JP2019523285A - タンパク質およびペプチドの送達のための粒子 - Google Patents

タンパク質およびペプチドの送達のための粒子 Download PDF

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Abstract

本出願は、粒子を製造する方法であって、（ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；（ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；（ｉｉｉ）第１の溶液と第２の溶液とを混合して、粒子を含む懸濁液を得ることとを含む方法を提供する。本出願はまた、治療用粒子を製造する方法であって、（ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；（ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を含む第１の懸濁液を得ることと；（ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液とを混合して、治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることとを含む方法を提供する。本出願はまた、開示する方法のいずれか１つによって調製される粒子（例えば、治療用粒子）、ならびにこうした粒子を含む組成物、およびこうした粒子および組成物を使用して疾患または状態を治療する方法を提供する。

Description

優先権の主張
本願は、２０１６年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７４，６３９号明細書；２０１６年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７１，３０６号明細書；および２０１６年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６９，４１２号明細書の利益を主張する。前述の内容全体を、参照により本明細書に組み込む。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって拠出された補助金番号ＨＬ０４８７４３、ＨＬ０６１７９５、ＧＭ１０７６１８、およびＨＬ１０８６３０に基づいて、政府支援の下で行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、粒子、その組成物、製造の方法、および使用の方法に、また、詳細には、治療用タンパク質などの治療用分子を含む粒子に関する。
タンパク質による治療法は、疾患の治療において重要である。したがって、タンパク質などの生体分子の、例えば、肺、経鼻、静脈内、非経口、皮下、および経口経路を介する、患者への送達のための改良された方法を開発する必要性が存在する。
多数の粒子（例えば、ナノ粒子（ＮＰ））プラットフォームが、タンパク質の送達のために開発されている。しかし、既存のタンパク質送達用途のためのＮＰの能力は、例えば、低装填効率および制御できない放出プロフィールが原因で、制限されたままである。
臨床解釈を達成するために克服されなければならないタンパク質ベースの治療薬の開発および製造の難しさが原因で、タンパク質薬物およびタンパク質送達ナノメディシンの臨床解釈は妨げられている。均質化、超音波処理、押し出し、および溶媒への曝露などの、合成の化学的結合および製剤パラメータなどの制限が、しばしば、生体分子（例えば、治療用タンパク質）の不活性化をもたらす。所望の疾患組織へのタンパク質治療薬の安全かつ有効な送達は、重要な課題のままである。本開示の粒子、組成物、および方法は、この必要性を満たすのを助ける。
いくつかの実施態様では、本開示は、特に、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子を含む（ここでは、正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共有結合的に架橋されている）、第１の懸濁液を得ることと
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水性の溶媒を含む。いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水および緩衝生理食塩水から選択される。いくつかの実施態様では、緩衝生理食塩水は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、第１の懸濁液は、水性の溶媒を含む。
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．２５：１００から約３：１００である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、治療用タンパク質の溶液を第１の懸濁液に添加することによって実施される。
いくつかの実施態様では、混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
いくつかの実施態様では、混合は、約２０分間実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
いくつかの実施態様では、糖アルコールの溶液は、水溶液である。
いくつかの実施態様では、糖アルコールの水溶液は、約２．５重量％のマンニトールを含む。
いくつかの実施態様では、糖アルコールの水溶液は、約５重量％のマンニトールを含む。
いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約９０％から約１００％である。
いくつかの実施態様では、粒子は、ナノ粒子である。
いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、約３００ｎｍから約６００ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のコアの直径は、粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未満である。
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約３：１から約５：１である。
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４：１である。
いくつかの実施態様では、検出可能な量の、粒子中の負の電荷を持つ多糖は、粒子調製物に使用される総量の約８０％である。
いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は、約−３５ｍＶから約−５０ｍＶである。いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は、約−４０ｍＶから約−４５ｍＶである。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、カルボン酸（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）または−ＳＯ３Ｈ）、およびホスホン酸（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、グリコサミノグリカンである。いくつかの実施態様では、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、グリカンである。いくつかの実施態様では、グリカンは、硫酸デキストランである。
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、アミノ基（−ＮＨ２）である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、ポリグルコサミンである。いくつかの実施態様では、ポリグルコサミンは、キトサンである。
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中で（例えば、共有結合的に）架橋されている。
いくつかの実施態様では、架橋剤は、ジカルボン酸である。
いくつかの実施態様では、ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、架橋のための触媒は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、耐塩性について選択される。
いくつかの実施態様では、選択は、３倍濃縮されたＤＰＢＳとのインキュベーションによって行われる。
いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、滅菌される。
いくつかの実施態様では、滅菌は、粒子を０．２２μｍ濾過膜に通過させることを含む。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、治療用粒子中の負の電荷を持つ多糖に結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖は、非共有結合的に結合されている。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質に固有のものである。
いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質の組換え産生中に、治療用タンパク質にタグ付けされる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される。
いくつかの実施態様では、増殖因子は、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される。
いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
いくつかの実施態様では、酵素は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ）、β−グルコ−セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｌｐｈａｓｅ）、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ（ｇａｌｓｕｌｐｈａｓｅ）、アガルシダーゼ−β、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１−プロテイナーゼ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼ（ｇａｌｓｕｌｆａｓｅ）から選択される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ−１αに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ−２に関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ−２に関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、リゾチームであり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用粒子は、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｖ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｖ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｖｉ）３つの溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖｉｉ）遠心分離によって、懸濁液中で粒子を沈殿させることと、
ｖｉｉｉ）粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｉｘ）粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、粒子のコア中の正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｘ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｘｉ）粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される。
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水溶液である。
いくつかの実施態様では、第１の溶液における水溶液は、水である。
いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、第２の溶液は、水溶液である。
いくつかの実施態様では、第２の溶液における水溶液は、約０．２％酢酸水溶液である。
いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第２の溶液を第１の懸濁液に添加することによって実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における第１の溶液と第２の溶液の混合の後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。
いくつかの実施態様では、金属は、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される。いくつかの実施態様では、金属は、カルシウムである。いくつかの実施態様では、金属は、亜鉛である。
いくつかの実施態様では、金属塩は、ＺｎＳＯ４である。いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）の混合物への金属塩の水溶液の添加の後に、この混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、糖アルコールは、マンニトールである。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１５重量％である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多糖との重量比は、約７５：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
いくつかの実施態様では、糖アルコールは、マンニトールである。
いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約５重量％である。
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に開示した方法のいずれか１つによって調製される治療用粒子を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって調製される、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に記載した通りの治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示はまた、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法であって、本明細書に記載した通りの治療有効量の治療用粒子またはその医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、疾患または状態は、治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、癌である。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本出願が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本出願に使用するために本明細書に記載されており；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定ではない。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献の全体を、参照によって組み込む。矛盾する場合は、本明細書が、定義を含めて、優先されることとなる。
本出願の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、また、特許請求の範囲から明らかであろう。
凍結乾燥中の硫酸デキストランおよびキトサン（ＤＳＣＳ）ナノ粒子の安定性に対するマンニトールの効果を示す棒グラフである。ＤＳＣＳナノ粒子を、示された濃度でマンニトール溶液に懸濁させ、凍結乾燥させた。サイズ測定の前に、粒子を水で再構成して元の体積とした。データは、３つの調製物からの測定値の平均±ＳＤを表す。 ＤＳＣＳ粒径に対する亜鉛濃度の効果を示す棒グラフである。粒子を、示された濃度のＺｎＳＯ４と共に調製し、調製後に５％マンニトールに再懸濁した。粒径は、凍結乾燥の前（黒色バー）と後（灰色バー）に測定した。データは、３つの別の調製物の測定値の平均±ＳＤを表す。 アズールＡの吸収スペクトルを示す折れ線グラフである。点線は、ＤＳ濃度の増大に伴って吸光度が相対的に変化した（５１０および６２０ｎｍ）または変化しなかった（５４８ｎｍ、等吸収点）波長を示す。 ９６ウェルプレートフォーマットにおいて荷電ＤＳを測定するために使用される検量線の例を示す折れ線グラフである。 ＳＤＦ−ｌαが組み込まれた粒子の粒径およびゼータ電位を示す。黒色バーは、反応がｐＨ６の水中で、灰色バーは、ｐＨ８の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で実施されたことを示す。ＳＤＦ−ｌαとＤＳＣＳナノ粒子は、４０μｇ荷電ＤＳあたりのＳＤＦ−ｌα（μｇ）の数値、またはＤＳＣＳナノ粒子中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ−ＳＯ３−）あたりのＳＤＦ−ｌα（ｎｍｏｌ）の数値として表される、示された比で混合した。 （左パネル）組み込まれていないタンパク質（上清、Ｓ）から粒子（ペレット、Ｐ）を分離するための遠心分離後の組み込みのＳＤＳゲル分析、および（右パネル）ゲルバンド中のＳＤＦ−ｌα含有量の濃度測定的定量化を示す。ここでは、グラフは、３つの別の調製物からの平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（ＳＤＦ−ｌαなしの対照と比較）を表す。 得られたＶＥＧＦが組み込まれた粒子の粒径およびゼータ電位を示す。ＶＥＧＦとＤＳＣＳナノ粒子は、より低い割合（１０〜２５μｇ ＶＥＧＦ／４０μｇ ＤＳ）の、または逆に、より高いＶＥＧＦ／ＮＰ比（２０〜８０μｇ／４０μｇ ＤＳ）の示された割合（これは、ＶＥＧＦの量を増大させることとＤＳＣＳナノ粒子の固定量を維持することとを通して達成された）で混合した。 ＶＥＧＦ組み込みのＳＤＳゲル分析（左および中央パネル）、およびゲルバンドの濃度測定分析から得られた組み込み効率（右パネル）を示す。データは、３つの別の調製物からの平均±ＳＤを表す。ＶＥＧＦとＤＳＣＳナノ粒子は、より低い割合（１０〜２５μｇ ＶＥＧＦ／４０μｇ ＤＳ）の、または逆に、より高いＶＥＧＦ／ＮＰ比（２０〜８０μｇ／４０μｇ ＤＳ）の、示された割合（これは、ＶＥＧＦの量を増大させることとＤＳＣＳナノ粒子の固定量を維持することとを通して達成された）で混合した。 ＳＤＳゲル電気泳動（左）、続いてバンドの分析に基づくタンパク質分布の濃度測定分析（右）によって分析される、ペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画中のタンパク質含有量を示す。データは、３つの別の組み込み反応からの平均±ＳＤを表す。組み込みは、タンパク質（２０μｇ ＳＤＦ−ｌαもしくはＶＥＧＦまたは５０μｇ ＢＳＡ）を、ＤＳＣＳナノ粒子（４０μｇ荷電ＤＳを含有）と、水（Ｈ２Ｏ）または５０％ＰＢＳ（ＰＢＳ）中で２０分間混合することによって実施した。次いで、粒子を、遠心分離によって、組み込まれていないタンパク質から分離した。 組み込み効率の推定のためにＳＤＳゲルに装填した等しい体積のペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を示す。データは、１回の組み込み実験からのものである。組み込み反応は、タンパク質とＤＳＣＳナノ粒子中の荷電糖単位（Ｇｌｕｃ−ＳＯ３−）との示されたモル比で、５０％ＰＢＳ中で実施した。粒子は、反応後すぐに遠沈させ、２．５％マンニトールに再懸濁して、元の体積とした。 ＳＤＦ−ｌαおよびＳＤＦＮＰの走化活性が、１ｎｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−ｌα濃度でのジャーカット細胞遊走アッセイによって検討されることを示す棒グラフである。ＳＤＦ−ｌα（黒色バー）およびＳＤＦＮＰ（灰色バー）試料は、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４日間インキュベートした。示された時点で、一定分量を取り出し、遊走アッセイで使用した。対照としてＳＤＦ−ｌαストック溶液（４℃に維持）を使用し、３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−ｌα濃度で遊走アッセイを実施した。データは、２つの別々に調製された試料からの４つの一定分量の平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（同じ群内のＳＤＦ−ｌα試料と比較）として表す。 ＳＤＦ−ｌαおよびＳＤＦＮＰの熱安定性の遊走アッセイを示す。ＳＤＦ−ｌα（黒色バー）およびＳＤＦＮＰ（灰色バー）試料は、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４日間インキュベートした。示された時点で、一定分量を取り出し、遊走アッセイで使用した。対照としてＳＤＦ−ｌαストック溶液（４℃に維持）を使用し、３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−ｌα濃度で遊走アッセイを実施した。データは、２つの別々に調製された試料からの４つの一定分量の平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（同じ群内のＳＤＦ−ｌα試料と比較）として表す。 肺動脈内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの活性を、示された濃度で検討し、比色定量細胞増殖アッセイによって測定したことを示す棒グラフである。ＯＤ４９０は、細胞増殖のレベルを示す。４℃に維持したＶＥＧＦストック溶液を、対照として使用した。データは、増殖アッセイにおいて３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。 ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの熱安定性を示す棒グラフである。試料は、２．５％マンニトールで５５μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃でインキュベートした。第１３日に、インキュベーション試料から一定分量を取り出し、内皮細胞増殖アッセイにかけた。データは、３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。 ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの安定性を示す棒グラフである。試料は、２．５％マンニトールで５５μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃でインキュベートした。第２０日に、インキュベーション試料から一定分量を取り出し、内皮細胞増殖アッセイにかけた。データは、３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。 ラットの肺におけるＳＤＦ−ｌαおよびＳＤＦＮＰの保持時間を示す棒グラフである。ＳＤＦ−ｌαおよびＳＤＦＮＰ（１２μｇ ＳＤＦ−ｌα含有量）を、ラットの肺にエアロゾル噴霧した。示された時点で、肺組織を採取し、ホモジナイズした。ホモジネート中のＳＤＦ−ｌαの濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。データは、４匹のラットから得られた組織からの平均±ＳＥＭを表す。 ＤＳＣＳナノ粒子の形成を模式的に示す図である。 