 및
xi) 멸균 및 최종 크기 선택을 위한 0.22마이크로미터의 PVDF 막에 상기 입자를 여과하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일부 실시형태에서, 제1 용액은 수용액이다.
일부 실시형태에서, 제1 용액 중의 수용액은 물이다.
일부 실시형태에서, 제1 용액 중의 음으로 하전된 다당류의 농도는 약 1 ㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액은 수용액이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액 중의 수용액은 물 중의 약 0.2% 아세트산이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액 중의 양으로 하전된 다당류의 농도는 약 1 ㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 4:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 제1 용액에 제2 용액을 첨가함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 800 rpm으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 제1 용액과 제2 용액의 혼합이 이루어진 후에 금속염의 수용액을 혼합물에 첨가한다.
일부 실시형태에서, 금속은 칼슘, 마그네슘, 바륨, 아연 및 베릴륨으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속은 칼슘이다. 일부 실시형태에서, 금속은 아연이다.
일부 실시형태에서, 금속염은 ZnSO4이다. 일부 실시형태에서, 금속염의 수용액 중의 ZnSO4의 농도는 약 0.2 M이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 ZnSO4의 중량비는 약 1.3:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)의 혼합물에 금속 염의 수용액을 첨가한 이후에 혼합물에 당 알코올의 수용액을 첨가한다. 일부 실시형태에서, 당 알코올은 만니톨이다. 일부 실시형태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 15중량%이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 당 알코올의 중량비는 약 75:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합이 이루어진 후에 당 알코올의 용액에서 상기 얻어진 고형분을 원심분리하고 현탁하여 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득한다.
일부 실시형태에서, 당 알코올은 만니톨이다.
일부 실시형태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 5중량%이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 방법들 중 임의의 하나에 의해 제조되는 치료용 입자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는, 본원에 개시된 방법들 중 임의의 하나에 의해 제조되는 입자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 치료용 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 개체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 상기 개체에 본원에 기술된 바와 같은 치료용 입자 또는 이의 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 치료용 입자 중의 치료용 단백질에 의해 유익하게 치료된다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 암이다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 염증, 황반 변성 또는 폐 고혈압이다.
달리 한정하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서 사용하기 위해 본원에 기술되어 있으며; 당업계에 공지된 기타 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한을 위한 것은 아니다. 본원에서 언급된 모든 공개공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에서 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면 및 청구범위로부터 자명하게 될 것이다.
도 1은 동결 건조 중에 덱스트란설페이트 및 키토산(DSCS) 나노입자의 안정성에 미치는 만니톨의 효과를 나타내는 막대그래프이다. 만니톨 용액에서 DSCS 나노입자를 표시된 농도로 현탁하고 동결 건조하였다. 크기 측정 이전에 물을 이용하여 입자를 원래 부피로 복원하였다. 데이터는 3개의 제제로부터의 측정치에 대한 평균 ± SD를 나타낸다.
도 2는 DSCS 입자 크기에 미치는 아연 농도의 효과를 나타내는 막대그래프이다. 표시된 농도의 ZnSO4로 입자를 제조하고, 제조 이후 5% 만니톨에 재현탁하였다. 동결 전조 이전(검은색 막대) 및 이후(회색 막대)에 입자 크기를 측정하였다. 데이터는 3개의 별도의 제제의 측정치에 대한 평균 ± SD를 나타낸다.
도 3a는 아주르 A(Azure A)의 흡수 스펙트럼을 보여주는 선 그래프이다. 점선은 DS 농도가 증가함에 따라 흡광도가 비례적으로 변하는 파장(510 및 620 ㎚) 또는 변하지 않는 파장(548 ㎚, 등흡광점(isosbestic point))을 나타낸다.
도 3b는 96-웰 플레이트 포맷에서 하전된 DS를 측정하기 위해 사용되는 표준 곡선의 예를 보여주는 선 그래프이다.
도 4a는 SDF-lα-혼입 입자의 입자 크기 및 제타 전위를 보여준다. 검은색 막대는 반응을 pH 6에서 물에서 수행하였다는 것을 나타내고, 회색 막대는 pH 8에서 30 mM Tris-HCl에서 수행하였다는 것을 나타낸다. SDF-lα 및 DSCS 나노입자를 표시된 비율로 혼합하였으며, 이들 하전된 DS 40 ㎍ 당 SDF-lα(단위: ㎍)의 수치로서 표시되거나 DSCS 나노입자 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위(Gluc-SO3 -) 100 nmol 당 SDF-lα(단위: nmol)의 수치로서 표시된다.
도 4b는 혼입되지 않은 단백질(상층액(S))로부터 입자(펠릿(P))를 분리하기 위한 원심분리 이후에 혼입물에 대한 SDS 겔 분석(좌측 패널) 및 겔 밴드 내의 SDF-lα 함량에 대한 농도측정 정량화(우측 패널)를 보여주며, 이때 그래프는 3개의 제제로부터의 측정치에 대한 평균 ± SD를 나타내고, SDF-lα 부재 대조군과 비교하여 *p < 0.05이다.
도 5a는 얻어진 VEGF-혼입 입자의 입자 크기 및 제타 전위를 보여준다. VEGF 및 DSCS 나노입자를 표시된 비율로 혼합하였으며, 이는 VEGF의 양을 증가시키고 DSCS 나노입자의 고정량을 보다 낮은 비율(DS 40 ㎍ 당 10 내지 25 ㎍의 VEGF) 또는 그 반대로 보다 높은 VEGF/NP 비율(DS 40 ㎍ 당 20 내지 80 ㎍)로 유지함으로써 구현되었다.
도 5b는 VEGF 혼입물에 대한 SDS 겔 분석(좌측 및 중간 패널) 및 겔 밴드에 대한 농도측정 분석으로부터 수득된 혼입 효율(우측 패널)을 보여준다. 데이터는 3개의 별도의 제제의 측정치에 대한 평균 ± SD를 나타낸다. VEGF 및 DSCS 나노입자를 표시된 비율로 혼합하였으며, 이는 VEGF의 양을 증가시키고 DSCS 나노입자의 고정량을 보다 낮은 비율(DS 40 ㎍ 당 10 내지 25 ㎍의 VEGF) 또는 그 반대로 보다 높은 VEGF/NP 비율(DS 40 ㎍ 당 20 내지 80 ㎍)로 유지함으로써 구현되었다.
도 6은 SDS 겔 전기영동에 의한 분석(좌측) 이후에 밴드의 분석에 기초한 단백질 분포에 대해 농도측정 분석(우측)이 이루어진 펠릿(P) 및 상층액(S) 분획 내의 단백질 함량을 보여준다. 데이터는 3개의 별도의 혼입 반응물로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. 물(H2O) 또는 50% PBS(PBS)에서 단백질(20 ㎍의 SDF-lα 또는 VEGF 또는 50 ㎍의 BSA)을 DSCS 나노입자(40 ㎍의 하전된 DS를 함유함)와 20분 동안 혼합함으로써 혼입을 수행하였다. 이어서, 원심분리에 의해 입자를 혼입되지 않은 단백질로부터 분리하였다.
도 7은 혼입 효율의 평가를 위해 SDS 겔에 로딩된 펠릿(P) 및 상층액(S) 분획의 동일한 부피를 보여준다. 데이터는 1회의 혼입 실험으로부터 얻어진다. DSCS 나노입자 중의 단백질 및 하전된 당 단위(Gluc-SO3 -)의 표시된 몰비로 50% PBS에서 혼입 반응을 수행하였다. 반응 직후에 입자를 회전 침전시키고, 2.5% 만니톨에서 입자를 원래 부피로 재현탁하였다.
도 8a는 저캇 세포(Jurkat cell) 이동 검정에 의해 1 ng/㎖ 및 3 ng/㎖의 SDF-lα 농도에서 분석된 SDF-lα 및 SDFNP의 주화성 활성을 보여주는 막대그래프이다. SDF-lα(검은색 막대) 및 SDFNP(회색 막대) 샘플을 2.5% 만니톨에서 희석하고, 최대 24일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 표시된 시점에, 분취액을 취하여 이동 검정에 사용하였다. SDF-lα 저장 용액(4 ℃에서 보관됨)을 대조군으로서 사용하고, 3 ng/㎖의 SDF-lα 농도에서 이동 검정을 실시하였다. 데이터는 별도로 준비한 2개의 샘플로부터 4개의 분취액에 대한 평균 ± SD로서 나타나 있으며, 동일한 그룹 내의 SDF-lα 샘플과 비교하여 *p < 0.05이다.
도 8b는 SDF-lα 및 SDFNP의 열적 안정성에 대한 이동 검정을 보여준다. SDF-lα(검은색 막대) 및 SDFNP (회색 막대) 샘플을 2.5% 만니톨에서 희석하고 최대 24일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 표시된 시점에, 분취액을 취하여 이동 검정에 사용하였다. SDF-lα 저장 용액(4 ℃에서 보관됨)을 대조군으로서 사용하고, 3 ng/㎖의 SDF-lα 농도에서 이동 검정을 실시하였다. 데이터는 별도로 준비한 2개의 샘플로부터 4개의 분취액에 대한 평균 ± SD로서 나타나 있으며, 동일한 그룹 내의 SDF-lα 샘플과 비교하여 *p < 0.05이다.
도 9a는 표시된 농도에서 분석되고 비색 세포 증식 검정에 의해 측정된 폐동맥 내피세포 증식에 대한 VEGF 및 VEGF NP의 활성을 보여주는 막대그래프이다. OD490은 세포 증식 수준을 나타낸다. 4 ℃에서 보관된 VEGF 저장 용액을 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 증식 검정에서 3회 시행된 2개의 37 ℃ 배양 샘플에 대한 평균값을 나타낸다.
도 9b는 VEGF 및 VEGF NP의 열적 안정성을 보여주는 막대그래프이며, 여기서 상기 샘플을 2.5% 만니톨에서 55 ㎍/㎖까지 희석하고 37 ℃에서 배양하였다. 13일째 날, 배양 샘플로부터 분취액을 취하고, 이에 대해 내피세포 증식 검정을 실시하였다. 데이터는 3회 시행된 2개의 37 ℃ 배양 샘플에 대한 평균값을 나타낸다.
도 9c는 VEGF 및 VEGF NP의 안정성을 보여주는 막대그래프이며, 여기서 상기 샘플을 2.5% 만니톨에서 55 ㎍/㎖까지 희석하고 37 ℃에서 배양하였다. 20일째 날, 배양 샘플로부터 분취액을 취하고, 이에 대해 내피세포 증식 검정을 실시하였다. 데이터는 3회 시행된 2개의 37 ℃ 배양 샘플에 대한 평균값을 나타낸다.
도 10은 래트의 폐에서의 SDF-lα 및 SDFNP의 체류 시간을 보여주는 막대그래프이다. SDF-lα 및 SDFNP(12 ㎍의 SDF-lα 함량)를 래트의 폐 내로 연무 주입하였다. 표시된 시점에, 폐 조직을 채취하고 균질화하였다. ELISA에 의해 균질액 중의 SDF-lα의 농도를 결정하였다. 데이터는 4마리의 래트로부터 수득된 조직에 대해 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 11은 DSCS 나노입자의 형성을 개략적으로 보여주는 도면이다.
도 12는 가교(xNP) 전후에 덱스트란설페이트 및 키토산 나노입자(DSCS NP)의 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼을 보여준다. 데이터는 가교된 NP, 및 디카르복실산에 의해 도입된 카르복실기의 잔기에서 새로운 아미드 결합의 형성을 나타낸다.
도 13은 가교된 DSCS NP의 안정성을 보여주는 막대그래프이다. 가교된 NP, 즉 MA xNP, SA xNP 또는 TA xNP를 25 ℃에서 16시간 동안 10% FBS(RPMI) 이외에도 소 태아 혈청(FBS) 또는 RPMI 1640과 함께 배양하였다. 이어서, 입자를 세척하고, PBS에서 현탁하였으며, 이들의 크기 및 제타 전위를 결정하였다. 데이터에 따르면 가교된 DSCS NP가 완전 혈청 또는 세포 배양 배지에서 안정한 것으로 나타나 있다.
도 14는 가교된 DSCS NP(xNP) 내로의 단백질의 혼입을 보여주는 도표이다. PBS에서 표시된 양의 FGF-2, SDF-lα, BMP-2 또는 VEGF를 100 nmol의 하전된 글루코오스설페이트 단위(Gluc-SO3 -)를 함유하는 xNP와 20분 동안 혼합하였다. 원심분리에 의해 혼입되지 않은 단백질을 입자로부터 분리하고, 얻어진 펠릿(P) 및 상층액(S) 분획을 SDS 겔 상에서 분석하였다. 겔 밴드의 농도측정 분석에 기초하여 혼입 효율을 추정하였다. 이어서 단백질-혼입 xNP를 동결 건조하고 -80 ℃에 저장하였다. PBS에서 NP를 복원한 이후에 단백질-혼입 xNP의 입자 크기 및 제타 전위를 결정하였다. 데이터에 따르면 xNP에 대한 추정된 성장 인자의 혼입 효율은 95 내지 100%이고, xNP의 입자 크기 및 제타 전위는 표시된 단백질 로딩 비율에서 많이 변하지 않았으며, 혼입 및 저장 과정 전반에 걸쳐 입자는 안정한 것으로 나타나 있다.
도 15는 가교 이전(DSCS NP) 및 가교 이후(xNP)에 DSCS 나노입자에 대한 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼이다.
도 16a는 25 ℃에서 16시간 동안 배양한 이후 NaCl 용액 중의 DSCS NP 및 가교된 NP(xNP)의 입경을 보여주는 막대그래프이다. 데이터에 따르면 DSCS NP는 생리 식염수(0.15 M NaCl)에서 응집하는 반면, xNP는 최대 2 M의 NaCl 농도에 대해 저항성이 있다.
도 16b는 NaCl 용액 중의 DSCS NP 및 가교된 NP(xNP)의 다분산 지수를 보여주는 막대그래프이다. 다분산 지수에서의 상당한 증가는 0.15 M NaCl에서 배양한 이후에 DSCS NP에서 발견되었으며, 이는 입자 모집단의 심한 응집 및 불균질성을 나타낸다. 비교해보면, xNP는 높은 염 용액에서의 배양 도중에 자신의 균질성을 유지하였다.
도 17은 10% FBS(RPMI+) 및 소 태아 혈청(혈청)뿐만 아니라 완전 세포 배양 배지인 RPMI 1640 중의 DSCS NP 및 가교된 NP(xNP)의 안정성을 보여주는 막대그래프를 나타낸다. 데이터에 따르면 DSCS NP가 이들 배지에서 응집하지만 가교된 NP는 영향을 받지 않는 것으로 나타나 있다.
도 18은 가교된 DSCS NP 내로의 혼입 이전(SDF-1) 및 이후(SDF-xNP)에 SDF-1α의 주화성 활성을 보여주는 막대그래프이다. 데이터에 따르면 SDF-1α는 가교된 NP 내로의 혼입 이후에 유사하거나 약간 더 높은 활성을 나타내는 것으로 나타나 있다.
도 19는 가교된 DSCS NP 내로의 혼입 이전(VEGF) 및 이후(VEGF xNP)에 VEGF의 증식 활성을 보여주는 막대그래프이다. 데이터에 따르면 VEGF는 가교된 NP 내로의 혼입 전후에 유사한 활성을 갖는 것으로 나타나 있다.
도 20은 DSCS NP(패널 A) 또는 가교된 NP(xNP, 패널 B)을 연무 주입받은 래트로부터 수득된, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 폐 단편을 보여준다. 래트 둘 모두에는 폐 내피세포 손상 및 폐 고혈압을 유발하는 모노크로탈린(monocrotaline)이 주사되었으며, 줄기세포 요법용 면역 억제제로서 사이클로스포린을 투여하였다. 이러한 엄격한 조건 하에 DSCSNP는 심각한 폐 염증/섬유증을 유발하는 반면, xNP는 무해하다.
본 발명의 입자
음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 제공하며, 이때 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자의 외피(표면)는 양으로 하전된 다당류를 포함하지 않는다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 제공하며, 이때 입자의 외피(표면)는 음으로 하전된 다당류를 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자의 외피(표면)는 양으로 하전된 다당류를 포함하지 않는다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 코어; 및 음으로 하전된 다당류를 포함하는 외피(표면)를 포함하는 입자를 제공한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자의 외피(표면)는 양으로 하전된 다당류를 포함하지 않는다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
치료용 입자
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하고, 적어도 하나의 치료용 단백질(예를 들어, 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있는 치료용 단백질)을 추가로 포함하는 치료용 입자를 제공하며, 이때 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 외피(예를 들어, 치료용 입자의 표면)는 양으로 하전된 다당류를 포함하지 않는다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 치료용 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 치료용 입자를 제공하며, 이때 외피(예를 들어, 치료용 입자의 표면)는 음으로 하전된 다당류를 포함하고, 적어도 하나의 치료용 단백질은 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 외피(예를 들어, 치료용 입자의 표면)는 양으로 하전된 다당류를 포함하지 않는다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 치료용 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 이들 실시형태의 기타 양태에서, 치료용 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 코어; 및 음으로 하전된 다당류 및 적어도 하나의 치료용 단백질을 포함하는 외피(예를 들어, 치료용 입자 표면)를 포함하는 치료용 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 정전기적 상호작용을 통해 양으로 하전된 다당류에 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류의 양은 양으로 하전된 다당류의 양전하를 완전히 중화시키기에 충분하다.
