KR102507156B1 - 포도당 민감성 인슐린 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 인슐린 유도체 및 당뇨병과 관련된 의학적 병태의 치료 또는 예방에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 인슐린 유도체는 포도당에 민감하고 포도당에 민감한 알부민 결합을 나타낸다. 본 발명은 또한 신규 중간체에 관한 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유도체를 포함하는 약학적 조성물 및 당뇨병과 관련된 의학적 병태의 치료 또는 예방에 있어서의 이러한 조성물의 용도를 제공한다.

Description

포도당 민감성 인슐린 유도체
본 발명은 신규 인슐린 유도체 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 인슐린 유도체를 포함하는 약학적 조성물, 및 당뇨병과 관련된 의학적 병태의 치료 또는 예방을 위한 이러한 화합물의 용도에 관한 것이다.
인슐린은 고혈당 치료에 가장 효과적인 약물이지만, 인슐린 투여는 생리학적 포도당 창이 좁기 때문에 너무 많거나 너무 적은 것 사이의 민감한 균형이 필요하다. 건강한 사람은 공복 상태에서 5 mM 내외의 혈당 수준을 가지며, 당뇨병 환자는 5 mM에 가깝게 되기 위해 식사와 기저 인슐린 제제를 모두 투여하려고 한다. 그러나, 약 3 mM 미만의 혈당 값(저혈당증)은 인슐린 치료 중에 종종 발생하며, 저혈당증은 불편함, 간결성 상실, 뇌 손상 또는 사망을 초래할 수 있다. 따라서, 당뇨병 환자는 저혈당증에 대한 두려움으로 인해 고혈당 또는 고혈당 수치를 적극적으로 치료하는 것을 주저한다. 따라서, 더 높은 혈당 값에서만 활성화되거나 저장소로부터 방출되고, 낮은 혈당 값에서는 비활성이거나 약하게 활성인 인슐린 약물이 개발된다면 당뇨병 치료에 도움이 될 수 있다. 이러한 목표는 1970년대 이후 수많은 논문(Brownlee 등, Science 1979, 1190; Zaykov 등, Nature Rev. Drug Disc. 2016, 425)에서 접근해 왔으나, 주로 포도당에 따라 달라지는 방식으로 피하 저장소로부터 인슐린을 포획하고 방출하는 포도당 민감성 중합체를 통한 것이었다. 그러나, 이러한 시스템은 느리기 때문에, 예를 들어 식사 후의 빠르게 변동하는 혈당 값에 대한 치료에는 효과적이지 않다. 결과적으로, 피하 포도당 민감성 방출 시스템은 임상시험에 도달한 적이 없다.
인슐린 생체 활성의 포도당 민감성 조정이 혈액에서 수행될 수 있다면 더 좋을 것이다. 이러한 필요를 충족시킬 수 있는 하나의 접근법은, 지방산 부분이 알부민 결합을 유발하는 지방산-모노보로네이트 인슐린 유도체로 전술한 바와 같이, 포도당 민감성 알부민 결합일 수 있다(Novo Nordisk WO2011/000823; WO 2014/093696; Chou 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 2015, 2401). 이들 시스템에서 알부민 상호작용의 주요 구동력은 지방산-모노보로네이트 인슐린 유도체의 (보로네이트가 아닌) 지방산 부분으로부터 발생하며, 포도당이 알부민 친화도에 미치는 영향은 약하다. 따라서, 알부민 결합의 포도당 민감도를 증가시키기 위해, 포도당에 의해 직접적으로 변위되는 포도당 민감성 알부민 결합 모티프가 필요하다. 모노보로네이트는 중간에서 높은 밀리몰 범위의 친화도(Kd)로 포도당 및 기타 당을 결합하는 것으로 알려져 있다(Hansen 등, Sensors Actuators B 2012, 45). 그러나, 생리학적 포도당 레벨에서 적절한 포도당 민감도를 제공하기 위해서는, 포도당에 대한 더 강한 친화도가 필요하다. 포도당 상의 히드록시기에 대해 적절한 기하학적 구조에 배치된 2개의 보로네이트/보록솔을 갖는 디보론 화합물은, 모노보론에 비해 증가된 포도당 친화도, 즉 낮은 mM Kd 또는 서브-mM Kd를 제공할 수 있다(Hansen 등, Sensors Actuators B 2012, 45). 문헌에 기술된 대부분의 이러한 디보론은 형광 프로브를 포함하는데, 이는 이들 연구의 목적이 광학 포도당 센서를 제조하는 것이기 때문이다. 형광 프로브는 광, 독성 및 유색에 민감할 수 있기 때문에 약물 후보물질에서는 바람직하지 않다. 따라서, 생리학적 혈당 레벨 내에서 포도당 감수성이 증가된 인슐린 유도체가 필요하다.
가장 넓은 양태에서, 본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 놀랍게도 알부민(HSA) 및 포도당 둘 모두에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, HSA 친화도는 포도당에 민감하다. 따라서, HSA의 존재 시 인간 인슐린 수용체(HIR) 친화도는 포도당 민감성이 된다. HSA-결합된 인슐린의 분획은 HIR에 대한 결합으로부터 차폐되지만, HSA로부터의 포도당-촉진 방출은 인슐린의 유리 분획을 증가시키고, 따라서 포도당은 HIR 친화도를 증가시킨다.
포도당-민감성 알부민 결합이라고 주장되는 이전에 개시된 인슐린 유도체와는 대조적으로, 본 발명의 화합물은 알부민 결합에 대한 지방산 부분에 의존하지 않지만, 포도당에 의해 직접적으로 변위되는 알부민 결합 모티프를 포함하여, 포도당이 알부민 결합에 미치는 영향을 증가시키고, 따라서 인슐린의 포도당 민감도를 증가시킨다.
알부민 결합은 대체적으로 펩티드 및 단백질 기반 약물의 생체 내 반감기를 연장시킬 수 있다. 알부민 결합 분획이 효소 분해 및 신장 제거로부터 보호되고, 유리 분획만이 생물학적으로 활성이어서 알부민 결합 분획의 수용체 매개 제거를 방지하므로, 연장된 효과가 달성된다.
따라서, 본 발명의 화합물은 포도당 농도에 의존적인 인슐린 활성을 나타내므로, 포도당 민감성 인슐린 유도체의 역할을 한다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 인슐린 또는 이의 유사체, 및 하나 이상의 변형기를 포함한다.
일 양태에서, 변형기는 포도당 및 알부민에 대한 친화도를 갖는다.
일 양태에서, 인슐린 펩티드 또는 이의 유사체는 선택적으로 스페이서를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은,
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및
ii) 하나 이상의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 각각의 변형기 M은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 하나 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B- 사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 변형기 M은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 유리 시스테인의 술파이드에 부착된다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은,
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및
ii) 2개 이상의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 각각의 변형기 M은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 2개 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 대체로 2개 이상의 변형기 M을 갖는 화합물은 단지 하나의 변형기 M을 갖는 화합물보다 더 높은 정도의 포도당 민감도(더 높은 포도당 인자)를 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 펩티드 스페이서를 포함하는 신규 인슐린 유사체를 포함하는, 신규 인슐린 유사체 형태의 중간 생성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 혈액 및 조직에서 포도당 농도의 함수로서 인슐린 수용체를 활성화시킨다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 낮은 가용성(낮은 비결합, 혈장 유리 분율)을 가지므로, 예를 들어 약 3 mM 포도당 미만의 레벨인 낮은 혈당의 상황(저혈당증) 동안 활성이 낮거나 없다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 높은 가용성(높은 비결합, 혈장 유리 분율)을 가지므로, 높은 혈당, 예를 들어 약 10 mM 초과의 포도당(고혈당증)에 반응하여 높은 활성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 포도당 민감성 알부민 결합을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 의약으로서의 사용을 위한 본 발명에 따른 화합물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 화합물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 의학적 사용(들)에 관한 것이다.
본 발명은 예시적인 구현예의 개시로부터 명백해지는 추가적인 문제를 해결할 수도 있다.
도 1은 10 mM 및 3.5 내지 4 mM 포도당에서의 인슐린 아스파트의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 2는 10 mM 및 3.5 내지 4 mM 포도당에서의 인슐린 데글루덱의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 3은 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 210(삼각형) 및 실시예 211(원)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 4는 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 233(삼각형) 및 실시예 234(사각형)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 5는 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 240(삼각형) 및 실시예 227(원)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 6은 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 241(삼각형) 및 실시예 181(사각형)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 7은 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 205(삼각형) 및 실시예 239(사각형)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 8은 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 285(삼각형) 및 실시예 273(사각형)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 9는 10 mM(흰색) 및 3.5 내지 4 mM(검정색) 포도당에서의 실시예 280(삼각형) 및 실시예 272(사각형)의 i.v. 볼루스의 PK 프로파일을 나타낸다(실시예 E).
도 10은, 예를 들어 실시예 205, 239, 272 및 280(실시예 E)에 대한 3.5 내지 4 mM 포도당 대 10 mM 포도당에서의 클램프에 대한 베이스라인-조정 포도당 주입 속도 곡선 하의 면적 간의 비교를 나타낸다.
본 발명은 인슐린 유도체에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 포도당 민감성 인슐린 유도체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 또는 이의 유사체를 포함하는 화합물 및 변형기에 관한 것으로서, 변형기는 포도당 및 알부민 둘 모두에 대한 친화도를 나타낸다.
일 구현예에서, 변형기는 포도당-민감성 알부민 결합을 나타낸다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체이다(서열번호 1 및 서열번호 2).
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 스페이서를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체를 포함하는 화합물; 및 하나 이상의 변형기 M을 제공하며, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 하나 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체를 포함하는 화합물; 및 2개 이상의 변형기 M을 제공하며, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 2개 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다. 변형기 M은 또한, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 유리 시스테인의 술파이드에 부착될 수 있다.
일반 정의
용어 "화합물"은 분자 엔티티를 지칭하도록 본원에서 사용되며, 따라서 "화합물"은 화합물 군의 각 화합물에 대해 정의된 최소 성분 이외에 상이한 구조적 성분을 가질 수 있다. 용어 "화합물"은 또한 이의 약학적으로 관련된 형태를 포함하도록 의도되며, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은, 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호 연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호 연결된 아미노산으로 구성된다.
용어 "유사체"는 일반적으로, 기준 아미노산 서열과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산이 변화된 서열을 가진 펩티드를 의미한다. 특정 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는, 이들의 기준 서열과 비교했을 때 추가의 변화를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 유사체는 명시된 변화를 "갖거나" "포함한다". 다른 특정 구현예에서, 유사체는 변화들로 "이루어진다". 용어 "이루어지다(consist 또는 consisting)"가 유사체와 관련하여 사용될 때, 예를 들어, 유사체가 명시된 아미노산 돌연변이의 군으로 이어지는 경우, 명시된 아미노산 돌연변이는 유사체에서의 유일한 아미노산 돌연변이임을 이해해야 한다. 대조적으로, 명시된 아미노산 돌연변이의 군을 "포함하는" 유사체는 추가의 돌연변이를 가질 수 있다.
용어 "유도체"는 대체로 화학적 변형에 의해, 특히 하나 이상의 치환기의 공유 부착에 의해 천연 펩티드 또는 이의 유사체로부터 제조될 수 있는 화합물을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 변형기 M은 공유 부착된 치환기이다.
용어 "아미노산"은 단백질생성(또는 천연) 아미노산(그 20개 표준 아미노산 중에서) 뿐만 아니라, 비단백질생성(또는 비천연) 아미노산을 포함한다. 단백질생성 아미노산은 자연적으로 단백질에 통합되는 것이다. 표준 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것들이다. 비단백질생성 아미노산은 단백질에서는 발견되지 않거나, 표준 세포 기구에 의해 생성되지 않는다(예를 들어, 번역 후 변형의 대상이 될 수 있음).
일반적으로, 아미노산 잔기(펩티드/단백질 서열)는 이들의 완전한 명칭, 이들의 1자 코드 및/또는 3자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이들 세 가지 방법은 완전히 동등하다. 다음으로, 광학 이성질체가 언급되지 않은 본 발명의 펩티드의 각 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 아미노산은 아미노기 및 카복실산기를 함유하는 분자이며, 종종 측쇄로서 지칭되는 하나 이상의 추가적인 기를 임의로 함유한다.
본원에서, 용어 "아미노산 잔기"는 형식적으로 히드록시기가 카복시기로부터 제거되었고/되었거나, 형식적으로 수소 원자가 아미노기로부터 제거된 아미노산이다.
다음의 예에서 명백한 바와 같이, 아미노산 잔기는 이들의 전체 명칭, 1자 코드, 및/또는 3자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이들 세 가지 방법은 완전히 동등하며 상호교환적으로 사용 가능하다.
본원에서, 용어 "아릴"은 5 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 환형 또는 다환형 방향족 고리를 의미한다. 용어 아릴은 1가, 2가 및 다가 종 모두를 포함한다. 아릴기의 예는 페닐, 바이페닐, 나프틸, 안트라세닐 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 아릴은 페닐이다. 본원에서, 용어 "아릴"은 "헤테로아릴"을 또한 포함한다. 용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 하나 이상의(예를 들어, 1 내지 4개, 특히 1, 2 또는 3개) 헤테로원자를 포함하는 방향족 모노-, 바이-, 또는 다환 고리를 의미한다.
인슐린
본원에서 사용되는 용어 "인간 인슐린"은 구조 및 특성이 잘 알려져 있는 인간 인슐린 호르몬을 의미한다. 인간 인슐린은 A-사슬과 B-사슬로 명명된 2개의 폴리펩티드 사슬을 갖는다. A-사슬은 21개 아미노산 펩티드이고, B-사슬은 30개 아미노산 펩티드이며, 2개의 사슬은 다음의 이황화 브리지에 의해 연결된다: A-사슬의 위치 7에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 7에 있는 시스테인 사이의 제1 브리지; 및 A-사슬의 위치 20에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 19에 있는 시스테인 사이의 제2 브리지. 제3 브리지는 A-사슬의 위치 6에 있는 시스테인과 11에 있는 시스테인 사이에 존재한다.
인간 인슐린 A-사슬은 다음의 서열: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(서열번호 1)을 갖는 반면, B-사슬은 다음의 서열을 갖는다: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(서열번호 2).
본원에서 사용되는 "인슐린 펩티드", "인슐린 화합물" 또는 "인슐린"은 인슐린 활성을 갖는 인간 인슐린 또는 유사체 또는 이의 유도체인, 즉 인슐린 수용체를 활성화시키는 펩티드를 의미한다.
인슐린 유사체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린으로부터 결실되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린에 추가 및/또는 삽입된, 변형된 인간 인슐린을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린 활성을 나타내는, 즉 인슐린 수용체를 활성화시키는 인슐린 유사체를 의미한다.
인슐린 유사체는 인간 인슐린에 대해 10개 미만의 아미노산 변형(치환, 결실, 추가(예를 들어, 확장), 삽입 및 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 대안적으로는 인간 인슐린에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 변형을 포함한다. 일 양태에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린에 대해 10개 미만의 아미노산 변형(치환, 결실, 추가(예를 들어, 확장), 삽입 및 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 대안적으로는 인간 인슐린에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 변형을 갖는다.
인슐린 분자에서의 변형은 사슬(A 또는 B), 위치, 및 천연 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 대한 1자 또는 3자 코드를 나타내는 것으로 표시된다.