架橋（ｘＮＰ）の前および後の、硫酸デキストランおよびキトサンナノ粒子（ＤＳＣＳ ＮＰ）のフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルを示す。データは、架橋されたＮＰと、ジカルボン酸によって導入されたカルボキシル基の残基における新しいアミド結合形成を示す。 架橋された ＤＳＣＳ ＮＰの安定性を示す棒グラフである。架橋されたＮＰ、ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、またはＴＡ ｘＮＰを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ）と共に、２５℃で１６時間インキュベートした。次いで、粒子をＰＢＳで洗浄および懸濁し、そのサイズおよびゼータ電位を決定した。データは、架橋されたＤＳＣＳ ＮＰが、完全な血清または細胞培養培地中で安定であることを示す。 架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）へのタンパク質の組み込みを示すプロットである。示された量のＦＧＦ−２、ＳＤＦ−ｌα、ＢＭＰ−２、またはＶＥＧＦを、１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ−ＳＯ３−）を含有するｘＮＰと、ＰＢＳ中で２０分間混合した。組み込まれていないタンパク質を、遠心分離によって粒子から分離し、得られたペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を、ＳＤＳゲル上で分析した。組み込み効率は、ゲルバンドの濃度測定分析に基づいて推定した。次いで、タンパク質が組み込まれたｘＮＰを、凍結乾燥させ、−８０℃で保管した。ＰＢＳでのＮＰの再構成後に、タンパク質が組み込まれたｘＮＰの粒子サイズおよびゼータ電位を決定した。データは、検討された増殖因子のｘＮＰへの組み込み効率が、９５〜１００％であり、ｘＮＰの粒径およびゼータ電位が、示されたタンパク質装填割合では有意には変化せず、粒子が、組み込みおよび保管プロセス全体を通して安定であったことを示す。 架橋前（ＤＳＣＳ ＮＰ）と架橋後（ｘＮＰ）のＤＳＣＳナノ粒子のフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルである。 ２５℃での１６時間のインキュベーション後の、ＮａＣｌ溶液中でのＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の粒子直径を示す棒グラフである。データは、ＤＳＣＳ ＮＰが生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で凝集するのに対して、ｘＮＰは最大２ＭまでのＮａＣｌ濃度に耐性であることを示す。 ＮａＣｌ溶液中でのＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の多分散指数を示す棒グラフである。０．１５Ｍ ＮａＣｌ中でのインキュベーション後のＤＳＣＳ ＮＰでは、多分散指数の劇的な増加が見られ、これは、粒子集団の深刻な凝集および不均一性を示す。比較すると、ｘＮＰは、高濃度塩類溶液中で、インキュベーション全体を通してその均一性を維持していた。 完全な細胞培養培地、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ＋）、およびウシ胎児血清（血清）中での、ＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の安定性を示す棒グラフを含有する。データは、ＤＳＣＳ ＮＰが、これらの培地中で凝集したが、架橋されたＮＰは影響を受けなかったことを示す。 架橋されたＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みの前（ＳＤＦ−１）および後（ＳＤＦ−ｘＮＰ）の、ＳＤＦ−１αの走化活性を示す棒グラフである。データは、ＳＤＦ−１αが、架橋されたＮＰへの組み込み後に、同様のまたはわずかに大きい活性を呈することを示す。 架橋されたＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みの前（ＶＥＧＦ）および後（ＶＥＧＦ ｘＮＰ）の、ＶＥＧＦの増殖活性を示す棒グラフである。データは、ＶＥＧＦが、架橋されたＮＰへの組み込みの前と後とで同様の活性を有することを示す。 ＤＳＣＳ ＮＰ（パネルＡ）または架橋されたＮＰ（ｘＮＰ、パネルＢ）のエアロゾル噴霧を受けたラットから得られたヘマトキシリンおよびエオシン染色された肺切片を示す。どちらのラットも、肺の内皮傷害および肺高血圧症を引き起こすモノクロタリンを注射されており、幹細胞治療のための免疫抑制剤としてシクロスポリンを与えられた。これらの厳しい条件下で、ＤＳＣＳＮＰは、重度の肺の炎症／線維症を引き起こす可能性があるのに対して、ｘＮＰは無害である。
本開示の粒子
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（ｏｕｔｅｒ ｓｈｅｌｌ）（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、粒子の外殻（表面）は、負の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含むコアと；負の電荷を持つ多糖を含む外殻（表面））とを含む粒子を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
治療用粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質（例えば、負の電荷を持つ多糖に結合した治療用タンパク質）をさらに含む、治療用粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば、治療用粒子の表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本開示は、外殻（例えば、治療用粒子の表面）が負の電荷を持つ多糖を含み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質が、負の電荷を持つ多糖に結合した、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む治療用粒子を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば、治療用粒子の表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含むコアと；負の電荷を持つ多糖と少なくとも１種の治療用タンパク質とを含む外殻（例えば、治療用粒子の表面）とを含む治療用粒子を提供する。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、負の電荷を持つ多糖に結合されている。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、静電相互作用を通じて正の電荷を持つ多糖に結合されている。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖の量は、正の電荷を持つ多糖の正電荷を完全に中和するのに十分である。
本開示の粒子（例えば、治療用粒子）の性質
図１１を参照すると、負の電荷を持つ多糖（例えば、硫酸デキストラン）を含む溶液が、正の電荷を持つ多糖を含む溶液と混合された場合、反対電荷を持つ多糖分子が（例えば、静電相互作用を通じて）反応して、コアと外殻（粒子の表面）とを含む粒子を形成する。正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中にあり、負の電荷を持つ多糖（これは、正の電荷を持つ多糖よりも多い）は、コア中と粒子の外殻（表面）中の両方にある。これは、正の電荷を持つ多糖と反応した、負の電荷を持つ多糖分子の部分のみが、粒子のコア中にとどまるのに対して、正の電荷を持つ多糖と反応しなかった、負の電荷を持つ多糖分子の部分が、粒子の外殻（表面）に位置することが理由で可能である。いくつかの実施態様では、粒子の外殻（表面）は、未反応の負の電荷を持つ多糖を含む。生じた負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれか１つ）とさらに反応して、本明細書に記載した通りの治療用粒子を形成する。治療用タンパク質は、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖の残基と（例えば、本明細書に記載した通りに、非共有結合的に）結合し、治療用粒子の外殻（表面））内にとどまる。いくつかの実施態様では、治療用粒子のコアは、治療用タンパク質を含まない。いくつかの実施態様では、粒子の外殻（表面）は、治療用タンパク質の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した通りの粒子または治療用粒子は、ナノ粒子である。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のサイズ（例えば、直径）は、約３００ｎｍから約６００ｎｍ、または約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様では、直径は、約１０ｎｍから約８００ｎｍ、または約５０ｎｍから約６００ｎｍ、または約６０ｎｍから約５５０ｎｍである。いくつかの実施態様では、直径は、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、または約７００ｎｍである。
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約７：１、または約３：１から約５：１である。いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４：１である。
いくつかの実施態様では、検出可能な量の、粒子中の負の電荷を持つ多糖は、粒子の粒子調製に使用される総量の約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。
いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は、約−３５ｍＶから約−５０ｍＶ、または約−４０ｍＶから約−４５ｍＶである。いくつかの実施態様では、ゼータ電位は、約−１０ｍＶから約−１００ｍＶ、約−２０ｍＶから約−１００ｍＶ、約−２０ｍＶから約−８０ｍＶ、約−３０ｍＶから約−７０ｍＶ、または約−４０ｍＶから約−６０ｍＶである。いくつかの実施態様では、ゼータ電位は、約−１０ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−３０ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−４５ｍＶ、または約−５０ｍＶである。
いくつかの実施態様では、ある集団内、例えばある組成物中に存在する粒子は、実質的に、同じ形状および／またはサイズを有することができる（すなわち、これらは、「単分散される」）。例えば、粒子は、約５％または約１０％以下の粒子が、粒子の平均直径の約１０％超よりも大きい直径を有するような、また、場合によっては、約８％、約５％、約３％、約１％、約０．３％、約０．１％、約０．０３％、または約０．０１％以下が、粒子の平均直径の約１０％超よりも大きい直径を有するような分布を有することができる。いくつかの実施態様では、２５％以下の粒子の直径が、平均粒子直径の１５０％、１００％、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％、または５％よりも大きく、平均粒子直径と異なる。粒子の大部分が類似の性質を有するように、サイズ、形状、および／または組成に関して比較的均一である粒子の集団を生じることが、しばしば望ましい。例えば、本明細書に記載した方法を使用して生成される粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、平均直径または最大径の５％、１０％、または２０％の範囲内にある直径または最大径を有することができる。いくつかの実施態様では、粒子の集団は、サイズ、形状、および／または組成に関して不均一であり得る。いくつかの実施態様では、多分散指数は、約０．０１から約０．５、約０．０５から約０．５、約０．１から約０．４、または約０．１から約０．３である。いくつかの実施態様では、多分散指数は、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、または約０．３である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、粒子中の負の電荷を持つ多糖に非共有結合的に結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメインを含み、ヘパリン結合ドメインを介してして粒子中の負の電荷を持つ多糖に結合される。本明細書で使用する場合、用語「非共有結合的」は、それらの構成要素間の結合が非共有結合である（すなわち、ある構成要素のどの原子も、別の構成要素の原子と電子対を共有しない）、２種以上の構成要素間の相互作用を指す。非共有結合には、水素結合、静電効果、π効果、疎水効果、またはファンデルワールス力などの、弱い結合が含まれる。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖との間の非共有結合的相互作用は、水素結合、静電相互作用、疎水相互作用、およびファンデルワールス力を含む。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、−ＳＯ３Ｈ官能基を含む単糖単位を含む負の電荷を持つ多糖と、−ＮＨ２官能基を含む単糖単位を含む正の電荷を持つ多糖を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、−ＳＯ３Ｈ官能基を有するグリカンと、−ＮＨ２官能基を含むポリグルコサミンを含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、硫酸デキストラン（例えば、硫酸デキストランナトリウム塩）とキトサンを含む。
負の電荷を持つ多糖
負の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然または合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖中の単糖残基は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、グルコサミン、シアル酸、イズロン酸、ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、中性ｐＨで酸性である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基、例えば、酸（カルボン酸（カルボン酸エステル）、スルホン酸（スルホン酸エステル）、硫酸エステル、リン酸エステル、およびホスホン酸エステルが含まれる）を含む。すなわち、多糖内の、あらゆる数の単糖単位は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）（すなわち、−ＳＯ３Ｈ）、または−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基で誘導体化されている可能性がある。（いくつかの実施態様では、これらの基のいずれか１つは、生理的ｐＨで負の電荷を持つ）。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸などの、グリコサミノグリカンである。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストラン（例えば、硫酸デキストランナトリウム塩、ＣＡＳ登録番号９０１１−１８−１）などのグリカンである。
正の電荷を持つ多糖
正の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然または合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖中の単糖残基は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、正味の正電荷は、正の電荷を持つ多糖に含まれている塩基性の基（例えばアミン、アンモニウム基、またはグアニジウム基）によって提供される。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、正味の正電荷は、多糖中の単量体の単糖単位がそれを用いて誘導体化される、アミンおよび／またはアンモニウム基によって提供される。正の電荷を持つ多糖内のあらゆる数の単糖単位が、生理的ｐＨで正の電荷を持つことが可能なＮＨ２基を含有することができる。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、中性ｐＨで塩基性である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、キトサン（例えば、ＣＡＳ登録番号９０１２−７６−４を参照のこと）などのポリグルコサミンである。
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、架橋される。架橋剤の適切な例としては、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸（ＭＡ）、コハク酸（ＳＡ）、グルタル酸（ＧＡ）、酒石酸（ＴＡ）、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ブラシル酸、またはタプシン酸などの、ジカルボン酸が挙げられる。いくつかの実施態様では、架橋は、例えば、正の電荷を持つ多糖中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシル基との間のアミド結合形成をもたらす。アミド結合は、多糖の糖単位を、粒子のコア中で架橋する。いくつかの実施態様では、粒子のコア中の多糖の架橋は、架橋されていない粒子（これは、高分子電解質複合体のその性質が原因で、生理食塩水または体液中で凝集体を形成することとなる）と比較した場合の粒子の塩安定性の増大を可能にする。
治療用タンパク質
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、増殖因子、サイトカイン、酵素、または構造タンパク質である。
いくつかの実施態様では、タンパク質治療薬は、例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬｅａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００８，７，２１−３９に記載されているタンパク質治療薬のいずれか１つである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合タンパク質である。
ヘパリン結合タンパク質は、そのタンパク質を≧０．１５Ｍ ＮａＣｌ中でヘパリン−セファロース樹脂に結合させることによって一般に実証される、ヘパリンに対するその高い親和性によって定義される。多くのタンパク質、特に、細胞間シグナル伝達を媒介するものは、このカテゴリーに入る。（例えば、Ｏｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２−１９９０４を参照のこと）。これらのタンパク質のうちの大部分の生物学的リガンドが、ヘパラン硫酸または硫酸化グリコサミノグリカンであり、これらは、細胞表面上に、および細胞外マトリックス中に存在する。これらのタンパク質の一次または三次構造におけるヘパリン結合部位またはドメインは、ヘパリン結合を担い、これは、しばしば、静電相互作用を通じてヘパリンと結合する正の電荷を持つアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）のクラスターを含む。（例えば、Ｅｓｋｏ ＪＤ．Ｄｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４；８３：１２９−１５７；およびＧａｌｌａｇｈｅｒ Ｊ．Ｆｅｌｌ−Ｍｕｉｒ Ｌｅｃｔｕｒｅ：Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｄｕｃｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒｃｈｅｓｔｒａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．Ａｕｇ ２０１５；９６（４）：２０３−２３１を参照のこと）。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメインを含む。いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質に固有のものである。他の実施態様では、いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質の組換え産生中に、治療用タンパク質にタグ付けされる。ヘパリン結合ドメインは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＯｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２−１９９０４に記載されている、ヘパリン結合タンパク質中に見られるドメインのいずれか１つであり得る。ヒトでは、多くの増殖因子、サイトカイン、および細胞間情報伝達を媒介するタンパク質を含めた、４３５種を超えるヘパリン結合タンパク質が存在する。ヘパリン結合部位がタンパク質合成中にペプチド配列の末端にタグ付けされる場合、他のタンパク質またはペプチド（ワクチンなど）も、ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰによって潜在的に送達される可能性がある。ヘパリン結合ドメインのタグ付けは、当技術分野で公知の組換えタンパク質産生のための手順のいずれか１つによって実施することができる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、および胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）などの、サイトカインである。インターフェロンは、インターフェロン−αｃｏｎ１、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−αｎ３、インターフェロン−β１ａ、またはインターフェロン−γ１ｂであり得る。サイトカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、およびインターロイキン−３５などの、インターロイキンであり得る。いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される増殖因子である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アミリン、抗ミュラー管ホルモン、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン、エンドセリン、エンケファリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ダルベポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長ホルモン（ＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インヒビン、インスリン、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インスリングラルギン、プラムリンチド、酢酸プラムリンチド、インスリン様増殖因子、レプチン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、モチリン、オレキシン、オキシトシン、膵ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、ヒト卵胞刺激ホルモン、ルトロピン、テリパラチド、エキセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン−α、骨形成タンパク質７、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子、トリプシン、ネシリチド、およびバソプレシンなどの、ポリペプチドホルモンである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、ドロトレコギン−α、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、サルグラモスチム、レピルジン、ビバリルジン、またはオプレルベキンである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アタシセプト、アバタセプト、アフリベルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、エタネルセプト、ソタテルセプト（ｓｏｔａｔｅｒｃｅｐｔ）、ロミプロスチム、またはリロナセプトである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、酵素である。いくつかの実施態様では、酵素は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β−グルコ−セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１−プロテイナーゼ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素（例えばリゾチーム）、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ（例えばＬ−アスパラギナーゼ）、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、またはガルスルファーゼである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アルブミン、ヒトアルブミン、または免疫グロブリンである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、治療用抗体を含めた抗体（例えば、モノクローナル抗体、例えば、二重特異性モノクローナル抗体）である。いくつかの実施態様では、抗体は、癌を治療するのに有用である（例えば、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ、アラシズマブ・ペゴール、ペンテト酸アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ・マフェナトクス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・ラブタンシン、カプロマブペンデチド、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シズツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、ダセツズマブ、デミシズマブ、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドロジツマブ、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプラツズマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレンツキシマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イムガツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、ロルボツズマブ・メルタンシン、ニモツズマブ、オファツムマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トツムマブ（ｔｏｔｕｍｕｍａｂ）、またはザルツムマブ）。