본 발명의 입자(예를 들어, 치료용 입자)의 특성
도 11을 참고하면, 음으로 하전된 다당류(예를 들어, 덱스트란설페이트)를 포함하는 용액이 양으로 하전된 다당류를 포함하는 용액과 혼합되는 경우, 반대로 하전된 다당류 분자들은 (예를 들어, 정전기적 상호작용을 통해) 반응하여 코어 및 외피(입자 표면)를 포함하는 입자를 형성한다. 양으로 하전된 다당류는 입자의 코어 내에 존재하고, 과량의 양으로 하전된 다당류 내에 있는 음으로 하전된 다당류는 코어 및 입자의 외피(표면)에 존재한다. 이는, 양으로 하전된 다당류와 반응하는 음으로 하전된 다당류 분자의 일부만이 입자의 코어 내에 잔류하는 반면, 양으로 하전된 다당류와 반응하지 않는 음으로 하전된 다당류 분자의 일부는 입자의 외피(표면)에 위치하기 때문이다. 일부 실시형태에서, 입자의 외피(표면)는 반응하지 않은 음으로 하전된 다당류를 포함한다. 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하며, 이때 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 상기 얻어진 입자는 치료용 단백질(예를 들어, 본원에 기술된 치료용 단백질들 중 임의의 하나)와 추가로 반응하여 본원에 기술된 바와 같은 치료용 입자를 형성한다. 치료용 단백질은 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 비공유결합으로) 입자 표면 상의 음으로 하전된 다당류의 잔기와 결합하고, 치료용 입자의 외피(표면)에 잔류한다. 일부 실시형태에서, 치료용 입자의 코어는 치료용 단백질을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 입자의 외피(표면)는 치료용 단백질의 총량에 대해 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%를 차지한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 입자 또는 치료용 입자는 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 크기(예를 들어, 직경)은 약 300 ㎚ 내지 약 600 ㎚이거나, 약 350 ㎚ 내지 약 500 ㎚이다. 일부 실시형태에서, 직경은 약 10 ㎚ 내지 약 800 ㎚이거나, 약 50 ㎚ 내지 약 600 ㎚이거나, 약 60 ㎚ 내지 약 550 ㎚이다. 일부 실시형태에서, 직경은 약 50 ㎚, 약 100 ㎚, 약 150 ㎚, 약 200 ㎚, 약 250 ㎚, 약 300 ㎚, 약 350 ㎚, 약 400 ㎚, 약 450 ㎚, 약 500 ㎚, 약 550 ㎚, 약 600 ㎚, 약 650 ㎚ 또는 약 700 ㎚이다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 1:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 7:1 또는 약 3:1 내지 약 5:1이다. 일부 실시형태에서, 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1 또는 약 5:1이다. 일부 실시형태에서, 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 4:1이다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 음으로 하전된 다당류의 검출 가능한 양은 입자의 입자 제조용으로 사용되는 총량에 대해 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%이다.
일부 실시형태에서, 입자는 음으로 하전되고, 제타 전위는 약 -35 mV 내지 약 -50 mV 또는 약 -40 mV 내지 약 -45 mV이다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 약 -10 mV 내지 약 -100 mV, 약 -20 mV 내지 약 -100 mV, 약 -20 mV 내지 약 -80 mV, 약 -30 mV 내지 약 -70 mV, 또는 약 -40 mV 내지 약 -60 mV이다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 약 -10 mV, 약 -20 mV, 약 -30 mV, 약 -40 mV, 약 -45 mV 또는 약 -50 mV이다.
일부 실시형태에서, 모집단, 예를 들어 조성물 내에 존재하는 입자는 실질적으로 동일한 형상 및/또는 크기를 가질 수 있다(즉, 이들은 "단분산성"임). 예를 들어, 입자는 입자의 약 5% 이하 또는 약 10% 이하가 입자의 평균 직경보다 큰 약 10% 초과의 직경을 갖는 분포를 가질 수 있고, 일부 경우에 약 8% 이하, 약 5% 이하, 약 3% 이하, 약 1% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.03% 이하 또는 약 0.01% 이하가 입자의 평균 직경보다 큰 약 10% 초과의 직경을 갖는 분포를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자의 25% 이하의 직경은 평균 입경의 150% 초과, 100% 초과, 75% 초과, 50% 초과, 25% 초과, 20% 초과, 10% 초과 또는 5% 초과로 평균 입경이 달라진다. 종종 대부분의 입자가 유사한 특성을 갖도록 크기, 형상 및/또는 조성의 측면에서 비교적 균일한 입자의 모집단을 생성하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 이용하여 생성된 입자의 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 평균 직경 또는 최대 치수의 5%, 10% 또는 20% 이내에 있는 직경 또는 최대 치수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자의 모집단은 크기, 형상 및/또는 조성에 대해 균질하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 다분산 지수는 약 0.01 내지 약 0.5, 약 0.05 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.4, 또는 약 0.1 내지 약 0.3이다. 일부 실시형태에서, 다분산 지수는 약 0.05, 약 0.1, 약 0.15, 약 0.2, 약 0.25 또는 약 0.3이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 입자 중의 음으로 하전된 다당류에 비공유결합으로 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 헤파린 결합 도메인을 포함하고, 헤파린 결합 도메인을 통해 입자 중의 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비공유결합"이란 용어는 2개 이상의 성분들 사이의 상호작용을 지칭하며, 이때 성분들 사이의 결합은 비공유결합이다(즉, 하나의 성분의 원자가 다른 성분의 원자와 전자쌍을 공유하지 않음). 비공유결합으로는 수소 결합, 정전기 효과, π-효과, 소수성 효과 또는 반데르발스 힘과 같은 약한 결합을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질과 음으로 하전된 다당류 사이의 비공유 상호작용은 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용 및 반데르발스 힘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 입자들 중 임의의 하나는 -SO3H 작용기를 포함하는 단당류 단위를 포함하는 음으로 하전된 다당류, 및 -NH2 작용기를 포함하는 단당류 단위를 포함하는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 입자들 중 임의의 하나는 -SO3H 작용기를 갖는 글리칸 및 -NH2 작용기를 포함하는 폴리글루코사민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 입자들 중 임의의 하나는 덱스트란설페이트(예를 들어, 덱스트란 황산나트륨 염) 및 키토산을 포함한다.
음으로 하전된 다당류
음으로 하전된 다당류는 임의의 개수의 단당류 잔기를 포함하는 천연 또는 합성 다당류(임의의 비환상 및/또는 환상 형태 및 임의의 가능한 입체이성질체를 포함함)일 수 있으며, 이때 상기 다당류는 알로오스, 알트로오스, 아라비노오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 프룩토오스, 푸코사민, 푸코오스, 갈락토사민, 갈락토오스, 글루코사민, 글루코사미니톨, 글루코오스, 글리세르알데히드, 글리세롤, 글리세론, 굴로오스, 이도오스, 릭소오스, 만노사민, 만노오스, 사이코오스, 퀴노보오스, 퀴노보사민, 람니톨, 람노사민, 람노오스, 리보오스, 리불로오스, 소르보오스, 타가토오스, 탈로오스, 트레오스, 자일로오스, 크실룰로오스, 글루쿠론산 및 이의 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 중의 단당류 잔기는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, N-아세틸글루코사민, 글루쿠론산, 글루코사민, 시알산, 이두론산, 갈락토사민 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 중성 pH에서 산성을 띄고 있다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 생리 pH에서 음으로 하전되는 작용기, 예를 들어 산을 포함하며, 이때 산으로는 카르복실산(카르복실산염), 설폰산(설폰산염), 황산염, 인산염 및 포스폰산염을 들 수 있다. 즉, 다당류 내의 임의의 개수의 단당류 단위는 -C(=O)OH, -S(=O)2(OH)(즉, -SO3H) 또는 -P(=O)(OH)2 기로 유도체화될 수 있다. (일부 실시형태에서, 이러한 기들 중 임의의 하나는 생리 pH에서 음으로 하전된다). 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 헤파린, 황산헤파란, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라탄 또는 히알루론산과 같은 글리코사미노글리칸이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트(예를 들어, 덱스트란 황산나트륨 염, CAS 등록 번호: 9011-18-1)와 같은 글리칸이다.
양으로 하전된 다당류
양으로 하전된 다당류는 임의의 개수의 단당류 잔기를 포함하는 천연 또는 합성 다당류(임의의 비환상 및/또는 환상 형태 및 임의의 가능한 입체이성질체를 포함함)일 수 있으며, 이때 상기 다당류는 알로오스, 알트로오스, 아라비노오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 프룩토오스, 푸코사민, 푸코오스, 갈락토사민, 갈락토오스, 글루코사민, 글루코사미니톨, 글루코오스, 글리세르알데히드, 글리세롤, 글리세론, 굴로오스, 이도오스, 릭소오스, 만노사민, 만노오스, 사이코오스, 퀴노보오스, 퀴노보사민, 람니톨, 람노사민, 람노오스, 리보오스, 리불로오스, 소르보오스, 타가토오스, 탈로오스, 트레오스, 자일로오스, 크실룰로오스, 글루쿠론산 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류 중의 단당류 잔기는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, N-아세틸글루코사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 갈락토사민, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 순 양전하는 양으로 하전된 다당류에 포함되는 염기성기(예를 들어, 아민, 암모늄기 또는 구아니디늄기) 에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 생리 pH에서 양으로 하전되는 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 순 양전하는 다당류 중의 단량체성 단당류 단위가 유도체화되는 아민 및/또는 암모늄기에 의해 제공된다. 양으로 하전된 다당류 내의 임의의 개수의 단당류 단위는 생리 pH에서 양으로 하전될 수 있는 NH2 기를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 중성 pH에서 염기성을 띄고 있다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 키토산(예를 들어, CAS 등록 번호: 9012-76-4 참조)과 같은 폴리글루코사민이다.
일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류는 가교된다. 가교제의 적합한 예로는 옥살산, 말론산, 말산(MA), 숙신산(SA), 글루타르산(GA), 타르타르산(TA), 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바신산, 브라실산 또는 탑식산(thapsic acid)과 같은 디카르복실산을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교는, 예를 들어 양으로 하전된 다당류 중의 아민기와 디카르복실산 중의 카르복실기 사이의 아미드 결합의 형성을 야기한다. 아미드 결합에 의해 입자의 코어에서 다당류의 당류 단위가 함께 가교된다. 일부 실시형태에서, 입자의 코어 중의 다당류의 가교는 고분자 전해질 복합체의 특성으로 인해 생리 식염수 또는 체액에서 응집체를 형성할 가교되지 않은 입자와 비교하여 입자의 염 안정성이 증가하게 된다.
치료용 단백질
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 항체, 호르몬, 막관통 단백질, 성장 인자, 사이토카인, 효소 또는 구조 단백질이다.
일부 실시형태에서, 단백질 치료제는, 예를 들어 그 개시내용이 전체가 본원에서 참고로 포함되는 문헌[Leader et al., Nature Reviews 2008, 7, 21~39]에 개시된 단백질 치료제들 중 임의의 하나이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 헤파린 결합 단백질이다.
헤파린 결합 단백질은, 흔히 0.15 M 이상의 NaCl에서 단백질을 헤파린-세파로오스 수지에 결합시킴으로써 증명된, 헤파린에 대한 이들의 높은 친화도에 의해 한정된다. 여러 단백질, 특히 세포내 신호전달을 매개하는 단백질이 이러한 범주에 포함된다(예를 들어, 문헌[Ori A, et al. J. Biol. Chem. 2011, 286 (22), 19892~19904] 참조). 대부분의 이들 단백질의 생물학적 리간드는 황산헤파란 또는 황산화 글리코사미노글리칸이며, 이들은 세포 표면 상에, 그리고 세포외 기질 내에 존재한다. 단백질의 1차 또는 3차 구조 중의 헤파린 결합 부위 또는 도메인은 헤파린 결합을 담당하고 있으며, 이는 종종 정전기적 상호작용을 통해 헤파린에 결합하는 일군의 양으로 하전된 아미노산 잔기(Lys, Arg 및 His)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Xu D, Esko JD. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu. Rev. Biochem. 2014; 83: 129~157]; 및 문헌[Gallagher J. Fell-Muir Lecture: Heparan sulphate and the art of cell regulation: a polymer chain conducts the protein orchestra. Int J Exp Pathol. Aug 2015; 96(4): 203~231] 참조).
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 헤파린 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 헤파린 결합 도메인은 치료용 단백질에서 기원한다. 기타 실시형태에서, 헤파린 결합 도메인은 치료용 단백질의 재조합 생성 중에 치료용 단백질에 표지된다. 헤파린 결합 도메인은, 예를 들어 그 개시내용이 본원에서 참고로 포함되는 문헌[Ori A et al. J. Biol. Chem. 2011, 286 (22), 19892~19904]에 기술되어 있는 헤파린 결합 단백질에서 발견되는 도메인들 중 임의의 하나일 수 있다. 인간에서는 다수의 성장 인자, 사이토카인 및 세포간 연락을 매개하는 단백질을 포함한 435개 초과의 헤파린 결합 단백질이 존재한다. 헤파린 결합 부위가 단백질 합성 동안에 펩티드 서열의 말단에 표지되는 경우에 기타 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 백신)은 잠재적으로는 DSCS NP 및 xNP에 의해 전달될 수도 있다. 헤파린 결합 도메인의 표지는 당업계에 공지된 재조합 단백질의 생성을 위한 절차들 중 임의의 하나에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 인터페론(예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마), 콜로니 자극 인자(예를 들어, 과립구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)) 및 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP)과 같은 사이토카인이다. 인터페론은 인터페론-αcon1, 인터페론-알파2a, 인터페론-α2b, 인터페론-αn3, 인터페론-β1a 또는 인터페론-γ1b일 수 있다. 사이토카인은 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-10, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-15, 인터류킨-17, 인터류킨-18, 인터류킨-22, 인터류킨-23 및 인터류킨-35와 같은 인터류킨일 수 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 인터페론, 콜로니 자극 인자, 흉선 기질상 림포포이에틴 및 인터류킨으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 인슐린 유사 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGFR), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)로부터 선택되는 성장 인자이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 아밀린, 항뮬러관 호르몬(
Figure 112019020693981-pct00001
), 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀, 엔도텔린, 엔케팔린, 에리트로포이에틴(EPO), 다르베포에틴(darbepoetin), 여포 자극 호르몬, 갈라닌(gallanin), 가스트린(gastrin), 그렐린(ghrelin), 글루카곤, 생식선 자극호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 헵시딘(hepcidin), 인간 융모성 생식선 자극호르몬, 성장 호르몬(GH), 인간 성장 호르몬(hGH), 인히빈(inhibin), 인슐린, 이소판 인슐린, 인슐린 디테미르(insulin detemir), 인슐린 글라진, 프람린타이드(pramlintide), 프람린타이드 아세테이트, 인슐린 유사 성장 인자, 렙틴, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 모틸린(motilin), 오렉신(orexin), 옥시토신, 췌장 폴리펩티드, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관 작동성 장 펩티드, 소마토트로핀(somatotropin), 메카세르민(mecasermin), 메카세르민 린파베이트(mecasermin rinfabate), 인간 여포 자극 호르몬, 루트로핀(lutropin), 테리파라타이드(teriparatide), 엑세나타이드(exenatide), 옥트레오타이드(octreotide), 디보테르민-α(dibotermin-α), 골형성 단백질 7, 케라틴세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 트립신, 네시리타이드(nesiritide) 및 바소프레신과 같은 폴리펩티드 호르몬이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 항트롬빈 III, 단백질 C, 드로트레코진-α(drotrecogin-α), 필그라스팀(filgrastim), 페그필그라스팀(pegfilgrastim), 사그라모스팀(sargramostim), 레피루딘(Lepirudin), 비발리루딘(Bivalirudin) 또는 오프렐베킨(oprelvekin)이다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 보툴리눔 독소 A형, 보툴리눔 독소 B형이다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 아타시셉트(atacicept), 아바타셉트(abatacept), 애플리버셉트(aflibercept), 알레파셉트(alefacept), 벨라타셉트(belatacept), 에타너셉트(etanercept), 소타터셉트(sotatercept), 로미플로스팀(romiplostim) 또는 릴로나셉트(rilonacept)이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 효소이다. 일부 실시형태에서, 효소는 아갈시다제 베타, 이미글루세라아제, 벨라글루세라아제 알파, 탈리글루세라아제, 알글루코시다아제 알파, 라로니다아제, 이두르설파아제, β-글루코-세레브로시다아제, 알글루코시다아제-α, 라로니다아제, α-L-이두로니다아제, 이두르설파아제, 이두로네이트-2-설파타아제, 갈설파아제, 아갈시다제-β, 인간 α-갈락토시다아제 A, α-1-프로테이나아제, α-1-프로테이나아제 억제제, 췌장 효소, 락타아제, 글리코시드 하이드롤라아제(예를 들어, 리소자임), 리파아제, 아밀라아제, 프로테아제, 아데노신 데아미나아제, 알테플라아제, 레테플라아제, 테넥테플라아제, 유로키나제, 콜라게나아제, 인간 데옥시리보뉴클레아제 I, 도르나제-α, 히알루로니다아제, 파파인, 아스파라기나아제(예를 들어, L-아스파라기나아제), 라스부리카아제, 스트렙토키나아제, 아니스트레플라아제 또는 갈설파아제이다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 알부민, 인간 알부민 또는 면역글로불린이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 치료용 항체를 포함하는 항체(예를 들어, 단클론성 항체, 예를 들어 이중 특이성의 단클론성 항체)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 암을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 아바고보맙(abagovomab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아푸투주맙(afutuzumab), 알라시주맙 페골(alacizumab pegol), 알투모맙 펜테테이트(altumomab pentetate), 아마툭시맙(amatuximab), 아나투모맙 마페나톡스(anatumomab mafenatox), 아폴리주맙(apolizumab), 아르시투모맙(arcitumomab), 바비툭시맙(bavituximab), 베크투모맙(bectumomab), 벨리무맙(belimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 비바투주맙 메르탄신(bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 칸투주맙 메르탄신(cantuzumab mertansine), 칸투주맙 라브탄신(cantuzumab ravtansine), 카프로맙 펜데티드(capromab pendetide), 세툭시맙(cetuximab), 시타투주맙 보가톡스(citatuzumab bogatox), 식수투무맙(cixutumumab), 클리바투주맙 테트락세탄(clivatuzumab tetraxetan), 다세투주맙(dacetuzumab), 뎀시주맙(demcizumab), 데투모맙(detumomab), 드로지투맙(drozitumab), 에크로멕시맙(ecromeximab), 에쿠리주맙(eculizumab), 엘로투주맙(elotuzumab), 엔시툭시맙(ensituximab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에타라시주맙(etaracizumab), 파를레투주맙(farletuzumab), 피기투무맙(figitumumab), 플란보투맙(flanvotumab), 갈릭시맙(galiximab), 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 지렌툭시맙(girentuximab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 임가투주맙(imgatuzumab), 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 로르보투주맙 메르탄신(lorvotuzumab mertansine), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오레고보맙(oregovomab), 파니투무맙(panitumumab), 펨투모맙(pemtumomab), 페르투주맙(pertuzumab), 타카투주맙 테트락세탄(tacatuzumab tetraxetan), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 토투무맙(totumumab) 또는 잘루투무맙(zalutumumab)).