본원에서, "A1", "A2" 및 "A3" 등과 같은 용어는 인슐린의 A 사슬에서 위치 1, 2 및 3 등에 있는 아미노산을 각각 나타낸다(N-말단 단부로부터 계수됨). 유사하게, "B1", "B2" 및 "B3" 등과 같은 용어는 인슐린의 B 사슬에서 위치 1, 2 및 3 등에 있는 아미노산을 각각 나타낸다(N-말단 단부로부터 계수됨). 아미노산에 대한 1자 코드를 사용하여, A21A, A21G 및 A21Q와 같은 용어는 A21 위치에서의 아미노산이 각각 A, G 및 Q임을 나타낸다. 아미노산에 대한 3자 코드를 사용하여, 이에 상응하는 표현은 각각 A21Ala, A21Gly 및 A21Gln이다.
"desB30"은 B30 아미노산이 결여된 천연 인슐린 B 사슬 또는 이의 유사체를 의미한다.
본원에서, 용어 "A-1" 또는 "B-1"은 각각 A1 또는 B1에 대해 N-말단에 있는 아미노산의 위치를 나타낸다. 용어 A-2 또는 B-2는 각각 A-1 또는 B-1에 대해 N-말단에 있는 제1 아미노산의 위치를 나타낸다.
용어 "A22" 또는 "B31"은 각각 A21 또는 B30에 대해 C-말단에 있는 아미노산의 위치를 나타낸다.
따라서, 예를 들어, A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린은 인간 인슐린의 유사체이며, 여기에서 A 사슬 위치 14의 아미노산은 글루탐산으로 치환되고, B 사슬 위치 1의 아미노산은 라이신으로 치환되고, B 사슬 위치 2의 아미노산은 프롤린으로 치환되고, B 사슬 위치 25의 아미노산은 히스티딘으로 치환되고, B 사슬 위치 27 및 30의 아미노산은 결실된다.
치환을 갖는 인슐린 유사체의 예는 위치 A14에서의 Tyr이 Glu로 치환되는 경우이다. 또한, 위치 B1 또는 B4의 아미노산은 Lys로 치환될 수 있다. 위치 B2의 아미노산은 Pro로 치환될 수 있다. 위치 B25의 아미노산은 His로 치환될 수 있다.
결실을 갖는 인슐린 유사체의 예는 인간 인슐린 중 B30 아미노산이 결실된 유사체(desB30 인간 인슐린), 인간 인슐린 중 B1 아미노산이 결실된 인슐린 유사체(desB1 인간 인슐린), 인간 인슐린 중 B1 및 B2 아미노산이 결실된 인슐린 유사체(desB1 desB2 인간 인슐린), 및 desB27 인간 인슐린이다.
A-사슬 및/또는 B-사슬이 N-말단 연장부를 갖는(즉, 하나 이상의 아미노산 잔기가 N-말단에 첨가된) 인슐린 유사체의 예는 A-2K 및 A-1P를 포함하는 인간 인슐린 유사체, 즉 인간 인슐린의 유사체이며, 여기에서 A-사슬은 KP와 함께 N-말단에서 연장된다. 또 다른 예는, 하나의 글리신 잔기가 B-사슬의 N-말단에 첨가되는 인간 인슐린 유사체, 즉, B-1G를 포함하는 인간 인슐린 유사체이다.
A-사슬 및/또는 B-사슬이 C-말단 연장부를 갖는 (즉, 하나 이상의 아미노산 잔기가 C-말단에 첨가된) 인슐린 유사체의 예는 A22K를 포함하는 인간 인슐린 유사체이다.
추가의 예는 언급된 돌연변이의 조합을 포함하는 인슐린 유사체이다.
인슐린 유사체의 예는 다음을 포함한다:
desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 11);
A21Q desB30 인간 인슐린(서열번호 3 및 서열번호 11);
A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 12);
A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 13);
A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 14);
A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 15);
A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 16);
A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 17);
A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 18);
A22K desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 11);
A22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 19);
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20); 및
A-2K A-1P desB30 인간 인슐린(서열번호 7 및 서열번호 11).
스페이서
전술한 바와 같이, 본 발명의 인슐린 유사체는 인간 인슐린에 대해 10개 미만의 아미노산 변형(치환, 결실, 확장 및 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 대안적으로는 인간 인슐린에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 변형을 포함한다. 이들 최대 9개 까지의 변형에 더하여, 본 발명의 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에, 또는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에 스페이서를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 스페이서는 펩티드이며, 본원에서는 스페이서 펩티드 또는 펩티드 스페이서로서 지칭된다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 비-펩티드 링커 L이다.
펩티드 스페이서
다양한 스페이서 펩티드가 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 화합물에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 스페이서는 펩티드 결합을 통해 연결된 4 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 분절이다. 일 구현예에서, 스페이서는 펩티드 결합을 통해 연결된 4 내지 24개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 분절이다.
일 구현예에서, 스페이서는 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Gly(G), Glu(E), Ser(S), Pro(P), Arg(R), Phe(F), Tyr(Y), Asp(D), 및 Lys(K). 일 구현예에서, 스페이서는 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Gly(G), Glu(E), Ser(S), 및 Lys(K). 일 구현예에서, 스페이서는 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Gly(G), Ser(S), Pro(P), Arg(R), Phe(F), Tyr(Y), Asp(D), 및 Lys(K). 일 구현예에서, 스페이서는 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Gly(G), Ser(S), Pro(P), 및 Lys(K). 일 구현예에서, 스페이서는 적어도 하나의 Lys(K) 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서 펩티드 스페이서를 포함한다. 일 구현예에서, 전술한 펩티드 스페이서는 (GES)pK를 포함하되, p는 3 내지 12의 정수이다.
전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 펩티드 스페이서의 예는 다음을 포함한다: (GES)3K(서열번호 29); (GES)6K(서열번호 30); 및 (GES)12K(서열번호 31).
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 펩티드 스페이서를 포함한다. 일 구현예에서, 전술한 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)r, GKPRGFFYTP(G4S)s, 또는 TYFFGRKPD(G4S)t를 포함하되, 각각의 q, r, s 및 t는 1 내지 5의 정수로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)3, GKPRGFFYTP(G4S)2, 또는 TYFFGRKPD(G4S)3을 포함하되, q는 1 내지 3의 정수이다.
전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서의 예는 다음을 포함한다:
GKPG(서열번호 32);
GKPGGGGS (GKP(G4S))(서열번호 33);
GKPGGGGSGGGGS (GKP(G4S)2)(서열번호 34);
GKPGGGGSGGGGSGGGGS (GKP(G4S)3)(서열번호 35);
KPGGGGSGGGGSGGGGS (KP(G4S)3)(서열번호 36);
GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS (GKPRGFFYTP(G4S)2)(서열번호 37); 및
TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS (TYFFGRKPD(G4S)3)(서열번호 38).
전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 펩티드 스페이서를 포함하는 인슐린 유사체의 예는 다음을 포함한다:
A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린(서열번호 8 및 서열번호 11);
A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린(서열번호 9 및 서열번호 11); 및
A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린(서열번호 10 및 서열번호 11).
전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서를 포함하는 인슐린 유사체의 예는 다음을 포함한다:
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 21);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 22);
B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 23);
B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 24);
B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 25);
B1-GKPG desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 26);
B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 27); 및
B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 28).
링커 L
일 양태에서, 스페이서는 비-펩티드 링커 L이다. 다양한 비-펩티드 링커는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 화합물에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 링커 L을 포함한다.
Figure 112021111337418-pct00001
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 링커는 화학식 L2이다:
Figure 112021111337418-pct00002
여기에서, *1은 변형기 A에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 u는 1, 2, 또는 3이다. 일 구현예에서, u는 2 또는 3이다.
일 구현예에서, 링커는 화학식 L3이다:
Figure 112021111337418-pct00003
여기에서, *1은 변형기 A에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 v는 2 또는 3이다.
인슐린 유도체
본원에서 사용되는 용어 "인슐린 유도체"는 화학적으로 변형된 인슐린 또는 이의 유사체를 의미하며, 변형(들)은 하나 이상의 변형기 M의 부착 형태이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 각각의 변형기 M은 다음의 기 중 하나로부터 선택된 부착 지점에 부착된다:
a) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
b) 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22에서의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기;
c) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기;
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L 내의 *1로 표시된 원위 아미노기; 및
d) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기.
일 구현예에서, 하나 이하의 변형기 M이 각각의 기 a), b), c) 및 d) 내의 부착 지점에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 하나의 변형기 M은 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4, 또는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 선택적인 펩티드 연장부 내의 리신의 엡실론 아미노기에서의 리신 잔기의 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 2개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 하나의 변형기 M은 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4, 또는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 선택적인 펩티드 연장부 내의 리신의 엡실론 아미노기에서의 리신 잔기의 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 2개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 2개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 다른 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 1개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 3개 또는 4개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 제1 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 제2 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 나머지 변형기 M은 각각은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L에서 *1로 표시된 원위 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 3개 또는 4개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 제1 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 제2 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 나머지 변형기 M은 각각은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L에서 *1로 표시된 원위 아미노기에 부착된다.
변형기 M
본 발명의 화합물은 하나 이상의 변형기 M을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1, 2, 3 또는 4개의 변형기 M을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2개 이상의 변형기 M을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2, 3 또는 4개의 변형기 M을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2개의 변형기 M을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 정확히 2개의 변형기 M을 갖는다. 하나 이상의 변형기는 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 변형기는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 변형기는 동일하다.
변형기 중 일부는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 아미노산 잔기의 각각은 독립적으로 각각의 아미노산 잔기의 D- 또는 L-형태, 즉 변형기 내의 키랄 원자의 각각은 독립적으로 (R)- 또는 (S)-형태일 수 있다. 일 구현예에서, 변형기의 아미노산 잔기는 L-아미노산 잔기이다.
각각의 변형기 M은 디보론 모이어티를 포함하고, 여기에서 디보론 모이어티(즉, 변형기 M)는 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 보론 원자는 보론산(또는 pKa/pH에 따라 보로네이트)의 일부이거나, 보록솔(또는 pKa/pH에 따라 보록솔레이트)의 일부일 수 있다.
용어 특정 특징부를 "포함한다" 또는 "포함하는"은 해당 대상체가 이러한 특정 특징부를 포함하지만, 다른 특징부의 존재를 배제하지 않는다는 의미로 해석되어야 한다. 따라서, 변형기 M은 2개 초과의 아릴 모이어티를 가질 수 있으며, 여기에서 아릴 모이어티의 각각에는 보론 원자가 부착된다. 일 구현예에서, 변형기는 정확히 2개의 아릴 모이어티를 갖고, 여기에서 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다. 일 구현예에서, 변형기는 정확히 4개의 아릴 모이어티를 갖고, 여기에서 4개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착된다.
본 발명의 디보로네이트/디보록솔은 실시예 A에 나타낸 바와 같이, 모노보로네이트보다 더 강하게 포도당에 결합한다. 이에 더하여, 놀랍게도, 본 발명의 디보론 화합물은 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있고, 따라서 HSA 결합이 또한 포도당 민감성이기 때문에, 이중 활성을 갖는다(디보론 펩티드의 HSA 결합 분획은 펩티드 상의 수용체 결합 부위 차단으로 인해 비활성화됨)(실시예 B에 나타낸 데이터).
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M1이다:
Figure 112021111337418-pct00004
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태, 또는
NH-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*을 나타내며,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00005
Figure 112021111337418-pct00006
여기에서 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 및 Y6은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M1의 기이며, 여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 H 또는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F이다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M1이며, 여기에서 n은 1이고;
W1은 NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; R1은,
Figure 112021111337418-pct00007
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고; Y3은 F 또는 CF3이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M2이다:
Figure 112021111337418-pct00008
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00009
Figure 112021111337418-pct00010
,
여기에서 Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 및 Y12는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M2이며, 여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H이다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M2이고, 여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; R2는,
Figure 112021111337418-pct00011
여기에서 Y7 및 Y8은 H이고; Y9는 Cl, CHF2, 또는 CF3이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M3이다:
Figure 112021111337418-pct00012
이는 3,4-디아미노-피롤리딘의 R,R 또는 S,S 또는 R,S 입체이성질체를 나타내고; 여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y13 및 Y14 는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M3이며, 여기에서 Y13은 H 또는 F이고; Y14는 H 또는 CF3이되; Y13 및 Y14 중 단 하나만이 H이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M4이다:
Figure 112021111337418-pct00013
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15 및 Y16 은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M4이고, 여기에서 Y15 및 Y16은 H 및 F로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M4이고, 여기에서 Y15는 H이고, Y16은 F이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M5이다:
Figure 112021111337418-pct00014
,
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 독립적으로 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M6이다:
Figure 112021111337418-pct00015
,
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17 및 Y18은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M6이고, 여기에서 Y17은 H 또는 F이고, Y18은 H 또는 F이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M7이다:
Figure 112021111337418-pct00016
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타낸다. 일 구현예에서, W3은 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M8이다:
Figure 112021111337418-pct00017
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3 또는 SF5이다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M8이고, 여기에서 Y19는 CF3 또는 SF5이다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M8이고, 여기에서 Y19는 CF3이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M9이다:
Figure 112021111337418-pct00018
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형기는 화학식 M9이고, 여기에서 Y20, Y21, 및 Y22 각각은 H, 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F일 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H일 경우 Y20 및 Y22는 F이다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M10이다:
Figure 112021111337418-pct00019
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 변형기는 화학식 M11이다:
Figure 112021111337418-pct00020
,
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타낸다.
본 발명의 화합물
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체를 포함하고; 하나 이상의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되고; 하나 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및 2개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되며; 제1 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4 내의 리신 잔기의 엡실론 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 제2 변형기는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및 2개의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되고; 제1 변형기는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되고; 제2 변형기는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및 2개의 변형기 M을 포함하고, 여기에서 변형기 M 각각은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되며; 제1 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신 잔기의 엡실론 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 제2 변형기는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및 1개의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 변형기 M은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되고; 변형기 M은 전술한 인간 인슐린의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명은 실시예 181, 205, 210, 211, 227, 233, 234, 239, 240, 241, 272, 273, 280, 284, 285, 288, 291, 300, 301, 324, 327, 331, 333, 및 335의 화합물의 군으로부터 독립적으로 선택된 화합물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 실시예 181, 205, 210, 211, 227, 233, 234, 239, 240, 241, 272, 273, 280, 285, 288, 291, 300, 301, 327, 331, 333, 및 335의 화합물의 군으로부터 독립적으로 선택된 화합물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 181의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 205의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 210의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 211의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 227의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 233의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 234의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 239의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 240의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 241의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 272의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 273의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 280의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 284의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 285의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 288의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 291의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 300의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 301의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 324의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 327의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 331의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 333의 화합물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실시예 335의 화합물이다.
중간 생성물
또한, 본 발명은 신규 인슐린 유사체의 형태 또는 펩티드 스페이서를 포함하는 인슐린 유사체로 중간 생성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 중간 생성물에 관한 것이다:
A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 16);
A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 17);
A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 18);
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20);
A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린(서열번호 8 및 서열번호 11);
A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린(서열번호 9 및 서열번호 11);
A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린(서열번호 10 및 서열번호 11);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 21);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 22);
B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 23);
B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 24);
B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 25);
B1-GKPG desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 26);
B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 27); 및
B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 28).
인슐린 기능
인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 인슐린 유사체의 상대적 결합 친화도는 실시예 B에 기술된 바와 같은 섬광 근접 분석(SPA)에서의 경쟁 결합에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인슐린 수용체에 결합하는 능력을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 포도당이 존재하지 않는 경우에 비해 20 mM 포도당의 존재 시 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는다.