いくつかの実施態様では、抗体は、炎症性疾患または状態を治療するのに有用である（例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、ダクリズマブ、ムロモナブ、エファリズマブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ルプリズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、ザノリムマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、エクリズマブ、またはブリアキヌマブ）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、感染症を治療するのに有用である（例えば、エンフビルチド）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アブシキシマブ、ペグビソマント、マムシ（ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ、ラニビズマブ、またはデニロイキンジフチトクスである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用粒子は、黄斑変性を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、治療用粒子は、ＳＤＦおよびＶＥＧＦ治療用タンパク質を含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、この粒子は、肺高血圧症を治療するのに有用である。実施態様では、この粒子は、幹細胞と組み合わせて対象に投与することができる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．０１ｎｍｏｌから約１００ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌから約５０ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌから約４０ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌから約３０ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２０ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約１０ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約５ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２．５ｎｍｏｌである。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する、約０．１ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ、約０．７５ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ、約１．２５ｎｍｏｌ、約１．５ｎｍｏｌ、約２ｎｍｏｌ、約２．５ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ、約３．５ｎｍｏｌ、約４ｎｍｏｌ、約５ｎｍｏｌ、約１０ｎｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ、約５０ｎｍｏｌ、または１００ｎｍｏｌの単糖単位である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約３０％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。
いくつかの実施態様では、治療用粒子に対する治療用タンパク質の割合は、治療用タンパク質の特性、治療用粒子の性質、および用途に依存する。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、治療用粒子の総重量の約０．０１重量％から約９９重量％の範囲で装填される。治療用タンパク質は、約１重量％から約８０重量％、約１重量％から約７５重量％、約１重量％から約７０重量％、約１重量％から約６５重量％、約１重量％から約６０重量％、約１重量％から約５５重量％、約１重量％から約５０重量％、約１重量％から約４５重量％、約１重量％から約４０重量％、約１重量％から約３５重量％、約１重量％から約３０重量％、約１重量％から約２５重量％、約１重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約１重量％から約１０重量％、および／または約１重量％から約５重量％の範囲内であり得る。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ−１αに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ−２に関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ−２に関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、リゾチームであり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
いくつかの実施態様では、粒子は、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
有用な治療用タンパク質のさらなる例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，９１０号明細書；および米国特許第８，０４３，８３３号明細書；米国特許出願第２０１３／０１９５８８８号明細書；および米国特許出願第２００７／００９２４８６号明細書；およびＰＣＴ国際公開第２０１４／１３００６４号パンフレットにおいて参照することができる。
プロセスによって調製される粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって調製された、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって調製された、負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、負の電荷を持つ多糖に結合した治療用タンパク質とを含む治療用粒子を提供する。
本開示の粒子を製造する方法
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を製造する方法であって：
ｘｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｘｉｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｘｉｖ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される。
いくつかの実施態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む（例えば、正の電荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、粒子のコア中にある）。
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水溶液である。
いくつかの実施態様では、第１の水溶液中の水性の溶媒は、水である。
いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、第２の溶液は、水溶液である。
いくつかの実施態様では、第２の水溶液中の水性の溶媒は、約０．２％から約０．５％酢酸（水中）である。いくつかの実施態様では、第２の水溶液中の水性の溶媒は、約０．２％酢酸水溶液である。
いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、第１の溶液からの負の電荷を持つ多糖と、第２の溶液からの正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約８：１、または約３：１から約５：１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第１の溶液に第２の溶液を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第２の溶液に第１の溶液を添加することによって実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍから約１２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における第１の溶液と第２の溶液の混合の後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、金属は、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される。いくつかの実施態様では、金属は、カルシウムである。いくつかの実施態様では、金属は、亜鉛である。いくつかの実施態様では、金属塩は、ＣａＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＺｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４から選択される。いくつかの実施態様では、金属塩は、ＺｎＳＯ４である。
いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中の金属塩の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍ、約０．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍ、約０．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。
いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．０５Ｍ、約０．１Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．２５Ｍ、または約０．３Ｍである。いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。
いくつかの実施態様では、金属塩と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１０：１から約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１、または約２：１から約１：１である。
いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１０：１から約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１、または約２：１から約１：１である。いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約４：１、約３：１、約２：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、または約１：１である。いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）の混合物への金属塩の水溶液の添加の後に、この混合物への糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトール、イノシトール、またはボレミトール）の水溶液の添加が続く。
いくつかの実施態様では、糖アルコールは、マンニトールである。
いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％から約５０重量％、約２重量％から約４０重量％、約３重量％から約３０重量％、または約５重量％から約２０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、または約３０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１５重量％である。
いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多糖との重量比は、約２００：１から約１：１、約１５０：１から約１０：１、約１００：１から約２０：１、または約９０：１から約５０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１００：１、約９０：１、約７５：１、約６０：１、約５０：１、または約３０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多糖との重量比は、約７５：１である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールは、マンニトールである。これらの実施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約０．１重量％から約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２重量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％である。これらの実施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量％である。これらの実施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約５重量％である。
いくつかの実施態様では、粒子は、粒子のコア中のキトサンを、ジカルボン酸と共有結合的に架橋させることによって調製される。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と粒子のコア中の正の電荷を持つ多糖とを含む粒子は、ほぼ中性のｐＨの水性緩衝液に懸濁される。水性緩衝液の適切な例としては、約７．０のｐＨのＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水が挙げられる。いくつかの実施態様では、粒子の懸濁液は、短鎖ジカルボン酸の溶液と混合される。ジカルボン酸の適切な例としては、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸が挙げられる。いくつかの実施態様では、溶液中のジカルボン酸の濃度は、約５ｍＭから約３０ｍＭである。いくつかの実施態様では、架橋反応は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）の存在下で実施される。架橋条件の適切な例としては、粒子を約２５℃で約１６時間反応させることが挙げられる。いくつかの実施態様では、コア中に、架橋された正の電荷を持つ多糖を有する粒子は、約１５，０００×ｇの約１５分間の遠心分離によって沈殿され、ＤＰＢＳで洗浄される。いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、耐塩性選択のために、３×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）にさらに再懸濁される。これらの実施態様では、３時間のインキュベーション後、懸濁液中の凝集体を、約２００×ｇでの約１５分間の遠心分離によって沈殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離によって沈殿させる。いくつかの実施態様では、粒子は、次いで、ＤＰＢＳに再懸濁され、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰＶＤＦ膜を通して濾過される。いくつかの実施態様では、濾過は、溶液の滅菌および最終の粒径選択の目的で実施される。
治療用粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）本明細書に記載した通りの負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を含む第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、第２の懸濁液を得て治療用粒子を得ることと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む（例えば、正の電荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、粒子のコア中にある）。
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水性の溶媒を含む。
いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水および緩衝生理食塩水から選択される。いくつかの実施態様では、緩衝生理食塩水は、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約０．１ｎｍｏｌ／ｍｌから約２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌから約１５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．３ｎｍｏｌ／ｍｌから約１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌから約８０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．３ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２ｎｍｏｌ／ｍｌ、約３ｎｍｏｌ／ｍｌ、約５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約７．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約３０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約５０ｎｍｏｌ／ｍｌである。
いくつかの実施態様では、第１の懸濁液は、水性の溶媒を含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、水性の溶媒は、糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトール、イノシトール、またはボレミトール）、特にマンニトールを、約０．１重量％から約２５重量％、約０．２重量％から約２０重量％、約０．５重量％から約１０重量％、または約１重量％から約５重量％の濃度で、または約０．５重量％、約１重量％、約１．５重量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、または約５重量％の濃度で含む。
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．０１：１００から約１００：１００、約０．０５：１００から約５０：１００、約０．１：１００から約４０：１００、約０．２：１００から約２０：１００、約０．２：１００から約１０：１００、約０．２：１００から約５：１００である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．２５：１００から約３：１００である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．１：１００、約０．２：１００、約２．５：１００、約０．３：１０００、約０．５：１００、約１：１００、約２：１００、約３：１００、または約５：１００である。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第１の懸濁液に治療用タンパク質の溶液を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、治療用タンパク質の溶液に第１の懸濁液を添加することによって実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍから約１２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
いくつかの実施態様では、混合は、約１分から約２時間、約２分から約１．５時間、約５分から約６０分、約７分から約４０分、または約１０分から約３０分実施される。いくつかの実施態様では、混合は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４０分、または約６０分間実施される。いくつかの実施態様では、混合は、約２０分間実施される。