일부 실시형태에서, 항체는 염증성 질병 또는 병태를 치료하는데 유용하다(예를 들어, 아달리무맙(adalimumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 카나키누맙, 세르톨리주맙, 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 다클리주맙(daclizumab), 무로모납(muromonab), 에팔리주맙(efalizumab), 폰톨리주맙(fontolizumab), 골리무맙(golimumab), 인플릭시맙(infliximab), 메폴리주맙(mepolizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 루플리주맙(ruplizumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 자놀리무맙(zanolimumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 벨리무맙, 오테릭시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙, 오크렐리주맙(ocrelizumab), 에프라투주맙, 에쿠리주맙 또는 브리아키누맙(briakinumab)). 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 전염병을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 엔푸비르티드(enfuvirtide)). 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 압식시맙(abciximab), 페그비소만트(pegvisomant), 살모사과 다가 면역 Fab(crotalidae polyvalent immune Fab), 디곡신 면역 혈청 Fab, 라비니주맙(ranibizumab) 또는 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox)이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 골형성 단백질-2(BMP-2), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 리소자임으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 온코스타틴 M(OSM) 또는 섬모 향신경성 인자(CNTF)이다. 실시형태의 일부 양태에서, 치료용 입자는 황반 변성을 치료하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 치료용 입자는 SDF 및 VEGF 치료용 단백질을 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자는 폐 고혈압을 치료하는데 유용하다. 실시형태에서, 입자는 줄기세포와 함께 개체에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질에 대한 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류(예를 들어, 입자 표면 상의 음으로 하전된 다당류) 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위 100 nmol 당 치료용 단백질 약 0.25 nmol 내지 약 3 nmol이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류(예를 들어, 입자 표면 상의 음으로 하전된 다당류) 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위 100 nmol 당 약 0.01 nmol 내지 약 100 nmol, 약 0.1 nmol 내지 약 50 nmol, 약 0.15 nmol 내지 약 40 nmol, 약 0.2 nmol 내지 약 30 nmol, 약 0.25 nmol 내지 약 20 nmol, 약 0.25 nmol 내지 약 10 nmol, 약 0.25 nmol 내지 약 5 nmol, 약 0.25 nmol 내지 약 2.5 nmol이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류(예를 들어, 입자 표면 상의 음으로 하전된 다당류) 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위에 대해 약 0.1 nmol, 약 0.15 nmol, 약 0.2 nmol, 약 0.25 nmol, 약 0.5 nmol, 약 0.75 nmol, 약 1 nmol, 약 1.25 nmol, 약 1.5 nmol, 약 2 nmol, 약 2.5 nmol, 약 3 nmol, 약 3.5 nmol, 약 4 nmol, 약 5 nmol, 약 10 nmol, 약 20 nmol, 약 50 nmol 또는 100 nmol이다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질에 대한 입자의 로딩 용량은 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위의 총량에 대해 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만 또는 약 10% 미만이다.
일부 실시형태에서, 치료용 입자에 대한 치료용 단백질의 비율은 치료용 단백질의 특징, 치료용 입자의 특성 및 응용에 의존한다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 치료용 입자의 총 중량에 대해 약 0.01중량% 내지 약 99중량% 범위로 로딩된다. 치료용 단백질은 약 1중량% 내지 약 80중량%, 약 1중량% 내지 약 75중량%, 약 1중량% 내지 약 70중량%, 약 1중량% 내지 약 65중량%, 약 1중량% 내지 약 60중량%, 약 1중량% 내지 약 55중량%, 약 1중량% 내지 약 50중량%, 약 1중량% 내지 약 45중량%, 약 1중량% 내지 약 40중량%, 약 1중량% 내지 약 35중량%, 약 1중량% 내지 약 30중량%, 약 1중량% 내지 약 25중량%, 약 1중량% 내지 약 20중량%, 약 1중량% 내지 약 15중량%, 약 1중량% 내지 약 10중량% 및/또는 약 1중량% 내지 약 5중량% 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, SDF-1α에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트(예를 들어, 입자 표면 상의 덱스트란설페이트)의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 3 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, VEGF에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트(예를 들어, 입자 표면 상의 덱스트란설페이트)의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 0.6 nmol 내지 약 1 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 골형성 단백질-2(BMP-2)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, BMP-2에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트(예를 들어, 입자 표면 상의 덱스트란설페이트)의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 0.5 nmol 내지 약 1 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, FGF-2에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트(예를 들어, 입자 표면 상의 덱스트란설페이트)의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 2 nmol이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 리소자임이고, 음으로 하전된 다당류는 덱스트란설페이트이고, 리소자임에 대한 입자의 로딩 용량은 덱스트란설페이트(예를 들어, 입자 표면 상의 덱스트란설페이트)의 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 약 1 nmol 내지 약 2 nmol이다.
일부 실시형태에서, 입자는 적어도 2개의 치료용 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자는 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α) 및 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함한다.
유용한 치료용 단백질의 추가적인 예는 그 전문 각각이 본원에서 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제8,349,910호; 및 제8,043,833호; 미국 출원 제2013/0195888호; 및 제2007/0092486호; 및 PCT WO 2014/130064에서 찾아볼 수 있다.
과정에 의해 제조되는 입자
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법들 중 임의의 하나에 의해 제조되는, 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법들 중 임의의 하나에 의해 제조되는, 음으로 하전된 다당류, 양으로 하전된 다당류 및 음으로 하전된 다당류에 결합되어 있는 치료용 단백질을 포함하는 치료용 입자를 제공한다.
본 발명의 입자를 제조하는 방법
음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자
일부 실시형태에서, 본 발명은 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 제조하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은,
xii) 음으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 용액을 수득하는 단계;
xiii) 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제2 용액을 수득하는 단계; 및
xiv) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 입자를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다(예를 들어, 양으로 하전된 다당류의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%가 입자의 코어 내에 있음).
일부 실시형태에서, 제1 용액은 수용액이다.
일부 실시형태에서, 제1 수용액 중의 수성 용매는 물이다.
일부 실시형태에서, 제1 용액 중의 음으로 하전된 다당류의 농도는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖, 약 0.25 ㎎/㎖ 내지 약 8 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖, 또는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 제1 용액 중의 음으로 하전된 다당류의 농도는 약 0.5 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖, 약 1.5 ㎎/㎖ 또는 약 2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 제1 용액 중의 음으로 하전된 다당류의 농도는 약 1 ㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액은 수용액이다.
일부 실시형태에서, 제2 수용액 중의 수성 용매는 물 중의 약 0.2% 내지 약 0.5% 아세트산이다. 일부 실시형태에서, 제2 수용액 중의 수성 용매는 물 중의 약 0.2% 아세트산이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액 중의 양으로 하전된 다당류의 농도는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖, 약 0.25 ㎎/㎖ 내지 약 8 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖, 또는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 제2 용액 중의 양으로 하전된 다당류의 농도는 약 0.5 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖, 약 1.5 ㎎/㎖ 또는 약 2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 제2 용액 중의 양으로 하전된 다당류의 농도는 약 1 ㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 제2 용액으로부터의 양으로 하전된 다당류에 대한 제1 용액으로부터의 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 1:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 8:1, 또는 약 3:1 내지 약 5:1이다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1 또는 약 5:1이다. 일부 실시형태에서, 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 약 4:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 제2 용액을 제1 용액에 첨가함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 제1 용액을 제2 용액에 첨가함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 400 rpm 내지 약 1200 rpm, 약 500 rpm 내지 약 1100 rpm, 또는 약 600 rpm 내지 약 1000 rpm으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 400 rpm, 약 600 rpm, 약 800 rpm 또는 약 1000 rpm으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 800 rpm으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서 제1 용액과 제2 용액을 혼합한 후, 금속염의 수용액을 혼합물에 첨가한다. 일부 실시형태에서, 금속은 칼슘, 마그네슘, 바륨, 아연 및 베릴륨으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속은 칼슘이다. 일부 실시형태에서, 금속은 아연이다. 일부 실시형태에서, 금속염은 CaSO4, CaCl2, MgCl2, MgSO4, ZnCl2 및 ZnSO4로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속염은 ZnSO4이다.
일부 실시형태에서, 금속염의 수용액 중의 금속염의 농도는 약 0.01 M 내지 약 1 M, 약 0.05 M 내지 약 0.5 M, 또는 약 0.1 M 내지 약 0.3 M이다. 일부 실시형태에서, 금속염의 수용액 중의 ZnSO4의 농도는 약 0.01 M 내지 약 1 M, 약 0.05 M 내지 약 0.5 M, 또는 약 0.1 M 내지 약 0.3 M이다.
일부 실시형태에서, 금속염의 수용액 중의 ZnSO4의 농도는 약 0.05 M, 약 0.1 M, 약 0.15 M, 약 0.2 M, 약 0.25 M 또는 약 0.3 M이다. 일부 실시형태에서, 금속염의 수용액 중의 ZnSO4의 농도는 약 0.2 M이다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 금속염의 중량비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 8:1 내지 약 1:2, 약 6:1 내지 약 1:1, 약 4:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1 내지 약 1:1이다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 ZnSO4의 중량비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 8:1 내지 약 1:2, 약 6:1 내지 약 1:1, 약 4:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1 내지 약 1:1이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 ZnSO4의 중량비는 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1.5:1, 약 1.4:1, 약 1.3:1, 약 1.2:1 또는 약 1:1이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 ZnSO4의 중량비는 약 1.3:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)의 혼합물에 금속염의 수용액을 첨가한 후, 당 알코올(예를 들어, 만니톨, 에리트리톨, 수크로오스, 락토오스, 소르비톨, 락티톨, 글리세롤, 크실리톨, 이노시톨 또는 볼레미톨)의 수용액을 혼합물에 첨가한다.
일부 실시형태에서, 당 알코올은 만니톨이다.
일부 실시형태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 1중량% 내지 약 50중량%, 약 2중량% 내지 약 40중량%, 약 3중량% 내지 약 30중량%, 또는 약 5중량% 내지 약 20중량%이다. 일부 실시형태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 1중량%, 약 2중량%, 약 3중량%, 약 5중량%, 약 10중량%, 약 15중량%, 약 20중량%, 약 25중량% 또는 약 30중량%이다. 일부 실시형태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 15중량%이다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 당 알코올의 중량비는 약 200:1 내지 약 1:1, 약 150:1 내지 약 10:1, 약 100:1 내지 약 20:1, 또는 약 90:1 내지 약 50:1이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 당 알코올의 중량비는 약 100:1, 약 90:1, 약 75:1, 약 60:1, 약 50:1 또는 약 30:1이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류에 대한 당 알코올의 중량비는 약 75:1이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합이 이루어진 후에 당 알코올의 용액에서 상기 얻어진 고형분을 원심분리하고 현탁하여 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 당 알코올은 만니톨이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 0.1중량% 내지 약 25중량%, 약 0.5중량% 내지 약 20중량%, 약 1중량% 내지 약 15중량%, 약 2중량% 내지 약 10중량%, 또는 약 3중량% 내지 약 7중량%이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 1중량%, 약 2중량%, 약 3중량%, 약 4중량%, 약 4중량%, 약 6중량% 또는 약 10중량%이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 수용액 중의 당 알코올의 농도는 약 5중량%이다.
일부 실시형태에서, 디카르복실산과 입자의 코어 중의 키토산을 공유결합으로 가교시킴으로써 입자를 제조한다. 일부 실시형태에서, 입자의 코어 내에 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 대략 중성 pH에서 수성 완충제에서 현탁한다. 수성 완충제의 적합한 예로는 pH가 약 7.0인 HEPES[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산] 완충수를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자의 현탁액은 짧은 사슬 디카르복실산의 용액과 혼합된다. 디카르복실산의 적합한 예로는 글루타르산, 말산, 숙신산 및 타르타르산을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액 중의 디카르복실산의 농도는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 일부 실시형태에서, 가교 반응은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC; 예를 들어 약 20 내지 약 100 mM의 농도) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS; 예를 들어 약 20 내지 약 100 mM의 농도)의 존재 하에 수행된다. 가교 조건의 적합한 예는 입자를 약 25 ℃에서 약 16시간 동안 반응시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코어 내에 가교된 양으로 하전된 다당류를 갖는 입자를 약 15분 동안 약 15,000 x g로 원심분리하여 침전시키고, DPBS로 세척한다. 일부 실시형태에서, 염-저항성 선택을 위해 가교 입자를 3x DPBS(3배의 높은 농도의 DPBS)에서 추가로 현탁한다. 이들 실시형태에서, 3시간 배양 이후, 현탁액 중의 응집체를 약 15분 동안 약 200 x g로 원심분리하여 침전시키고, 나머지 입자를 약 15분 동안 약 15,000 x g로 원심분리하여 침전시킨다. 일부 실시형태에서, 이어 입자를 DPBS에서 현탁하고, 기공 크기가 0.22마이크로미터인 PVDF 막을 통해 여과한다. 일부 실시형태에서, 여과는 용액의 멸균 및 최종 입자 크기 선택을 목적으로 수행된다.
치료용 입자
일부 실시형태에서, 본 발명은 치료용 입자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
i) 치료용 단백질을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
ii) 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류(본원에 기술된 바와 같음)를 포함하는 입자를 포함하는 제1 현탁액을 수득하는 단계; 및
iii) 치료용 단백질의 용액과 제1 현탁액을 혼합하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함한다(예를 들어, 양으로 하전된 다당류의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%는 입자의 코어 내에 있음).
일부 실시형태에서, 제1 용액은 수성 용매를 포함한다.
일부 실시형태에서, 수성 용매는 물 및 완충 식염수로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 완충 식염수는 50% 둘베코 인산 완충 식염수(PBS)이다.
일부 실시형태에서, 용액 중의 치료용 단백질의 농도는 약 0.1 nmol/㎖ 내지 약 200 nmol/㎖, 약 0.2 nmol/㎖ 내지 약 150 nmol/㎖, 약 0.3 nmol/㎖ 내지 약 100 nmol/㎖, 약 0.5 nmol/㎖ 내지 약 80 nmol/㎖, 약 0.75 nmol/㎖ 내지 약 60 nmol/㎖, 약 1 nmol/㎖ 내지 약 60 nmol/㎖, 또는 약 2 nmol/㎖ 내지 약 30 nmol/㎖이다. 일부 실시형태에서, 용액 중의 치료용 단백질의 농도는 약 2 nmol/㎖ 내지 약 30 nmol/㎖이다. 일부 실시형태에서, 용액 중의 치료용 단백질의 농도는 약 0.1 nmol/㎖, 약 0.2 nmol/㎖, 약 0.3 nmol/㎖, 약 0.5 nmol/㎖, 약 0.75 nmol/㎖, 약 1 nmol/㎖, 약 1.25 nmol/㎖, 약 1.5 nmol/㎖, 약 1.75 nmol/㎖, 약 2 nmol/㎖, 약 3 nmol/㎖, 약 5 nmol/㎖, 약 7.5 nmol/㎖, 약 10 nmol/㎖, 약 15 nmol/㎖, 약 20 nmol/㎖, 약 25 nmol/㎖, 약 30 nmol/㎖, 약 40 nmol/㎖ 또는 약 50 nmol/㎖이다.
일부 실시형태에서, 제1 현탁액은 수성 용매를 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 수성 용매는 당 알코올(예를 들어, 만니톨, 에리트리톨, 수크로오스, 락토오스, 소르비톨, 락티톨, 글리세롤, 크실리톨, 이노시톨 또는 볼레미톨), 특히 만니톨을 약 0.1중량% 내지 약 25중량%, 약 0.2중량% 내지 약 20중량%, 약 0.5중량% 내지 약 10중량%, 또는 약 1중량% 내지 약 5중량%의 농도, 또는 약 0.5중량%, 약 1중량%, 약 1.5중량%, 약 2중량%, 약 2.5중량%, 약 3중량%, 약 4중량% 또는 약 5중량%의 농도로 포함한다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는, 입자 중의 단당류 단위에 대한 용액 중의 치료용 단백질에 대한 몰비는 약 0.01:100 내지 약 100:100, 약 0.05:100 내지 약 50:100, 약 0.1:100 내지 약 40:100, 약 0.2:100 내지 약 20:100, 약 0.2:100 내지 약 10:100, 약 0.2:100 내지 약 5:100이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는, 입자 중의 단당류 단위에 대한 용액 중의 치료용 단백질에 대한 몰비는 약 0.25:100 내지 약 3:100이다. 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는, 입자 중의 단당류 단위에 대한 용액 중의 치료용 단백질에 대한 몰비는 약 0.1:100, 약 0.2:100, 약 2.5:100, 약 0.3:1000, 약 0.5:100, 약 1:100, 약 2:100, 약 3:100 또는 약 5:100이다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 치료용 단백질의 용액을 제1 현탁액에 첨가함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 제1 현탁액을 치료용 단백질의 용액에 첨가함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 400 rpm 내지 약 1200 rpm, 약 500 rpm 내지 약 1100 rpm, 또는 약 600 rpm 내지 약 1000 rpm으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합은 약 400 rpm, 약 600 rpm, 약 800 rpm 또는 약 1000 rpm으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 혼합은 약 800 rpm으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 혼합은 약 1분 내지 약 2시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 5분 내지 약 60분, 약 7분 내지 약 40분, 또는 약 10분 내지 약 30분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 혼합은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분 또는 약 60분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 혼합은 약 20분 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 iii)에서의 혼합이 이루어진 후에 당 알코올의 용액에서 상기 얻어진 고형분을 원심분리하고 현탁하여 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 당 알코올의 용액은 수용액이다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 당 알코올의 수용액은 약 0.1중량% 내지 약 25중량%, 약 0.5중량% 내지 약 20중량%, 약 1중량% 내지 약 15중량%, 약 2중량% 내지 약 10중량%, 또는 약 3중량% 내지 약 7중량%의 만니톨을 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 당 알코올의 수용액은 약 1중량%, 약 2중량%, 약 2.5중량%, 약 3중량%, 약 4중량%, 약 4중량%, 약 6중량% 또는 약 10중량%의 만니톨을 포함한다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 당 알코올의 수용액은 약 2.5중량%의 만니톨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 입자 중의 치료용 단백질의 혼입 효율은 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%이다. 일부 실시형태에서, 입자 중의 치료용 단백질의 혼입 효율은 약 90% 내지 약 100%이다. 일부 실시형태에서, 입자 중의 치료용 단백질의 혼입 효율은 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%이다.