실시예 C에 기술된 AKT 인산화 분석 및 실시예 D에 기술된 지방 생성 분석은 인슐린 유사체의 기능적(작용적) 활성의 척도로서 사용될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 예를 들어, 본 발명의 유사체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 아미드 또는 에스테르, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)을 포함하는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 제조할 수 있다.
"부형제"라는 용어는 활성 치료 성분 이외의 임의의 성분을 광범위하게 가리킨다. 부형제는 불활성 물질, 비활성 물질, 및/또는 의약적 비활성 물질일 수 있다. 부형제는 예를 들어, 담체, 운송체, 희석제로서의 다양한 목적, 및/또는 활성 물질의 투여 및/또는 흡수를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 부형제의 비제한적인 예는 용매, 희석제, 완충액, 보존제, 등장화 조절제, 킬레이트제 및 안정화제이다. 다양한 부형제를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy(예를 들어, 제21판(2005), 및 이후의 판).
본 발명의 조성물은 액체 제형, 즉 물을 포함하는 수성 제형의 형태일 수 있다. 액체 제형은 용액이거나 현탁액일 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여용으로서, 예를 들어, 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의해 수행될 수 있다.
아릴 보론 화합물은 일반적으로 중성 값에 가까운 pH의 수용액에서 낮은 안정성을 갖는다. C-B 결합이 가수분해되어 페닐 잔기 및 유리 보레이트, Ph-H + B(OH)3이 생성되거나, 화합물이 산화되어 페놀 잔기 + 유리 보레이트, Ph-OH + B(OH)3이 생성될 수 있다. 본 발명의 특정 바람직한 디보론 화합물 및 디보론 인슐린 접합체는 본 발명의 다른 아릴-보론 및 일반적인 아릴-보론보다 더 안정적인 것으로 밝혀졌다. 안정성은, 예를 들어 1주일 동안 연장된 기간 동안 25° 또는 37°에서 중성 pH의 수용액에 방치한 후, 인슐린 유도체의 순도를 측정함으로써 평가될 수 있다.
약학적 징후
당뇨병
용어 "당뇨병" 또는 "진성 당뇨병"은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병(임신 중) 및 고혈당증을 유발하는 다른 상태를 포함한다. 이 용어는 췌장이 인슐린을 불충분하게 생산하거나, 신체의 세포가 인슐린에 적절히 반응하지 않는, 세포가 포도당을 흡수하지 못하는 대사 장애에 사용된다. 그 결과, 포도당이 혈액 내에 축적된다.
인슐린-의존성 당뇨병(IDDM) 및 청소년-발병성 당뇨병이라고도 불리는 1형 당뇨병은 베타-세포 파괴에 의해 야기되어, 일반적으로 절대적인 인슐린 결핍을 초래한다.
비-인슐린-의존성 당뇨병(NIDDM) 및 성인-발병성 당뇨병으로도 알려진 2형 당뇨병은 우세한 인슐린 저항성 및 이에 따른 상대적인 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성을 동반한 우세한 인슐린 분비 결함과 관련이 있다.
기타 징후
일 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물은 스트레스 유도성 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 또는 1형 당뇨병을 포함하는 고혈당증의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물은 2형 당뇨병에서의 질환 진행을 지연시키거나 예방하기 위한 의약으로서 사용된다.
본 발명의 일 구현예에서, 화합물은 스트레스 유도성 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 또는 1형 당뇨병을 포함하는 고혈당증의 치료 또는 예방을 위한 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 스트레스 유도성 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 또는 1형 당뇨병을 포함하는 고혈당증의 치료 또는 예방을 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 화합물의 이러한 치료를 위한 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
투여 모드
용어 "치료"는 참조된 질환, 장애 또는 병태의 예방 및 최소화 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다(즉, "치료"는 달리 명시되거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 예방적 및 치료적 투여를 지칭한다).
투여 경로는 본 발명의 화합물을 신체 내에 원하는 또는 적절한 장소로 효율적으로 전달하는, 비경구(예를 들어, 피하, 근육 내 또는 정맥 내)와 같은, 임의의 경로일 수 있다.
비경구 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 알려진 인슐린의 제형과 유사하게 제형화된다. 또한, 비경구 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 알려진 인슐린의 투여와 유사하게 투여되며, 의사들은 이 절차에 익숙하다.
투여될 본 발명의 화합물의 양, 본 발명의 화합물을 투여하는 빈도의 결정, 및 선택적으로 또 다른 항당뇨병 화합물과 함께 투여할 본 발명의 화합물 또는 화합물들의 선택은 당뇨병의 치료에 익숙한 전문의와 상담하여 결정 된다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 구현예는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해해야 한다.
구현예
본 발명은 본 발명의 제한 없는 다음의 구현예에 의해 추가로 기술된다:
1. 화합물로서,
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체; 및
ii) 하나 이상의 변형기 M을 포함하며, 여기에서 각각의 변형기 M은 2개의 아릴 모이어티를 포함하되, 2개의 아릴 모이어티 각각에는 보론 원자가 부착되고;
하나 이상의 변형기 M 각각은, 선택적으로 스페이서를 통해, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬 또는 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기, 또는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체 중 리신의 엡실론 아미노기에 부착되는, 화합물.
2. 구현예 1에 있어서, 변형기 M 각각은 다음의 화학식의 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물:
Figure 112021111337418-pct00021
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태, 또는
NH-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*을 나타내며,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00022
여기에서 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 및 Y6은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00023
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00024
Figure 112021111337418-pct00025
,
여기에서 Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 및 Y12는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00026
이는 3,4-디아미노-피롤리딘의 R,R 또는 S,S 또는 R,S 입체이성질체를 나타내고; 여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y13 및 Y14는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00027
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15 및 Y16 은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00028
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 독립적으로 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00029
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17 및 Y18은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00030
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00031
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3 또는 SF5임;
Figure 112021111337418-pct00032
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H, F, Cl, CHF2, 및 CF3으로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00033
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄; 및
Figure 112021111337418-pct00034
,
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 독립적으로 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄.
3. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 변형기 M 각각은 다음의 화학식의 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물:
Figure 112021111337418-pct00035
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태, 또는
NH-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*을 나타내며,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00036
Figure 112021111337418-pct00037
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 H 또는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F임;
Figure 112021111337418-pct00038
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00039
Figure 112021111337418-pct00040
여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00041
이는 3,4-디아미노-피롤리딘의 R,R 또는 S,S 또는 R,S 입체이성질체를 나타내고; 여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y13은 H 또는 F이고; Y14는 H 또는 CF3이되; Y13 및 Y14 중 단지 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00042
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15 및 Y16 은 H, 및 F로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00043
,
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00044
,
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17은 H 또는 F이고; Y18은 H 또는 F임;
Figure 112021111337418-pct00045
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00046
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3 또는 SF5임;
Figure 112021111337418-pct00047
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F임;
Figure 112021111337418-pct00048
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄; 및
Figure 112021111337418-pct00049
,
여기에서, α-아미노산 잔기 각각은 독립적으로 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 변형기 M 각각은 다음의 화학식의 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물:
Figure 112021111337418-pct00050
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기에서 n은 1이고;
W1은 NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 화학식 R1a
Figure 112021111337418-pct00051
이고,
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고; Y3은 F 또는 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00052
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 R2는 화학식 R2a
Figure 112021111337418-pct00053
이고,
여기에서 Y7 및 Y8은 H이고; Y9는 Cl, CHF2, 또는 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00054
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15는 H이고, Y16은 F임;
Figure 112021111337418-pct00055
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00056
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00057
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F임.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 변형기 M은 동일한, 화합물.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는, 다음의 군으로부터 선택된 스페이서를 선택적으로 포함하는, 화합물:
a) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 펩티드 스페이서로서, 전술한 펩티드 스페이서는 (GES)pK를 포함하되, p는 3 내지 12의 정수인, 펩티드 스페이서; 또는
b) 전술한 인간 인슐린 또는 전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서 또는 링커 L;
여기에서, 전술한 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)r, GKPRGFFYTP(G4S)s, 또는 TYFFGRKPD(G4S)t를 포함하되, 각각의 q, r, s 및 t는 1 내지 5의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
전술한 연결기 L은 다음의 화학식으로부터 선택됨:
Figure 112021111337418-pct00058
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00059
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 u는 1, 2 또는 3임; 및
Figure 112021111337418-pct00060
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 v는 2 또는 3임.
7. 구현예 6에 있어서, q는 1 내지 3으로부터 선택된 정수이고; r은 3이고; s는 2이고; t는 3인, 화합물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 키랄 아미노산은 L-형태인, 화합물.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 각각의 변형기 M은 다음의 군 중 하나로부터 선택된 부착 지점에 부착되는, 화합물:
a) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
b) 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22에서의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기;
c) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기;
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L 내의 *1로 표시된 원위 아미노기; 및
d) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기.
10. 구현예 9에 있어서, 하나 이하의 변형기 M이 각각의 기 a), b), c) 및 d) 내의 부착 지점에 부착되는, 화합물.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 정확히 1, 2, 3 또는 4개의 변형기 M을 갖는, 화합물.
12. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2개의 변형기 M을 포함하는, 화합물.
13. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 정확히 2, 3 또는 4개의 변형기 M을 갖는, 화합물.
14. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 정확히 2개의 변형기 M을 갖는, 화합물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 desB30을 포함하는 인간 인슐린 유사체인, 화합물.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 인간 인슐린 유사체인, 화합물:
desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 11);
A21Q desB30 인간 인슐린(서열번호 3 및 서열번호 11);
A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 12);
A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 13);
A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 14);
A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 15);
A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 16);
A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 17);
A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 18);
A22K desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 11);
A22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 19);
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20); 및
A-2K A-1P desB30 인간 인슐린(서열번호 7 및 서열번호 11).
17. 구현예 1에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서 또는 링커 L로부터 선택된 스페이서를 선택적으로 포함하는, 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체;
여기에서, 전술한 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)r, GKPRGFFYTP(G4S)s, 또는 TYFFGRKPD(G4S)t를 포함하되, 각각의 q, r, s 및 t는 1 내지 5의 정수로부터 독립적으로 선택되고;
전술한 연결기 L은 다음의 화학식으로부터 선택됨:
Figure 112021111337418-pct00061
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00062
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 u는 1, 2 또는 3임; 및
Figure 112021111337418-pct00063
여기에서, *1은 변형기 M에 대한 부착 지점을 나타내고, *2는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 아미노산 잔기의 아미노기에 대한 부착 지점을 나타내며, 여기에서 v는 2 또는 3임;
ii) 2, 3 또는 4개의 변형기 M을 포함하되, 각각의 변형기 M은 다음의 군으로부터 독립적으로 선택됨:
Figure 112021111337418-pct00064
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00065
Figure 112021111337418-pct00066
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F임;
Figure 112021111337418-pct00067
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00068
여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00069
이는 3,4-디아미노-피롤리딘의 R,R 또는 S,S 또는 R,S 입체이성질체를 나타내고; 여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y13은 H 또는 F이고; Y14는 H 또는 CF3이되; Y13 및 Y14 중 단지 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00070
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15는 H이고, Y16은 F임;
Figure 112021111337418-pct00071
,
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17은 F이고; Y18은 H임;
Figure 112021111337418-pct00072
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00073
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3 또는 SF5임;
Figure 112021111337418-pct00074
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F임; 및
Figure 112021111337418-pct00075
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
각각의 변형기 M은 다음의 기 중 하나로부터 선택된 부착 지점에 부착됨:
a) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
b) 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22에서의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기;
c) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기;
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L 내의 *1로 표시된 원위 아미노기; 및
d) 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기이되,
여기에서 하나의 변형기 M은 부착 지점 c) 중 하나에 부착되고, 하나의 변형기 M은 부착점 d)에 부착됨.
18. 구현예 17에 있어서, 하나 이하의 변형기 M이 각각의 기 a), b), c) 및 d) 내의 부착 지점에 부착되는, 화합물.
19. 구현예 17 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 정확히 2개의 변형기 M을 갖고, 여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은,
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산기;
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기;
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 링커 L 내의 *1로 표시된 원위 아미노기에 부착되는, 화합물.
20. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서를 선택적으로 포함하는, 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체이되;
여기에서, 전술한 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)r, GKPRGFFYTP(G4S)s, 또는 TYFFGRKPD(G4S)t를 포함하고, q는 1 내지 3으로부터의 정수이고; r은 3이고; s는 2이고; t는 3임;
ii) 2개의 변형기 M, 각각의 변형기 M은 다음의 군으로부터 독립적으로 선택됨:
Figure 112021111337418-pct00076
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기에서 n은 1이고; W1은 NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 R1은
Figure 112021111337418-pct00077
이고,
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3 은 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00078
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00079
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00080
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F이고;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
21. 구현예 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 펩티드 스페이서를 포함하고; 여기에서 전술한 펩티드 스페이서는 GKP(G4S)q, 또는 KP(G4S)r을 포함하되, q는 1 내지 3으로부터의 정수이고; r은 3인, 인간 인슐린 유사체;
ii) 다음의 군으로부터 독립적으로 선택된 2개의 변형기 M,
Figure 112021111337418-pct00081
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기에서 n은 1이고; W1은
NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 R1은
Figure 112021111337418-pct00082
이고,
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3 은 CF3임;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 펩티드 스페이서에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
22. 구현예 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 다음으로 이루어진, 화합물:
i) 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 펩티드 스페이서를 선택적으로 포함하는, 인간 인슐린 유사체이되;
여기에서, 전술한 펩티드 스페이서는 GKPG, GKP(G4S)q, KP(G4S)r, GKPRGFFYTP(G4S)s, 또는 TYFFGRKPD(G4S)t를 포함하고, q는 1 내지 3으로부터의 정수이고; r은 3이고; s는 2이고; t는 3임;
ii) 2개의 변형기 M, 각각의 변형기 M은 다음의 군으로부터 독립적으로 선택됨:
Figure 112021111337418-pct00083
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기에서 n은 1이고; W1은
NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 R1은
Figure 112021111337418-pct00084
이고,
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3 은 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00085
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00086
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3임;
Figure 112021111337418-pct00087
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F이고;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고;
하나의 변형기 M은,
전술한 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 1 또는 위치 4에서의 리신 잔기의 엡실론 아미노기, 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
23. 구현예 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 다음으로 이루어진, 화합물:
i) 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 펩티드 스페이서를 갖고; 여기에서 전술한 펩티드 스페이서는 GKP(G4S)q, 또는 KP(G4S)r이되, q는 1 내지 3으로부터의 정수이고; r은 3인, 인간 인슐린 유사체;
ii) 다음의 군으로부터 독립적으로 선택된 2개의 변형기 M,
Figure 112021111337418-pct00088
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기에서 n은 1이고; W1은
NH-CH2CH2-C(=O)-* 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 R1은
Figure 112021111337418-pct00089
이고,
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3 은 CF3이고;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 펩티드 스페이서에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
24. 구현예 17 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 키랄 아미노산은 L-형태인, 화합물.
25. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 정확히 2개의 변형기 M을 갖는, 화합물.
26. 구현예 17 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 변형기 M은 동일한, 화합물.
27. 구현예 17 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 유사체는 desB30을 포함하는, 화합물.
28. 구현예 17 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 인간 인슐린 유사체인, 화합물:
desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 11);
A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 12);
A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 13);
A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 16);
A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 17);
A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 18);
A22K desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 11);
A22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 19); 및
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20).