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得られる。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの溶液は、水溶液である。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約０．１重量％から約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２重量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％のマンニトールを含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約１重量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量％を含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約２．５重量％のマンニトールを含む。
いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から約１００％、約９０％から約１００％、または約９５％から約１００％である。いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約９０％から約１００％である。いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９９％、または約１００％である。
本開示の粒子を使用する方法
本開示の方法は、治療用タンパク質を過酷な生理的条件に曝露させずに（例えば、治療用タンパク質を胃の生理的条件に曝露させずに）所望の生物学的標的に治療用タンパク質を送達する能力を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、対象における疾患または状態を治療する方法であって、本明細書に記載した通りの治療有効量の粒子、または本明細書に記載した通りの粒子を含む医薬組成物を、対象（例えば、それを必要とする対象）に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される状態の疾患である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、内分泌障害（ホルモン欠乏症）（例えば、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症、高血糖、ＧＨ欠乏もしくは慢性腎不全に起因する成長障害、プラダー・ウィリー症候群、ターナー症候群、抗ウイルス療法を用いるＡＩＤＳ消耗症候群もしくは悪液質、ＧＨ遺伝子欠失もしくは重度の原発性ＩＧＦ１欠損症を伴う小児における成長障害、閉経後骨粗鬆症、重度の骨粗鬆症、またはメトホルミンおよびスルホニル尿素での治療に抵抗性の２型糖尿病、または先端巨大症）を治療するのに有用なホルモンである。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、止血および血栓症（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、外科または産科処置と関連する遺伝性ＡＴ−ＩＩＩ欠損症、または重度の遺伝性プロテインＣ欠乏症を患う患者における血栓塞栓症、静脈血栓症、および電撃性紫斑病；肺血栓塞栓症、心筋梗塞、急性虚血性脳卒中、中心静脈アクセス装置（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｎｏｕｓ ａｃｃｅｓｓ ｄｅｖｉｃｅｓ）の閉塞、急性心筋梗塞、血友病ＡまたはＢおよび第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害剤を有する患者における出血、死亡のリスクが高い重症敗血症、ヘパリン起因性血小板減少症、冠動脈形成術における血液凝固、急性進行性貫壁性心筋梗塞、深部静脈血栓症、動脈血栓症、動静脈カニューレの閉塞、または不安定狭心症を有する患者における血栓溶解）を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、代謝酵素欠損（例えば、ゴーシェ病、ポンペ病、糖原病ＩＩ型、ＨｕｒｌｅｒおよびＨｕｒｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｅ型のムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、またはファブリー病）を治療するのに有用な酵素である。いくつかの実施態様では、酵素は、肺および胃腸管障害（例えば、先天性α−１−アンチトリプシン欠損症、ガス、腹部膨満、ラクトースを消化できないことに起因する腹痛および下痢、嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵機能不全、ビルロートＩＩ胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、または膨満）を治療するのに有用である。いくつかの実施態様では、酵素は、免疫不全（例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損に起因する重症複合免疫不全疾患、または原発性免疫不全）を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、癌（例えば、膀胱癌、脳癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、胃腸癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、皮膚癌、または精巣癌；特に、肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、奇形腫、肺癌、気管支原性肺癌、扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞・細気管支癌（ａｌｖｅｏｌａｒ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、胃腸癌、食道癌、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃癌、癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫、膵癌、管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍、小腸癌、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸または結腸の癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫、尿生殖器癌、腎癌、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、膀胱癌、尿道癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、前立腺癌、精巣癌、精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫、肝臓癌、肝細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、骨癌、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、神経系癌、頭蓋骨の癌、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜癌、髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳癌、星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄の癌、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫、婦人科癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮頚癌、前腫瘍性子宮頚部異形成、卵巣癌、卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌、顆粒膜−莢膜細胞腫（ｇｒａｎｕｌｏｓａ−ｔｈｅｃａ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰癌、扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣癌、明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児性横紋筋肉腫、卵管癌、血液系癌、血液の癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、慢性リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、皮膚癌、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、副腎癌、および神経芽腫）を治療するのに有用な抗体である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、炎症性疾患または状態（例えば、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、炎症性関節疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、および線維筋痛症を治療するのに有用な抗体である。追加の型の関節炎としては、アキレス腱炎、軟骨無形成症、先端肥大性関節症、癒着性関節包炎、成人スチル病、鵞足炎、無腐性壊死、ベーチェット症候群、上腕二頭筋腱炎、Ｂｌｏｕｎｔ病、ブルセラ症性脊椎炎（ｂｒｕｃｅｌｌａｒ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、滑液包炎、踵骨滑液包炎、ピロリン酸カルシウム二水和物沈着症（ＣＰＰＤ）、結晶沈着症、カプラン症候群、手根管症候群、軟骨石灰化症、膝蓋軟骨軟化症、慢性滑膜炎症、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、コルチコステロイド誘発性骨粗鬆症、肋胸骨症候群（ｃｏｓｔｏｓｔｅｒｎａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クレスト症候群、クリオグロブリン血症、変性関節疾患、皮膚筋炎、糖尿病性手指強皮症、広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ）、椎間板炎、円板状エリテマトーデス、薬剤誘発性ループス、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、デュピュイトラン拘縮、エーラス・ダンロス症候群、腸炎性関節炎、上顆炎、びらん性変形性関節症（ｅｒｏｓｉｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、運動誘発性コンパートメント症候群、ファブリー病、家族性地中海熱、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フェルティ症候群、第五病、扁平足、異物性滑膜炎、フライバーグ病、真菌性関節炎、ゴーシェ病、巨細胞性動脈炎、淋菌性関節炎、グッドパスチャー症候群、肉芽腫性動脈炎、関節血症、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、Ｂ型肝炎表面抗原疾患、股関節形成不全、ハーラー症候群、過剰可動性症候群、過敏性血管炎、肥大性骨関節症、免疫複合体病、インピンジメント症候群、ジャクー関節症、若年性強直性脊椎炎、若年性皮膚筋炎、若年性関節リウマチ、川崎病、キーンベック病、レッグ・カルベ・ペルテス病、レッシュ・ナイハン症候群、線状強皮症、リポイド皮膚関節炎、ロフグレン症候群、ライム病、悪性滑膜腫、マルファン症候群、内側滑膜ひだ症候群（ｍｅｄｉａｌ ｐｌｉｃａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、転移性癌性関節炎（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、混合型クリオグロブリン血症、ムコ多糖症、多中心性細網組織球症、多発性骨端異形成症、マイコプラズマ関節炎、筋筋膜性疼痛症候群、新生児ループス、神経障害性関節症、結節性脂肪織炎、組織褐変症、肘頭部滑液包炎、オスグッド・シュラッター病、変形性関節症、骨軟骨腫症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨壊死、骨粗鬆症、オーバーラップ症候群、肥厚性皮膚骨膜症、骨パジェット病、回帰性リウマチ、膝蓋大腿部痛症候群、ペレグリニ・スチーダ症候群、色素性絨毛結節性滑膜炎、梨状筋症候群、足底筋膜炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、膝窩嚢胞、後脛骨筋腱炎（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｉｂｉａｌ ｔｅｎｄｉｎｉｔｉｓ）、ポット病、膝蓋前滑液包炎、人工関節感染症、弾性線維性仮性黄色腫、乾癬性関節炎、レイノー現象、反応性関節炎／ライター症候群、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、再灌流傷害、踵骨後部滑液包炎（ｒｅｔｒｏｃａｌｃａｎｅａｌ ｂｕｒｓｉｔｉｓ）、リウマチ熱、リウマチ性血管炎、肩回旋筋腱板炎、仙腸関節炎、サルモネラ菌性骨髄炎、サルコイドーシス、鉛痛風、ショイエルマン骨軟骨炎（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ’ｓ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ）、強皮症、化膿性関節炎、血清反応陰性関節炎、赤痢菌性関節炎、肩手症候群、鎌状赤血球関節症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、シェーグレン症候群、大腿骨頭すべり症、脊柱管狭窄症、脊椎分離症、ブドウ球菌性関節炎、スティックラー症候群、亜急性皮膚エリテマトーデス、スイート症候群、シデナム舞踏病、梅毒性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、足根管症候群、テニス肘、ティーツェ症候群、一過性骨粗鬆症、外傷性関節炎、転子部滑液包炎、結核性関節炎、潰瘍性大腸炎の関節炎、分類不能型結合組織症候群（ＵＣＴＳ）、蕁麻疹様血管炎、ウイルス性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、ウィップル病、ウィルソン病、またはエルシニア性関節炎（ｙｅｒｓｉｎｉａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、疾患または状態は、不十分な量の成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）によって特徴付けることができる。例えば、ｈＧＨは、ｈＧＨ欠乏を患う小児または成人における補充療法として使用することができる。低身長をもたらすがｈＧＨの欠乏と関連しない状態を治療するために、またはＡＩＤＳなどの疾患の結果としての筋消耗を改善するために筋肉量を維持することにおいて、本開示の方法を使用して、例えばヒト成長ホルモンを送達することもできる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、造血（例えば、貧血、骨髄形成異常、腎不全もしくは化学療法に起因する貧血、手術前準備、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）（＋／−透析）を患う患者における貧血、好中球減少症、ＡＩＤＳ、または化学療法後、または骨髄移植における好中球減少症、重症慢性好中球減少症、白血球減少症、骨髄移植後の骨髄再構成、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、または（特に骨髄抑制性化学療法後の）血小板減少症）を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、不妊症を治療するのに有用である。（例えば、生殖補助、および黄体形成ホルモン欠乏を伴う不妊症を治療すること）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、免疫調節において有用である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、成長制御と関係がある疾患または状態を治療するのに有用である。（例えば、先端巨大症、ＶＩＰ産生腫瘍（ＶＩＰ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｍａ）および転移性カルチノイド腫瘍の症状軽減、脊椎固定術、骨損傷修復、脛骨骨折癒合不全、腰椎、脊椎固定術、思春期早発症、糖尿病性潰瘍のための化学療法またはデブリードマン補助を受けている患者における重度の口腔粘膜炎）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、褥瘡、静脈瘤性潰瘍、焼痂のデブリードマン、裂開した創傷、日焼け、または急性非代償性のうっ血性心不全を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、巨大分子の酵素的分解に有用である。（例えば、多くの型のジストニア（例えば、頸部）、慢性皮膚潰瘍および重い熱傷を負った領域のデブリードマン、嚢胞性線維症、気道感染症、予測値の４０％を超えるＦＶＣを有する選択された患者における気道感染症、または急性および慢性病変（例えば、褥瘡、静脈瘤性および糖尿病性潰瘍、熱傷、術後創、毛巣嚢胞傷、癰、および他の創傷）における壊死組織のデブリードマンもしくは脱落組織の融解）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、臓器移植（例えば、急性の腎臓移植拒絶反応を治療すること）に有用である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、肺障害（例えば、ＲＳウイルス感染症、喘息）を治療するのに有用である。
いくつかの実施態様では、本開示は、組織再生または幹細胞ホーミングのために有用な粒子を提供する。他の実施態様では、本明細書に記載した通りの粒子、およびこの粒子を含む組成物は、組織培養に有用である（例えば、増殖因子が装填されたＤＳＣＳ ＮＰを様々な幹細胞培養培地中で使用して、組み込まれた増殖因子の効果を延長させ、かつ、頻繁な培養培地の交換を省くことによって幹細胞培養の費用を削減することができる）。研究目的では、タンパク質プルダウン濃縮、および粒子からタンパク質を分離することを伴わないＳＤＳゲル上での分析のために、タンパク質を含まない（非装填）ＤＳＣＳ ＮＰを使用することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子および組成物は、美容目的で使用することができる（例えば、細胞によって分泌される増殖因子を吸収させるために、非装填ＤＳＣＳ ＮＰを、幹細胞馴化培地に添加することができる、また、特別な皮膚の若返りのために使用することができる）。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む治療用粒子は、黄斑変性を治療するのに有用である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む治療用粒子は、肺高血圧症を治療するのに有用である。
組成物および投与経路
本出願は、特に、本明細書に記載した通りの粒子（例えば、治療用粒子）を含む組成物を提供する。この組成物は、粒子（例えば、治療用粒子）が薬学的に許容可能な担体と共に含まれる医薬組成物であり得る。
本出願はまた、有効量の治療用タンパク質を含む粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。本開示の組成物は、有機溶媒に対して高感受性であり得る治療用タンパク質を、他の調製物に必要とされる溶媒に曝露させずに送達する能力を提供する。こうした組成物は、天然の形態と比較して、粒子内での治療用タンパク質の高い生理活性を保持し、向上された安定性も有する。いくつかの実施態様では、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、または約９０％から約１００％の範囲内である。いくつかの実施態様では、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。したがって、いくつかの態様では、治療用タンパク質を含む粒子を含む、本明細書に記載した通りの組成物が提供され、ここでは、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、または約９０％から約１００％の範囲である、または、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。
放出プロフィールの制御は、ＴＮＰに装填されていない、対象における治療用タンパク質と比較して、対象内での治療用タンパク質の薬物動態プロフィールの向上をもたらすことができる。薬物動態プロフィールの向上は、ＡＵＣ、半減期、クリアランス、平均滞留時間、および分布容積（Ｖｓｓ）から選択される１以上のものの性質の改善を呈することができる。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質のＡＵＣは、天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１００％から約１０００％、約１５０％から約７００％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質のＡＵＣは、天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、または５００％超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の半減期は、天然の治療用タンパク質の半減期の約１００％から約１００，０００％、約１００％から約１０００％、約１００％から約５００％、約１５０％から約４００％、または約２００％から約３００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質の半減期は、天然の治療用タンパク質の半減期の約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、または４００％超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質のクリアランスは、天然の治療用タンパク質のクリアランスの約１％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、または約４０％から約８０％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質のクリアランスは、天然の治療用タンパク質のクリアランスの約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の平均滞留時間は、天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１００％から約１０００％、約１５０％から約７００％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質の平均滞留時間は、天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、または５００％超である。
本明細書で使用する場合、「有機溶媒を実質的に含まない」は、有機溶媒をほとんどまたはまったく含まない組成物を指す。例えば、有機溶媒を実質的に含まない水性の混合物は、混合物からほとんどまたはすべての有機溶媒を除去する工程にかけられている水性の混合物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、重量で、約５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、または約０．０１％以下の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、約５％、約２％、約１％、０．５％、約０．１％、約０．０５％、または約０．０１％の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、薬学的に許容可能な緩衝液を含む水溶液を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、薬学的に許容可能な塩を含む水溶液を含むことができる。一般的な薬学的に許容可能な緩衝液としては、酢酸（酢酸および酢酸ナトリウム）、クエン酸（クエン酸およびクエン酸ナトリウム）、およびリン酸（リン酸ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム）緩衝液が挙げられる。薬学的に許容可能な塩溶液としては、希薄塩類溶液が挙げられる。組成物は、ｐＨ緩衝リン酸溶液または塩類溶液中であり得る。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、水中の組成物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、塩を含まない可能性がある。