본 발명의 입자를 사용하는 방법
본 발명의 방법은 가혹한 생리 조건에 대한 치료용 단백질의 노출 없이(예를 들어, 위의 생리 조건에 대한 치료용 단백질의 노출 없이) 목적하는 생물학적 표적까지 치료용 단백질을 전달하기 위한 능력을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 개체(예를 들어, 이를 필요로 하는 개체)에 본원에 기술된 바와 같은 입자 또는 본원에 기술된 바와 같은 입자를 포함하는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 입자 중의 치료용 단백질에 의해 유익하게 치료되는 질병 또는 병태이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 내분비 질환(호르몬 결핍)(예를 들어, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 케톤산증, 고칼륨혈증, 고혈당증, GH 결핍 또는 만성 신부전으로 인한 발육 부전, 프라더-윌리 증후군, 터너 증후군, 항바이러스 요법에 의한 AIDS 소모증(wasting) 또는 악액질, GH 유전자 결실 또는 심각한 1차 IGF1 결핍을 갖는 어린이의 발육 부전, 폐경기 후 골다공증, 심각한 골다공증, 또는 메트포르민 및 설포닐우레아에 의한 치료에 대해 내성인 2형 당뇨병, 또는 말단 비대증)을 치료하는데 유용한 호르몬이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 지혈 및 혈전증을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 혈우병 A, 혈우병 B, 심각한 유전적 단백질 C 결핍에 걸린 환자에서의 수술 또는 산과 과정과 관련되거나 혈전 색전증, 정맥 혈전증 및 전격자색반증(purpura fulminan)으로 인한 유전적 AT-III 결핍, 폐색전증, 심근경색증, 급성 허혈성 뇌졸중, 중심 정맥 접근 장치의 폐색, 급성 심근경색증, 혈우병 A 또는 B에 걸리거나 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 억제제를 갖는 환자에서의 출혈, 사망 위험성이 높은 심각한 패혈증, 헤파린 유도 저혈소판증, 관상동맥 형성술에서의 혈액 응고 위험성, 급성 진행성 전층 심근경색증, 심부정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 동정맥 캐뉼라의 폐색, 또는 불안정 협심증에 걸린 환자에서의 혈전 용해).
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 대사성 효소 결핍(예를 들어, 고세병(Gaucher's disease), 폼페병(Pompe disease), II형 글리코겐 축적병, I형 점액다당류증(mucopolysaccharidosis I), II형 점액다당류증의 헐러(Hurler) 및 헐러-쉬에(Scheie) 형태, 헌터증후군(Hunter syndrome), VI형 점액다당류증, 또는 파브리병(Fabry disease))을 치료하는데 유용한 효소이다. 일부 실시형태에서, 효소는 폐질환 및 위장관 질환(예를 들어, 선천성 α-1-항트립신 결핍, 락토오스에 대한 소화 불능으로 인한 가스, 팽만감(bloating), 경련 및 설사, 낭포성 섬유증, 만성 췌장염, 췌장 부전, 포스트-빌로스 II 위 우회술(post-Billroth II gastric bypass surgery), 췌장관 폐색, 지방변증, 소화불량, 가스 또는 팽만감)을 치료하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 효소는 면역결핍을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 결핍 또는 1차 면역결핍으로 인한 심각한 복합 면역결핍 질병).
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 암(예를 들어, 방광암, 뇌암, 유방암, 대장암, 자궁경부암, 위장관암, 비뇨기암, 두경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 고환암; 특히 육종, 혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종, 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종, 기형종, 폐암, 기관지원성 암종 편평 세포, 미분화 소형 세포, 미분화 대형 세포, 선암, 폐포 세기관지 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골종 과오종(chondromatous hamartoma), 중피종(mesothelioma), 위장관암, 식도의 암, 편평 세포 암종, 선암, 평할근육종, 림프종, 위의 암, 암종, 림프종, 평할근육종, 췌장의 암, 관선암(ductal adenocarcinoma), 인슐린종, 글루카곤종, 가스트리노마(gastrinoma), 카르시노이드종양(carcinoid tumor), 비포마(vipoma), 소장암, 선암, 림프종, 카르시노이드종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종, 대장 또는 결장의 암, 관샘종(tubular adenoma), 융모선종(villous adenoma), 과오종, 평활근종, 비뇨기암, 신장 선암의 암, 빌름스종양(Wilm's tumor; 신장모세포종(nephroblastoma)), 림프종, 백혈병, 방광의 암, 요도의 암, 편평 세포 암종, 이행세포 암종(transitional cell carcinoma), 전립선의 암, 고환의 암, 정상피종(seminoma), 기형종(teratoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 기형암종(teratocarcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 육종, 간질세포 암종, 섬유종, 섬유선종(fibroadenoma), 섬유선종 종양, 지방종, 간암, 간종양(hepatoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 담관암종(cholangiocarcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma), 혈관육종(angiosarcoma), 간세포 선종(hepatocellular adenoma), 혈관종, 골암, 골형성 육종(골육종(osteosarcoma)), 섬유육종(fibrosarcoma), 악성 섬유조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 연골육종(chondrosarcoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 악성 림프종(세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대세포 종양, 척삭종(chordoma), 골연골종(골연골성 외골증(osteocartilaginous exostoses)), 양성 연골증(benign chondroma), 연골 모세포종(chondroblastoma), 연골점액섬유종(chondromyxofibroma), 유골 골종 거대세포 종양(osteoid osteoma giant cell tumor), 신경계암, 두개골의 암, 골종(osteoma), 혈관종(hemangioma), 육아종(granuloma), 황색종(xanthoma), 변형성 골염(osteitis deformans), 뇌수막종(meninges meningioma)의 암, 수막육종(meningiosarcoma), 신경교종증(gliomatosis), 뇌의 암, 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 뇌실막종(ependymoma), 배세포종(germinoma; 송과체종(pinealoma)), 다형 교아종(glioblastoma multiforme), 희돌기교종(oligodendroglioma), 신경집종(schwannoma), 망막아종(retinoblastoma), 선천성 종양, 척수의 암, 신경섬유종(neurofibroma), 수막종(meningioma), 신경교종, 육종, 부인암, 자궁의 암, 자궁내막 암종, 자궁경관의 암, 자궁경부 암종, 전-종양 자궁경부 형성 장애(pre-tumor cervical dysplasia), 난소의 암, 난소 암종, 혈청 낭종암(serous cystadenocarcinoma), 점액성 낭종암, 미분류 암종, 과립-난포막 세포 종양(granulosa-theca cell tumor), 세르톨리-라이디히 세포 종양(Sertoli Leydig cell tumor), 난소고환종(dysgerminoma), 악성 기형종, 음문의 암, 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암, 섬유육종, 흑색종, 질암, 투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상 육종, 배아형 횡문근육종, 나팔관의 암, 혈액암, 혈액의 암, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수 증식 질환, 다발성 골수종, 골수형성 이상 증후군(myelodysplastic syndrome), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(악성 림프종), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 피부암, 악성 흑색종, 기저세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 맥관종(angioma), 피부 섬유종(dermatofibroma), 켈로이드, 건선, 부신암 및 신경아 세포종(neuroblastoma))을 치료하는데 유용한 항체이다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 염증성 질병 또는 병태(예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 강직성 척추염, 반응성 관절염, 통풍, 가성통풍(pseudogout), 염증성 관절 질병, 전신 성홍반 성낭창, 다발근육염(polymyositis), 및 섬유근육통(fibromyalgia))를 치료하는데 유용한 항체이다. 관절염의 부가적인 유형으로는 아킬레스건염(achilles tendinitis), 연골 무형성증(achondroplasia), 말단비대성 관절증(acromegalic arthropathy), 유착성 관절낭염(adhesive capsulitis), 성인 발병성 스틸병(adult onset Still's disease), 거위발 점액낭염(anserine bursitis), 무혈관성 괴사(avascular necrosis), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 이두건 건염(bicipital tendinitis), 블라운트병(Blount's disease), 브루셀라 척추염(brucellar spondylitis), 점액낭염, 석회성 점액낭염(calcaneal bursitis), 피로인산칼슘 이수화물 침착병(CPPD), 결정 침착병, 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 손목 터널 증후군, 연골석회증(chondrocalcinosis), 슬개연골 연화증(chondromalacia patellae), 만성 활액막염, 만성 재발성 다발성 골수염(chronic recurrent multifocal osteomyelitis), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 코간 증후군(Cogan's syndrome), 코르티코스테로이드 유도 골다공증, 늑흉골 증후군(costosternal syndrome), CREST 증후군, 저온글로불린혈증(cryoglobulinemia), 퇴행성 관절 질병, 피부근염(dermatomyositis), 당뇨병성 수족 경화증(diabetic finger sclerosis), 미만성 특발성 골격 과골화증(DISH), 추간판염(discitis), 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 약제 유도 낭창, 뒤셴 근이영양증(Duchenne's muscular dystrophy), 듀피트렌 구축(Dupuytren's contracture), 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 장병성 관절염, 상과염(epicondylitis), 미란성 염증성 골관절염, 운동 유도 구획 증후군(exercise-induced compartment syndrome), 파브리병, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 파버 지방육아종증(Farber's lipogranulomatosis), 펠티증후군(Felty's syndrome), 제5 발진병(Fifth's disease), 평발, 이물 활액막염, 프라이베르그병(Freiberg's disease), 진균성 관절염, 고세병, 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 임균성 관절염(gonococcal arthritis), 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 육아종성 동맥염(granulomatous arteritis), 관절혈증(hemarthrosis), 혈색소 침착증(hemochromatosis), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), B형 간염 표면 항원 질병, 고관절 이형성(hip dysplasia), 헐러 증후군, 과운동성 증후군(hypermobility syndrome), 과민성 혈관염(hypersensitivity vasculitis), 비대성 골관절증(hypertrophic osteoarthropathy), 면역 복합체 질환, 충돌 증후군(impingement syndrome), 자쿠 관절증(Jaccoud's arthropathy), 연소성 강직성 척추염, 연소성 피부근염, 연소성 류마티스성 관절염, 가와사키병(Kawasaki disease), 킨뵉병(Kienbock's disease), 레그-칼베-페르테스 병(Legg-Calve-Perthes disease), 레시-나이헌 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 선피부경화증(linear scleroderma), 리포이드 피부관절염(lipoid dermatoarthritis), 로프겐 증후군(Lofgren's syndrome), 라임병(Lyme disease), 악성 윤활막종(synovioma), 마르판 증후군(Marfan's syndrome), 내측 추벽 증후군(medial plica syndrome), 전이성 암성 관절염(metastatic carcinomatous arthritis), 혼합 결합 조직병(MCTD), 혼합 저온글로불린혈증, 점액다당류증, 다중심망내조직구증(multicentric reticulohistiocytosis), 다발성 골단 이형성증(multiple epiphyseal dysplasia), 마이코플라즈마성 관절염(mycoplasmal arthritis), 근막동통 증후군(myofascial pain syndrome), 신생아 낭창, 신경변성 관절증(neuropathic arthropathy), 결절지방층염(nodular panniculitis), 갈색증(ochronosis), 주두 점액낭염(olecranon bursitis), 오스굿-슐라터병(Osgood-Schlatter's disease), 골관절염, 골연골종증(osteochondromatosis), 골형성 부전(osteogenesis imperfecta), 골연화증(osteomalacia), 골수염, 골괴사(osteonecrosis), 골다공증, 중복 증후군(overlap syndrome), 경피골막증(pachydermoperiostosis), 골의 파제트병(Paget's disease), 재발성 류머티즘(palindromic rheumatism), 슬개대퇴 통증 증후군(patellofemoral pain syndrome), 펠리그리니-스티다 증후군(Pellegrini-Stieda syndrome), 색소성 융모결절성 활액막염(pigmented villonodular synovitis), 이상근 증후군(piriformis syndrome), 족저근막염(plantar fasciitis), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 류마티스성 다발근통, 다발근육염, 슬와낭종(popliteal cyst), 후경골 건염(posterior tibial tendinitis), 포트병(Pott's disease), 슬개골전 점액낭염(prepatellar bursitis), 보철 관절 감염, 탄력 섬유성 가황색종(pseudoxanthoma elasticum), 건선성 관절염, 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 반응성 관절염/라이터 증후군(Reiter's syndrome), 반사 교감신경 이상증후군(reflex sympathetic dystrophy syndrome), 재발성 다발 연골염(relapsing polychondritis), 재관류 손상, 후종골 점액낭염(retrocalcaneal bursitis), 류마티스열, 류마티스성 혈관염, 회전 근개 건염(rotator cuff tendinitis), 천장관절염(sacroiliitis), 살모넬라 골수염, 유육종증(sarcoidosis), 납중독성 통풍(saturnine gout), 쇼이에르만 골연골염(Scheuermann's osteochondritis), 경피종, 화농성 관절염, 혈청 반응 음성 관절염, 시겔라 관절염(shigella arthritis), 어깨-손 증후군(shoulder-hand syndrome), 낫세포 관절증(sickle cell arthropathy), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 대퇴골두 골단 분리증(slipped capital femoral epiphysis), 척추관 협착증(spinal stenosis), 척추 분리증(spondylolysis), 포도상구균 관절염, 스티클러 증후군(Stickler syndrome), 아급성 피부 낭창(subacute cutaneous lupus), 스위트 증후군(Sweet's syndrome), 시드남 무도병(Sydenham's chorea), 매독 관절염, 전신 성홍반 성낭창(SLE), 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 발목 터널 증후군, 테니스 엘보(tennis elbow), 티에체 증후군(Tietse's syndrome), 일과성 골다공증, 외상성 관절염, 대전자 점액낭염(trochanteric bursitis), 결핵성 관절염, 궤양성 대장염에 의한 관절염(arthritis of Ulcerative colitis), 미분화 결합조직 증후군(UCTS), 두드러기성 혈관염(urticarial vasculitis), 바이러스성 관절염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 휘플병(Whipple's disease), 윌슨병(Wilson's disease) 또는 에르시나아 관절염(yersinial arthritis)을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 전염병(예를 들어, HIV 감염)을 치료하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 질병 또는 병태는 불충분한 양의 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬(hGH)을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, hGH는 hGH 결핍에 걸린 어린이 또는 성인에서 대체 요법으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은, 단신을 유발하지만 hGH 결핍과는 무관한 병태를 치료하도록 인간 성장 호르몬을 전달하기 위해 사용될 수 있거나, AIDS와 같은 질병의 결과로서 근육 감소를 개선하기 위해 근육량을 유지할 때 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 조혈(예를 들어, 빈혈, 골수이형성증(myelodysplasia), 신부전 또는 화학 요법으로 인한 빈혈, 수술전 처치, 만성 신부전 및 만성 신부전에 걸린 환자(+/- 투석)에서의 빈혈, 호중구 감소증(neutropaenia), AIDS에서 또는 화학 요법 또는 골수 이식 후의 호중구 감소증, 심각한 만성 호중구 감소증, 백혈구 감소증(leukopaenia), 골수 이식 후 골수성 복원, HIV/AIDS 또는 저혈소판증(특히 골수억제 화학 요법 이후의 저혈소판증))을 치료하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 불임을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 인공 수정 및 황체 형성 호르몬 결핍에 의한 불임 치료). 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 면역조절에 유용하다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 성장 조절과 연관된 질병 또는 병태(예를 들어, 말단 비대증, VIP 분비 선종 및 전이성 카르시노이드 종양의 증후성 완화, 척추 융합 수술, 골손상 복구, 경골 골절 불유합, 요추, 척추 융합, 성조숙증, 당뇨병성 궤양에 대한 창상 절제 부가물(debridement adjunct) 또는 화학 요법을 받은 환자에서의 심각한 경구 점막염)를 치료하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 욕창, 정맥류 궤양, 가피 조직 제거, 열개성 상처(dehiscent wound), 햇빛 화상 또는 급성 비대상성 충혈성 심부전(acute decompensated congestive heart failure)을 치료하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 거대분자의 효소적 분해에 유용하다(예를 들어, 많은 유형의 긴장 이상(dystonia; 예를 들어, 경부 긴장 이상), 만성 피부 궤양 및 심한 화상 영역의 조직 제거, 낭포성 섬유증, 기도 감염, FVC가 예상치의 40%를 초과하는 선택된 환자에서의 기도 감염, 괴사성 조직의 제거, 또는 급성 및 만성 병변(예를 들어, 압압 궤양, 정맥류성 및 당뇨병성 궤양, 화상, 수술후 상처, 모발둥지낭 상처(pilonidal cyst wound), 부스럼 및 기타 상처)에서의 괴사성 조직의 제거 또는 딱지의 액화). 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 장기 이식에 유용하다(예를 들어, 급성 신장 이식 거부반응의 치료). 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 폐질환(예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 감염, 천식)을 치료하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 조직 재생 또는 줄기세포 회기(stem cell homing)에 유용한 입자를 제공한다. 기타 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 입자 및 입자를 포함하는 조성물은 조직 배양에 유용하다(예를 들어, 성장 인자 로딩 DSCS NP는 다양한 줄기세포 배양 배지에서 사용되어, 빈번한 배양 배지의 교체를 생략함으로써 혼입된 성장 인자의 효과를 늘리고 줄기세포의 배양 비용을 줄일 수 있음). 연구 목적으로, 단백질이 없는(로딩되지 않은) DSCS NP는 입자로부터 단백질의 분리 없이도 단백질의 풀다운 농축(pull-down enrichment) 및 SDS 겔 상에서의 분석을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 입자 및 조성물은 미용 목적으로 사용될 수 있다(예를 들어, 로딩되지 않은 DSCS NP는 세포가 분비하는 성장 인자를 흡수하기 위해 줄기세포 조정 배지에 첨가될 수 있으며, 특수 피부 회춘용으로 사용될 수 있음).