29. 구현예 17 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 전술한 스페이서를 포함하는 전술한 인간 인슐린 유사체는, 다음의 군으로부터 선택되는, 화합물:
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 21);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 22);
B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 23);
B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 24); 및
B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 25).
30. 구현예 17 내지 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 다음의 군으로부터 선택되는, 화합물:
실시예 280의 화합물; 실시예 284의 화합물; 실시예 285의 화합물; 실시예 288의 화합물; 실시예 291의 화합물; 실시예 300의 화합물; 실시예 301의 화합물; 실시예 324의 화합물; 실시예 327의 화합물; 실시예 331의 화합물; 실시예 333의 화합물; 및 실시예 335의 화합물.
31. 구현예 17 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서, 다음의 군으로부터 선택되는, 화합물:
실시예 280의 화합물; 실시예 285의 화합물; 실시예 288의 화합물; 실시예 291의 화합물; 실시예 300의 화합물; 실시예 301의 화합물; 실시예 327의 화합물; 실시예 331의 화합물; 실시예 333의 화합물; 및 실시예 335의 화합물.
32. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 280의 화합물인, 화합물.
33. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 284의 화합물인, 화합물.
34. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 285의 화합물인, 화합물.
35. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 288의 화합물인, 화합물.
36. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 291의 화합물인, 화합물.
37. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 300의 화합물인, 화합물.
38. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 301의 화합물인, 화합물.
39. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 324의 화합물인, 화합물.
40. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 327의 화합물인, 화합물.
41. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 331의 화합물인, 화합물.
42. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 333의 화합물인, 화합물.
43. 구현예 17 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 실시예 335의 화합물인, 화합물.
44. 구현예 1에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체;
ii) 다음의 군으로부터 독립적으로 선택된 2개의 변형기 M,
Figure 112021111337418-pct00090
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00091
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 H 또는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F임;
Figure 112021111337418-pct00092
여기에서 W2는 부재이고, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 * 을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00093
Figure 112021111337418-pct00094
여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00095
,
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17은 H 또는 F이고; Y18은 H 또는 F임; 및
Figure 112021111337418-pct00096
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F이고;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
45. 구현예 44에 있어서, 변형기 M은 동일한, 화합물.
46. 구현예 44 또는 45 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 desB30을 포함하는 인간 인슐린 유사체인, 화합물.
47. 구현예 46에 있어서, 전술한 인간 인슐린 유사체는 desB30 인간 인슐린 유사체인, 화합물.
48. 구현예 1에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체로서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서 펩티드 스페이서를 선택적으로 포함하고; 여기에서 전술한 펩티드 스페이서는 (GKP)pK를 포함하되, p는 3 내지 12로부터의 정수인, 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체;
ii) 다음의 군으로부터 독립적으로 선택된 2개의 변형기 M,
Figure 112021111337418-pct00097
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태, 또는
NH-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*을 나타내며,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄; 및
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00098
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 H 또는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F임;
Figure 112021111337418-pct00099
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00100
여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00101
이는 3,4-디아미노-피롤리딘의 R,R 또는 S,S 또는 R,S 입체이성질체를 나타내고; 여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y13은 H 또는 F이고; Y14는 H 또는 CF3이되; Y13 및 Y14 중 단지 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00102
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y15 및 Y16 은 H, 및 F로부터 독립적으로 선택됨;
Figure 112021111337418-pct00103
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00104
,
여기에서, α-아미노산 잔기는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내며; Y17은 H 또는 F이고; Y18은 H 또는 F임;
Figure 112021111337418-pct00105
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00106
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3 또는 SF5임;
Figure 112021111337418-pct00107
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F임;
Figure 112021111337418-pct00108
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄; 및
Figure 112021111337418-pct00109
여기에서, 아미노산 잔기 각각은 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 하나의 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 하나의 변형기 M은,
전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22에서의 리신의 엡실론 아미노기; 또는
전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 C-말단에서의 전술한 선택적인 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
49. 구현예 48에 있어서, 키랄 아미노산은 L-형태인, 화합물.
50. 구현예 48 또는 49 중 어느 하나에 있어서, 변형기 M은 동일한, 화합물.
51. 구현예 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 desB30을 포함하는 인간 인슐린 유사체인, 화합물.
52. 구현예 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 다음의 군으로부터 선택되는, 화합물:
A21Q desB30 인간 인슐린(서열번호 3 및 서열번호 11);
A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 14);
A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 15);
A22K desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 11); 및
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20).
53. 구현예 48 내지 구현예 52 중 어느 하나에 있어서, 다음의 군으로부터 선택되는, 화합물:
실시예 227의 화합물; 실시예 239의 화합물; 실시예 240의 화합물; 실시예 241의 화합물; 및 실시예 272의 화합물.
54. 구현예 1에 있어서, 다음을 포함하는, 화합물:
i) 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체;
ii) 다음의 군으로부터 선택된 1개의 변형기 M,
Figure 112021111337418-pct00110
이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내고,
여기에서, n는 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고;
W1은 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W1은
NH-CH2-C(=O)-*,
NH-CH2CH2-C(=O)-*,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태,
NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태, 또는
NH-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*을 나타내며,
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00111
Figure 112021111337418-pct00112
여기에서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 F 또는 CF3이고; Y4는 H 또는 F이고; Y5는 H이고 Y6은 F임;
Figure 112021111337418-pct00113
여기에서 W2는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W2는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 다음으로부터 선택되되,
Figure 112021111337418-pct00114
,
여기에서 Y7은 H이고; Y8은 H, Cl, CHF2, 또는 CF3이고; Y9는 H, F, 또는 CF3 이고; Y10은 F이고; Y11은 H이고; Y12는 F이되; Y8 및 Y9 중 단 하나만이 H임;
Figure 112021111337418-pct00115
여기에서 W3는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W3는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타냄;
Figure 112021111337418-pct00116
여기에서 W4는 부재이고 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점 *을 나타내거나, W4는 NH-CH2-C(=O)-*을 나타내되, *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고; Y19는 CF3 또는 SF5임;
Figure 112021111337418-pct00117
여기에서 *는 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고, Y20, Y21 및 Y22 각각은 H 및 F로부터 독립적으로 선택되되; Y21이 F인 경우 Y20 및 Y22는 H이고; Y21이 H인 경우 Y20 및 Y22는 F임;
Figure 112021111337418-pct00118
여기에서 *은 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
여기에서 변형기 M은 전술한 인간 인슐린 유사체의 A-사슬의 위치 22 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되거나; 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 22 또는 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착됨.
55. 구현예 54에 있어서, 전술한 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 A22K 및 desB30을 포함하는 인간 인슐린 유사체인, 화합물.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 인슐린 수용체에 결합하는 능력을 갖는, 화합물.
57. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 포도당이 존재하지 않는 경우보다 20 mM 포도당의 존재 시에 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는, 화합물.
58. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 포도당이 존재하지 않는 경우보다 20 mM 포도당의 존재 시에 적어도 3배 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는, 화합물.
59. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 포도당이 존재하지 않는 경우보다 20 mM 포도당의 존재 시에 적어도 10배 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는, 화합물.
60. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 포도당이 존재하지 않는 경우보다 20 mM 포도당의 존재 시에 적어도 15배 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는, 화합물.
61. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는, 조성물.
62. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 따른, 의약으로서 사용하기 위한, 화합물.
63. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 및 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 화합물.
64. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 및 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군)의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 구현예 61에 따른 조성물의 사용.
65. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 및 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군)의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 구현예 61에 따른 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예
물질 및 방법
약어 목록
AIBN 2,2'-아조비스이소부티로니트릴
AKT 일명 PKB, 단백질 키나아제 B
ALP 아크로모박터 용해성 프로테아제
Ar 아릴
ARS 알리자린 레드 나트륨
C18 옥타데카닐(HPLC 컬럼)
CV 컬럼 부피
DAST 디에틸아미노황 삼불화물
DBU 1,8-디아자비시클로(5.4.0)운데크-7-엔
DCM 디클로로메탄
DIC N,N-디이소프로필카보디이미드
DMF N,N-디메틸포름아미드
DIPEA N,N- 디이소프로필에틸아민
EDC.HCl N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드
EtOAc 에틸 아세테이트
FFC 유리 지방 세포(r, 랫트)
Fmoc-OSu 9-플루오레닐메틸 N-숙신이미딜 카보네이트
HATU 1-((디메틸아미노)(디메틸이미노)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEPES 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산
HIR 인간 인슐린 수용체(A = A 이소형, B = B 이소형)
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸
HONSU N-히드록시숙신마이드
HRMS 고해상도 질량 분광분석
HSA 인간 혈청 알부민
Kd 변위 상수
LCMS 액체 크로마토그래피 질량 분광분석
MeCN 아세토니트릴
mM 밀리몰
NBS N-브로모숙신이미드
N.D. 미검출
NMM N-메틸-모르폴린
NMR 핵 자기 공명
NMP N-메틸-피롤리돈
OEG 2-(2-아미노에톡시)에톡시-아세트산(올리고에틸렌글리콜 아미노산)
OXYMA 에틸 시아노히드록시이미노아세테이트
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
Ph 페닐
SPA 섬광 근접 분석
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라히드로푸란
THPTA 트리스(3-히드록시프로필트리아졸메틸)아민
TSTU 숙신이미딜-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
WGA 밀 배아 응집소
인슐린 변이체의 제조
실시예 1: 효모에서의 인슐린 변이체의 발현 및 ALP 등을 이용한 형질전환
예를 들어, WO2017/032798에 개시된 것과 같은 공지된 기술을 사용하여 인슐린 유사체를 효모에서 발현시켰다.
보다 구체적으로, 인슐린 유사체를 단쇄 전구체로서 발현시켰고, 이는 이온-교환 포획으로 단리되었고, 후술하는 바와 같이 ALP로 처리하여 2-사슬 인슐린 유사체로 절단하였다.
SP 세파로스(Sepharose) BB 상에서의 전구체의 포획:
효모 상청액을 SP 세파로스 BB로 충진된 컬럼 상에서 10 내지 20 CV/시간의 유동으로 로딩하였다.
pH 3.5의 0.1 M 구연산으로 세척한 후, 40% EtOH로 세척하였다.
0.2 M 아세트산나트륨 pH 5.5/35% EtOH로 유사체를 용리시켰다.
ALP 분해:
단쇄 전구체의 용액을 pH 9로 조정하고, ALP 효소를 1:100(w/w)으로 첨가하였다. UPLC에 대한 반응을 수행하였다. ALP 절단 풀을 pH 2.5로 조정하고, RP-HPLC 정제 준비를 위해 2배로 희석하였다.
RP-HPLC 정제:
정제는 아래와 같이 RP-HPLC C18에 의해 수행되었다:
컬럼: 15 um C18 50 x 250 mm 200Å
완충액:
A: 0.2% 포름산, 5% EtOH,
B: 0.2% 포름산, 50% EtOH,
구배: 20 내지 55% B-완충액.
구배: 20 CV
유속 20 CV/시간
로딩 g 약 5 g/l 수지
UPLC로 분획을 분석하고, 풀링하고, 동결건조시켰다.
다음의 실시예에서 제조되고 사용된 인슐린 유사체:
desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 11);
A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 13);
A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 14);
A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린(서열번호 5 및 서열번호 15);
A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 16);
A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 17);
A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 18);
A22K desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 11);
A22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 19);
A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린(서열번호 6 및 서열번호 20);
A-2K A-1P desB30 인간 인슐린(서열번호 7 및 서열번호 11);
A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린(서열번호 8 및 서열번호 11);
A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린(서열번호 9 및 서열번호 11);
A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린(서열번호 10 및 서열번호 11);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 21);
B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린(서열번호 4 및 서열번호 22);
B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 23);
B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 24);
B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 25);
B1-GKPG desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 26);
B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 27); 및
B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린(서열번호 1 및 서열번호 28).
B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린은 GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS를 갖는 B1로부터 연장된 desB30 인간 인슐린(desB30 인간 인슐린의 B1에 연결된 C-말단 S를 갖는 새로운 N-말단 G로부터 작성됨)을 의미한다. A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린은 GESGESGESK를 갖는 A21Q로부터 연장된 인슐린(C-말단 A21Q에 연결된 새로운 N-말단 G로부터 작성됨)을 의미한다. 다른 B1 및 A21 연장 인슐린 유사체에 대해서도 유사하다. B-1은 B1로부터의 N-말단 위치를 의미하며, 예를 들어, B-1G는 G를 갖는 인슐린 B1의 N-말단 연장을 의미한다.
빌딩 블록의 제조
각각의 실시예에서는 판독을 용이하게 하기 위해 중간 생성물 및 최종 생성물에 숫자를 부여한다. 동일한 수들이 실시예 전체에 걸쳐 사용되지만, 수는 각각의 실시예 내에서 명확하다.
실시예 2: O-숙신이미딜 3,5-비스[[[3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일]아미노]메틸]벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00119
테트라히드로푸란(110 mL) 중 2-플루오로-4-카복시페닐보론산(1, 8.44 g, 45.9 mmol), 피나콜(5.42 g, 45.9 mmol) 및 황산마그네슘(60 g)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 증발시키고 진공에서 건조시켜 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(2)을 베이지 분말로서 수득하였다. 수율: 10.4 g(85%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.93-7.80 (m, 2 H); 7.75 (d, J=9.4 Hz, 1 H); 1.39 (s, 12 H).
카복실산(2, 10.3 g, 38.6 mmol)를 디클로로메탄(130 mL)에 용해시켰다. 1-히드록시-피롤리딘-2,5-디온(HOSu, 8.89 g, 77.2 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 14.8 g, 77.2 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(130 mL)와 0.5 M 염산 수용액(130 mL) 사이에서 분리시켰다. 유기층을 0.5 M 염산 수용액(3 x 120 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(40 mL)에 용해시키고 시클로헥산(130 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 숙신이미딜3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(3)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 13.9 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.93-7.84 (m, 2 H); 7.77 (d, J=9.4 Hz, 1 H); 2.92 (s, 4 H); 1.39 (s, 12 H).
3,5-디메틸벤조산(4, 827.6 g, 18.4 mmol)을 메탄올(80 mL)에 현탁시키고 농축 황산(8 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 2일 동안 환류시켰다. 탄산나트륨(50 g)으로 중화시킨 후, 혼합물을 물(250 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(2 x 300 mL)로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발 건조시켜 메틸 3,5-디메틸벤조에이트(5)를 담황색 오일로서 수득하였다. 수율: 29.3 g(97%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.67 (s, 2 H); 7.19 (s, 1 H); 3.91 (s, 3 H); 2.37 (s, 6 H).
전술한 메틸 3,5-디메틸벤조에이트(5, 29.3 g, 178 mmol), N-브로모숙신이미드(NBS, 111 g, 623 mmol)의 혼합물 및 메틸 포르메이트(450 mL) 중 아조비스이소부티로니트릴의 압설자를 20시간 동안 환류하도록 가열하면서 가시광으로 조사하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄(200 mL)에 용해시켰다. 침전된 숙신이미드를 여과하고 여과물을 아황산나트륨(2 x 150 mL)의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 헥산/에틸 아세테이트 15:1)로 정제하였다. 생성물을 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물로부터 결정화시켜 메틸 3,5-비스(브로모메틸)벤조에이트(6)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 25.6 g(45%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.50. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.02-7.95 (m, 2 H); 7.62 (s, 1 H); 4.51 (s, 4 H); 3.94 (s, 3 H).