担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ薬学的に許容可能な担体の場合には医薬品中に使用される量でそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容可能な」または「薬学的に許容可能な」。
本出願の医薬組成物中に使用することができる薬学的に許容可能な担体、補助剤、およびビヒクルとしては、限定はされないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和した植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
必要に応じて、医薬組成物中の本出願の治療用タンパク質の溶解度およびバイオアベイラビリティを、当技術分野で周知の方法によって向上させることができる。１つの方法としては、製剤中の脂質賦形剤の使用が挙げられる。「Ｏｒａｌ Ｌｉｐｉｄ−Ｂａｓｅｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｈａｕｓｓ，ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００７；および「Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｏｒａｌ ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｘａｍｐｌｅｓ」，Ｋｉｓｈｏｒ Ｍ．Ｗａｓａｎ，ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６を参照のこと。
バイオアベイラビリティを向上させる別の公知の方法は、場合によってはＬＵＴＲＯＬ（商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などのポロクサマー、または酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック共重合体と共に製剤化される、本出願の化合物の非晶質形の使用である。米国特許第７，０１４，８６６号明細書；および米国特許出願公開第２００６００９４７４４号明細書および第２００６００７９５０２号明細書を参照のこと。
本出願の医薬組成物としては、経口、直腸内、経鼻、局所（頬側および舌下が含まれる）、膣内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内が含まれる）投与に適したものが挙げられる。他の製剤は、単位剤形、例えば、錠剤、徐放性カプセルで、また、リポソームで、好都合に提供することができ、薬学の技術分野で周知のあらゆる方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２０ｔｈ ｅｄ．２０００）を参照のこと。
本出願の医薬組成物は、注射（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）によって投与することができる。例えば、医薬組成物は、例えば、この医薬組成物が、黄斑変性を治療するのに有用なタンパク質を含む場合、注射によって対象の眼に投与することができる。
こうした調製方法には、投与されることとなる分子と、１種以上の補助的成分を構成する担体とを混合するステップが含まれる。一般に、組成物は、活性成分と、液体担体、リポソームもしくは微粉化された固体担体、またはこれらの両方とを均一かつ十分に混合し、次いで、必要であれば生成物を成形することによって調製される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子は、経口的に投与される。経口投与に適した本出願の組成物は、カプセル剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、もしくは錠剤（それぞれがあらかじめ定められた量の活性成分を含有する）；散剤もしくは顆粒剤；水性の液体もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液；水中油型液体エマルジョン；油中水型液体エマルジョン；リポソームに充填させて；またはボーラスとしてなどの不連続な単位として提供することができる。ソフトゼラチンカプセルは、こうした懸濁液を含有させるのに有用であり得、これは、化合物吸収の速度を有益に増大させることができる。
経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加される。カプセル形での経口投与については、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性の懸濁剤が経口的に投与される場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と合わせられる。所望される場合、ある種の甘味料および／または着香料および／または着色剤を添加することができる。
経口投与に適した組成物としては、風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に成分を含むトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）；およびゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中に活性成分を含む香錠が挙げられる。
本出願の医薬組成物は、直腸内投与のための座剤の形態で投与することができる。これらの組成物は、本出願の化合物を、適切な非刺激性の賦形剤（これは、室温では固体であるが直腸温では液体であるので、直腸内で溶けて活性成分を放出することとなる）と混合することによって調製することができる。こうした材料としては、限定はされないが、カカオ脂、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
本出願の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。こうした組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で公知の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。例えば、米国特許第６，８０３，０３１号明細書を参照のこと。
所望される治療が、局所適用によって容易に到達可能な部位または器官を含む場合、本出願の医薬組成物の局所投与が、特に有用である。
本開示の局所組成物は、エアロゾルスプレー、クリーム、乳剤、固体、液体、分散系、フォーム、オイル、ゲル、ヒドロゲル、ローション、ムース、軟膏、粉末、パッチ、ポマード、液剤、ポンプスプレー、スティック、ウェットペーパータオル（ｔｏｗｅｌｅｔｔｅ）、セッケンの形態、または局所投与および／または美容およびスキンケア製剤の技術分野で一般に用いられる他の形態で調製および使用することができる。局所組成物は、乳剤形態であり得る。
いくつかの実施態様では、局所組成物は、治療用タンパク質を含む粒子と、１以上の追加の成分、担体、賦形剤、または希釈剤（限定はされないが、吸収剤、抗刺激剤、抗ざ瘡剤、保存剤、酸化防止剤、着色剤／色素、皮膚軟化薬（保湿剤）、乳化剤、皮膜形成／保持剤、香料、洗い流し不要の（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）角質除去剤（ｅｘｆｏｌｉａｎｔ）、処方薬、保存剤、スクラブ剤、シリコーン、皮膚と同質の／修復剤、滑剤（ｓｌｉｐ ａｇｅｎｔ）、日焼け止め、界面活性剤／洗剤入り清浄剤、浸透促進剤、および増粘剤が含まれる）との組み合わせを含む。
成分のリストは、当技術分野で周知であり、例えば、「Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｓ．Ｂａｌｓａｍ ａｎｄ Ｅ．Ｓａｇａｒｉｎ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７２，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂ．Ｃｏ．；Ｍ．Ｇ．ＤｅＮａｖａｓｓｅによる「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ」；および「Ｈａｒｒｙ’ｓ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ」，Ｊ．Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｐｕｂ．Ｃｏ（上のそれぞれの開示の内容全体を参照によって本明細書に組み込む）に開示されている。いくつかの実施態様では、希釈剤、担体、および賦形剤には、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５４０、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、またはそれらの混合物など）が含まれ得る。
本出願の医薬組成物においては、治療用タンパク質を含む粒子は、有効量（例えば、治療有効量）で存在する。
動物とヒトについての投薬量（ミリグラム／体表面（平方メートル）に基づく）の相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ，１９６６，５０：２１９に記載されている。体表面積は、対象の身長と体重から近似的に決定することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｓｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７０，５３７を参照のこと。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子の有効量は、例えば、約１μｇから約１０００ｍｇの範囲であり得る。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用タンパク質を含む有効量の粒子を含有する組成物が、１日１回、１日２回、または１日３回投与される。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子の有効量は、例えば、約０．００１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
当業者によって認識される通り、有効な用量はまた、治療される疾患、疾患の重症度、投与経路、性別、年齢、および対象の全身健康状態、賦形剤用法、他の薬剤の使用などの他の治療的処置との同時用法の可能性、および治療を行う医師の判断に応じて変動することとなる。
併用療法
本明細書に記載した通りの、治療用タンパク質を含む粒子、またはその組成物と組み合わせて、１種以上の追加の医薬品または治療方法、例えば、抗ウイルス薬、化学療法薬、他の抗癌剤、免疫増強剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、放射線、抗腫瘍および抗ウイルスワクチン、サイトカイン療法（例えば、ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦなど）、および／またはチロシンキナーゼ阻害剤を使用することができる。これらの薬剤は、単一の剤形で本発明の治療用粒子と組み合わせることもできるし、これらの薬剤を、別の剤形として同時にまたは連続的に投与することもできる。本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれか１つを、本開示の粒子および組成物と組み合わせて使用されることとなる追加の薬剤として使用することができる。いくつかの実施態様では、追加の薬剤は、幹細胞（例えば、幹細胞治療である。
キット
本発明はまた、例えば、本明細書に言及した疾患または障害のいずれか１つの治療または予防において有用な医薬キットを含む。このキットは、治療有効量の本発明の粒子を含む医薬組成物を含有する１つ以上の容器を含む。こうしたキットは、所望される場合、１つ以上の様々な従来の医薬キット構成要素、例えば、当業者には容易に明らかであろう、１種以上の薬学的に許容可能な担体を含む容器、追加の容器などをさらに含むことができる。投与されるべき成分の量、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合するためのガイドラインを表示する、挿入物としてのまたはラベルとしての説明書も、キット内に含めることができる。
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、「およそ」（例えば、示された値のおよそプラスマイナス１０％）を意味する。
用語「粒子」は、本明細書で使用する場合、約１ｎｍから約１０００μｍのサイズを有する組成物を指す。
用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用する場合、約１ｎｍから約１０００ｎｍのサイズ（例えば、球体換算径（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ））を有する粒子を指す。
用語「粒径」（または「ナノ粒子径」もしくは「微小粒子径」）は、本明細書で使用する場合、ナノ粒子または微小粒子の分布におけるサイズ中央値を指す。サイズ中央値は、個々のナノ粒子の平均の直線寸法、例えば、球状のナノ粒子の直径から決定される。サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術を含めた、当技術分野のいくつもの方法によって決定することができる。
用語「組み込み効率」および「封入効率」は、本明細書で使用する場合、粒子の調製に使用される最初の量の治療用タンパク質に対する、粒子（例えば、ナノ粒子）に組み込まれる治療用タンパク質の量の割合を指す。
用語「装填能力」および「装填効率」は、本明細書では互換的に使用され、粒子（例えば、ナノ粒子）の荷電単糖単位のモル分率に対する、封入される治療用タンパク質のモル分率を指す。
本明細書で使用する場合、用語「水性の溶媒」は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の水を含む液体を指す。いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水である。いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、緩衝液（例えば、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））である。
本明細書で使用する場合、「室温」は、室内の周囲温度、典型的には約１５℃から約２５℃の温度を指す。いくつかの実施態様では、室温は、１８℃である。
材料および方法
硫酸デキストランナトリウム塩（重量平均分子量５００ｋＤａ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。キトサン（分子量範囲５０〜１９０ｋＤａ、７５〜８５％脱アセチル化）（カタログ番号４４８８６９）、硫酸亜鉛、マンニトール、アズールＡ塩化物（カタログ番号８６１０４９）、およびリゾチーム（ニワトリ卵白）、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ（カタログ番号ｓｃ−２１４７１９）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水は、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。組換えヒトＳＤＦ−ｌαおよびＶＥＧＦ１６５は、以前に記載されたプロトコルに従って調製した。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１８６３−７２；およびＹｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９−２０を参照のこと）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）および骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ＳＤＦ−ｌα ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−ｌα ＤｕｏＳｅｔ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
実施例１−ＤＳＣＳナノ粒子の調製および分析
ナノ粒子調製物のための一般手順：
この研究では、ＤＳＣＳナノ粒子を、１．２〜３００ｍｌの総体積で調製した。３００ｍｌの調製については、１５０ｍｌ ＤＳ（１ｍｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｏ中））を、７００ｒｐｍで撹拌し、３７．５ｍｌ ＣＳ（１ｍｇ／ｍｌ、０．２％ 酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、０．８、０．４５、および０．２μｍ ＳＦＣＡ膜を通して連続的に濾過した）と１５分間混合した。次いで、撹拌速度を８００ｒｐｍに増大し、５．８ｍｌ ２００ｍＭ ＺｎＳＯ４を、シリンジポンプを通して１ｍｌ／分で添加した。この混合物を、さらに６０分間撹拌し、その後、１００ｍｌのマンニトールの１５％溶液の添加を行った。ＤＳＣＳナノ粒子を、２０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって沈殿させた。粒子ペレットを７０ｍｌ水で２回洗浄し、３０，０００×ｇで４０分間遠心分離させた。最終の粒子を、１２ｍｌのマンニトールの５％溶液に懸濁し、０．５ｍｌの一定分量に分け、−８０℃で凍結させ、３日間凍結乾燥させた。乾燥させた粒子を、使用まで４℃で乾燥保管した。
粒径およびゼータ電位最適化研究
以前に記載された手順に従う粒子分析のために、ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した（例えば、Ｂａｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ−ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこと）。簡単に言うと、１０〜１５μｌの粒子試料を、サイズまたはゼータ電位測定のために、０．５ｍｌまたは２．５ｍｌの水にそれぞれ希釈した。機器の標準の操作手順に従った。自己相関関数を、Ｃｏｎｔｉｎアルゴリズムによって分析し、粒子直径を、キュムラントとして示した。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して、電気泳動移動度から算出した。
マンニトール濃度の効果：
凍結乾燥中のＤＳＣＳナノ粒子の安定性に対するマンニトールの効果を、図１に示す。０．３〜５％マンニトールの存在下で、粒子のサイズと多分散指数との両方を徐々に低下させた。濃度効果は、２．５〜５％でプラトーに達し、ＤＳＣＳナノ粒子調製のために、５％マンニトールを選択した。
亜鉛濃度の効果：
粒径に対する亜鉛濃度の効果を、図２に示す。０から２０ｍＭに亜鉛濃度を増大させることは、凍結乾燥前の粒径低下をもたらしたが、これは凍結乾燥後に増加した。どちらの場合にも、粒子の多分散指数は、亜鉛濃度を増大させると共に低下した。ＤＳＣＳナノ粒子調製のために、６ｍＭの硫酸亜鉛濃度を選択した。
凍結乾燥の効果：
凍結乾燥は、粒子の全体サイズを低下させた；しかし、粒子の多分散指数は増加した（図２参照）。多分散の増大は、凍結乾燥プロセス中の超微小粒子の生成に起因する、粒子の不均一性の増大を反映していた。残りの粒子から粒子を超微小化するために、凍結乾燥させたＤＳＣＳナノ粒子の再構成後に、遠心分離（２１，０００×ｇ、２０分間）を実施し、得られた上清を捨てた。最後に調製された粒子のパラメータを、表１に示す：
ＤＳＣＳナノ粒子中の非中和ＤＳの定量化（アズールＡアッセイ）
ＤＳＣＳ ＮＰ中の荷電ＤＳの量を決定するために、アズールＡ異染色性アッセイを使用した。アズールＡアッセイは、溶液中の硫酸デキストラン（例えば、Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５９，１２，４６７−７２を参照のこと）およびヘパリン（例えば、Ｇｒａｎｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４，１３７（１），２５−３２を参照のこと）の濃度を測定するために、以前より確立されている。
アズールＡを、ストック溶液（４℃で保管）として１ｍｇ／ｍｌで水に溶解し、作業用溶液として水で０．０２ｍｇ／ｍｌに希釈した。分光光度分析のために、２ｍｌアズールＡ作業用溶液を、ポリスチレンキュベットに添加し、２０μｌ ＤＳ溶液と混合した。測定は、混合から１５分以内に行った。９６ウェルプレートフォーマットにおいてＤＳ濃度を決定するために、１０μｌ ＤＳ標準（硫酸デキストランナトリウム塩を用いて作成）または０〜０．２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＮＰ試料を、プレートウェルに添加した。次に、アズールＡ作業用溶液（２００μｌ）を添加し、続いて、プレートシェーカー上で２分間混合した。６２０ｎｍの波長での吸光度を読み取った。試料は、３連で行い、空のウェルは、装置ブランクとして使用した。
ＤＳ溶液と相互作用させた後のアズールＡの吸収スペクトルを、図３Ａに示す。典型的な検量線を図３Ｂに示し、０．０４〜０．２ｍｇ／ｍＬ濃度の硫酸デキストランナトリウム塩を用いて標準溶液を作製した。
アズールＡアッセイが、ＤＳＣＳ ＮＰ中の荷電ＤＳを検出することを確認するために、アッセイを実施して、粒子調製の各ステップにおけるＤＳ濃度を測定した。その結果を表２に示す：
ＤＳ含有量の低下の測定：
表２に表されたデータから分かる通り、ＤＳの検出可能な総量は、ＮＰ調製の第１のステップにおける１５０ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＳへの３７．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＣＳの添加後に、ＣＳによるＤＳ中の硫酸基の中和に起因して、約２０％低下した。ＤＳＣＳナノ粒子中の非中和ＤＳ含有量の算出は、次の通りに実施した：ＤＳ（硫黄含有量１７％）中の硫酸グルコース単位の質量は、２．３硫酸ナトリウム置換［（２３＋９７−１８）＊２．３＝２３５］と１グリコシド結合（５％分枝を無視）（−１８）を有するグルコース単位（質量＝１８０）と仮定すれば、およそ３９７であり；ＣＳ（８０％脱アセチル化）中のグルコサミン単位の質量は、０．８グルコサミン単位（１７９＊０．８＝１４３）、０．２ Ｎ−アセチルグルコサミン単位（２２１＊０．２＝４４）、および１グリコシド結合（−１８）と仮定すれば、１６９である。４：１のＤＳとＣＳとの重量比では、ＤＳとＣＳ中の糖単位の比は、１：０．５９である。各単位は、平均で、ＤＳ中の２．３負電荷とＣＳ中の０．８正電荷を有する。したがって、ＤＳとＣＳとの間の総電荷比は、約２．３：０．４７（５：１）である。中和された場合、荷電ＤＳは、全体の約８０％を構成するであろう。この電荷は、硫酸亜鉛およびマンニトール添加後に残存し、これは、粒子構造それ自体が、アズールＡによるその荷電ＤＳの検出性に影響を与えなかったことを示している。
ＣＳ含有量の測定：
チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ比色定量アッセイ（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｏｖｉｔｓ，Ａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｐｐｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ ２０１２，６６（８），９７９−８２；およびＭｕｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２６０（２），２５５−７を参照のこと）を使用して、遊離のＣＳの濃度を測定した。このアッセイを使用して、ＤＳとＣＳの混合物中でキトサンは検出されず、これは、ＣＳの完全な中和を示している。