일부 실시형태에서, 치료용 단백질을 포함하는 치료용 입자는 황반 변성을 치료하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질을 포함하는 치료용 입자는 폐 고혈압을 치료하는데 유용하다.
조성물 및 투여 경로
본 발명은 특히 본원에 기술된 바와 같은 입자(예를 들어, 치료용 입자)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 입자(예를 들어, 치료용 입자)가 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함되어 있는 약학 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 유효량의 치료용 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 기타 제제에서 요구되는 용매에 대한 노출 없이 유기 용매에 민감할 수 있는 치료용 단백질을 전달하는 능력을 제공한다. 이 같은 조성물은 천연 형태와 비교하여 입자 내의 치료용 단백질의 높은 생물활성을 유지하지만 향상된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 치료용 단백질의 생물활성은 천연 치료용 단백질의 생물활성에 대해 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100% 범위이다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 치료용 단백질의 생물활성은 천연 치료용 단백질의 생물활성에 대해 약 90%, 약 95%, 약 97% 또는 99% 초과이다. 따라서, 일부 양태에서는 치료용 단백질을 포함하는 입자를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 조성물이 제공되며, 이때 조성물 중의 치료용 단백질의 생물활성은 천연 치료용 단백질의 생물활성에 대해 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100% 범위이거나, 조성물 중의 치료용 단백질의 생물활성은 천연 치료용 단백질의 생물활성에 대해 약 90%, 약 95%, 약 97% 또는 99% 초과이다.
제어된 방출 프로파일은 TNP 내에 로딩되지 않은 개체에서의 치료용 단백질과 비교하여 개체 내에서 치료용 단백질의 향상된 약동학적 프로파일을 제공할 수 있다. 향상된 약동학적 프로파일은 AUC, 반감기, 소거(clearance), 평균 잔류 시간 및 분포 용적(Vss)으로부터 선택되는 하나 이상의 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 치료용 단백질의 AUC는 천연 치료용 단백질의 AUC에 대해 약 100% 내지 약 1000%, 약 150% 내지 약 700%, 또는 약 200% 내지 약 500% 범위이거나, 조성물 중의 치료용 단백질의 AUC는 천연 치료용 단백질의 AUC에 대해 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350%, 약 400%, 약 450%, 약 500% 또는 500% 초과이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 치료용 단백질의 반감기는 천연 치료용 단백질의 반감기에 대해 약 100% 내지 약 100,000%, 약 100% 내지 약 1000%, 약 100% 내지 약 500%, 약 150% 내지 약 400%, 또는 약 200% 내지 약 300% 범위이거나, 조성물 중의 치료용 단백질의 반감기는 천연 치료용 단백질의 반감기에 대해 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300% 또는 400% 초과이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 치료용 단백질의 소거는 천연 치료용 단백질의 소거에 대해 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 80% 범위이거나, 조성물 중의 치료용 단백질의 소거는 천연 치료용 단백질의 소거에 대해 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 치료용 단백질의 평균 잔류 시간은 천연 치료용 단백질의 평균 잔류 시간에 대해 약 100% 내지 약 1000%, 약 150% 내지 약 700%, 또는 약 200% 내지 약 500% 범위이거나, 조성물 중의 치료용 단백질의 평균 잔류 시간은 천연 치료용 단백질의 평균 잔류 시간에 대해 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350%, 약 400%, 약 450%, 약 500% 또는 500% 초과이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유기 용매가 실질적으로 없는"은 유기 용매가 대부분 또는 전혀 없는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 유기 용매가 실질적으로 없는 수성 혼합물은 혼합물로부터 대부분 또는 모든 유기 용매를 제거하는 과정이 적용되는 수성 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물은 약 5중량% 이하, 약 2%중량% 이하, 약 1%중량% 이하, 약 0.5%중량% 이하, 0.1중량% 이하, 0.05중량% 이하 또는 약 0.01중량% 이하의 유기 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물은 약 5중량%, 약 2중량%, 약 1중량%, 0.5중량%, 약 0.1중량%, 약 0.05중량, 또는 약 0.01중량%의 유기 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함하는 수용액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 수용액을 포함할 수 있다. 흔한 약학적으로 허용 가능한 완충제로는 아세트산염(아세트산 및 아세트산나트륨), 시트르산염(시트르산 및 시트르산나트륨) 및 인산염(인산나트륨 및 인산이나트륨) 완충제를 들 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염 용액으로는 희석 식염수 용액을 들 수 있다. 예를 들어, 조성물은 pH 완충 인산염 용액 또는 식염수 용액 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물은 물 중의 조성물이다. 일부 실시형태에서, 유기 용매가 실질적으로 없는 조성물에는 염이 없을 수 있다.
담체(들)는 제형의 기타 성분과의 양립성의 측면에서 "허용 가능한" 또는 "약학적으로 허용 가능한" 것이고, 약학적으로 허용 가능한 담체의 경우에 약제에 사용되는 양일 때는 이의 수용체에 무해하다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 및 비히클로는 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨과 같은 완충 물질, 포화 식물성 지방산, 물, 염 또는 전해질의 부분 글리세리드 혼합물, 예를 들어 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 3규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 기반 물질, 폴리에틸렌글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌글리콜, 및 양모지를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
필요에 따라, 약학 조성물 중의 본 발명의 치료용 단백질의 용해성 및 생체 이용률은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 향상될 수 있다. 하나의 방법은 제형에서 지질 부형제의 사용을 포함한다. 문헌["Oral Lipid-Based Formulations: Enhancing the Bioavailability of Poorly Water-Soluble Drugs (Drugs and the Pharmaceutical Sciences)," David J. Hauss, ed. Informa Healthcare, 2007]; 및 문헌["Role of Lipid Excipients in Modifying Oral and Parenteral Drug Delivery: Basic Principles and Biological Examples," Kishor M. Wasan, ed. Wiley-Interscience, 2006]을 참고한다.
생체 이용률을 향상시키는 다른 공지된 방법은 LUTROLTM 및 PLURONICTM(바스프 코포레이션(BASF Corporation))과 같은 폴록사머 또는 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드의 블록 공중합체와 함께 선택적으로 제형화되는 무정형 형태인 본 발명의 화합물의 사용이다. 미국 특허 제7,014,866호; 및 미국 특허 공개공보 제20060094744호 및 제20060079502호를 참고한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 비강, 국소(협부 및 설하 투여를 포함함), 질 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥 내 및 피내 투여를 포함함) 투여에 적합한 조성물을 들 수 있다. 기타 제형은 편의상 단위 투여 형태, 예를 들어 정제, 서방성 캡슐로 제공되거나 리포솜 내에 제공될 수 있으며, 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (20th ed. 2000)]을 참고한다.
본 발명의 약학 조성물은 주사(예를 들어, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사)에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은, 예를 들어 약학 조성물이 황반 변성을 치료하는데 유용한 단백질을 포함하는 경우 개체의 눈으로 주사함으로써 투여될 수 있다.
이 같은 제조 방법은 하나 이상의 부성분을 구성하는 담체와 같은 성분을 투여될 분자와 결합하게 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 액체 담체, 리포솜 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 활성 성분을 균일하고 단단히 결합하게 한 후, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질을 포함하는 입자는 경구 투여된다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 사쉐(sachet) 또는 정제와 같은 개별 단위; 분말 또는 과립; 수성 액체 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 수중유 액체 유화액; 유중수 액체 유화액으로서 제공될 수 있으며; 이는 리포솜 내에 포장되거나 볼러스 등로서 포장된다. 연질 젤라틴 캡슐은 화합물의 흡수율을 유익하게 증가시킬 수 있는 이 같은 현탁액을 함유하는데 유용할 수 있다.
경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토오스 및 옥수수 전분을 들 수 있다. 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제가 전형적으로 또한 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여에 있어서, 유용한 희석제로는 락토오스 및 건조된 옥수수 전분을 들 수 있다. 수성 현탁액이 경구 투여되는 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 조합한다. 필요한 경우, 특정 감미제 및/또는 방향제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
경구 투여용으로 적합한 조성물은 방향 기반의 성분(흔히 수크로오스 및 아카시아) 또는 트라가칸트를 포함하는 로젠지; 및 젤라틴 및 글리세린과 같은 불활성 기반의 활성 성분, 또는 수크로오스 및 아카시아를 포함하는 향정(pastille)을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 실온에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 용융되어 활성 성분을 방출할 무자극 부형제와 본 발명의 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이 같은 물질로는 코코아 유지, 밀랍 및 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이 같은 조성물은 약학 제형 분야에서 널리 공지된 기법에 따라 제조되고, 식염수 중의 용액으로서 제조될 수 있으며, 여기에 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 불화탄소, 및/또는 당업계에 공지된 기타 가용화제 또는 분산제가 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,803,031호를 참고한다.
본 발명의 약학 조성물의 국소 투여는, 목적하는 치료가 국소 도포에 의해 용이하게 접근 가능한 영역 또는 장기를 수반하는 경우에 특히 유용하다.
본 발명의 국소 조성물은 에어로졸 스프레이, 크림, 유화액, 고체, 액체, 분산액, 발포체, 오일, 겔, 하이드로겔, 로션, 무스, 연고, 분말, 패치, 포마드(pomade), 용액, 펌프 스프레이, 스틱, 종이 수건, 비누의 형태, 또는 국소 투여 분야 및/또는 화장료 및 피부 관리 조성물 분야에서 흔히 사용되는 기타 형태로 제조되고 사용될 수 있다. 국소 조성물은 유화액 형태일 수 있다.
일부 실시형태에서, 국소 조성물은 치료용 단백질을 포함하는 입자와 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 하나 이상의 부가적인 성분의 조합을 포함하며, 여기서 상기 부가적인 성분으로는 흡착제, 자극 방지제, 여드름 방지제, 보존제, 항산화제, 착색제/안료, 연화제(보습제), 유화제, 필름 형성제/유지제, 향료, 잔류형 박리제, 처방 약제, 보존제, 스크러빙제, 실리콘, 피부 유사제/복원제, 슬립제, 햇빛 차단제, 계면활성제/세정제, 침투 촉진제 및 증점제를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
당업계에 널리 공지되어 있는 성분의 목록은, 예를 들어 문헌["Cosmetics: Science and Technology," edited by M. S. Balsam and E. Sagarin, 2nd Edition, 1972, Wiley Pub. Co.; "The Chemistry and Manufacture of Cosmetics" by M. G. DeNavasse; and "Harry's Cosmeticology," J.B. Wilkinson et al., 7th Edition, 1982, Chem. Pub. Co.]에 개시되어 있으며, 상기 문헌 각각의 개시내용은 전체가 본원에서 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 희석제, 담체 및 부형제는 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG200, PEG300, PEG400, PEG540, PEG600, PEG1450 또는 이들의 혼합물)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에서, 치료용 단백질을 포함하는 입자는 유효량(예를 들어, 치료학적 유효량)으로 존재한다.
동물 및 인간에 있어서 복용량(신체 표면 제곱미터 당 밀리그램에 기초함)의 상호관계는 문헌[Freireich et al., Cancer Chemother. Rep, 1966, 50: 219]에 개시되어 있다. 신체 표면적은 개체의 신장 및 체중으로부터 대략적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y., 1970, 537]을 참고한다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질을 포함하는 입자의 유효량은, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎎의 범위일 수 있다. 이들 실시형태의 일부 양태에서, 치료용 단백질을 포함하는 입자를 유효량으로 함유하는 조성물은 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 투여된다.
일부 실시형태에서, 치료용 단백질을 포함하는 입자의 유효량은, 예를 들어 약 0.001 ㎍/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 수 있다.
또한 유효 투여량은, 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 치료될 질병, 질병의 중증도, 투여 경로, 개체의 성, 나이 및 일반적인 건강 상태, 부형제의 사용, 기타 약제의 사용과 같은 기타 치료제와의 동시 사용 가능성, 및 치료의의 판단에 따라 달라질 것이다.
병용 요법
예를 들어, 항바이러스제, 화학 치료제, 기타 항암제, 면역 증강제, 소염제, 면역 억제제, 방사선, 항종양 및 항바이러스 백신, 사이토카인 요법(예를 들어, IL2, GM-CSF 등) 및/또는 티로신 키나아제 억제제와 같은 하나 이상의 부가적인 약제 또는 치료 방법은 본원에 기술된 바와 같은 치료용 단백질을 포함하는 입자 또는 이의 조성물과 함께 사용될 수 있다. 상기 약제는 본 발명의 치료용 입자와 단일 투여 형태로 조합될 수 있거나, 상기 약제는 별개의 투여 형태로서 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본원에 기술된 치료용 단백질들 중 임의의 하나는 본 발명의 입자 및 조성물과 함께 사용될 부가적인 약제로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부가적인 약제는 줄기세포(예를 들어, 줄기세포 요법)이다.
키트
또한 본 발명은, 예를 들어 본원에 기술된 질병 또는 질환들 중 임의의 하나의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 키트를 포함하며, 이때 상기 약학적 키트는 본 발명의 입자를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학 조성물을 담고 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 필요한 경우, 이 같은 키트는, 당업자에게 매우 자명한 바와 같이, 예를 들어 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체가 구비된 용기, 부가적인 용기 등과 같은 다양한 통상의 약학적 키트 성분들 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 투여될 성분의 양, 투여 지침서, 및/또는 성분을 혼합하기 위한 지침서가 기술되어 있는 삽입물 또는 라벨로서의 설명서가 키트에 포함될 수도 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "하나" 및 "일"이란 단수 형태는 문맥에서 달리 표시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 "대략"(예를 들어, 표시된 값의 대략 ±10%)을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "입자"란 용어는 약 1 ㎚ 내지 약 1000 ㎛의 크기를 갖는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "나노입자"란 용어는 약 1 ㎚ 내지 약 1000 ㎚의 크기(예를 들어, 구상당직경)를 갖는 입자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "입자 크기"(또는 "나노입자 크기" 또는 "마이크로입자 크기")란 용어는 나노입자 또는 마이크로입자의 분포에서 중간 크기를 지칭한다. 중간 크기는 개개의 나노입자의 평균 선형 치수, 예를 들어 구형 나노입자의 직경으로부터 결정된다. 동적 광산란(DLS) 및 투과 전자현미경(TEM) 기법을 포함한 당업계에 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 크기가 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "혼입 효율" 및 "캡슐화 효율"이란 용어는 입자의 제조 시에 사용된 치료용 단백질의 초기량에 대한 입자(예를 들어, 나노입자) 내로 혼입되는 치료용 단백질의 양의 비율을 지칭한다.
"로딩 용량" 및 "로딩 효율"이란 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 입자(예를 들어, 나노입자)의 하전된 단당류 단위의 몰분율로 캡슐화되는 치료용 단백질의 몰분율을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "수성 용매"란 용어는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 물을 포함하는 액체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 수성 용매는 물이다. 일부 실시형태에서, 수성 용매는 완충 용액(예를 들어, 둘베코 인산 완충 식염수(DPBS))이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실온"은 주위 실내 온도, 전형적으로는 약 15 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 실온은 18 ℃이다.
실시예
재료 및 방법
중량 평균 분자량(MW)이 500 kDa인 덱스트란 황산나트륨 염은 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구매하였다. 키토산(MW 범위: 50 내지 190 kDa, 75 내지 85%가 탈아세틸화됨)(카탈로그 번호: 448869), 황산아연, 만니톨, 아주르 A 클로라이드(카탈로그 번호: 861049) 및 리소자임(달걀 흰자 유래), 글루타르산, 말산, 숙신산, 타르타르산, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수득하였다. 시바크론 브릴리언트 레드(Cibacron brilliant red) 3B-A(카탈로그 번호: sc-214719)는 산타크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology)로부터 구매하였다. 울트라푸어(Ultra Pure) DNase/RNase 부재 증류수는 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구매하였다. 재조합 인간 SDF-lα 및 VEGF165는 앞서 기술한 프로토콜에 따라 제조하였다(예를 들어, 문헌[Lauten, E. et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules 2010, 11 (7), 1863~72]; 및 문헌[Yin, T. et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules 2013, 14 (11), 4009~20] 참조). 소 혈청 알부민(BSA)은 이엠디 밀리포어(EMD Millipore)로부터 구매하였다. 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 골형성 단백질-2(BMP-2)는 페프로텍(Peprotech)으로부터 구매하였다. SDF-lα ELISA 키트(인간 CXCL12/ SDF-lα DuoSet)는 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 구매하였다.
실시예 1: DSCS 나노입자의 제조 및 분석
나노입자 제조를 위한 일반적인 절차:
본 연구에서는 DSCS 나노입자를 1.2 내지 300 ㎖의 총 부피로 제조하였다. 300 ㎖ 제제의 경우, 150 ㎖의 DS(H2O 중의 1 ㎎/㎖)를 700 rpm으로 교반하고, 37.5 ㎖의 CS(1 ㎎/㎖, 0.2% 아세트산/H2O에서 용해하고 0.8, 0.45 및 0.2 ㎛ SFCA 막에 연속하여 여과함)와 15분 동안 혼합하였다. 이어서, 교반 속도를 800 rpm까지 증가시키고, 5.8 ㎖의 200 mM ZnSO4를 주사기 펌프를 통해 1 ㎖/분으로 첨가하였다. 100 ㎖의 15% 만니톨 용액을 첨가하기 전에 혼합물을 추가의 60분 동안 교반하였다. DSCS 나노입자를 20분 동안 20,000 x g로 원심분리하여 침전시켰다. 입자 펠릿을 70 ㎖의 물로 2회 세척하고, 40분 동안 30,000 x g로 원심분리하였다. 최종 입자를 12 ㎖의 5% 만니톨 용액에서 현탁하고, 0.5 ㎖의 분취액으로 나누고, -80 ℃에서 동결시키고, 3일 동안 동결 건조하였다. 건조된 입자는 사용하기 전까지 4 ℃에서 건조한 상태로 저장하였다.