건조 아세토니트릴(350 mL) 중 전술한 브롬화물(6, 25.3 g, 78.6 mmol) 및 디포르밀아미드 나트륨(20.9 g, 220 mmol)의 현탁액을 4시간 동안 환류시켰다. 여과로 백색 고형분을 제거한 후, 용매를 증발시켰다. 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물로부터 재결정화하여 메틸 3,5-비스((N-포르밀포름아미도)메틸)벤조에이트(7)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 21.0 g(88%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.08 (s, 4 H); 7.72 (s, 2 H); 7.44 (s, 1 H); 4.70 (s, 4 H); 3.84 (s, 3 H).
벤조에이트(7, 20.9 g, 68.5 mmol)를 1,4-디옥산(220 mL) 및 농축 염산(280 mL)의 혼합물에 용해시키고 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 용액에 공기를 통과시켰다. 생성물이 침전되기 시작하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고, 메탄올/디에틸 에테르 혼합물로부터 생성물을 재결정화시켜 3,5-비스(아미노메틸)벤조산 디히드로클로라이드(8)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 17.1 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.26 (bs, 1 H); 8.65 (bs, 6 H); 8.10 (s, 2 H); 7.88 (s, 1 H); 4.08 (s, 4 H).
디히드로클로라이드(8, 2.08 g, 8.20 mmol)을 물(20 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(5.73 mL, 32.9 mmol), N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 및 활성화된 에스테르(3, 5.97 g, 16.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(1.40 g, 11.8 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(3 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조산(9)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.18 g(75%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.96 (bs, 1 H); 9.27 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 7.82-7.67 (m, 6 H); 7.64-7.56 (m, 2 H); 7.53 (s, 1 H); 4.58-4.44 (m, 4 H); 1.31 (s, 24 H).
전술한 산(9, 4.17 g, 6.20 mmol)를 아세토니트릴/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(4:1, 100 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.85 g, 7.40 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0°C까지 냉각시킨 다음, N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 1.53 g, 7.40 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(2 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 O-숙신이미딜 3,5-비스[[[3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일]아미노]메틸]벤조에이트(10)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.62 g(97%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.31 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 7.93 (s, 2 H); 7.79-7.68 (m, 5 H); 7.63-7.56 (m, 2 H); 4.60-4.50 (m, 4 H); 2.87 (s, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 773.4(M+H)+, 773.4로 계산됨.
실시예 3: O-숙신이미딜 N,N -비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도-리신-베타-알라닌
Figure 112021111337418-pct00120
2-클로로트리틸 수지 100 내지 200 메쉬 1.8 mmol/g(1, 53.3 g, 96.0 mmol)을 건조 디클로로메탄(350 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 수지를 여과하고 건조 디클로로메탄(300 mL)으로 세척하였다. 이어서, 건조 디클로로메탄(250 mL) 중 Fmoc-알라닌-OH(24.9 g, 80.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(55.7 mL, 320 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(50 mL)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5 분, 2 x 250 mL). 이어서, 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 피페리딘의 20% 용액으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 250 mL). 이어서, 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드(180 mL) 중 Fmoc-L-리신(Boc)-OH(56.2 g, 120 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미노)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 42.7 g, 120 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(34.8 mL, 200 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 피페리딘의 20% 용액으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 300 mL). 이어서, 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(2 x 300 mL), 디클로로메탄(2 x 300 mL), 메탄올(2 x 300 mL) 및 디클로로메탄(10 x 300 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(300 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하여 제거하고 디클로로메탄(2 x 200 mL), 2-프로판올(2 x 200 mL) 및 디클로로메탄(2 x 200 mL)으로 세척하였다. 감압 하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 디에틸 에테르(2 x 300 mL) 중에서 분말화하였다. 여과 및 건조 후, L-리신(Boc)-베타-알라닌(2)을 회백색 분말로서 수득하였다. 수율: 13.3 g(56%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.20 (t, J=7.1 Hz, 1 H); 3.66-3.46 (m, 2 H); 3.17-3.00 (m, 2 H); 2.65 (t, J=6.4 Hz, 2 H); 1.97-1.80 (m, 2 H); 1.60-1.30 (m, 13 H).
트리플루오로아세트산의 95% 수용액(60 mL)을 디클로로메탄(50 mL) 중 2(13.2 g, 41.6 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 전체 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 진공에서 건조시켜 L-리신-베타-알라닌 TFA 염(3)을 갈색 오일로서 수득하였다. 수율: 18.5 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.24 (t, J=6.7 Hz, 1 H); 3.71-3.46 (m, 2 H); 3.09 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.66 (t, J=6.6 Hz, 2 H); 2.01-1.89 (m, 2 H); 1.85-1.68 (m, 2 H); 1.60-1.46 (m, 2 H).
트리에틸아민(14.1 mL, 101 mmol)을 아세토니트릴 중 3(15.0 g, 33.7 mmol)의 용액에 첨가하여 회백색 침전물을 수득하였다. 여과 및 건조 후, L-리신-베타-알라닌(4)을 백색 흡수성 분말로서 수득하였다. 수율: 7.30 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.21 (t, J=6.4 Hz, 1 H); 3.72-3.45 (m, 2 H); 3.08 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 2.65 (t, J=6.0 Hz, 2 H); 2.00-1.88 (m, 2 H); 1.83-1.66 (m, 2 H); 1.59-1.43 (m, 2 H).
숙신이미딜 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트 5(5.00 g, 13.8 mmol)를 건조 아세토니트릴(80 mL) 중 4(3.00 g, 13.8 mmol) 및 트리에틸아민(7.74 mL, 55.5 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 전체 혼합물을 밤새 교반하였다. 이어서, 감압 하에서 용매를 제거하고 톨루엔으로 3회 증발시켰다. 이어서, 에틸 아세테이트(70 mL)를 첨가하고, 혼합물을 물(3 x 50 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(2 mL)에 용해시키고 격렬하게 교반된 시클로헥산(100 mL)에 적가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 N,N-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도-리신-베타-알라닌(6)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 2.31 g(47%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 7.83-7.73 (m, 2 H); 7.71-7.45 (m, 4 H); 4.77 (t, J=7.2 Hz, 1 H); 3.61-3.39 (m, 4 H); 2.64 (t, J=6.2 Hz, 2 H); 2.00-1.80 (m, 2 H); 1.77-1.47 (m, 4 H); 1.37 (s, 24 H).
N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.97 g, 8.41 mmol)를 건조 아세토니트릴(70 mL) 중 6(2.00 g, 2.80 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0°C까지 냉각시킨 다음, N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 0.87 g, 4.20 mmol)를 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 1 M 염산 수용액(3 x 70 mL), 물(70 mL) 및 염수(70 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔 중 피나콜과 함께 5회 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 0.1 M 염산 수용액(70 mL), 물(70 mL) 및 염수(70 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고 격렬하게 교반된 시클로헥산/디에틸 에테르의 혼합물(10:1, 110 mL)에 적가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 잔류 시클로헥산을 디클로로메탄과 함께 5회 증발시켜 제거하였다. 건조 후, O-숙신이미딜 N,N-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도-리신-베타-알라닌(7)를 회백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 1.12 g(48%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.83-7.71 (m, 2 H); 7.62-7.40 (m, 4 H); 7.19 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 7.02 (t, J=6.1 Hz, 1 H); 6.68 (t, J=5.6 Hz, 1 H); 4.67 (m, 1 H); 3.73-3.62 (m, 2 H); 3.44 (q, J=6.2 Hz, 2 H); 2.90-2.78 (m, 6 H); 2.07-1.60 (m, 4 H); 1.53-1.30 (m, 26 H). LC-MS: 810.5 (M+H)+, 810.4로 계산됨.
실시예 4: O-숙신이미딜 N,N -비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도-리신-글리신
Figure 112021111337418-pct00121
테트라히드로푸란(90 mL) 중 2-플루오로-4-카복시페닐보론산(1, 4.95 g, 27.0 mmol), 피나콜(3.21 g, 27.2 mmol) 및 황산마그네슘(450 g)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 증발시키고 진공에서 건조시켜 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(2)을 황색 분말로서 수득하였다. 수율: 7.06 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.93-7.80 (m, 2 H); 7.76 (d, J=9.4 Hz, 1 H); 1.39 (s, 12 H).
카복실산(2, 7.05 g, 26.5 mmol)를 디클로로메탄(100 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 6.10 g, 53.0 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 10.2 g, 53.0 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(110 mL)와 0.1 M 염산 수용액(110 mL) 사이에서 분리시켰다. 유기층을 0.1 M 염산 수용액(2 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(20 mL)에 용해시키고 시클로헥산(120 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 숙신이미딜3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(3)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 9.60 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 7.96-7.89 (m, 2 H); 7.79 (d, J=9.4 Hz, 1 H); 2.91 (s, 4 H); 1.33 (s, 12 H).
L-리신-글리신 TFA 염(4, 2.67 g, 6.20 mmol)를 물(20 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(4.32 mL, 24.8 mmol), N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(3, 4.50 g, 12.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(1.00 g, 8.46 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(3 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 차가운 시클로헥산(200 mL)에 적가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 고형분을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시켰다. 디에틸 에테르(10 mL) 및 시클로헥산(150 mL)을 첨가하였다. 용매를 따라내고, 잔류물을 진공에서 건조시켜 N,N'-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-L-리실글리신(5)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.60 g(37%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.91-7.79 (m, 2 H); 7.78-7.64 (m, 2 H); 7.58-7.34 (m, 4 H); 7.19-7.07 (m, 1 H); 4.86-4.72 (m, 1 H); 4.15-3.88 (m, 2 H); 3.47-3.25 (m, 2 H); 2.00-1.74 (m, 2 H); 1.66-1.52 (m, 2 H); 1.50-1.37 (m, 2 H); 1.34 (s, 24 H). LC-MS: 699.3(M+H)+, 617.2(M+H-피나콜)+, 535.0(M+H-2 x 피나콜)+.
전술한 산 5(1.59 g, 2.30 mmol)를 디클로로메탄(70 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.31 g, 2.70 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 0.65 g, 3.40 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 0.1 M 염산 수용액(2 x 80 mL) 및 염수(1 x 80 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발 건조시켜 O-숙신이미딜 N,N-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도-리신-글리신(6)를 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.29 g(70%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.73-8.53 (m, 3 H); 7.78-7.61 (m, 5 H); 7.54 (d, J=10.4 Hz, 1 H); 4.52-4.40 (m, 1 H); 4.36-4.17 (m, 2 H); 3.29-3.17 (m, 2 H); 2.81 (s, 4 H); 1.87-1.68 (m, 2 H); 1.59-1.47 (m, 2 H); 1.46-1.36 (m, 2 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 796.4 (M+H)+, 796.4로 계산됨.
실시예 5: 2-((23-(3,5-비스((3-(3-아세톡시-2,2-비스(아세톡시메틸)프로폭시)프로판아미도)메틸)벤즈아미도)-7,16-디옥소-3,9,12,18,21-펜타옥사-6,15-디아자트리코실)옥시)- N- (4-포르밀벤질)아세트아미드
Figure 112021111337418-pct00122
펜타에리트리톨(136 g, 1.00 mol), 수산화나트륨(8.00 g, 200 mmol), 디메틸 술폭시드(200 mL) 및 물(18 mL)의 혼합물을 투명한 용액이 형성될 때까지 (밤새) 80°C에서 가열하였다. 터트-부틸 아크릴레이트(2, 174 mL, 1.20 mol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 80°C에서 24시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시키고, 물(200 mL)로 희석시키고 에틸 아세테이트(3 x 400 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 물(400 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였다. 수성 세척액이 생성물(3)을 함유하였으므로, 이들을 합치고 에틸 아세테이트(2 x 200 mL)로 재추출하였다. 모든 에틸 아세테이트 분획을 합치고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 99:1 내지 90:10)로 정제하여 터트-부틸 3-(3-히드록시-2,2-비스(히드록시메틸)프로폭시)프로파노에이트(3)를 무색 오일로서 수득하였다.
수율: 39.7 g(15%). RF(SiO2, 디클로로메탄/메탄올 9:1): 0.30.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 3.67 (t, J=5.6 Hz, 2 H); 3.65 (s, 6 H); 3.52 (s, 2 H); 2.73 (bs, 3 H); 2.49 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 1.46 (s, 9 H). LC-MS: 287.2(M+Na)+.
아세트산 무수물(95.6 mL, 350 mmol)을 0°C에서 건조 디클로로메탄(600 mL) 중 전술한 터트-부틸 3-(3-히드록시-2,2-비스(히드록시메틸)프로폭시)프로파노에이트(3, 74.5 g, 281 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(88.1 mL, 506 mmol)의 용액에 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하고; 잔류물을 에틸 아세테이트(2 L)에 재용해시키고, 물(600 mL), 0.5 M 염산 수용액(1.2 L), 물(600 mL), 10% 탄산칼륨 수용액(600 mL), 물(600 mL) 및 염수(230 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1 내지 8:2)로 정제하여 2-(아세톡시메틸)-2-((3-(터트-부톡시)-3-옥소프로폭시)메틸)프로판-1,3-디일 디아세테이트(4)를 무색 오일로서 수득하였다. 수율: 86.7 g(79%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 3:2): 0.40. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 4.11 (s, 6 H); 3.65 (t, J=6.2 Hz, 2 H); 3.44 (s, 2 H); 2.45 (t, J=6.3 Hz, 2 H); 2.06 (s, 9 H); 1.46 (s, 9 H). LC-MS: 413.2(M+Na)+.
트리플루오로아세트산(300 mL)을 디클로로메탄(100 mL) 중 전술한 2-(아세톡시메틸)-2-((3-(터트-부톡시)-3-옥소프로폭시)메틸)프로판-1,3-디일 디아세테이트(4, 86.0 g, 220 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 증발 건조시키고, 잔류물을 톨루엔(3 x 150 mL)으로부터 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 10:0 내지 9:1)로 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 증발시켜 표제 화합물(5)을 연갈색 오일로서 수득하였다.
수율: 70.4 g(96%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 1:1): 0.25. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 4.10 (s, 6 H); 3.69 (t, J=6.1 Hz, 2 H); 3.46 (s, 2 H); 2.60 (t, J=6.1 Hz, 2 H); 2.06 (s, 9 H). LC-MS: 357.2(M+Na)+.
2-클로로트리틸 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(10.7 g, 16.0 mmol)을 건조 디클로로메탄(100 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(20 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 4.12 g, 10.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.07 mL, 40.6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(3.72 mL, 21.4 mmol)의 용액으로 처리하였다(2:8, 2 x 5분, 2 x 50 mL). 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 10분, 1 x 30분, 3 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 6.17 g, 16.0 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 5.70 g, 16.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(5.02 mL, 28.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 10분, 1 x 30분, 3 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 6.17 g, 16.0 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 5.70 g, 16.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(5.02 mL, 28.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 10분, 1 x 30분, 3 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 3,5-비스(((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)메틸)벤조산(10.0 g, 16.0 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 5.70 g, 16.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(5.02 mL, 28.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 10분, 1 x 30분, 3 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 3-(3-아세톡시-2,2-비스(아세톡시메틸)프로폭시)프로판산(5, 10.7 g, 32.0 mmol), 에틸 시아노-글리옥실레이트-2-옥심(OXYMA, 4.55 g, 32.0 mmol), 2,4,6-콜리딘(7.68 mL, 6.99 mmol) 및 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC, 4.96 g, 32.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(3 x 50 mL), 디클로로메탄(4 x 50 mL), 메탄올(4 x 50 mL) 및 디클로로메탄(7 x 50 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 혼합물(1:1, 50 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하여 제거하고 디클로로메탄(2 x 50 mL)으로 세척하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 100:0 내지 90:10)로 정제하여 메틸에스테르 및 부분적으로 탈아세틸화된 생성물로 오염된 화합물(8)을 수득하였다. 화합물 (8)을 디옥산에 용해시키고, 물(160 mL) 중 수산화리튬(3.42 g, 81.5 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 1 M 염산(80 mL)으로 중화시키고 동결건조시켰다. 탈아세틸화된 8을 디클로로메탄(50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(10 mL)의 혼합물에 용해시킨 후, 피리딘(50 mL) 및 아세트산 무수물(30.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 72시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드로부터 여러 번 증발시켜 목적하는 화합물 8을 갈색 오일로서 수득하였다. 수율: 13.2 g(99%). LC-MS: 1249(M+H)+.