実施例２−タンパク質のＤＳＣＳナノ粒子への組み込み
タンパク質のナノ粒子への組み込みのための一般手順：
タンパク質組み込みの前に、一定分量の凍結乾燥させたＤＳＣＳナノ粒子を水（例えば、０．５ｍｌ）で再構成し、２１，０００×ｇで２０分間遠心分離して、超微小粒子を除去した。ペレットを０．５ｍｌ ２．５％マンニトールに再懸濁し、アズールＡアッセイを実施して、懸濁させたＮＰ中の荷電ＤＳ濃度を決定した。次いで、タンパク質組み込みを、次の通りに実施した：
ａ）４０μｇ荷電ＤＳを含有する量のナノ粒子を、２ｍｌガラスバイアルに移し、水、そうでなければ特定の緩衝液と混合して、０．３ｍｌの総体積とした。次いで、このナノ粒子を８００ｒｐｍで撹拌し、０．１ｍｌタンパク質溶液をゆっくりと添加した。撹拌速度を３００ｒｐｍに低下させ、２０分間継続して、組み込み反応を完了した、または
ｂ）組み込み反応は、特定の量のＤＳＣＳ ＮＰおよびタンパク質を、水、５０％ＰＢＳ、そうでなければ記述した緩衝液に入れたものを希釈し、８００ｒｐｍで撹拌しながらＮＰにタンパク質溶液をゆっくりと添加することによって実施した。総反応体積は、０．３ｍｌまたは場合によっては０．１５ｍｌであり、これを、それぞれ、１．５×８ｍｍ撹拌子を備えた２ｍｌガラスバイアル、または３×３ｍｍ撹拌子を備えた１．５ｍｌ管に入れた。この混合物を、３００ｒｐｍでさらに２０分間撹拌した。
タンパク質組み込み効率分析のための一般プロトコル
組み込み反応後、２１，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、組み込まれていないタンパク質から粒子を分離した。上清を収集し、ペレットを２．５％マンニトールに再懸濁して、元の体積とした。等しい体積の上清およびペレットを、電気泳動のための４〜２０％ ＳＤＳゲルに装填した。ゲルを、クーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドを、ＢｉｏＲａｄ ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して、以前に記載されている濃度測定分析によって定量化した。（例えば、Ｂａｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ−ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこと）。
ＳＤＦ−１α
ＳＤＦ−ｌαは、ケモカインかつ重要な幹細胞ホーミング因子である（例えば、Ｓｔｅｂｌｅｒ，Ｊｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００４，２７２，（２），３５１−６１；Ｓｈａｒｍａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１／ＣＸＣＲ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２０１１，２０，（６），９３３−４６；およびＧｈａｄｇｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ−ｌαｌｐｈａ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｏｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１２９，（ｌ）９７−１０８を参照のこと）。その成熟形は、７，９６３Ｄａの分子量および等電点９．９を有する。ＳＤＦ−ｌαは、溶液では単量体であるが、ヘパリンと結合すると二量体を形成する（例えば、Ｆｅｒｍａｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｆｕｃｏｉｄａｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ １２） ａｒｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＥ−ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８，（１２），１０５４−６４；およびＳａｄｉｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−ｌａｌｐｈａ−ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，（１１），８２８８−９６を参照のこと）。アルカリ性のｐＨも、ＳＤＦ−ｌαの二量体形成を促進する。ＳＤＦ−ｌαは、ヘパリン断片内の１２〜１４個の糖単位を占める、特異的なヘパリン結合部位を有する。（例えば、Ｖｅｌｄｋａｍｐ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｏｎｏｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＣＸＣＬ１２） ｉｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｂｙ ｐＨ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５，１４，（４），１０７１−８１；およびＡｍａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−ｌａｌｐｈａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｂｅｔａ−ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４，（３４），２３９１６−２５を参照のこと）。
ＳＤＦ ＮＰの形成および特徴付け：
組み込み研究においてＤＳＣＳ ＮＰ中のＳＤＦ−ｌαと荷電ＤＳとの化学量論比を決定するために、荷電ＤＳ中の糖単位の数を、３７９というＤＳ中の硫酸グルコース単位の質量を使用して算出した（上の説明を参照のこと）。ＳＤＦ−１αをＤＳＣＳ ＮＰと様々な比で混合することによって、組み込み反応を実施し、続いて、遠心分離を行って、ＤＳＣＳ ＮＰから組み込まれていないＳＤＦ−１αを分離した。ペレットおよび上清分画中のＳＤＦ−１αの量を、ＳＤＳゲル上で分析した。ＳＤＦ−ｌαの、あらかじめ形成したＤＳＣＳナノ粒子への組み込みの結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。
図４Ａは、水（ｐＨ６）中で実施された反応について、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり１．３〜１．９ｎｍｏｌのＳＤＦ−１α比で、粒径およびゼータ電位は有意には変化しなかったことを示す。この点を超えると、粒子は著しく凝集した。アルカリ性のｐＨ（ｐＨ８）は、凝集を誘発するまでに、もう少しの（ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり２．５ｎｍｏｌまで）ＳＤＦ−１α装填を可能にした。ＤＳＣＳ ＮＰの前述の装填限界（平均約１．５ｎｍｏｌのＳＤＦ−１α／ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位）は、全荷電ＤＳの１０％未満が、ＮＰ安定性に影響を及ぼす前に占有されている可能性があることを示唆している。
図４Ｂは、組み込み効率が、試験されたＳＤＦ−ｌα装填量（１〜３ｎｍｏｌ／１００ｎｍｏｌ荷電糖単位）のすべてで、９２〜１００％であったことを示し、これは、ＤＳＣＳナノ粒子中の荷電ＤＳが、より多くのＳＤＦ−ｌαと結合する能力があったが、余分な結合が粒子の凝集を引き起こしたことを示している。この組み込み効率は、捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）方法を使用して以前に得られたものを超えており、得られた粒径は、以前に得られたよりも小さかった（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ−ｌａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９−２０（ここでは、組み込み効率は６６〜８０％であり、粒径は約６４０ｎｍであった）を参照のこと）。
ＶＥＧＦ
ＶＥＧＦは、血管形成および脈管形成に関与する重要な増殖因子である。（例えば、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）１９９９，７７，（７），５２７−４３を参照のこと）。このタンパク質は、約４０，０００ＤａのＭＷ、および７．６の等電点を有するジスルフィド結合されたホモ二量体である（糖鎖修飾を含まない各単量体は１９，１６６Ｄａである）。ＶＥＧＦは、各単量体のカルボキシル末端に位置する２つのヘパリン結合ドメインを介してヘパリンと結合する。（例えば、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９８，６，（５），６３７−４８を参照のこと）。各単量体中の結合ドメインは、６〜７個の糖単位を占め、ホモ二量体ＶＥＧＦは、強い結合のために１４個の糖単位を必要とする。（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＶＥＧＦ１６５−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｌｉｂｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｋ５ ｌｙａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１，（３），１７３１−４０；およびＺｈａｏ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１２，３２，（１），７１−８１を参照のこと）。
ＶＥＧＦ ＮＰの形成および特徴付け：
ＶＥＧＦの、あらかじめ形成したＤＳＣＳナノ粒子への組み込みを、図５に示す。図５内のデータは、粒子のサイズおよびゼータ電位に有意には影響を及ぼさないＶＥＧＦの最大装填が、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり０．６３〜１ｎｍｏｌ ＶＥＧＦであり、組み込み効率が、試験されたＶＥＧＦ装填量（最大２ｎｍｏｌ）で９６〜１００％であったことを示す。これらの結果は、ＳＤＦ−ｌα組み込みから得られた結果と同様である。すなわち、粒子が、より多くのタンパク質と結合する能力があったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位のうち、１４ｎｍｏｌのみが、粒子の安定性に影響を与えずに占有された可能性がある。ＳＤＦ−１αで判明したのと同様、ＶＥＧＦの装填限界は、１０％未満の荷電硫酸グルコース単位ＤＳＣＳ ＮＰが、ＮＰの安定性に影響を与えずに占有され得ることを示唆している。
組み込み効率は、試験されたすべてのＶＥＧＦ装填量（０．２５〜２ｎｍｏｌ／１００ｎｍｏｌ荷電糖単位）で、９６〜１００％であり、捕捉方法によって達成されたものを超えていた。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１，（７），１８６３−７２ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ 〜４０％；およびＨｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７−１４は、５０〜８０％の組み込み効率を示していた）。
あらかじめ作製したＤＳＣＳナノ粒子への、ＳＤＦ−ｌα、ＶＥＧＦ、およびＢＳＡの組み込みの比較
アルブミンおよびグロブリンは、血液中で最も豊富なタンパク質である。タンパク質は、様々な無機／有機材料の表面に吸着することができるので、あらかじめ形成したＤＳＣＳ ＮＰへの、これらのタンパク質の吸着を検討した。
ＢＳＡは、血清中で最も豊富なタンパク質であり；これは、血液中の様々な小分子または巨大分子と結合して運搬する。ＢＳＡは、６６，４６３ＤａのＭＷ、４．７〜５．６の等電点を有し、ヘパリン結合部位またはその配列内のドメインを有しない。ＤＳＣＳナノ粒子へのＢＳＡの組み込みを水中で最初に試験し、かなり効率的であることが判明した：
ａ）図６に示す通り、５０μｇ ＢＳＡ（０．７５ｎｍｏｌ）を、ＤＳＣＳナノ粒子中の４０μｇ荷電ＤＳと混合することは、ＢＳＡのＮＰへの８０％組み込みをもたらした。それにもかかわらず、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下では、ＢＳＡの８％しか組み込まれなかった；または
ｂ）５０μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．７５ｎｍｏｌ）またはヤギガンマグロブリン（０．４２ｎｍｏｌ）を、中水または５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のＤＳＣＳ ＮＰ（１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位を含有）と混合した。水中で混合した場合、かなりの量のＢＳＡおよびガンマグロブリンがＤＳＣＳ ＮＰに吸着する（それぞれ、８０％および９２％）のに対して、５０％ＰＢＳ中で混合した場合には、それぞれ、８％および４％しか吸着しなかった。
対照的に、ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの、ＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みは、５０％ＰＢＳによって影響を受けなかった（図６参照）。
あらかじめ作製したＤＳＣＳナノ粒子への、リゾチーム、ＦＧＦ−２、およびＢＭＰ−２の組み込み
リゾチーム、ＦＧＦ−２、およびＢＭＰ−２の組み込みを、５０％ＰＢＳにおいて研究した。
リゾチーム（ＭＷ １４．３ｋＤａ、ｐｌ １１．４）は、ヘパリン結合タンパク質ではない（例えば、Ｏｒｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６，（２２），１９８９２−９０４を参照のこと）が、低濃度塩類溶液中でヘパリンと結合することが、以前より示されている。（例えば、Ｚｏｕ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ １９９２，１０３，（４），８８９−９５；およびＶａｎ ｄｅ Ｗｅｅｒｔ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００４，２１，（１２），２３５４−９を参照のこと）。精製されたリゾチームは、商業的供給源から、比較的大量かつ低コストで得られる可能性がある。
ＦＧＦ−２（ＭＷ １７．１ｋＤａ、ｐｌ ９．６）は、単量体のタンパク質であり、ヘパリンと結合すると二量体を形成する。（例えば、ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｅｐａｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９３，（６６８７），８１２−７；Ｆａｈａｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７１，（５２５２），１１１６−２０；およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｔｅｒｎａｒｙ ＦＧＦ−ＦＧＦＲ−ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２０００，６，（３），７４３−５０を参照のこと）。
ＢＭＰ−２（ＭＷ ２５．８ｋＤａ、ｐｌ ８．２）は、ジスルフィド結合されたホモ二量体ヘパリン結合タンパク質である。（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，（１），２９５−３０２；およびＶａｌｌｅｊｏ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３，２８０，（１），８３−９２を参照のこと）。
これらのタンパク質のそれぞれの組み込みを、２つの異なる装填比で検討した。リゾチームおよびＦＧＦ−２については、比は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位あたり１または２ｎｍｏｌのタンパク質であった；ＢＭＰ−２については、ＢＭＰ−２は二量体であるので、この比を半分に減らした。図７および表３に示す通り、５０％ＰＢＳにおけるこれらのタンパク質の組み込み効率は、９５〜１００％であった。ＤＳＣＳ ＮＰのサイズおよびゼータ電位は、タンパク質と荷電硫酸グルコース単位の比２：１００でのＦＧＦ−２が組み込まれたＤＳＣＳ ＮＰを除いて、有意には変化しなかった。ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦ組み込みからの知見に加えて、ヘパリン結合タンパク質のＤＳＣＳ ＮＰへの最大装填は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり、単量体タンパク質についてはおよそ１．５ｎｍｏｌ、または二量体タンパク質については０．７５ｎｍｏｌであった。これらの試料では、有意な凝集は見られなかった。多分散指数は、２ｎｍｏｌ ＦＧＦ−２および１ｎｍｏｌ ＢＭＰ−２試料において増加し、これは、これらが、その装填限界に近づいていることを示唆していた。
実施例３−ＳＤＦ−１αナノ粒子およびＶＥＧＦナノ粒子の活性および安定性
遊走アッセイプロトコル：
ＳＤＦ−ｌαの走化性アッセイ活性を決定するために、ジャーカット細胞遊走アッセイを使用した。以前に記載された手順に従った。（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ−ｌａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９−２０を参照のこと）。
内皮細胞増殖アッセイプロトコル：
ＶＥＧＦの活性を決定するために、以前に記載された手順に従ってこのアッセイを使用した。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１８６３−７２を参照のこと）。このアッセイのためにヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）を使用し、細胞増殖の推定のために細胞増殖アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６）を使用した。
ＳＤＦ ＮＰの活性および安定性：
ＮＰが組み込まれたＳＤＦ−１α（ＳＤＦＮＰ）の走化活性を検討するために、ジャーカット細胞遊走アッセイを実施した。遊離またはナノ粒子形のＳＤＦ−ｌαを、遊走培地で１および３ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、遊走アッセイのために使用した。図８Ａに示す通り、分析された両方のＳＤＦ−ｌα濃度で、遊離のＳＤＦ−ｌαとＳＤＦ−ｌαナノ粒子の遊走活性は、類似であり、これは、ＮＰ組み込みが、ＳＤＦ−ｌαの走化活性に影響を与えなかったことを示している。
タンパク質ナノ粒子の熱安定性を決定するために、遊離のＳＤＦ−ｌαおよびＳＤＦ−ｌα ナノ粒子（ＳＤＦ ＮＰ）を、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４日間インキュベートした。様々な時点で一定分量を取り出し、遊走アッセイによって分析した。図８Ｂに示す通り、３７℃での６、１４、および２４日のインキュベーション後、ＳＤＦ−ｌαの活性は、それぞれ、６１±９％、２９±１２％、および２９±５％であったのに対して、ＳＤＦ ＮＰの活性は、それぞれ、９６±５％、８０±２０％、および５２±４％であった。したがって、ＳＤＦ−ｌαの熱安定性は、ＤＳＣＳナノ粒子への組み込みによって向上した。研究では、ヘパリンへの結合が、プロテアーゼ分解からＳＤＦ−ｌαを保護することが示されている。（例えば、Ｓａｄｉｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，（４２），４３８５４−６０；およびＴａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ＣＸＣＲ４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２，１１，（１１），２５１６−２５を参照のこと）。
ＶＥＧＦ ＮＰの活性および安定性：
ＶＥＧＦの活性を、内皮細胞増殖アッセイによって検討した。図９Ａに示す通り、ＮＰが組み込まれたＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＮＰ）は、ＶＥＧＦと同様の活性を有し、これは、捕捉方法によって作製されたＶＥＧＦ ＮＰを使用する以前の知見と一致していた。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１８６３−７２を参照のこと）。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰの熱安定性を比較するために、これらの試料を３７℃で最大２０日間インキュベートした。試料の活性を、様々なインキュベーション時間で分析し、４℃に維持したＶＥＧＦストック（対照）と比較した。第１３日および第２０日のインキュベーションでの試料の活性を、それぞれ、図９Ｂおよび図９Ｃに示す。
結果は、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰが両方とも、３７℃での２０日間のインキュベーション後に十分な活性を保持していたことを示し、これは、遊離の形のＶＥＧＦが、普通とは異なって熱的に安定であり、３７℃での第２０日のインキュベーションが、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰの安定性に差異を生じさせなかったことを示している。この結果は、ＶＥＧＦの熱安定性を決定するために示差走査熱量測定法を使用する以前の研究と一致している。（例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７−１４；およびＭｕｌｌｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，（４５），４３４１０−６（ここでは、ＶＥＧＦが、１０７℃またはｌ０８℃という普通ではない高い融点を有することが判明し、これは、非常に高い熱安定性を示していた）を参照のこと）。ＶＥＧＦをＤＳＣＳナノ粒子に組み込むことは、融点をさらに１１５℃超まで上昇させ、これは、ＶＥＧＦの熱安定性が、ＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みによってさらに高められることを示している。
実施例４−ＤＳＣＳナノ粒子の架橋
ＤＳＣＳナノ粒子を、粒子のコア中のキトサンをジカルボン酸と架橋させることによって、共有結合的に改変した。この方法では、ＤＳＣＳ ＮＰを、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水に懸濁させた。ＮＰを、短鎖ジカルボン酸（例えば、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、または酒石酸、５〜３０ｍＭ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２０〜１００ｍＭ））、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２０〜１００ｍＭ）と、２５℃で１６時間混合することによって、架橋反応を実施した。粒子を、１５，０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈殿させ、ＤＰＢＳで洗浄し、耐塩性選択のために３×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）に再懸濁した。３時間のインキュベーション後、懸濁液中の凝集体を、２００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離によって沈殿させる。次いで、粒子を、ＤＰＢＳに再懸濁し、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰＶＤＦ膜を通して濾過する。得られた粒子を、架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）と称する。架橋反応は、キトサン中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシル基との間のアミド結合形成をもたらし、これは、キトサンを粒子のコア中で橋架けする。架橋されたＮＰ中の新しいアミドの形成は、フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）のスペクトルが示される図１２および１５において実証される。