입자 크기 및 제타 전위 최적화 연구
앞서 개시된 절차를 따르는 입자 분석을 위해 델사나노(DelsaNano) C 입자 분석기(베크만(Beckman))를 사용하였다(예를 들어, 문헌[Bader et al, Preparation and characterization of SDF-1alpha-chitosan-dextran sulfate nanoparticles. J Vis Exp 2015, (95), 52323] 참조). 간단히 말하면, 10 내지 15 ㎕의 입자 샘플을 크기 또는 제타 전위 측정을 위해 각각 0.5 ㎖ 또는 2.5 ㎖의 물에 희석하였다. 기기의 표준 운영 절차를 따랐다. 콘틴 알고리즘(Contin algorithm)에 의해 자기 상관 함수(autocorrelation function)를 분석하고, 입경을 누적률로서 제공하였다. 스몰루호프스키 근사법(Smoluchowski approximation)을 이용하여 전기영동 이동도로부터 제타 전위를 계산하였다.
만니톨 농도의 효과:
동결 건조 동안에 DSCS 나노입자의 안정성에 미치는 만니톨의 효과는 도 1에 나타나 있다. 0.3 내지 5% 만니톨의 존재 하에 입자의 크기 및 다분산 지수 둘 모두는 점진적으로 감소하였다. 농도 효과는 2.5 내지 5%에서 안정되었으며, DSCS 나노입자의 제조를 위해 5% 만니톨이 선택되었다.
아연 농도의 효과:
입자 크기에 미치는 아연 농도의 효과는 도 2에 나타나 있다. 아연 농도가 0 mM에서 20 mM로 증가하면 입자 크기는 동결 건조 이전에는 감소하지만 동결 건조 이후에는 증가한다. 2개의 경우 모두에서, 아연 농도가 증가함에 따라 입자의 다분산 지수는 감소하였다. DSCS 나노입자의 제조를 위해 6 mM의 황산아연 농도가 선택되었다.
동결 건조의 효과:
동결 건조에 의해 입자의 전반적인 크기는 감소하지만, 입자의 다분산 지수는 증가하였다(도 2 참조). 다분산성의 증가는, 동결 건조 과정 중에 초미세 입자의 생성으로 인한 입자의 불균질성의 증가를 반영하였다. 나머지 입자로부터 초미세 입자를 분리하기 위해, 동결 건조된 DSCS 나노입자의 복원 이후에 원심분리(20분 동안 21,000 x g)를 수행하였으며, 얻어진 상층액은 폐기하였다. 최종적으로 제형화된 입자의 매개변수는 표 1에 나타나 있다:
대규모 나노입자 제제의 크기 및 전하 특성
나노입자 제조 단계 직경(㎚) 다분산 지수 제타 전위(mV)
동결 건조 이전 455 ± 14 0.11 ± 0.2 -45.9 ± 5.4
동결 건조 이후 349 ± 15 0.14 ± 0.04 -40.0 ± 2.6
원심분리 이후 377 ± 10 0.11 ± 0.01 -43.1 ± 1.5
DSCS 나노입자 중의 중화되지 않은 DS의 정량화(아주르 A 검정)
DSCS NP 중의 하전된 DS의 양을 측정하기 위해, 아주르 A 변색 검정을 사용하였다. 용액 중의 덱스트란설페이트(예를 들어, 문헌[Ellis, H. et al. The estimation and recovery of dextran sulphates in biological fluids. J. Clin. Pathol. 1959, 12, 467~72] 참조) 및 헤파린(예를 들어, 문헌[Grant, A. et al. Metachromatic activity of heparin and heparin fragments. Anal. Biochem. 1984, 137 (1), 25~32] 참조)의 농도를 측정하기 위한 아주르 A 검정이 이전에 확립되었다.
아주르 A를 저장 용액(4 ℃에 저장)으로서 물에 1 ㎎/㎖로 용해하고, 작업 용액으로서 물에서 0.02 ㎎/㎖까지 희석하였다. 분광 광도 분석을 위해, 2 ㎖의 아주르 A 작업 용액을 폴리스티렌 큐벳에 첨가하고, 20 ㎕의 DS 용액과 혼합하였다. 혼합 15분 이내에 측정이 이루어졌다. 96-웰 플레이트 포맷에서 DS 농도를 측정하기 위해, 농도가 0 내지 0.20 ㎎/㎖ 범위인 NP 샘플 또는 DS 표준물질(덱스트란 황산나트륨 염으로 제조됨) 10 ㎕를 플레이트 웰에 첨가하였다. 그 다음에 아주르 A 작업 용액(200 ㎕)을 첨가한 후, 플레이트 교반기 상에서 2분 동안 혼합하였다. 620 ㎚의 파장에서 흡광도를 판독하였다. 샘플을 3회 운용하고, 비어 있는 웰을 기기 바탕시료(instrument blank)로 사용하였다.
DS 용액과의 상호작용 이후의 아주르 A의 흡수 스펙트럼은 도 3a에 나타나 있다. 전형적인 표준 곡선은 도 3b에 나타나 있으며, 덱스트란 황산나트륨 염을 이용하여 표준 용액을 0.04 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 제조하였다.
아주르 A 검정에 의해 DSCS NP 중의 하전된 DS가 검출되는지를 확인하기 위해, 상기 검정을 수행하여 각각의 입자 제조 단계에서 DS 농도를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타나 있다:
DSCS 나노입자1를 제조하는 동안의 다양한 단계에서의 아주르 A가 검출 가능한 덱스트란설페이트(DS)의 양
제조 단계 부피(㎖) DS 농도(㎎/㎖) DS 총량(㎎) DS 입력(%)
초기 DS 150 0.99 148.5 99.0
CS 첨가 후 187.5 0.64 120 80.0
ZnSO4 첨가(add.) 후2 193.3 0.63 121.8 81.2
만니톨 첨가 후 293.3 0.41 120.3 80.2
제1 스핀 펠릿 현탁액(pel. susp.)3 72 0.16 11.5 7.7
제2 스핀 펠릿 현탁액 72 0.12 8.6 5.7
최종 펠릿 현탁액 12 0.55 6.6 4.4
1DSCS 나노입자는 일반적인 절차에 개시된 절차에 따라 제조되었다. 각각의 제조 단계 이후, 0.1 ㎖의 분취액을 취하고, 아주르 A의 측정을 위해 물에 희석하였다. 2add.: 첨가. 3pel. susp.: 펠릿 현탁액. 데이터는 4개의 제제로부터의 평균을 나타낸다.
DS 함량의 감소에 대한 측정:
표 2에 나타나 있는 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, DS의 총 검출 가능한 양은 NP의 제1 제조 단계에서 1 ㎎/㎖의 CS(37.5 ㎖)를 1 ㎎/㎖의 DS(150 ㎖)에 첨가한 이후에 약 20% 정도 감소하였는데, 이는 CS에 의해 DS 중의 황산염 기가 중화되었기 때문이다. DSCS 나노입자 중의 중화되지 않은 DS 함량의 계산은 하기와 같이 수행하였다: DS 중의 글루코오스설페이트 단위의 질량(황 함량: 17%)은 대략 397이며, 이는 2.3개의 황산나트륨이 치환된 글루코오스 단위(질량 = 180)[(23+97-18)*2.3 = 235] 및 하나의 글리코시드 결합(5% 분지는 무시함)(-18)으로 추정되며; CS(80%가 탈아세틸화됨) 중의 글루코사민 단위의 질량은 169이며, 이는 0.8개의 글루코사민 단위(179*0.8 = 143), 0.2개의 N-아세틸글루코사민 단위(221*0.2 = 44) 및 하나의 글리코시드 결합(-18)으로 추정된다. DS와 CS의 중량비가 4:1일 때, DS와 CS 중의 당류 단위의 비율은 1:0.59이다. 각각의 단위는 평균적으로 DS에 2.3개의 음전하를 갖고, CS에 0.8개의 양전하를 갖는다. 따라서 DS와 CS 사이의 총 전하 비율은 대략 2.3:0.47(5:1)이다. 중화되는 경우, 하전된 DS는 대략 총 80%를 차지할 것이다. 황산아연 및 만니톨의 첨가 이후에도 이러한 변화는 유지되었으며, 이는 입자 구조 자체는 아주르 A에 의한 이의 하전된 DS의 검출 가능성에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다.
CS 함량의 측정:
시바크론 브릴리언트 레드 3B-A 비색 분석 검정(예를 들어, 문헌[Mendelovits, A et al, Improved colorimetric determination of chitosan concentrations by dye binding. Appl Spectrosc 2012, 66 (8), 979~82]; 및 문헌[Muzzarelli, R. A., Colorimetric determination of chitosan. Anal. Biochem. 1998, 260 (2), 255~7] 참조)을 이용하여 유리 CS의 농도를 측정하였다. 상기 검정을 이용할 때, DS와 CS의 혼합물에서는 키토산이 검출되지 않았으며, 이는 CS가 완전히 중화되었음을 보여주는 것이다.
실시예 2: DSCS 나노입자 내로의 단백질의 혼입
나노입자 내로 단백질을 혼입하기 위한 일반적인 절차:
단백질을 혼입하기 전, 동결 건조된 DSCS 나노입자의 분취액을 물(예를 들어, 0.5 ㎖)로 복원하고, 20분 동안 21,000 x g로 원심분리하여 초미세 입자를 제거하였다. 펠릿을 0.5 ㎖의 2.5% 만니톨에서 재현탁하고, 아주르 A 검정을 수행하여 현탁된 NP 중의 하전된 DS의 농도를 측정하였다. 이어서, 단백질 혼입을 하기와 같이 수행하였다:
a) 40 ㎍의 하전된 DS를 함유하는 나노입자의 양을 2 ㎖ 유리 바이얼로 전달하고, 물과 혼합하거나, 달리 명시된 완충제 용액과 혼합하여 총 부피가 0.3 ㎖이 되도록 하였다. 이어서, 나노입자를 800 rpm로 교반하고, 0.1 ㎖의 단백질 용액을 천천히 첨가하였다. 교반 속도를 300 rpm까지 감소시키고, 교반을 20분 동안 계속하여 혼입 반응을 완료하거나;
b) 물, 50% PBS, 또는 달리 언급된 완충제 용액에서 소정량의 DSCS NP 및 단백질을 희석하고, 단백질 용액을 800 rpm로 교반하면서 NP에 천천히 첨가함으로써 혼입 반응을 수행하였다. 총 반응 부피는 0.3 ㎖이었거나, 일부 경우에 0.15 ㎖이었으며, 이를 각각 1.5 x 8 ㎜ 교반 막대가 구비된 2 ㎖ 유리 바이얼에 넣거나, 3 x 3 ㎜ 교반 막대가 구비된 1.5 ㎖ 튜브에 넣었다. 혼합물은 추가의 20분 동안 300 rpm로 교반하였다.
단백질의 혼입 효율에 대한 분석을 위한 일반적인 프로토콜
혼입 반응 이후, 입자를 20분 동안 21,000 x g로 원심분리하여 혼입되지 않은 단백질로부터 분리하였다. 상층액을 수집하고, 펠릿을 원래 부피가 되도록 2.5% 만니톨에서 재현탁하였다. 동일한 부피의 상층액 및 펠릿을 전기영동을 위한 4~20% SDS 겔 상에 로딩하였다. 겔을 쿠마시블루로 염색하고, BioRad ImageLab 소프트웨어를 이용하여 앞서 기술한 바와 같은 농도측정 분석에 의해 단백질 밴드를 정량화하였다(예를 들어, 문헌[Bader, A. et al, Preparation and characterization of SDF-1alpha-chitosan-dextran sulfate nanoparticles. J Vis Exp 2015, (95), 52323] 참조).
SDF-1α
SDF-lα는 케모카인이면서도 중요한 줄기세포 회기 인자이다(예를 들어, 문헌[Stebler, Jet al. Primordial germ cell migration in the chick and mouse embryo: the role of the chemokine SDF-1/CXCL12. Dev. Biol. 2004, 272, (2), 351~61]; 문헌[Sharma M. et al. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev 2011, 20, (6), 933~46]; 및 문헌[Ghadge S. et al. SDF-lαlpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol. Ther. 2011, 129, (l) 97~108] 참조). 이의 성숙한 형태는 7,963 Da의 분자량 및 9.9의 등전점을 갖는다. SDF-lα는 용액에서 단량체이지만 헤파린과 결합 시에는 이량체를 형성한다(예를 들어, 문헌[Fermas S. et al. Sulfated oligosaccharides (heparin and fucoidan) binding and dimerization of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1/CXCL 12) are coupled as evidenced by affinity CE-MS analysis. Glycobiology 2008, 18, (12), 1054~64]; 및 문헌[Sadir R et al. Characterization of the stromal cell-derived factor-lalpha-heparin complex. J. Biol. Chem. 2001, 276, (11), 8288~96] 참조). 또한 알칼리 pH는 SDF-lα의 이량체 형성을 용이하게 한다. SDF-lα는 헤파린 절편에 12 내지 14개의 당 단위를 차지하는 특정 헤파린 결합 부위를 갖는다(예를 들어, 문헌[Veldkamp C. et al. The monomer-dimer equilibrium of stromal cell-derived factor-1(CXCL12) is altered by pH, phosphate, sulfate, and heparin. Protein Sci. 2005, 14, (4), 1071~81]; 및 문헌[Amara A et al. Stromal cell-derived factor-lalpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J. Biol. Chem. 1999, 274, (34), 23916~25] 참조).
SDF NP의 형성 및 특성 분석:
혼입 연구에서 DSCS NP 중의 SDF-lα와 하전된 DS 사이의 화학량론적 비율을 결정하기 위해, DS 중의 글루코오스설페이트 단위의 질량(379)을 이용하여 하전된 DS 중의 당 단위의 개수를 계산하였다(상기 설명 참조). DSCS NP와 SDF-1α를 다양한 비율로 혼합한 후, 원심분리하여 DSCS NP로부터 혼입되지 않은 SDF-1α를 분리함으로써 혼입 반응을 수행하였다. 펠릿 및 상층액 분획 중의 SDF-1α의 양을 SDS 겔 상에서 분석하였다. 예비 형성된 DSCS 나노입자 내로의 SDF-lα의 혼입 결과는 도 4a 및 도 4b에 나타나 있다.
도 4a는 물(pH 6)에서 수행된 반응의 경우 입자 크기 및 제타 전위가 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 1.3 내지 1.9 nmol의 SDF-1α 비율에서 유의하게 변하지 않는다는 것을 보여준다. 이러한 범위를 벗어나면 입자는 상당히 응집하였다. 알칼리 pH(pH 8)는 응집을 유도하기 전에 일부 추가적인 SDF-1α의 로딩(DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 최대 2.5 nmol)을 가능케 하였다. DSCS NP의 상술한 로딩 한계(평균적으로 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 대략 1.5 nmol SDF-1α임)는 NP 안정성에 영향을 미치기 전에는 총 하전된 DS 중 10% 미만을 차지할 수 있다는 것을 암시한다.
도 4b는 시험된 모든 SDF-lα 로딩량(하전된 당류 단위 100 nmol 당 1 내지 3 nmol)에서 혼입 효율이 92 내지 100%임을 보여주며, 이는 추가의 결합이 입자의 응집을 유발할지라도 DSCS 나노입자 중의 하전된 DS가 추가의 SDF-lα와 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 혼입 효율은 포괄법(entrapment method)을 이용하여 이전에 수득된 혼입 효율보다 높았으며, 얻어진 입자 크기는 이전에 수득된 입자 크기보다 작았다(예를 들어, 문헌[Yin, T. et al, SDF-lalpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules 2013, 14 (11), 4009~20]을 참고하며, 여기서 혼입 효율은 66 내지 80%이고 입자 크기는 대략 640 ㎚임).
VEGF
VEGF는 혈관형성 및 맥관 형성에 관련이 있는 중요한 성장 인자이다(예를 들어, 문헌[Ferrara, N., Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med (Berl) 1999, 77, (7), 527~43] 참조). 단백질은 이황화 결합된 동종 이량체로서, 대략 40,000 Da의 MW(글리코실화가 없는 각각의 단량체는 19,166 Da임) 및 7.6의 등전점을 갖는다. VEGF는 각 단량체의 카르복실 말단에 위치하는 2개의 헤파린 결합 도메인을 경유하여 헤파린에 결합한다(예를 들어, 문헌[Fairbrother, W. et al. Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure 1998, 6, (5), 637~48] 참조). 각 단량체 내의 결합 도메인은 6 내지 7개의 당 단위를 차지하고, 동종 이량체인 VEGF는 단단한 결합을 위해 14개의 당 단위를 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Robinson, C. et al. VEGF165-binding sites within heparin sulfate encompass two highly sulfated domains and can be liberated by K5 lyase. J. Biol. Chem. 2006, 281, (3), 1731~40; 및 문헌[Zhao, W et al. Binding affinities of vascular endothelial growth factor (VEGF) for heparin-derived oligosaccharides. Biosci Rep 2012, 32, (1), 71~81] 참조).
VEGF NP의 형성 및 특성 분석:
예비 형성된 DSCS 나노입자 내로의 VEGF의 혼입은 도 5에 나타나 있다. 도 5의 데이터에 따르면 입자의 크기 및 제타 전위에 큰 영향을 미치지 않으면서 VEGF의 최대 로딩은 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 0.63 내지 1 nmol VEGF이고, 혼입 효율은 시험된 VEGF 로딩량(최대 2 nmol)에서 96 내지 100%인 것으로 나타난다. 이들 결과는 SDF-lα의 혼입으로부터 수득된 결과와 유사하다. 즉 입자가 보다 많은 단백질과 결합할 수 있을지라도 입자의 안정성에 영향을 미치지 않으면서 DSCS NP 중의 하전된 당 단위 100 nmol 중 14 nmol만을 차지할 수 있다. SDF-1α에 의해 확인된 바와 유사하게, VEGF의 로딩 한계는 NP의 안정성에 영향을 미치지 않으면서 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위를 10% 미만으로 차지할 수 있다는 것을 암시한다.
혼입 효율은 모든 시험된 VEGF의 로딩량(하전된 당류 단위 100 nmol 당 0.25 내지 2 nmol)에서 96 내지 100%였으며, 포괄법에 의해 구현된 로딩량보다 많았다(예를 들어, 문헌[Lauten, E. et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules 2010, 11, (7), 1863~72]에는 약 40%의 혼입 효율이 나타나 있고; 문헌[Huang, M et al. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules 2007, 8, (5), 1607~14]에는 50 내지 80%의 혼입 효율이 나타나 있음).