전술한 화합물(8, 15.6 g, 12.5 mmol), 2,4,6-콜리딘(14.9 mL, 113 mmol), [1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-올(HOAt, 5.10 g, 37.6 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 7.89 g, 41.3 mmol)를 디클로로메탄(170 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(20 mL)에 용해시켰다. 4-포르밀-벤질-암모늄 클로라이드(7.08 g, 41.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 HPLC(Deltapak, C18, 5 m, 50 x 500 mm, 아세토니트릴/물, 15:85 내지 25:75, 30분 동안, 25:75 내지 50:50, 170분 동안 + 0.05% TFA)로 정제하여 표제 화합물 10을 갈색 오일로서 수득하였다. 수율: 1.96 g(12%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 9.98 (s, 1 H); 7.84 (d, J=8.1 Hz, 2 H); 7.56-7.41 (m, 3 H); 7.39-7.33 (m, 1 H); 7.25-7.14 (m, 2 H); 7.09-7.00 (m, 1 H); 4.56 (d, J=6.2 Hz, 2 H); 4.46-4.40 (m, 4 H); 4.09-3.96 (m, 16 H); 3.91 (s, 2 H); 3.73-3.56 (m, 20 H); 3.52 (t, J=5.1 Hz, 4 H); 3.45-3.32 (m, 8 H); 2.49 (t, J=5.8 Hz, 4 H); 2.05 (s, 18 H). LC-MS: 1366(M+H)+.
실시예 6: Boc-리신(Boc)-OEG3-벤즈알데히드
Figure 112021111337418-pct00123
실시예 6의 화합물은 Boc-리신(Boc)로부터의 실시예 5의 화합물과 유사하게 제조되었다.
실시예 7: 비스(비스(4-보로노-3-플루오로벤조일)-3,5-아미노메틸벤조에이트-엡실론,알파 -리신-N- 베타-알라닌-OSu = (S)-3-(2,6-비스(3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로파노에이트
Figure 112021111337418-pct00124
3,5-디메틸벤조산(1, 45.1 g, 18.4 mmol)을 메탄올(130 mL)에 현탁시키고 농축 황산(13 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 2일 동안 환류시켰다. 탄산나트륨(80 g)으로 중화시킨 후, 혼합물을 물(250 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(2 x 300 mL)로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발 건조시켜 메틸 3,5-디메틸벤조에이트(2)를 담황색 오일로서 수득하였다. 수율: 46.8 g(95%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.67 (s, 2 H); 7.19 (s, 1 H); 3.91 (s, 3 H); 2.37 (s, 6 H).
전술한 메틸 3,5-디메틸벤조에이트 2(46.7 g, 284 mmol), N-브로모숙신이미드(NBS, 177 g, 994 mmol)의 혼합물 및 메틸 포르메이트(550 mL) 중 아조비스이소부티로니트릴의 압설자를 20시간 동안 환류하도록 가열하면서 가시광으로 조사하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄(300 mL)에 용해시켰다. 침전된 숙신이미드를 여과하고 여과물을 아황산나트륨(2 x 250 mL)의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 헥산/에틸 아세테이트 15:1)로 정제하였다. 생성물을 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물(1:5, 360 mL)로부터 결정화시켜 메틸 3,5-비스(브로모메틸)벤조에이트(3)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 46.5 g(51%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.50. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.03-7.97 (m, 2 H); 7.62 (s, 1 H); 4.50 (s, 4 H); 3.94 (s, 3 H).
건조 아세토니트릴(200 mL) 중 전술한 브롬화물 3(35.2 g, 109 mmol) 및 디포르밀아미드 나트륨(29.1 g, 306 mmol)의 현탁액을 4시간 동안 환류시켰다. 여과로 백색 고형분을 제거한 후, 용매를 증발시켰다. 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물로부터 재결정화하여 메틸 3,5-비스((N-포르밀포름아미도)메틸)벤조에이트(4)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 32.7 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.08 (s, 4 H); 7.72 (s, 2 H); 7.44 (s, 1 H); 4.70 (s, 4 H); 3.84 (s, 3 H).
벤조에이트 4(32.7 g, 107 mmol)을 1,4-디옥산(340 mL) 및 농축 염산(430 mL)의 혼합물에 용해시키고 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 용액에 공기를 통과시켰다. 생성물이 침전되기 시작하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고, 메탄올/디에틸 에테르 혼합물(300 mL)로부터 생성물을 재결정화시켜 3,5-비스(아미노메틸)벤조산 디히드로클로라이드(5)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 22.2 g(82%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, D2O, δH): 8.08 (s, 2 H); 7.72 (s, 1 H); 4.26 (s, 4 H).
디히드로클로라이드(5, 6.33 g, 25.0 mmol)을 물(110 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(17.4 mL, 100 mmol), N,N-디메틸포름아미드(110 mL) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6, 18.2 g, 50.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 중화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(0.60 g, 5.00 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(3 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산 및 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조산(7)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 14.5 g(86%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.96 (bs, 1 H); 9.33-9.23 (m, 2 H); 7.83-7.67 (m, 6 H); 7.64-7.57 (m, 2 H); 7.54 (s, 1 H); 4.55-4.46 (m, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 512.0(M+H-2 x 피나콜)+.
전술한 산 7(14.4 g, 21.3 mmol)를 아세토니트릴/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(4:1, 100 mL)에 용해시켰다. 이어서, N-히드록시숙신이미드(HOSu, 2.95 g, 25.6 mmol) 및 N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 5.28 g, 25.6 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(2 x 150 mL) 및 염수(1 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴(100 mL)에 용해시켰다. 잔류 N,N-디시클로헥실우레아를 여과하여 제거하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 테트라히드로푸란(150 mL)에 용해시키고, 피나콜(0.60 g, 5.00 mmol) 및 분자체로 밤새 처리하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(40 mL)에 용해시켰다. 생성물을 시클로헥산(150 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 시클로헥산 및 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조에이트(8)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 13.3 g(75%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.34-9.21 (m, 2 H); 7.94 (s, 2 H); 7.79-7.66 (m, 5 H); 7.65-7.56 (m, 2 H); 4.62-4.50 (m, 4 H); 2.88 (s, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 773.4(M+H)+, 691.2(M+H-피나콜)+, 609.1(M+H-2 x 피나콜)+.
2-클로로트리틸 수지 100 내지200 메쉬 1.8 mmol/g(9, 10.9 g, 19.7 mmol)을 건조 디클로로메탄(140 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(120 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산 (Fmoc-b알라닌-OH, 4.08 g, 13.1 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(8.68 mL, 49.9 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(4.57 mL, 26.2 mmol)의 용액으로 처리하였다(1:4, 10분, 140 mL). 이어서, 수지를 디클로로메탄(2 x 130 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 130 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 15분, 2 x 130 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 130 mL), 2-프로판올(2 x 130 mL) 및 디클로로메탄(2 x 130 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 130 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(110 mL) 중 N2,N6-비스(터트-부톡시카보닐)-L-리신(Boc-리신(Boc)-OH, 9.09 g, 26.2 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 9.33 g, 26.2 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(8.23 mL, 47.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 130 mL) 및 디클로로메탄(10 x 130 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(220 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(2 x 200 mL)으로 세척하였다. 용액을 합치고; 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 90:10)로 정제하여 (S)-3-(2,6-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)프로판산(10)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.30 g(78%). RF(SiO2, 디클로로메탄/메탄올 90:10): 0.40.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.27-3.99 (m, 1 H); 3.65-3.44 (m, 2 H); 3.17-3.00 (m, 2 H); 2.70-2.56 (m, 2 H); 1.86-1.58 (m, 2 H); 1.57-1.26 (m, 22 H). LC-MS: 417.5(M+H)+.
전술한 화합물(10, 4.30 g, 10.3 mmol)을 트리플루오로아세트산(50 mL)에 용해시키고 1.5시간 동안 방치하였다. 용매를 증발시켰다. 디에틸 에테르(100 mL)를 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 따라낸 후, 잔류물을 진공에서 건조시켜 (S)-6-((2-카복시에틸)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트(11)를 경질 오일로서 수득하였다. 수율: 4,50 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.58 (t, J=5.4 Hz, 1 H); 8.18 (bs, 2 H); 7.87 (bs, 2 H); 3.77-3.62 (m, 1 H); 3.34-3.18 (m, 2 H); 2.83-2.65 (m, 2 H); 1.74-1.60 (m, 2 H); 1.60-1.44 (m, 2 H); 1.37-1.19 (m, 2 H). LC-MS: 217.2(M+H)+.
전술한 염(11, 2.70 g, 6.06 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(100 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(5.30 mL, 30.3 mmol), 물(50 mL) 및 활성화된 에스테르(8, 9.36 g, 12.1 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 중화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(0.50 g, 4.23 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(1 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 부분적인 피나콜 에스테르 절단이 NMR 분석에 의해 관찰되었다. 물질을 테트라히드로푸란(110 mL) 중 피나콜(0.04 g, 0.34 mmol) 및 황산마그네슘(20.0 g)으로 밤새 처리하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 생성물을 디클로로메탄/시클로헥산 혼합물(1:5, 180 mL)로부터 결정화시켜 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로판산(12)을 담갈색 분말로서 수득하였다. 수율: 5.86 g(63%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.31-9.13 (m, 4 H); 8.53-8.43 (m, 1 H); 8.43-8.35 (m, 1 H); 8.11-7.98 (m, 1 H); 7.78-7.55 (m, 16 H); 7.48-7.38 (m, 2 H); 4.55-4.43 (m, 8 H); 4.43-4.33 (m, 1 H); 3.31-3.13 (m, 4 H); 2.38 (t, J=6.4 Hz, 2 H); 1.79-1.64 (m, 2 H); 1.57-1.44 (m, 2 H); 1.42-1.21 (m, 50 H).
카복실산(12, 5.46 g, 3.57 mmol)을 아세토니트릴(50 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.70 g, 6.07 mmol) 및 N,N-디시클로헥실카보디이미드(1.47 g, 7.14 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 부산물을 여과로 제거하였다. 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(1 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(60 mL)에 용해시키고, 피나콜(0.06 g, 0.50 mmol)로 처리하고, 분자체로 밤새 처리하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 아세트산에틸(10 mL)에 용해시키고 디에틸 에테르(90 ml)를 첨가한 후 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(13)을 담갈색 분말로서 수득하였다. 생성물에는 미량의 N,N-디시클로헥실우레아가 함유되어 있다. 수율: 1.55 g(27%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.28-9.17 (m, 3 H); 8.52-8.33 (m, 2 H); 8.25-8.15 (m, 1 H); 7.80-7.51 (m, 16 H); 7.48-7.35 (m, 2 H); 4.58-4.32 (m, 9 H); 3.49-3.35 (m, 2 H); 3.25-3.09 (m, 2 H); 2.91-2.72 (m, 6 H); 1.81-1.65 (m, 2 H); 1.57-1.42 (m, 2 H); 1.41-1.12 (m, 50 H). LC-MS: 1631.9(M+H)+, 1549.0(M-피나콜+H)+, 715.0(M-2 x H2O-2 x 피나콜/2+H)+, 1384.5(M-3 x 피나콜+H)+, 1302.3(M-4 x 피나콜+H)+.
실시예 8: (7S,18S)-18-(3-((S)-2,6-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)헥산아미도)프로판아미도)-7-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)-1-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-1,8,12,19-테트라옥소-2,9,13,20-테트라아자트리코산-23-오익산
Figure 112021111337418-pct00125
테트라히드로푸란(400 mL) 중 2-플루오로-4-카복시페닐보론산(1, 15.1 g, 82.0 mmol), 피나콜(9.81 g, 83.0 mmol) 및 황산마그네슘(150 g)의 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 증발시키고 진공에서 건조시켜 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(2)을 담황색 분말로서 수득하였다. 수율: 21.5 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, DMSO-d6, δH): 7.95-7.42 (m, 3 H); 1.30 (s, 12 H).
카복실산(2, 21.4 g, 81.9 mmol)를 디클로로메탄(300 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 18.8 g, 163 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 31.3 g, 163 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 M 염산 수용액(1 x 200 mL), 물(1 x 200 mL) 및 염수(1 x 200 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(60 mL)에 용해시키고 시클로헥산(250 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(3)를 베이지색 분말로서 수득하였다. 수율: 27.8 g(93%). 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, DMSO-d6, δH): 7.98-7.87 (m, 2 H); 7.80 (dd, J=9.2 Hz, 1 H); 2.90 (s, 4 H); 1.33 (s, 12 H).
2-클로로트리틸 수지 100 내지 200 메쉬 1.8 mmol/g(4, 16.4 g, 29.5 mmol)을 건조 디클로로메탄(230 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(180 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-b알라닌-OH, 6.13 g, 19.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(13.0 mL, 74.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(6.86 mL, 39.4 mmol)의 용액으로 처리하였다(1:4, 10분, 200 mL). 이어서, 수지를 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 15분, 2 x 200 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 2-프로판올(2 x 200 mL) 및 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(180 mL) 중 N2,N6-비스(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-L-리신(Fmoc-리신(Fmoc)-OH, 23.3 g, 39.4 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 14.0 g, 39.4 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(12.3 mL, 70.9 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 15분, 2 x 200 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 2-프로판올(2 x 200 mL) 및 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(230 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-b알라닌-OH, 24.5 g, 78.7 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 28.0 g, 78.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(24.7 mL, 142 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 15분, 2 x 200 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 2-프로판올(2 x 200 mL) 및 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(230 mL) 중 N2,N6-비스(터트-부톡시카보닐)-L-리신(Boc-리신(Boc)-OH, 27.3 g, 78.7 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 28.0 g, 78.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(24.7 mL, 142 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 15분, 2 x 200 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL), 2-프로판올(2 x 200 mL) 및 디클로로메탄(2 x 200 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 200 mL)로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(350 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(2 x 300 mL)으로 세척하였다. 용액을 합치고; 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 85:15)로 정제하여 (10S,21S)-21-(3-((S)-2,6-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)프로판아미도)-10-((터트-부톡시카보닐)아미노)-2,2-디메틸-4,11,15,22-테트라옥소-3-옥사-5,12,16,23-테트라아자헥사코산-26-오익산(5)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11.3 g(56%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.52-4.43 (m, 1 H); 4.22-3.98 (m, 2 H); 3.64-3.44 (m, 6 H); 3.27-3.16 (m, 2 H); 3.15-3.03 (m, 4 H); 2.69-2.48 (m, 6 H); 1.84-1.59 (m, 6 H); 1.58-1.28 (m, 48 H). LC-MS: 1016.2(M+H)+.