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）の性質
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）は、架橋されていない粒子と比較すると注目すべき塩安定性を獲得した。図１３、１６、および１７に示す通り、ｘＮＰの粒径および均一性（多分散指数）は、最大２ＭのＮａＣｌ溶液中でのインキュベーション後に変化しなかったが、架橋されていないＤＳＣＳ ＮＰは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中で凝集した。同様に、ｘＮＰは、ウシ胎児血清（血清）および完全な細胞培養培地、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ＋）中で安定であったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰは、これらの培地中で凝集した。
架橋反応は、粒子のコアで起こるので、ｘＮＰは、ＤＳＣＳ ＮＰと同様の粒径および表面特性を有する。ｘＮＰは、ＤＳＣＳ ＮＰと同様の方式でヘパリン結合タンパク質が組み込まれることを可能にし（図１４および表４）、結合されたタンパク質は、十分なまたは増進された生物活性を呈する。図１８および１９を参照のこと。
タンパク質の架橋ナノ粒子への組み込み：
図１４および表４は、タンパク質の架橋ＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）への組み込みを示す。
プロトコル：
示された量のＦＧＦ−２、ＳＤＦ−ｌα、ＢＭＰ−２、またはＶＥＧＦを、１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ−ＳＯ３−）を含有するｘＮＰと、ＰＢＳ中で２０分間混合した。組み込まれていないタンパク質を、遠心分離によって粒子から分離し、得られたペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を、ＳＤＳゲル上で分析した（図１４に示す通り）。組み込み効率は、ゲルバンドの濃度測定分析に基づいて推定した。次いで、タンパク質が組み込まれたｘＮＰを、凍結乾燥させ、−８０℃で保管した。ＰＢＳでのＮＰの再構成後に、タンパク質が組み込まれたｘＮＰの粒子サイズおよびゼータ電位を決定した。データは、検討された増殖因子のｘＮＰへの組み込み効率が、９５〜１００％であり、ｘＮＰの粒径およびゼータ電位が、示されたタンパク質装填割合では有意には変化せず、粒子が、組み込みおよび保管プロセス全体を通して安定であったことを示す。
インビボ特性
ｘＮＰは、体液、または半流動体の体表面において凝集しない。この特性は、特に炎症性疾患の状況において、粒子に対する炎症反応を予防する。図２０は、違いの例を示す。研究のために使用されるラットに、肺の内皮傷害および肺高血圧症を引き起こすモノクロタリンを注射した。さらに、これらのラットに、毎日、シクロスポリン、すなわち幹細胞治療のために使用される免疫抑制剤を与えた。ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰを、これらのラットの肺内でエアロゾル噴霧した場合、ＤＳＣＳ ＮＰ治療されたラットの何匹かにおいて、炎症および線維症が見られたが、ｘＮＰ治療されたラットでは見られなかった。これらの結果は、ｘＮＰが、インビボ送達目的で、ＤＳＣＳ ＮＰよりも優れている可能性があることを示唆している。
架橋されたナノ粒子の特徴付け
硫酸デキストランおよびキトサンナノ粒子（ＤＳＣＳ ＮＰ）およびその架橋された誘導体ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、およびＴＡ ｘＮＰのフーリエ変換赤外分光スペクトルを、図１２に示す。データは、架橋されたＮＰ中のアミド結合形成を示す。
架橋されたナノ粒子の安定性
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰの安定性を、図１３で実証する。架橋されたＮＰ、ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、またはＴＡ ｘＮＰを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ）と共に、２５℃で１６時間インキュベートした。次いで、粒子をＰＢＳで洗浄および懸濁し、そのサイズおよびゼータ電位を決定した。データは、架橋されたＤＳＣＳ ＮＰが、完全な血清または細胞培養培地中で安定であることを示す。
改変されたＤＳＣＳ ＮＰは、高濃度塩類溶液および様々な生理流体（血漿が含まれる）中で安定であり、治療目的のヘパリン結合タンパク質を容易に装填することができる。この粒子は、亜鉛イオンの代わりに、血液への注射に、より適合する、カルシウムイオンを含有する。
実施例５−気管内エアロゾル噴霧、およびＳＤＦ−ｌα含有量に関する肺組織の分析（ＳＤＦ ＮＰのインビボ保持時間）
２００〜２２５ｇの体重の雄のスプラーグドーリーラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、本発明者らの動物施設内で４日間順化させた。動物に関するハーバードメディカルエリア常設委員会（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ）によって承認されたプロトコルに従って、動物研究を実施した。
ＳＤＦ−ｌαまたはＳＤＦナノ粒子の気管内エアロゾル噴霧、ならびに肺におけるＳＤＦ−ｌα含有量の分析は、以前に記載された手順に従って実施した。（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ−ｌαｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９−２０を参照のこと）。簡単に言うと、ＳＤＦ−ｌα、または１２μｇ ＳＤＦ−ｌα含有量を伴うＳＤＦナノ粒子を、０．２５ｍｌの体積の５０％ＰＢＳで希釈し、Ｐｅｎｎ−ＣｅｎｔｕｒｙからのＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒを用いてラットの肺にエアロゾル噴霧した。エアロゾル噴霧の後、０、１６、４８、および７２時間で、ラット肺組織を採取し、液体窒素中で凍結させた。この組織をホモジナイズし、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、ホモジネート上清中のタンパク質濃度を決定した。上清中のＳＤＦ−ｌα濃度は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからの試薬を製造業者の指示に従って使用するＥＬＩＳＡによって決定した。
図１０に示す通り、遊離の形のＳＤＦ−ｌαに曝露させた肺組織におけるＳＤＦ−ｌα含有量は、エアロゾル噴霧の１６時間後にほとんど検出できなかった（約２％残存）が、ＳＤＦ ＮＰに曝露させた肺においては、送達の１６時間、４８時間、および７２時間後に、それぞれ、最初の値の１００％、７６％、および３４％で、検出可能なままであった。
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２４．Ｓａｄｉｒ Ｒ，Ｂａｌｅｕｘ Ｆ，Ｇｒｏｓｄｉｄｉｅｒ Ａ，Ｉｍｂｅｒｔｙ Ａ，Ｌｏｒｔａｔ−ＪａｃｏｂＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ−ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｒ １６ ２００１；２７６（１１）：８２８８−８２９６．
２５．Ｆｅｒｍａｓ Ｓ，Ｇｏｎｎｅｔ Ｆ，Ｓｕｔｔｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｆｕｃｏｉｄａｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ １２）ａｒｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＥ−ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄｅｃ ２００８；１８（１２）：１０５４−１０６４．
２６．Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．Ｊｕｌ １９９９；７７（７）：５２７−５４３．
２７．Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ ＷＪ，Ｃｈａｍｐｅ ＭＡ，ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨＷ，Ｋｅｙｔ ＢＡ，Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ ＭＡ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅＨｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｍａｙ １５ １９９８；６（５）：６３７−６４８．
２８．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＣＪ，Ｍｕｌｌｏｙ Ｂ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＪＴ，Ｓｔｒｉｎｇｅｒ ＳＥ．ＶＥＧＦ１６５−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎＨｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓ ｔｗｏＨｉｇｈｌｙ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｌｉｂｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｋ５ ｌｙａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｎ ２０ ２００６；２８１（３）：１７３１−１７４０．
２９．Ｚｈａｏ Ｗ，ＭｃＣａｌｌｕｍ ＳＡ，Ｘｉａｏ Ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｆｏｒＨｅｐａｒｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．Ｆｅｂ ２０１２；３２（１）：７１−８１．
３０．ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ ＡＤ，Ｌａｘ Ｉ，Ｃｈｅｎ ＤＩ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａＨｅｐａｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｊｕｎ ２５ １９９８；３９３（６６８７）：８１２−８１７．
３１．Ｆａｈａｍ Ｓ，Ｈｉｌｅｍａｎ ＲＥ，Ｆｒｏｍｍ ＪＲ，Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ，Ｒｅｅｓ ＤＣ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｆｅｂ ２３ １９９６；２７１（５２５２）：１１１６−１１２０．
３２．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ，Ｉｂｒａｈｉｍｉ ＯＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｔｅｒｎａｒｙ ＦＧＦ−ＦＧＦＲ−ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒＨｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ ２０００；６（３）：７４３−７５０．
３３．Ｒｕｐｐｅｒｔ Ｒ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅ，Ｓｅｂａｌｄ Ｗ．Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａＨｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｐｒ １ １９９６；２３７（１）：２９５−３０２．
３４．Ｖａｌｌｅｊｏ ＬＦ，Ｒｉｎａｓ Ｕ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ Ｊ．Ｊａｎ ２０１３；２８０（１）：８３−９２．
３５．Ｚｏｕ Ｓ，Ｍａｇｕｒａ ＣＥ，Ｈｕｒｌｅｙ ＷＬ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ．Ｄｅｃ １９９２；１０３（４）：８８９−８９５．
３６．Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ，Ｊａｙａｎｔｈｉ Ｓ，Ｌａｎｇｓｔｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．Ｏｃｔ ２０１６；１２６：９３−１０３．
３７．Ｓａｄｉｒ Ｒ，Ｉｍｂｅｒｔｙ Ａ，Ｂａｌｅｕｘ Ｆ，Ｌｏｒｔａｔ−ＪａｃｏｂＨ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ １５ ２００４；２７９（４２）：４３８５４−４３８６０．
３８．Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ Ｔ，Ｚｉａｒｅｋ ＪＪ，Ｖｏｌｋｍａｎ ＢＦ，Ｈｗａｎｇ ＳＴ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ＣＸＣＲ４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．Ｎｏｖ ２０１２；１１（１１）：２５１６−２５２５．
３９．Ｍｕｌｌｅｒ ＹＡ，Ｈｅｉｒｉｎｇ Ｃ，Ｍｉｓｓｅｌｗｉｔｚ Ｒ，Ｗｅｌｆｌｅ Ｋ，ＷｅｌｆｌｅＨ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖ ８ ２００２；２７７（４５）：４３４１０−４３４１６．
４０．Ｄｅｌａｉｒ，Ｔ．（２０１１）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ７８，１０−１８．
４１．Ｚａｍａｎ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｌａｕ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｔ．，Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｏｓｃａｌｚｏ，Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｙ．（２０１６）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆＨｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ−ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，６１４９−６１５９．
他の実施態様
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しないことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許請求の範囲の範囲内である。
他の実施態様
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しないことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許請求の範囲の範囲内である。

本発明は次の実施態様を含む。
［１]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコアは、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［２]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であって、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［３]
前記第１の溶液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［４]
前記水性の溶媒が、水および緩衝生理食塩水から選択される、［３］に記載の方法。
［５]
前記緩衝生理食塩水が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である、［４］に記載の方法。
［６]
前記溶液中の治療用タンパク質の濃度が、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７]
前記第１の懸濁液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［８]
前記溶液中の治療用タンパク質と、前記粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記治療用タンパク質の溶液を前記第１の懸濁液に添加することによって実施される、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０]
前記混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１]
前記混合が、約２０分間実施される、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４]
前記糖アルコールの溶液が、水溶液である、［１３］に記載の方法。
［１５]
前記糖アルコールの水溶液が、約２．５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１６]
前記糖アルコールの水溶液が、約５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１７]
前記粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率が、約９０％から約１００％である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８]
前記粒子が、ナノ粒子である、［１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９]
前記ナノ粒子の直径が、約３００ｎｍから約６００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２０]
前記ナノ粒子の直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２１]
前記ナノ粒子の直径が、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである、［２０］に記載の方法。
［２２]
前記ナノ粒子のコアの直径が、前記粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未満である、［２０］に記載の方法。
［２３]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約３：１から約５：１である、［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［１］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５]
前記検出可能な量の前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖が、粒子調製物に使用される総量の約８０％である、［１］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約−３５ｍＶから約−５０ｍＶである、［１］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約−４０ｍＶから約−４５ｍＶである、［１］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８]
前記負の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９]
前記官能基が、カルボン酸（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ） ２ （ＯＨ）または−ＳＯ ３ Ｈ）、およびホスホン酸（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ ）から選択される、［１］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリコサミノグリカンである、［１］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１]
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリカンである、［１］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３３]
前記グリカンが、硫酸デキストランである、［３２］に記載の方法。
［３４]
前記正の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５]
前記官能基が、アミノ基（−ＮＨ ２ ）である、［１］〜［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６]
前記正の電荷を持つ多糖が、ポリグルコサミンである、［１］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７]
前記ポリグルコサミンが、キトサンである、［３６］に記載の方法。
［３８]
前記正の電荷を持つ多糖が、前記粒子のコア中で架橋されている、［１］または［３］〜［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９]
前記架橋剤が、ジカルボン酸である、［３８］に記載の方法。
［４０]
前記架橋のための触媒が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択される、［３９］に記載の方法。
［４１]
前記ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から選択される、［３９］または［４０］に記載の方法。
［４２]
前記治療用タンパク質が、前記治療用粒子中の前記負の電荷を持つ多糖に結合されている、［１］〜［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３]
前記治療用タンパク質と前記負の電荷を持つ多糖が、非共有結合的に結合されている、［４２］に記載の方法。
［４４]
前記治療用タンパク質が、ヘパリン結合ドメインを含む、［１］〜［４３］のいずれかに記載の方法。
［４５]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質に固有のものである、［４４］に記載の方法。
［４６]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質の組換え産生中に、前記治療用タンパク質にタグ付けされる、［４５］に記載の方法。
［４７]
前記治療用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［４８]
前記増殖因子が、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、［４７］に記載の方法。
［４９]
前記サイトカインが、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される、［４７］に記載の方法。