미리 제조된 DSCS 나노입자 내로의 SDF-lα, VEGF 및 BSA 혼입의 비교
알부민 및 글로불린은 혈액 중에서 가장 풍부한 단백질이다. 단백질이 다양한 무기/유기 물질의 표면에 흡착될 수 있으므로 예비 형성된 DSCS NP로의 이들 단백질의 흡착을 검토하였다.
BSA는 혈청 중에서 가장 풍부한 단백질이며; 이는 다양한 혈액 중의 소분자 또는 거대분자와 결합하여 이동시킨다. BSA는 66,463 Da의 MW 및 4.7 내지 5.6의 등전점을 가지며, 이의 서열 내에는 헤파린 결합 부위 또는 도메인이 없다. DSCS 나노입자에 대한 BSA의 혼입은 처음에 물에서 시험되었으며, 다소 효율적인 것으로 밝혀졌다:
a) 도 6에 나타나 있는 바와 같이, DSCS 나노입자 중의 40 ㎍의 하전된 DS와 50 ㎍의 BSA(0.75 nmol)를 혼합하면 NP 내로 BSA가 80% 정도 혼입되게 된다. 그럼에도 불구하고, 50% 둘베코 인산 완충 식염수(PBS)의 존재 하에 BSA의 8%만이 혼입되었거나;
b) 50 ㎍의 소 혈청 알부민(BSA)(0.75 nmol) 또는 염소 감마 글로불린(0.42 nmol)을 물 또는 50% 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 DSCS NP(하전된 글루코오스설페이트 단위를 100 nmol 함유함)와 혼합하였다. 상당량의 BSA 및 감마 글로불린을 물에서 혼합하는 경우에 DSCS NP 흡착되는 반면(80% 및 92% 각각), 50% PBS와 혼합하는 경우 각각 8% 및 4%만이 흡착되었다.
이에 반해, DSCS NP에 대한 SDF-1α 및 VEGF의 혼입은 50% PBS에 의해 영향을 받지 않았다(도 6 참조).
미리 제조된 DSCS 나노입자 내로의 리소자임, FGF-2 및 BMP-2의 혼입
50% PBS에서 리소자임, FGF-2 및 BMP-2의 혼입에 대해 연구하였다.
리소자임(MW: 14.3 kDa 및 pl: 11.4)은 헤파린 결합 단백질이 아니지만(예를 들어, 문헌[Ori, A et al. A systems biology approach for the investigation of the heparin/heparan sulfate interactome. J. Biol. Chem. 2011, 286, (22), 19892~904] 참조), 사전에 저염 용액에서 헤파린과 결합하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Zou, S et al. Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozyme. Comp Biochem Physiol B 1992, 103, (4), 889~95]; 및 문헌[Van de Weert, M et al. Complex coacervation of lysozyme and heparin: complex characterization and protein stability. Pharm Res 2004, 21, (12), 2354~9] 참조). 정제된 리소자임은 비교적 많은 양 및 낮은 가격으로 상업적 출처(commercial source)로부터 수득 가능하다.
FGF-2(MW: 17.1 kDa 및 pl: 9.6)는 단량체성 단백질이며, 헤파린과 결합할 때 이량체를 형성한다(예를 들어, 문헌[DiGabriele, A. et al. Structure of a heparin-linked biologically active dimer of fibroblast growth factor. Nature 1998, 393, (6687), 812~7]; 문헌[Faham, S. et al. Heparin structure and interactions with basic fibroblast growth factor. Science 1996, 271, (5252), 1116~20]; 및 문헌[Schlessinger, J. et al. Crystal structure of a ternary FGF-FGFR-heparin complex reveals a dual role for heparin in FGFR binding and dimerization. Mol. Cell 2000, 6, (3), 743~50] 참조).
BMP-2(MW: 25.8 kDa 및 pl: 8.2)는 이황화 결합된 동종 단량체성 헤파린 결합 단백질이다(예를 들어, 문헌[Ruppert, R. et. al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur. J. Biochem. 1996, 237, (1), 295~302]; 및 문헌[Vallejo, L et al. Folding and dimerization kinetics of bone morphogenetic protein-2, a member of the transforming growth factor-beta family. FEBS J. 2013, 280, (1), 83~92] 참조).
2개의 다른 로딩 비율로 단백질 각각의 혼입을 검토하였다. 리소자임 및 FGF-2에 있어서, 상기 비율은 DSCS NP 중의 하전된 당 단위 100 nmol 당 1 또는 2 nmol 단백질이고; BMP-2에 있어서, 상기 비율은 BMP-2가 이량체가 됨에 따라 절반으로 감소하였다. 도 7 및 표 3에 나타나 있는 바와 같이, 50% PBS에서의 이들 단백질의 혼입 효율은 95 내지 100%이었다. 2:100의 단백질 대 하전된 글루코오스설페이트 단위의 비율로 FGF-2가 혼입된 DSCS NP의 크기 및 제타 전위를 제외하면 DSCS NP의 크기 및 제타 전위는 많이 변화지 않았다. SDF-1α 및 VEGF의 혼입으로부터 연구결과와 더불어, DSCS NP에 대한 헤파린 결합 단백질의 최대 로딩은 단량체성 단백질의 경우에 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트 단위 100 nmol 당 대략 1.5 nmol이거나, 이량체성 단백질의 경우에 0.75 nmol이었다. 이들 샘플에서는 어떠한 유의한 응집도 발견되지 않았다. 2 nmol의 FGF-2 및 1 nmol의 BMP-2 샘플에서는 다분산 지수가 증가하였으며, 이는 이들이 이들의 로딩 한계에 도달하고 있다는 것을 암시하다.
예비 형성된 DSCS NP1 내로의 단백질의 혼입
단백질 단백질:Gluc-SO3 -(nmol:nmol) 혼입 효율(%) 직경(㎚) 다분산 지수 제타 전위(mV)
부재 336 ± 4 0.08 ± 0.01 -40.6 ± 1.6
FGF-2 1:100 95 ± 1 356 ± 11 0.10 ± 0.03 -41.9 ± 3.1
FGF-2 2:100 96 ± 1 437 ± 75 0.22 ± 0.06 -43.3 ± 2.9
BMP-2 0.5:100 100 380 ± 6 0.11 ± 0.02 -42.6 ± 3.2
BMP-2 1:100 100 389 ± 11 0.09 ± 0.03 -41.7 ± 0.2
리소자임 1:100 100 357 ± 1 0.09 ± 0.01 -43.5 ± 3.5
리소자임 2:100 100 353 ± 5 0.09 ± 0.02 -44.4 ± 3.8
1혼입 반응은 50% PBS에서 단백질과 DSCS NP 중의 하전된 글루코오스설페이트를 표시된 비율로 20분 동안 혼합함으로써 수행하였다.
실시예 3: SDF-1α 나노입자 및 VEGF 나노입자의 활성 및 안정성
이동 검정 프로토콜:
저캇 세포 이동 검정을 이용하여 SDF-lα의 주화성 검정 활성을 측정하였다. 앞서 기술한 절차를 따랐다(예를 들어, 문헌[Yin, T. et al. SDF-lalpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules 2013, 14 (11), 4009~20] 참조).
내피세포 증식 검정 프로토콜:
이러한 검정을 이용하여 VEGF의 활성을 측정하였으며, 이를 위해 앞서 기술한 절차를 따랐다(예를 들어, 문헌[Lauten, E. et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules 2010, 11 (7), 1863~72] 참조). 상기 검정을 위해 인간 폐동맥 내피세포(HPAEC)를 사용하였으며, 세포 증식을 평가하기 위해 세포 증식 검정 키트(CellTiter 96)를 사용하였다.
SDF NP의 활성 및 안정성 :
NP가 혼입된 SDF-1α(SDFNP)의 주화성 활성을 검토하기 위해, 저캇 세포 이동 검정을 수행하였다. 유리 형태 또는 나노미립자 형태인 SDF-lα를 이동 배지에서 1 및 3 ng/㎖의 농도까지 희석하고, 이동 검정을 위해 사용하였다. 도 8a에 나타나 있는 바와 같이, 분석된 SDF-lα의 농도 둘 모두에서 유리 SDF-lα 및 SDF- lα 나노입자의 이동 활성은 유사하였으며, 이는 NP의 혼입이 SDF-lα의 주화성 활성에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다.
단백질 나노입자의 열적 안정성을 측정하기 위해, 유리 SDF-lα 및 SDF- lα 나노입자(SDF NP)를 2.5% 만니톨에서 희석하고, 37 ℃에서 최대 24일 동안 배양하였다. 다양한 시간에 분취액을 취하고, 이동 검정에 의해 분석하였다. 도 8b에 나타나 있는 바와 같이, 37 ℃에서의 6일, 14일 및 24일간의 배양 이후, SDF-lα의 활성은 각각 61 ± 9%, 29 ± 12% 및 29 ± 5%인 반면, SDF NP의 활성은 각각 96 ± 5%, 80 ± 20% 및 52 ± 4%이었다. 따라서 DSCS 나노입자의 혼입에 의해 SDF-lα의 열적 안정성이 개선되었다. 연구에 따르면 헤파린에 결합하면 SDF-lα가 프로테아제 분해로부터 보호되는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Sadir, R. et al. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J. Biol. Chem. 2004, 279, (42), 43854~60]; 및 문헌[Takekoshi, T. et al. A locked, dimeric CXCL12 variant effectively inhibits pulmonary metastasis of CXCR4-expressing melanoma cells due to enhanced serum stability. Mol. Cancer Ther. 2012, 11, (11), 2516~25]).
VEGF NP의 활성 및 안정성 :
내피세포 증식 검정을 이용하여 VEGF의 활성을 검토하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, NP가 혼입된 VEGF(VEGF NP)는 VEGF와 유사한 활성을 가졌으며, 이러한 활성은 포괄법에 의해 제조된 VEGF NP를 사용하는 이전 연구결과와 일치하였다(예를 들어, 문헌[Lauten, E. et al, Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules 2010, 11 (7), 1863~72]). VEGF 및 VEGF NP의 열적 안정성을 비교하기 위해, 샘플을 37 ℃에서 최대 20일 동안 배양하였다. 다양한 배양 시간에 샘플의 활성을 분석하고, 4 ℃로 유지되는 VEGF 저장액(대조군)과 비교하였다. 배양 13일 및 20일째 날의 샘플의 활성이 도 9b 및 도 9c에 각각 나타나 있다.
상기 결과에 따르면 VEGF 및 VEGF NP 둘 모두는 37 ℃에서 20일 동안의 배양 이후에 온전한 활성을 유지하는 것으로 나타나며, 이는 유리 형태의 VEGF가 통상 열적으로 안정하고, 37 ℃에서 20일간 배양하여도 VEGF와 VEGF NP 사이의 안정성이 구별되지 않는다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 VEGF의 열적 안정성을 결정하기 위해 시차 주사 열량 분석법을 이용하는 이전 연구와 일치한다(예를 들어, 문헌[Huang, M et al. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules 2007, 8, (5), 1607~14]; 및 문헌[Muller, Y. et al. The cystine knot promotes folding and not thermodynamic stability in vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem. 2002, 277, (45), 43410~6]을 참고하며, 여기서 VEGF는 107 ℃ 또는 l08 ℃의 매우 높은 용융점을 가지며, 이는 열적 안정성이 매우 높다는 것을 보여주는 것으로 밝혀져 있음]). DSCS 나노입자 내로 VEGF를 혼입하면 용융점을 115 ℃ 초과까지 추가로 증가시키며, 이는 VEGF의 열적 안정성이 DSCS NP 내로의 혼입에 의해 추가로 향상된다는 것을 보여준다.
실시예 4: DSCS 나노입자를 가교하기
입자의 코어 중의 키토산을 디카르복실산과 가교시킴으로써 DSCS 나노입자를 공유결합으로 변형하였다. 이러한 방법에서, DSCS NP를 HEPES[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산] 완충수(pH 7.0)에서 현탁하였다. NP를 짧은 사슬 디카르복실산(예를 들어, 글루타르산, 말산, 숙신산 또는 타르타르산; 5 내지 30 mM), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC; 20 내지 100 mM)) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS; 20 내지 100 mM)과 25 ℃에서 16시간 동안 혼합함으로써 가교 반응을 수행하였다. 입자를 15분 동안 15,000 x g로 원심분리하여 침전시키고, DPBS로 세척하고, 염-저항성 선택을 위해 3x DPBS(3배의 높은 농도의 DPBS)에서 재현탁하였다. 3시간의 배양 이후, 현탁액 중의 응집체를 15분 동안 200 x g로 원심분리하여 침전시켰으며, 나머지 입자는 15분 동안 15,000 x g로 원심분리하여 침전시켰다. 이어서, 입자를 DPBS에서 재현탁하고, 기공 크기가 0.22마이크로미터인 PVDF 막에 여과하였다. 상기 얻어진 입자는 가교된 NP(xNP)로서 지칭된다. 가교 반응에 의해 키토산 중의 아민기와 디카르복실산 중의 카르복실기 사이에 아미드 결합이 형성되며, 이러한 결합은 입자의 코어에서 키토산을 함께 가교시킨다. 가교된 NP 중의 새로운 아미드 결합의 형성은 도 12 및 도 15에 나타나 있는 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼에서 증명된다.
가교된 DSCS NP(xNP)의 특성
가교된 DSCS NP(xNP)는 가교되지 않은 입자와 비교하여 상당한 염 안정성을 얻었다. 도 13, 도 16 및 도 17에 나타나 있는 바와 같이, xNP의 입자 크기 및 균질성(다분산 지수)는 최대 2M NaCl 용액에서 배양한 이후에도 변하지 않는 반면, 가교되지 않은 DSCS NP는 0.15 M NaCl 용액에서 응집하였다. 유사하게, xNP는 소 태아 혈청(혈청) 및 완전 세포 배양 배지(10% FBS 포함 RPMI 1640(RPMI+))에서 안정한 반면, DSCS NP는 이들 배지에서 응집하였다.
가교 반응이 입자의 코어 내에서 일어나므로 xNP는 DSCS NP와 유사한 입자 크기 및 표면 물성을 갖는다. xNP는 헤파린 결합 단백질이 DSCS NP와 유사한 방식으로 혼입되도록 하고(도 14 및 표 4), 결합된 단백질은 온전하거나 향상된 생물학적 활성을 나타낸다. 도 18 및 도 19를 참고한다.
가교된 나노입자 내로의 단백질의 혼입:
도 14 및 표 4에는 가교된 DSCS NP(xNP) 내로의 단백질의 혼입이 나타나 있다.
가교된 DSCS NP 내로의 단백질의 혼입
단백질 단백질:Gluc-SO3 -(nmol:nmol) 혼입 효율(%) 직경(㎚) 다분산 지수 제타 전위(mV)
부재 369 0.61 45.1
FGF-2 1:100 100 351 0.155 -48.8
FGF-2 2:100 100 423 0.382 -35.6
SDF-la 1:100 100 330 0.123 -40.6
SDF-la 2:100 100 324 0.233 -35.9
BMP-2 0.5:100 100 343 0.117 -46.9
VEGF 0.5:100 95 323 0.114 -45.1
프로토콜:
표시된 양의 FGF-2, SDF-lα, BMP-2 또는 VEGF를 100 nmol의 하전된 글루코오스설페이트 단위(Gluc-SO3 -)를 함유하는 xNP와 PBS에서 20분 동안 혼합하였다. 혼입되지 않은 단백질을 원심분리하여 입자로부터 분리하고, 얻어진 펠릿(P) 및 상층액(S) 분획을 SDS 겔 상에서 분석하였다(도 14에 나타나 있는 바와 같음). 겔 밴드의 농도측정 분석에 기초하여 혼입 효율을 추정하였다. 이어서, 단백질이 혼입된 xNP를 동결 건조하고, -80 ℃에서 저장하였다. PBS에서 NP를 복원한 후에 단백질이 혼입된 xNP의 입자 크기 및 제타 전위를 측정하였다. 데이터에 따르면 xNP에 대한 검토된 성장 인자의 혼입 효율은 95 내지 100%이고, xNP의 입자 크기 및 제타 전위는 표시된 단백질 로딩 비율에서 크게 변하지 않았으며, 입자는 혼입 및 저장 과정 전반에 걸쳐 안정한 것으로 나타났다.
생체 내 특성
xNP는 체액 또는 반유동체 신체 표면에서 응집하지 않는다. 이러한 특성은, 특히 염증성 질환의 환경에서 입자에 대한 염증 반응을 예방한다. 도 20은 상기 차이의 일례를 보여준다. 연구에 사용된 래트에 폐 내피세포 손상 및 폐 고혈압을 유발하는 모노크로탈린을 주사하였다. 게다가, 래트는 줄기세포 요법용으로 사용되는 면역 억제제인 사이클로스포린을 매일 투여 받았다. DSCS NP 및 xNP를 이들 래트의 폐로 연무 주입하는 경우, DSCS NP로 처리된 래트 일부에서 염증 및 섬유증이 발견되었지만, xNP로 처리된 래트에서는 발견되지 않았다. 이러한 결과에 따르면 xNP가 생체 내 전달 목적에 있어서 DSCS NP보다 우수할 수 있다는 것을 암시한다.
가교된 나노입자의 특성 분석
덱스트란설페이트 및 키토산 나노입자(DSCS NP) 및 이의 가교된 유도체인 MA xNP, SA xNP 및 TA xNP에 대한 푸리에 변환 적외선 스펙트럼은 도 12에 나타나 있다. 데이터에 따르면 가교된 NP에서 아미드 결합이 형성하는 것으로 나타난다.
가교된 나노입자의 안정성
가교된 DSCS NP의 안정성은 도 13에 증명되어 있다. 가교된 NP인 MA xNP, SA xNP 또는 TA xNP를 소 태아 혈청(FBS) 또는 10% FBS 포함 RPMI 1640(RPMI)와 함께 25 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 입자를 세척하고, PBS에서 현탁하였으며, 이들의 크기 및 제타 전위를 측정하였다. 데이터에 따르면 가교된 DSCS NP는 완전 혈청 또는 세포 배양 배지에서 안정한 것으로 나타나 있다.