전술한 화합물(5, 11.3 g, 11.1 mmol)을 트리플루오로아세트산(200 mL)에 용해시키고 1.5시간 동안 방치하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고 디에틸 에테르(200 mL)를 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 (5S,12S,23S)-12-((2-카복시에틸)카바모일)-6,10,18,22-테트라옥소-7,11,17,21-테트라아자헵타코산-1,5,23,27-테트라아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트(6)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 9.25 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.56-8.44 (m, 2 H); 8.27-7.72 (m, 11 H); 4.22-4.08 (m, 1 H); 3.78-3.60 (m, 2 H); 3.39-3.17 (m, 6 H); 3.07-2.92 (m, 2 H); 2.82-2.66 (m, 4 H); 2.42-2.19 (m, 6 H); 1.77-1.43 (m, 10 H); 1.42-1.14 (m, 8 H).
전술한 염(6, 7.91 g, 9.37 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(170 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(14.7 mL, 84.3 mmol), 물(0.50 mL) 및 활성화된 에스테르(3, 13.6 g, 37.5 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(1.00 g, 8.46 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(1 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 부피의 1/3까지 농축시켰다. 시클로헥산(150 mL)을 첨가하고; 침전물을 여과하고 시클로헥산으로 세척하였다. 고형분을 아세토니트릴/디에틸 에테르 혼합물(1:1, 150 mL)에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 아세토니트릴로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(7)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.10 g(27%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.67-8.43 (m, 4 H); 8.05-7.83 (m, 4 H); 7.82-7.47 (m, 13 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.20-4.05 (m, 1 H); 3.42-3.13 (m, 10 H); 3.05-2.90 (m, 2 H); 2.42-2.27 (m, 4 H); 2.27-2.17 (m, 2 H); 1.84-1.66 (m, 4 H); 1.63-1.10 (m, 62 H). LC-MS: 1226.4(M-3 x H2O-4 x 피나콜+H)+.
실시예 9: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N -(2-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)에틸 )-N -(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리시네이트
Figure 112021111337418-pct00126
3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(2, 8.85 g, 33.3 mmol)을 디클로로메탄(100 mL)에 용해시킨 후, 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(V)(HATU, 12.3 g, 32.4 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민에틸(14.5 mL, 83.2 mmol) 및 터트-부틸 (2-아미노에틸)글리시네이트 히드로클로라이드(1, 4.11 g, 16.6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1 M 염산 수용액(2 x 100 mL), 물(1 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 건조 테트라히드로푸란(50 mL)에 용해시키고, 2,3-디메틸-2,3-부탄디올(3.70 g, 31.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/에틸 아세테이트 5:2)로 정제하여 터트-부틸 N-(2-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)에틸)-N-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리시네이트(3)를 백색 발포체로 수득하였다. 수율: 8.13 g(73%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.78-8.55 (m, 1 H); 7.79-7.44 (m, 4 H); 7.12-6.88 (m, 2 H); 4.18-3.90 (m, 2 H); 3.67-3.47 (m, 2 H); 3.45-3.29 (m, 2 H); 1.44 (s, 9 H); 1.30 (s, 24 H).
전술한 화합물(3, 8.13 g, 12.1 mmol)을 트리플루오로아세트산(100 mL)에 용해시키고 2.5시간 동안 방치하였다. 이어서, 용매를 증발시키고 톨루엔으로 2회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(30 mL)에 용해시키고 시클로헥산(250 mL)을 첨가하였다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 N-(2-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)에틸)-N-(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리신(4)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 6.91 g(93%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, 80 C, δH): 8.49-8.38 (m, 1 H); 7.76-7.68 (m, 1 H); 7.67-7.59 (m, 2 H); 7.57-7.45 (m, 1 H); 7.16-7.09 (m, 1 H); 7.04-6.94 (m, 1 H); 4.20-4.03 (m, 2 H); 3.59-3.40 (m, 4 H); 1.33 (s, 24 H). LC-MS: 449.9(M-2 x 피나콜+H)+, 532.1(M-피나콜+H)+, 614.2(M+H)+.
전술한 산(4, 6.90 g, 11.2 mmol)을 디클로로메탄/테트라히드로푸란 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시킨 후, N-히드록시숙신이미드(1.36 g, 11.8 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(2.26 g, 11.8 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(2 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 생성물을 디클로로메탄/시클로헥산 혼합물(25 mL/250 mL)로부터 침전시켰다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(5)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 7.62 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, 80 C, δH): 8.51-8.38 (m, 1 H); 7.77-7.57 (m, 3 H); 7.55-7.45 (m, 1 H); 7.18-7.10 (m, 1 H); 7.06-6.97 (m, 1 H); 4.62 (bs, 2 H); 3.67-3.41 (m, 4 H); 2.84 (s, 4 H); 1.33 (s, 24 H). LC-MS: 547.0(M-2 x 피나콜+H)+, 629.1(M-피나콜+H)+, 711.3(M+H)+.
실시예 10: N- (6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카보닐)- N- (2-(6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00127
6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실산(1, 10.0 g, 51.0 mmol)을 테트라히드로푸란(100 mL)에 용해시켰다. N,N-디메틸포름아미드(15 mL), N-히드록시숙신이미드(6.46 g, 56.1 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(10.8 g, 56.1 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(400 mL)에 재용해시키고, 1 M 염산 수용액(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실레이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 13.8 g(92%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.65 (s, 1 H); 8.11 (d, J=5.9 Hz, 1 H); 7.71 (d, J=10.1 Hz, 1 H); 5.08 (s, 2 H); 2.90 (s, 4 H). LC-MS: 294.4(M+H)+.
(2-아미노에틸)글리신(3, 1.81 g, 15.4 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(40 mL), 트리에틸아민(12.8 mL, 92.1 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실레이트(2, 9.00 g, 30.7 mmol)에 실온에서 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 40°C로 가열하고 72시간 동안 추가로 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(400 mL)에 재용해시키고, 1 M 염산 수용액(100 mL)으로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 생성물을 아세토니트릴/물 혼합물로부터 침전시키고, 원심분리로 수집하고 동결건조시켜 N-(6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카보닐)-N-(2-(6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복사미도)에틸)글리신 4를 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.99 g(27%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.87 (bs, 1 H); 9.50-9.37 (m, 2 H); 8.52-8.22 (m, 1 H); 7.69-7.30 (m, 4 H); 5.08-4.70 (m, 4 H); 4.27-3.96 (m, 2 H); 3.74-3.35 (m, 4 H). LC-MS: 475.5(M+H)+.
실시예 11: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 (S)-3-(2,6-비스(3,5-비스((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로파노에이트
Figure 112021111337418-pct00128
2-클로로트리틸 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(1, 21.0 g, 31.5 mmol)을 건조 디클로로메탄(300 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(250 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-b알라닌-OH, 6.54 g, 21.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(13.9 mL, 79.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 주말 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(7.32 mL, 42.0 mmol)의 용액으로 처리하였다(1:4, 1 x 15분, 250 mL). 이어서, 수지를 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 20분, 2 x 250 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(250 mL) 중 N2,N6-비스(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-L-리신(Fmoc-리신(Fmoc)-OH, 18.6 g, 31.5 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 11.2 g, 31.5 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(9.87 mL, 56.7 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(3 x 250 mL)으로 세척하였다.
수지의 일부를 제거하였다(2.00 mmol). N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 10분, 1 x 30분, 3 x 30 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(4 x 30 mL), 디클로로메탄(4 x 30 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 30 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(30 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3,5-비스((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조에이트(2, 3.65 g, 4.72 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.40 mL, 8.00 mmol)을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(4 x 30 mL), 디클로로메탄(4 x 30 mL), N,N-디메틸포름아미드(4 x 30 mL) 및 디클로로메탄(10 x 30 mL)으로 세척하였다.
생성물을 2시간 동안 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올/디클로로메탄 혼합물(1:2, 30 mL)로 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(3 x 30 mL)으로 세척하였다. 용액을 합치고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(5 mL)에 용해시키고 시클로헥산(25 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 (S)-3-(2,6-비스(3,5-비스((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로판산(3)을 수득하였다. 수율: 1.53 g(52%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.20-9.03 (m, 4 H); 8.52-8.42 (m, 1 H); 8.39-8.32 (m, 1 H); 8.06-7.99 (m, 1 H); 7.94-7.80 (m, 10 H); 7.78-7.65 (m, 10 H); 7.48-7.39 (m, 2 H); 4.56-4.43 (m, 8 H); 4.43-4.32 (m, 1 H); 3.27-3.14 (m, 4 H); 2.40-2.29 (m, 2 H); 1.78-1.64 (m, 2 H); 1.56-1.430 (m, 3 H) 1.37-1.21 (s, 49 H).
카복실산(3, 1.53 g, 1.00 mmol)를 디클로로메탄(40 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(HOSu, 148 mg, 1.30 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 242 mg, 1.30 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 물(2 x 50 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(50 mL)을 첨가하여 침전시켰다. 여과로 생성물을 수집하고, 시클로헥산 및 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(4)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 1.16 g(71%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.23-9.01 (m, 4 H); 8.50-8.42 (m, 1 H); 8.41-8.35 (m, 1 H); 8.23-8.16 (m, 1 H); 7.91-7.81 (m, 9 H); 7.77-7.70 (m, 9 H); 7.70-7.64 (m, 2 H); 7.47-7.40 (m, 2 H); 4.55-4.43 (m, 8 H); 4.40-4.34 (m, 1 H) 3.50-3.38 (m, 2 H); 3.26-3.12 (m, 2 H); 2.88-2.77 (m, 6 H); 1.82-1.63 (m, 2 H); 1.60-1.43 (m, 4 H); 1.31 (s, 48 H). LC-MS: 1631.9(M+H)+, 1549.0(M-피나콜+H)+, 715.0(M-2 x H2O-2 x 피나콜/2+H)+, 1384.5(M-3 x 피나콜+H)+, 1302.3(M-4 x 피나콜+H)+.
실시예 12: (S)-3-(2,6-비스(3,5-비스((2-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로판산
Figure 112021111337418-pct00129
3,5-디메틸벤조산(1, 300 g, 2.00 mol)을 메탄올(900 mL)에 현탁시키고 농축 황산(90 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 3일 동안 교반하였다. 탄산나트륨(480 g)으로 중화시킨 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 물(1 L)에 용해시키고 디에틸 에테르(3 x 1 L)로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발 건조시켜 메틸 3,5-디메틸벤조에이트(2)를 담황색 오일로서 수득하였다. 수율: 309 g(94%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.65 (s, 2 H); 7.16 (s, 1 H); 3.88(s, 3 H); 2.34 (s, 6 H).
전술한 메틸 3,5-디메틸벤조에이트 (2, 307 g, 1.87 mol), N-브로모숙신이미드(1.17 kg, 6.55 mol)의 혼합물 및 메틸 포르메이트(2.7 L) 중 아조비스이소부티로니트릴의 압설자를 20시간 동안 환류하도록 가열하면서 가시광으로 조사하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄(2 L)에 용해시켰다. 침전된 숙신이미드를 여과하고 여과물을 아황산나트륨(2 x 1 L)의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 고온의 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물로부터 다중 결정화를 수행하고 시클로헥산으로 세척하여 메틸 3,5-비스(브로모메틸)벤조에이트(3)를 백색 고체로서 수득하였다. 생성물을 2개의 배치로 제조하였다. 수율: 243 g(40%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.50. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.00 (s, 2 H); 7.62 (s, 1 H); 4.51 (s, 4 H); 3.94 (s, 3 H).
건조 아세토니트릴(900 mL) 중 전술한 브롬화물 (3, 122 g, 380 mmol) 및 디포르밀아미드 나트륨(101 g, 1.06 mol)의 현탁액을 4시간 동안 환류시켰다. 여과로 백색 고형분을 제거한 후, 용매를 에틸 아세테이트와 함께 증발시키고 진공에서 건조시켜 메틸 3,5-비스((N-포르밀포름아미도)메틸)벤조에이트(4)를 담황색 고체로서 수득하였다. 수율: 116 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.07 (s, 4 H); 7.72 (s, 2 H); 7.43 (s, 1 H); 4.70 (s, 4 H); 3.82 (s, 3 H).
벤조에이트(4, 116 g, 380 mmol)을 1,4-디옥산(400 mL) 및 농축 염산(600 mL)의 혼합물에 용해시키고 3시간 동안 가열하여 환류시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 용액에 공기를 통과시켰다. 생성물이 침전되기 시작하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고, 메탄올/디에틸 에테르 혼합물로부터 생성물을 재결정화시켜 3,5-비스(아미노메틸)벤조산 디히드로클로라이드(5)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 89.5 g(92%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, D2O, δH): 8.10 (s, 2 H); 7.74 (s, 1 H); 4.28 (s, 4 H).
디히드로클로라이드(5, 30.0 g, 118 mmol) 및 수산화나트륨(14.2 g, 356 mmol)을 물(240 mL)에 용해시켰다. 1,4-디옥산(480 mL) 중 디-터트-부틸 디카보네이트(77.6 g, 356 mmol)를 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트(400 mL) 및 0.5 M 염산 수용액(400 mL)으로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 물(2 x 350 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 뜨거운 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 시클로헥산(400 mL)을 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고 시클로헥산으로 세척하여 3,5-비스(((터트-부톡시카보닐)아미노)메틸)벤조산(6)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 39.1 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 7.70 (s, 2 H); 7.45-7.36 (m, 2 H); 7.33 (s, 1 H); 4.21-4.04 (m, 4 H); 1.39 (s, 18 H).
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(7, 21.2 g, 31.8 mmol)을 건조 디클로로메탄(280 mL)에서 40분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(220 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-알라닌-OH, 6.61 g, 21.2 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(14.1 mL, 80.7 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(7.40 mL, 42.5 mmol)의 용액으로 처리하였다(1:4, 1 x 20분, 1 x 250 mL). 이어서, 수지를 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 220 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(220 mL) 중 N2,N6-비스(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-L-리신(Fmoc-리신(Fmoc)-OH, 18.8 g, 31.8 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 11.3 g, 31.8 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(9.98 mL, 57.3 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 220 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(220 mL) 중 3,5-비스(((터트-부톡시카보닐)아미노)메틸)벤조산(6, 24.2 g, 63.7 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 22.6 g, 63.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(20.0 mL, 115 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(10 x 250 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(400 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(2 x 200 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올 90:10)로 정제하여 (S)-3-(2,6-비스(3,5-비스(((터트-부톡시카보닐)아미노)메틸)벤즈아미도)헥산아미도)프로판산(8)을 백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 16.3 g(82%). RF(SiO2, 디클로로메탄/메탄올 90:10): 0.30. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.75-7.35 (m, 6 H); 7.26-7.19 (m, 2 H); 7.13 (bs, 1 H); 5.61-5.35 (m, 4 H); 4.76-4.61 (m, 1 H); 4.25-4.08 (m, 8 H); 3.60-3.26 (m, 4 H); 2.60-2.45 (m, 2 H); 2.02-1.85 (m, 1 H); 1.85-1.69 (m, 1 H); 1.62-1.51 (m, 2 H); 1.46-1.39 (m, 38 H). LC-MS: 942.1(M+H)+.