［５０]
前記酵素が、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β−グルコ−セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１−プロテイナーゼ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、［４７］に記載の方法。
［５１]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５２]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５３]
前記治療用タンパク質に関する粒子の装填能力が、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］〜［５２］のいずれかに記載の方法。
［５４]
前記治療用タンパク質に関する前記粒子の装填能力が、前記負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、［５２］に記載の方法。
［５５]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ−１αに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５６]
前記治療用タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５７]
前記治療用タンパク質が、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ−２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５８]
前記治療用タンパク質が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ−２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［５９]
前記治療用タンパク質が、リゾチームであり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［６０]
前記治療用粒子が、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む、［１］〜［５９］のいずれかに記載の方法。
［６１]
前記粒子が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とを含む、［６０］に記載の方法。
［６２]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される、［１］〜［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される、［１］〜［６１］のいずれかに記載の方法。
［６４]
前記第１の溶液が、水溶液である、［６２または６３］に記載の方法。
［６５]
前記第１の溶液における水溶液が、水である、［６４］に記載の方法。
［６６]
前記第１の溶液中の前記負の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］〜［６５］のいずれかに記載の方法。
［６７]
前記第２の溶液が、水溶液である、［６２］〜［６６］のいずれかに記載の方法。
［６８]
前記第２の溶液における水性の溶媒が、約０．２％酢酸水溶液である、［６７］に記載の方法。
［６９]
前記第２の溶液中の前記正の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］〜［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０]
前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［６２］〜［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記第２の溶液を前記第１の溶液に添加することによって実施される、［６２］〜［７０］のいずれかに記載の方法。
［７２]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［６２］〜［７１］のいずれかに記載の方法。
［７３]
前記ステップｉｉｉ）における前記第１の溶液と前記第２の溶液の混合の後に、この混合物への金属塩の水溶液の添加が続く、［６２］〜［７２］のいずれかに記載の方法。
［７４]
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される、［７３］に記載の方法。
［７５]
前記金属が、カルシウムである、［７３］に記載の方法。
［７６]
前記金属が、亜鉛である、［７３］に記載の方法。
［７７]
前記金属塩が、ＺｎＳＯ ４ である、［７３］に記載の方法。
［７８]
前記金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ ４ の濃度が、約０．２Ｍである、［７７］に記載の方法。
［７９]
ＺｎＳＯ ４ と前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約１．３：１である、［７７］または［７８］に記載の方法。
［８０]
前記ステップｉｉｉ）の混合物への前記金属塩の水溶液の添加の後に、前記混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く、［７３］〜［７９］のいずれかに記載の方法。
［８１]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８０］に記載の方法。
［８２]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約１５重量％である、［８０］または［８１］に記載の方法。
［８３]
前記糖アルコールと前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約７５：１である、［８０］〜［８２］のいずれかに記載の方法。
［８４]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、［６２］〜［８３］のいずれかに記載の方法。
［８５]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８４］に記載の方法。
［８６]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約５重量％である、［８５］に記載の方法。
［８７]
［１］〜［８６］のいずれかに記載の方法によって調製される治療用粒子。
［８８]
［６２］〜［８７］のいずれかに記載の方法によって調製される粒子。
［８９]
［８７］に記載の治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
［９０]
疾患または状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の［８７］に記載の治療用粒子または［８９］に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
［９１]
前記疾患または状態が、前記治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される、［９０］に記載の方法。
［９２]
前記疾患または状態が、癌である、［９０］または［９１］に記載の方法。
［９３]
前記疾患または状態が、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である、［９０］または［９１］に記載の方法。

Claims (93)

  1. 治療用粒子を製造する方法であって：
    ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
    ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコアは、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
    ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
    を含む方法。
  2. 治療用粒子を製造する方法であって：
    ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
    ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であって、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
    ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
    を含む方法。
  3. 前記第１の溶液が、水性の溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記水性の溶媒が、水および緩衝生理食塩水から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記緩衝生理食塩水が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記溶液中の治療用タンパク質の濃度が、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１の懸濁液が、水性の溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記溶液中の治療用タンパク質と、前記粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記治療用タンパク質の溶液を前記第１の懸濁液に添加することによって実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記混合が、約８００ｒｐｍで実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記混合が、約２０分間実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記糖アルコールの溶液が、水溶液である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記糖アルコールの水溶液が、約２．５重量％のマンニトールを含む、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記糖アルコールの水溶液が、約５重量％のマンニトールを含む、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率が、約９０％から約１００％である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記粒子が、ナノ粒子である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ナノ粒子の直径が、約３００ｎｍから約６００ｎｍである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ナノ粒子の直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ナノ粒子の直径が、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ナノ粒子のコアの直径が、前記粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未満である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約３：１から約５：１である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記検出可能な量の前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖が、粒子調製物に使用される総量の約８０％である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約−３５ｍＶから約−５０ｍＶである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約−４０ｍＶから約−４５ｍＶである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記負の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記官能基が、カルボン酸（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）または−ＳＯ３Ｈ）、およびホスホン酸（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記負の電荷を持つ多糖が、グリコサミノグリカンである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記負の電荷を持つ多糖が、グリカンである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記グリカンが、硫酸デキストランである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記正の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記官能基が、アミノ基（−ＮＨ２）である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記正の電荷を持つ多糖が、ポリグルコサミンである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ポリグルコサミンが、キトサンである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記正の電荷を持つ多糖が、前記粒子のコア中で架橋されている、請求項１または３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記架橋剤が、ジカルボン酸である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記架橋のための触媒が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記治療用タンパク質が、前記治療用粒子中の前記負の電荷を持つ多糖に結合されている、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記治療用タンパク質と前記負の電荷を持つ多糖が、非共有結合的に結合されている、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記治療用タンパク質が、ヘパリン結合ドメインを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質に固有のものである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質の組換え産生中に、前記治療用タンパク質にタグ付けされる、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記治療用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記増殖因子が、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記サイトカインが、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記酵素が、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β−グルコ−セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１−プロテイナーゼ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびリゾチームから選択される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記治療用タンパク質に関する粒子の装填能力が、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記治療用タンパク質に関する前記粒子の装填能力が、前記負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ−１αに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記治療用タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記治療用タンパク質が、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ−２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記治療用タンパク質が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ−２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記治療用タンパク質が、リゾチームであり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記治療用粒子が、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記粒子が、ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記粒子が、
    ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
    ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
    ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと
    を含む方法によって製造される、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記粒子が、
    ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
    ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
    ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
    ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
    ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
    ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
    ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
    ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
    ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
    を含む方法によって製造される、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記第１の溶液が、水溶液である、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記第１の溶液における水溶液が、水である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記第１の溶液中の前記負の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記第２の溶液が、水溶液である、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記第２の溶液における水性の溶媒が、約０．２％酢酸水溶液である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記第２の溶液中の前記正の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記第２の溶液を前記第１の溶液に添加することによって実施される、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記ステップｉｉｉ）における混合が、約８００ｒｐｍで実施される、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ステップｉｉｉ）における前記第１の溶液と前記第２の溶液の混合の後に、この混合物への金属塩の水溶液の添加が続く、請求項６２〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記金属が、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記金属が、カルシウムである、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記金属が、亜鉛である、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記金属塩が、ＺｎＳＯ４である、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度が、約０．２Ｍである、請求項７７に記載の方法。
  79. ＺｎＳＯ４と前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約１．３：１である、請求項７７または７８に記載の方法。
  80. 前記ステップｉｉｉ）の混合物への前記金属塩の水溶液の添加の後に、前記混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記糖アルコールが、マンニトールである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約１５重量％である、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記糖アルコールと前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約７５：１である、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、請求項６２〜８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記糖アルコールが、マンニトールである、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約５重量％である、請求項８５に記載の方法。
  87. 請求項１〜８６のいずれか一項に記載の方法によって調製される治療用粒子。
  88. 請求項６２〜８７のいずれか一項に記載の方法によって調製される粒子。
  89. 請求項８７に記載の治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  90. 疾患または状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項８７に記載の治療用粒子または請求項８９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
  91. 前記疾患または状態が、前記治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記疾患または状態が、癌である、請求項９０または９１に記載の方法。
  93. 前記疾患または状態が、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である、請求項９０または９１に記載の方法。
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