변형된 DSCS NP는 고염 용액 또는 다양한 생리 유체(혈장을 포함함)에서 안정하며, 치료 목적을 위해 헤파린 결합 단백질과 함께 용이하게 로딩될 수 있다. 입자는 혈액에 주사하는데 보다 적합한 아연 이온 대신에 칼슘 이온을 함유한다.
실시예 5: SDF-lα 함량에 대한 기관 내 연무 주입 및 폐 조직의 분석(SDF NP의 생체 내 체류 시간)
체중이 200 내지 225 g인 스프라그다울리 수컷 래트를 챨스 리버 레버러토리스(Charles River Laboratories)로부터 구매하였으며, 본 발명자의 동물 시설에서 4일 동안 적응시켰다. 동물에 대한 하버드 메디컬 부분 상임 위원회(Harvard Medical Area Standing Committee on Animals)가 승인한 프로토콜에 따라 동물 연구를 수행하였다.
앞서 기술한 절차에 따라 폐의 SDF-lα 함량에 대한 분석뿐만 아니라 SDF-lα 또는 SDF 나노입자의 기관 내 연무 주입을 수행하였다(예를 들어, 문헌[Yin, T. et al, SDF-lαlpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules 2013, 14 (11), 4009~20]). 간단히 말하면, SDF-lα 함량이 12 ㎍인 SDF-lα 또는 SDF 나노입자를 50% PBS에서 0.25 ㎖의 부피로 희석하고, 펜-센츄리(Penn-Century)사의 마이크로스프레이어 연무기를 이용하여 래트의 폐 내로 연무 주입하였다. 연무 주입 후 0시간, 16시간, 48시간 및 72시간에 래트 폐 조직을 채취하고, 액체 질소로 냉동시켰다. 조직을 균질화하고, 균질액 상층액 중의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정에 의해 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 알앤디 시스템즈사의 시약을 이용하여 상층액 중의 SDF-lα 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 유리 형태의 SDF-lα에 노출된 폐 조직 중의 SDF-lα 함량은 연무 주입 16시간 이후에 거의 검출 불가능하였으며(약 2% 잔류), 전달 후 16시간, 48시간 및 72시간에는 초기 값의 100%, 76% 및 34%로 SDF NP에 노출된 폐에서 각각 검출 가능하였다.
참고문헌
1. Leader B, Baca QJ, Golan DE. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. Jan 2008; 7(1): 21~39.
2. Kontermann RE. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics. Curr. Opin. Biotechnol. Dec 2011; 22(6): 868~876.
3. Chen Y, Siddalingappa B, Chan PH, Benson HA. Development of a chitosan-based nanoparticle formulation for delivery of a hydrophilic hexapeptide, dalargin. Biopolymers. 2008; 90(5): 663~670.
4. Sarmento B, Ribeiro A, Veiga F, Ferreira D, Neufeld R. Oral bioavailability of insulin contained in polysaccharide nanoparticles. Biomacromolecules. Oct 2007; 8(10): 3054~3060.
5. Huang M, Vitharana SN, Peek LJ, Coop T, Berkland C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. May 2007; 8(5): 1607~1614.
6. Drogoz A, Munier S, Verrier B, David L, Domard A, Delair T. Towards biocompatible vaccine delivery systems: interactions of colloidal PECs based on polysaccharides with HIV-1 p24 antigen. Biomacromolecules. Feb 2008; 9(2): 583~591.
7. Huang M, Berkland C. Controlled release of repifermin from polyelectrolyte complexes stimulates endothelial cell proliferation. J. Pharm. Sci. Jan 2009; 98(1): 268~280.
8. Sharma S, Mukkur TK, Benson HA, Chen Y. Enhanced immune response against pertussis toxoid by IgA-loaded chitosan-dextran sulfate nanoparticles. J. Pharm. Sci. Jan 2012; 101(1): 233~244.
9. Lauten EH, VerBerkmoes J, Choi J, et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. Jul 12 2010; 11(7): 1863~1872.
10. Yin T, Bader AR, Hou TK, et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. Nov 11 2013; 14(11): 4009~4020.
11. Ricketts CR. Dextran sulphate-a synthetic analogue of heparin. Biochem. J. Apr 1952; 51(1): 129~133.
12. Xu D, Esko JD. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu. Rev. Biochem. 2014; 83: 129~157.
13. Gallagher J. Fell-Muir Lecture: Heparan sulphate and the art of cell regulation: a polymer chain conducts the protein orchestra. Int J Exp Pathol. Aug 2015; 96(4): 203~231.
14. Ori A, Wilkinson MC, Fernig DG. A systems biology approach for the investigation of the heparin/heparan sulfate interactome. J. Biol. Chem. Jun 3 2011; 286(22): 19892~19904.
15. Bader AR, Li T, Wang W, Kohane DS, Loscalzo J, Zhang YY. Preparation and characterization of SDF-1alpha-chitosan-dextran sulfate nanoparticles. J Vis Exp. 2015(95): 52323.
16. Ellis HA, Walton KW. The estimation and recovery of dextran sulphates in biological fluids. J. Clin. Pathol. Sep 1959; 12: 467~472.
17. Grant AC, Linhardt RJ, Fitzgerald GL, Park JJ, Langer R. Metachromatic activity of heparin and heparin fragments. Anal. Biochem. Feb 1984; 137(1): 25~32.
18. Mendelovits A, Prat T, Gonen Y, Rytwo G. Improved colorimetric determination of chitosan concentrations by dye binding. Appl Spectrosc. Aug 2012; 66(8): 979~982.
19. Muzzarelli RA. Colorimetric determination of chitosan. Anal. Biochem. Jul 1 1998; 260(2): 255~257.
20. Stebler J, Spieler D, Slanchev K, et al. Primordial germ cell migration in the chick and mouse embryo: the role of the chemokine SDF-1/CXCL12. Dev. Biol. Aug 15 2004; 272(2): 351~361.
21. Sharma M, Afrin F, Satija N, Tripathi RP, Gangenahalli GU. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. Jun 2011; 20(6): 933~946.
22. Ghadge SK, Muhlstedt S, Ozcelik C, Bader M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol. Ther. Jan 2011; 129(1): 97~108.
23. Amara A, Lorthioir O, Valenzuela A, et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J. Biol. Chem. Aug 20 1999; 274(34): 23916~23925.
24. Sadir R, Baleux F, Grosdidier A, Imberty A, Lortat-Jacob H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J. Biol. Chem. Mar 16 2001; 276(11): 8288~8296.
25. Fermas S, Gonnet F, Sutton A, et al. Sulfated oligosaccharides (heparin and fucoidan) binding and dimerization of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1/CXCL 12) are coupled as evidenced by affinity CE-MS analysis. Glycobiology. Dec 2008; 18(12): 1054~1064.
26. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med (Berl). Jul 1999; 77(7): 527~543.
27. Fairbrother WJ, Champe MA, Christinger HW, Keyt BA, Starovasnik MA. Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure. May 15 1998; 6(5): 637~648.
28. Robinson CJ, Mulloy B, Gallagher JT, Stringer SE. VEGF165-binding sites within heparan sulfate encompass two highly sulfated domains and can be liberated by K5 lyase. J. Biol. Chem. Jan 20 2006; 281(3): 1731~1740.
29. Zhao W, McCallum SA, Xiao Z, Zhang F, Linhardt RJ. Binding affinities of vascular endothelial growth factor (VEGF) for heparin-derived oligosaccharides. Biosci Rep. Feb 2012; 32(1): 71~81.
30. DiGabriele AD, Lax I, Chen DI, et al. Structure of a heparin-linked biologically active dimer of fibroblast growth factor. Nature. Jun 25 1998; 393(6687): 812~817.
31. Faham S, Hileman RE, Fromm JR, Linhardt RJ, Rees DC. Heparin structure and interactions with basic fibroblast growth factor. Science. Feb 23 1996; 271(5252): 1116~1120.
32. Schlessinger J, Plotnikov AN, Ibrahimi OA, et al. Crystal structure of a ternary FGF-FGFR-heparin complex reveals a dual role for heparin in FGFR binding and dimerization. Mol. Cell. Sep 2000; 6(3): 743~750.
33. Ruppert R, Hoffmann E, Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur. J. Biochem. Apr 1 1996; 237(1): 295~302.
34. Vallejo LF, Rinas U. Folding and dimerization kinetics of bone morphogenetic protein-2, a member of the transforming growth factor-beta family. FEBS J. Jan 2013; 280(1): 83~92.
35. Zou S, Magura CE, Hurley WL. Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozyme. Comp Biochem Physiol B. Dec 1992; 103(4): 889~895.
36. Morris J, Jayanthi S, Langston R, et al. Heparin-binding peptide as a novel affinity tag for purification of recombinant proteins. Protein Expr Purif. Oct 2016; 126: 93~103.
37. Sadir R, Imberty A, Baleux F, Lortat-Jacob H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J. Biol. Chem. Oct 15 2004; 279(42): 43854~43860.
38. Takekoshi T, Ziarek JJ, Volkman BF, Hwang ST. A locked, dimeric CXCL12 variant effectively inhibits pulmonary metastasis of CXCR4-expressing melanoma cells due to enhanced serum stability. Mol. Cancer Ther. Nov 2012; 11(11): 2516~2525.
39. Muller YA, Heiring C, Misselwitz R, Welfle K, Welfle H. The cystine knot promotes folding and not thermodynamic stability in vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem. Nov 8 2002; 277(45): 43410~43416.
40. Delair, T. (2011) Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm 78, 10~18.
41. Zaman, P., Wang, J., Blau, A., Wang, W., Li, T., Kohane, D. S., Loscalzo, J., and Zhang, Y. Y. (2016) Incorporation of heparin-binding proteins into preformed dextran sulfate-chitosan nanoparticles. Int J Nanomedicine 11, 6149~6159.
기타 실시형태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 개시되어 있을지라도 상기 설명은 예시를 위한 것이지 첨부된 청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 제한하기 위한 것은 아니다. 기타 양태, 이점 및 변경은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (93)

  1. 치료용 입자를 제조하는 방법으로서,
    i) 치료용 단백질을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    ii) 음으로 하전된 다당류(polysaccharide) 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 포함하며, 이때 상기 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 현탁액을 수득하는 단계로서, 상기 양으로 하전된 다당류는 입자의 코어 내의 디카르복실산 링커에 의해 공유결합으로 가교되는 것인 단계; 및
    iii) 상기 치료용 단백질의 용액 및 상기 제1 현탁액을 혼합하여 상기 치료용 입자를 포함하는 제2 현탁액을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 치료용 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 골형성 단백질-2(BMP-2), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 리소자임으로부터 선택되는 것인, 치료용 입자를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 음으로 하전된 다당류는 생리적 pH에서 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함하고,
    상기 양으로 하전된 다당류는 생리적 pH에서 양으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 입자 중의 음으로 하전된 다당류 내에 음으로 하전된 작용기를 갖는 단당류 단위에 대한 상기 용액 중의 치료용 단백질의 몰비는 0.25:100 내지 3:100이고,
    상기 입자 중의 양으로 하전된 다당류에 대한 음으로 하전된 다당류의 중량비는 3:1 내지 5:1인 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 음으로 하전된 다당류는 카르복실산(-C(=O)OH), 설폰산(-S(=O)2(OH) 또는 -SO3H) 및 포스폰산(-P(=O)(OH)2)으로부터 선택된 작용기를 갖는 단당류 단위를 포함하고,
    상기 양으로 하전된 다당류는 아미노기(-NH2)를 갖는 단당류 단위를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 음으로 하전된 다당류는 글리코사미노글리칸 또는 글리칸이고,
    상기 양으로 하전된 다당류는 폴리글루코사민인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 음으로 하전된 다당류는 헤파린, 황산헤파란, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라탄, 히알루론산, 및 덱스트란설페이트로부터 선택되고,
    상기 양으로 하전된 다당류는 키토산인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    iv) 음으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 용액을 수득하는 단계;
    v) 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제2 용액을 수득하는 단계; 및
    vi) 상기 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 음으로 하전된 다당류 및 양으로 하전된 다당류를 포함하는 입자를 포함하며, 이때 상기 입자의 코어가 양으로 하전된 다당류를 포함하는 제1 현탁액을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단계 iii)에서 제1 용액과 제2 용액을 혼합한 후, 상기 혼합물에 금속 염의 수용액을 첨가하고,
    상기 단계 iii)의 혼합물에 상기 금속 염의 수용액의 첨가 후, 상기 혼합물에 당 알코올의 수용액을 첨가하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 금속 염은 아연 염이고, 상기 당 알코올은 만니톨인 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제1 현탁액과 디카르복실산을 혼합하여 상기 입자의 코어 내의 양으로 하전된 다당류의 가교를 구현하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 헤파린 결합 도메인을 포함하고, 상기 치료용 단백질은 상기 치료용 입자 내의 음으로 하전된 다당류에 비공유결합으로 결합되어 있는 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 치료용 단백질, 양으로 하전된 다당류 및 음으로 하전된 다당류를 포함하는 치료용 입자로서,
    상기 입자는 코어 및 외피로 이루어지며,
    상기 입자의 코어는 양으로 하전된 다당류를 포함하며, 상기 양으로 하전된 다당류는 입자의 코어 내의 디카르복실산 링커에 의해 공유결합으로 가교되고,
    상기 외피 내 치료용 단백질은 치료용 입자 내 상기 음으로 하전된 다당류에 비공유결합으로 결합되며,
    상기 치료용 단백질은 간질 세포 유래 인자-1α(SDF-1α), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 골형성 단백질-2(BMP-2), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2) 및 리소자임으로부터 선택되는 것인, 치료용 입자.
  16. 제15항의 치료용 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 질병 또는 병태를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질병 또는 병태는 암, 염증, 황반 변성, 및 폐 고혈압 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102511953B1 (ko) 2016-08-01 2023-03-20 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 단백질 및 펩티드 전달용 입자
US11123304B2 (en) 2017-02-03 2021-09-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles having poly(ester amide) polymer cores as drug delivery vehicles
EP3829598A4 (en) * 2018-08-01 2022-06-29 Nanoneuron Therapeutics, Inc. Neuroprotective compositions and use thereof
CN111607103B (zh) * 2020-06-30 2022-05-17 江苏创健医疗科技有限公司 烷基膦酰基改性胶原基材料及制备方法、改性胶原、应用
US20220143272A1 (en) * 2020-07-14 2022-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic heparin mimetics and uses thereof
WO2023245293A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-28 Oligo Medic Inc. A nanoparticle architecture for combined in vivo stealth and selective targeting
CN115778918A (zh) * 2022-10-10 2023-03-14 中国药科大学 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用
CN117462664B (zh) * 2023-10-29 2024-09-03 浙江省农业科学院 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080254078A1 (en) * 2005-09-16 2008-10-16 Peter Kauper Chitosan-Based Particles
JP2009215220A (ja) * 2008-03-11 2009-09-24 Keio Gijuku マイクロカプセル及びその製造方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8137684B2 (en) * 1996-10-01 2012-03-20 Abraxis Bioscience, Llc Formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
GB9925962D0 (en) 1999-11-02 1999-12-29 Novartis Ag Organic compounds
UA76463C2 (en) 2001-05-03 2006-08-15 Hoffmann La Roche Pharmaceutical dosage form of amorphous nelfinavir mesylate
US6737042B2 (en) 2001-05-24 2004-05-18 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of drug esters through an inhalation route
US20050163821A1 (en) * 2002-08-02 2005-07-28 Hsing-Wen Sung Drug-eluting Biodegradable Stent and Delivery Means
FR2862536B1 (fr) 2003-11-21 2007-11-23 Flamel Tech Sa Formulations pharmaceutiques pour la liberation prolongee de principe(s) actif(s), ainsi que leurs applications notamment therapeutiques
US7740883B2 (en) 2004-03-28 2010-06-22 University Of Debrecen Nanoparticles from chitosan
US20060094744A1 (en) 2004-09-29 2006-05-04 Maryanoff Cynthia A Pharmaceutical dosage forms of stable amorphous rapamycin like compounds
US9492400B2 (en) * 2004-11-04 2016-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
US8338366B2 (en) 2005-03-14 2012-12-25 The Board of Regents of the University of the Texas System Bioactive FUS1 peptides and nanoparticle-polypeptide complexes
CA2622210A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
WO2007055789A2 (en) 2005-10-31 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble therapeutic proteins
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
WO2009009469A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Ultra-small chitosan nanoparticles useful as bioimaging agents and methods of making same
WO2009022358A1 (en) 2007-08-10 2009-02-19 Luigi Ambrosio Superabsorbent polymer hydro gels and a method of preparing thereof
US20130195888A1 (en) 2007-11-30 2013-08-01 Abbvie Ultrafiltration and diafiltration formulation methods for protein processing
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
CN102477172B (zh) 2010-11-29 2016-01-13 吴忠仕 壳聚糖-肝素纳米颗粒以及用该纳米颗粒处理的去细胞基质的生物材料
CN102532580B (zh) * 2012-02-06 2013-06-12 浙江大学 一种制备多功能纳米载体的方法
WO2016040814A2 (en) 2014-09-11 2016-03-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Disulfide polymers and methods of use
WO2016061201A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles and methods of use
US10583091B2 (en) 2014-10-23 2020-03-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Amphiphile-polymer particles
US10639588B2 (en) * 2015-08-28 2020-05-05 Serionix, Inc. Gas filters for acidic contaminants
US11833255B2 (en) 2015-10-07 2023-12-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles with pH triggered drug release
KR102511953B1 (ko) 2016-08-01 2023-03-20 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 단백질 및 펩티드 전달용 입자
US11123304B2 (en) 2017-02-03 2021-09-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles having poly(ester amide) polymer cores as drug delivery vehicles

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080254078A1 (en) * 2005-09-16 2008-10-16 Peter Kauper Chitosan-Based Particles
JP2009215220A (ja) * 2008-03-11 2009-09-24 Keio Gijuku マイクロカプセル及びその製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Paula Zaman et al., Incorporation of SDF-1α into Pre-formed Dextran Sulfate and Chitosan Nanoparticles, The FASEB Journal, Volume 29, Issue S1, LB645, 01 April 2015
Tao Yin et al., Biomacromolecules, 2013, vol. 14, pp. 4009-4020

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