전술한 화합물(8, 16.1 g, 17.3 mmol)을 트리플루오로아세트산(80 mL)에 용해시키고 30분 동안 방치하였다. 용매를 1/3 부피까지 농축시키고 디에틸 에테르/시클로헥산 혼합물(1:1, 300 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 (S)-((((6-((2-카복시에틸)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디일)비스(아자네디일))비스(카보닐))비스(벤젠-5,1,3-트리일))테트라메탄아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트(9)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 16.5 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 8.09 (dd, J=9.4 and 1.5 Hz, 4 H); 7.84 (d, J=10.5 Hz, 2 H); 4.76 (dd, J=8.2 and 6.1 Hz, 1 H); 4.36 (s, 4 H); 4.35 (s, 4 H); 3.60-3.43 (m, 4 H); 2.64 (t, J=6.5 Hz, 2 H); 2.00-1.80 (m, 2 H); 1.77-1.65 (m, 2 H); 1.57-1.48 (m, 2 H). LC-MS: 541.6(M+H)+.
톨루엔/에탄올 혼합물(1:1, 480 mL) 중 4-카복시-3-플루오로페닐보론산(10, 30.0 g, 163 mmol) 및 피나콜(21.2 g, 179 mmol)의 현탁액을 24시간 동안 환류시켰다. 이어서, 용매를 증발시키고 디클로로메탄과 함께 3회 증발시켜 2-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(11)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 43.3 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 7.60 (t, J=7.3 Hz, 1 H); 7.39 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 7.24 (d, J=10.6 Hz, 1 H); 1.29 (s, 12 H).
전술한 산(11, 35.2 g, 132 mmol)을 테트라히드로푸란(1:1, 600 mL)에 용해시킨 후, 1-히드록시-피롤리딘-2,5-디온(HOSu, 25.2 g, 219 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 42.0 g, 219 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(400 mL)에 용해시키고 물(2 x 300 mL) 및 염수(1 x 300 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물(1:4, 600 mL)로부터 침전시켰다. 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(12)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 45.2 g(94%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.07 (t, J=7.3 Hz, 1 H); 7.71 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 7.60 (d, J=10.8 Hz, 1 H); 2.90 (s, 4 H); 1.32 (s, 12 H).
(S)-((((6-((2-카복시에틸)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디일)비스(아자네디일))비스(카보닐))비스(벤젠-5,1,3-트리일))테트라메탄아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트(9, 3.91 g, 3.92 mmol)를 물/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(1:1, 80 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(6.15 mL, 35.3 mmol) 및 활성화된 에스테르(12, 5.69 g, 15.7 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(2 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 테트라히드로푸란(70 mL) 중 피나콜(0.06 g, 0.49 mmol)로 처리하고 테트라히드로푸란으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 진공에서 건조시켜 표제 화합물(13)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.82 g(95%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.01-8.83 (m, 4 H); 8.51-8.42 (m, 1 H); 8.39-8.30 (m, 1 H); 8.10-8.00 (m, 1 H); 7.80-7.31 (m, 18 H); 4.59-4.33 (m, 9 H); 3.30-3.19 (m, 4 H); 2.39 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 1.80-1.67 (m, 2 H); 1.59-1.49 (m, 2 H); 1.41-1.21 (m, 50 H). LC-MS: 566.6((M-4 x 피나콜-4 x H2O)/2+H)+.
실시예 13: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3,5-비스((2-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00130
3,5-비스(아미노메틸)벤조산 디히드로클로라이드(2, 1.88 g, 7.43 mmol)를 물(20 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(10.4 mL, 59.5 mmol), N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(1, 5.40 g, 14.8 mmol)를 첨가하였다.
혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액(200 mL)으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(1.24 g, 10.5 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(3 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 이어서, 시클로헥산(190 mL)을 첨가하고, 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조산(3)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.38 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.95 (bs, 1 H); 9.05-8.97 (m, 2 H); 7.82 (s, 2 H); 7.64 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 7.56-7.49 (m, 3 H); 7.44-7.37 (m, 2 H); 4.55-4.47 (m, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 677.5(M+H)+, 595.3(M+H-피나콜)+, 513.3(M+H-2 x 피나콜)+.
전술한 산(3, 4.37 g, 6.48 mmol)을 아세토니트릴/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(4:1, 100 mL)에 용해시키고 N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.89 g, 7.77 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0°C까지 냉각시킨 다음, N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 1.60 g, 7.77 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(2 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하였다. 백색 분말을 테트라히드로푸란(100 mL)에 용해시켰다. 피나콜(0.19 g, 1.60 mmol) 및 황산마그네슘(10 g)을 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(170 mL)을 용액에 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(4)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 3.99 g(80%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.07 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 7.96 (s, 2 H); 7.75 (s, 1 H); 7.65 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 7.53 (d, J=7.7 Hz, 2 H); 7.41 (d, J=10.4 Hz, 2 H); 4.61-4.48 (m, 4 H); 2.89 (s, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 774.6(M+H)+, 692.4(M+H-피나콜)+, 610.3(M+H-2 x 피나콜)+.
실시예 14:
Figure 112021111337418-pct00131
베타-알라닌, Fmoc-리신 및 피나콜 4-카복시-2-플루오로페닐보로네이트로부터 고체상 펩티드 합성에 의해 제조되었다
실시예 15: 2,5-디옥시피롤리딘-1-일 (R)-3-(2,4-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)부탄아미도)프로파노에이트
Figure 112021111337418-pct00132
L-2,4-디아미노부티르산 디히드로클로라이드(1, 4.81 g, 25.2 mmol)를 물(80 mL) 중탄산나트륨(10.6 g, 126 mmol)의 용액에 현탁시켰다. 투명한 용액이 형성될 때까지 혼합물을 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 1,4-디옥산(80 mL) 및 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐옥시)숙신이미드(20.4 g, 60.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 5 M 염산 수용액으로 산성화시켰다. 1,4-디옥산을 증발시키고, 수성상을 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 물(3 x 100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 고온의 에틸 아세테이트/시클로헥산 혼합물로부터 2회 재결정화하였다. 생성물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 (R)-2,4-비스((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)부탄산(2)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 13.3 g(94%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.62 (bs, 1 H); 7.94-7.83 (m, 4 H); 7.79-7.55 (m, 5 H); 7.46-7.26 (m, 9 H); 4.34-4.13 (m, 6 H); 4.08-3.94 (m, 1 H); 3.14-3.02 (m, 2 H); 1.98-1.84 (m, 1 H); 1.84-1.65 (m, 1 H). LC-MS: 562.6(M+H)+.
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100 내지200 메쉬 1.5 mmol/g(3, 5.84 g, 8.75 mmol)을 건조 디클로로메탄(70 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(50 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-알라닌-OH, 1.82 g, 5.84 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(3.86 mL, 22.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(2.03 mL, 11.7 mmol)의 용액으로 처리하였다(1:4, 1 x 10분, 1 x 50 mL). 이어서, 수지를 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 (R)-2,4-비스((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)부탄산(2, 6.57 g, 11.7 mmol), 에틸 시아노-글리옥실레이트-2-옥심(OXYMA, 1.66 g, 11.7 mmol), N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC, 1.81 mL, 11.7 mmol) 및 2,4,6-콜리딘(3.09 mL, 23.4 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2.5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(2 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(4, 8.48 g, 23.4 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(7.32 mL, 42.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(3 x 60 mL) 및 디클로로메탄(10 x 60 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2시간 동안 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올/디클로로메탄 혼합물(1:2, 90 mL)로 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 50 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 물(2 x 80 mL) 및 염수(1 x 80 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발건조시켜 (R)-3-(2,4-비스(3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)부탄아미도)프로판산(5)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.25 g(81%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 12.11 (bs, 1 H); 8.69 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 8.63-8.52 (m, 1 H); 8.14-8.03 (m, 1 H); 7.81-7.61 (m, 5 H); 7.56 (d, J=10.5 Hz, 1 H); 4.54-4.39 (m, 1 H); 3.44-3.17 (m, 4 H); 2.43-2.33 (m, 2 H); 2.14-1.99 (m, 1 H); 1.99-1.85 (m, 1 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 521.0(M-2 x 피나콜+H)+, 603.1(M-피나콜+H)+, 685.3(M+H)+.
전술한 산(5, 3.24 g, 4.73 mmol)을 디클로로메탄(50 mL)에 용해시킨 후, N-히드록시숙신이미드(0.65 g, 5.67 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(1.09 g, 5.67 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 다음, 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 물(2 x 80 mL) 및 염수(1 x 80 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발건조시켜 표제 화합물(6)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.42 g(92%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.72 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 8.57 (t, J=5.4 Hz, 1 H); 8.22 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 7.77-7.62 (m, 5 H); 7.56 (d, J=10.1 Hz, 1 H); 4.53-4.40 (m, 1 H); 3.48-3.27 (m, 4 H); 2.86 (t, J=7.1 Hz, 2 H); 2.80 (s, 4 H); 2.15-2.02 (m, 1 H); 2.02-1.88 (m, 1 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 618.1(M-2 x 피나콜+H)+, 700.2(M-피나콜+H)+, 782.4(M+H)+.
실시예 16: 3-(3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산
Figure 112021111337418-pct00133
3-브로모-5-요오드벤조산(1, 16.4 g, 50.0 mmol)을 메탄올(100 mL)에 현탁시키고 메탄술폰산(1 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60°C(오일조)에서 16시간 동안 교반하였다. 생성된 투명한 용액을 냉동고에서 -20°C까지 16시간 동안 냉각시키고, 생성된 고형분을 여과로 수집하고, 냉각된(-20°C) 메탄올로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(2)를 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 13.9 g(82%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.30 (s, 1 H); 8.14 (s, 1 H); 8.04 (s, 1 H); 3.93 (s, 1 H).
1,3-디브로모-5-플루오로벤젠(3, 6.30 mL, 50.0 mmol)을 건조 디에틸 에테르(150 mL)에 용해시키고 -78°C까지 냉각시켰다. 헥산 중 2.35 M n-부틸리튬(22.0 mL, 52.5 mmol)을 교반하면서 적가하였다. 15분 후, 건조 N,N-디메틸포름아미드(7.70 mL, 100 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 실온으로 가온시켰다. 1시간 후, 반응 혼합물을 1 M 염산 수용액(150 mL)으로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발시켜 3-브로모-5-플루오로벤즈알데히드(4)를 황색 오일로서 수득하고, 이를 냉동고에 보관하여 고형화시켰다. 수율: 10.2 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 9.92 (s, 1 H); 7.80 (bs, 1 H); 7.50 (bs, 2 H).
메틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(2, 6.80 g, 20.0 mmol)를 질소 대기 하에 건조 테트라히드로푸란(50 mL)에 용해시키고, -40°C까지 냉각시켰다. 테트라히드로푸란(16.1 mL, 21.0 mmol) 중 1.3 M 이소프로필마그네슘 염화물-리튬 염화물 복합체를 첨가 깔때기를 통해 적가하였다. 30분 후, 3-브로모-5-플루오로벤즈알데히드(4)(4.87 g, 24.0 mmol)를 건조 테트라히드로푸란(5 mL)과 함께 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간에 걸쳐 실온까지 가온시키고, 실온에서 1시간 더 교반하였다. 0.5 M 염산 수용액(50 mL)을 첨가하여 반응물을 급냉시키고 디에틸 에테르(1 x 200 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물 5를 건조 디클로로메탄(100 mL)에 용해시키고 피리디늄 클로로크로메이트(PCC, 6.45 g, 30.0 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 밤새(16시간) 교반하고, 2-프로판올(3 mL)로 급냉시켰다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트 S로 상단을 채운 실리카 겔 플러그(100 g)를 통해 여과하고, 디클로로메탄(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/디클로로메탄 6:1 내지 2:1)로 정제하여 메틸 3-브로모-5-(3-브로모-5-플루오로벤조일)벤조에이트(6)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.10 g(85%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.43 (s, 1 H); 8.30 (s, 1 H); 8.11 (s, 1 H); 7.71 (s, 1 H); 7.53 (d, J=7.6 Hz, 1 H); 7.41 (d, J=8.3 Hz, 1 H); 3.97 (s, 3 H).
LC-MS: 분자 오일이나 단편은 검출되지 않았다.
250 mL의 반응 용기를 아세트산칼륨(6.70 g, 68.4 mmol)으로 채우고, 염을 진공 하 110°C에서 1시간 동안 건조시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 용기를 질소로 다시 채우고 메틸 3-브로모-5-(3-브로모-5-플루오로벤조일)벤조에이트(6, 7.10 g, 481 mol), 팔라듐 아세테이트(77.0 mg, 342 mol), 2-디시클로헥실포스피노-2,4,6-트리이소프로필비페닐(XPhos, 325 mg, 684 mol) 및 비스(피나콜라토)디보론(9.53 mg, 37.6 mmol)으로 채웠다. 이어서, 반응 용기를 배기하고 질소로 다시 채우고(이 절차를 2회 반복함), 무수 테트라히드로푸란(3 mL)을 주사기로 첨가하고. 용기를 플라스틱 스토퍼로 밀봉하고 60°C까지 예열된 가열 수조에 잠기게 하였다. 16시간 동안(밤새) 400 rpm으로 교반한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 디클로로메탄(100 mL)으로 희석하고, 셀라이트 S를 상단에 채운 실리카(70 g)의 짧은 플러그를 통해 디클로로메탄(3 x 70 mL)과 함께 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축시켜 황백색 왁스 발포체로서 생성물을 수득하고, 이를 얼음-냉각 n-헥산(70 mL)으로 분쇄하여 결정화를 유발하였다. 생성된 고형분을 여과로 수집하고 진공에서 건조시켜 메틸 3-(3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.10 g(88%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.69 (s, 1 H); 8.48 (s, 1 H); 8.38 (s, 1 H); 7.97 (s, 1 H); 7.72 (d, J=8.5 Hz, 1 H); 7.54 (d, J=9.0 Hz, 1 H); 3.95 (s, 3 H); 1.36 (s, 12 H); 1.35 (s, 12 H). LC-MS: 511.6(M+H)+.
메틸 3-(3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7, 7.10 g, 13.9 mmol)를 메탄올(42 mL) 및 물(13 mL)에 현탁시켰다. 수산화리튬(2.91 g, 69.5 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 물(120 mL)로 희석하고 디에틸 에테르(70 mL)로 추출하였다. 에테르 층을 버리고, 수성층을 농축 염산(10 mL)으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(100 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 고온 에틸 아세테이트(80 mL)에 용해시키고, 투명한 용액이 수득될 때까지 피나콜을 첨가하였다. 용액을 증발건조시킨 후, 디클로로메탄(2 x 40 mL)으로부터 2회 증발시켜 표제 3-(3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산
(8)을 무색 고체로서 수득하였다. 화합물은 제거할 수 없었던 잔류 피나콜을 함유한다. 수율: 6.82 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.77 (s, 1 H); 8.54 (t, J=1.8 Hz, 1 H); 8.44 (d, J=1.1 Hz, 1 H); 7.98 (s, 1 H); 7.80-7.68 (m, 1 H); 7.63-7.50 (m, 1 H); 1.37 (s, 12 H); 1.35 (s, 12 H). LC-MS: 497.5(M+H)+, 415.4(M-피나콜+H)+.
실시예 17: (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 3,5-비스[[[4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일]아미노]메틸]벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00134
3,5-비스((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조산(1, 2.57 g, 4.00 mmol)을 아세토니트릴/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(3:1, 100 mL)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(0.55 g, 4.80 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0°C까지 냉각시킨 다음, N,N-디시클로헥실카보디이미드(0.99 g, 4.80 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(2 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔(10 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(2)을 백색 분말로서 수득하였다. 생성물에는 미량의 N,N-디시클로헥실우레아가 함유되어 있다. 수율: 2.85 g(97%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.24 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 7.95-7.83 (m, 6 H); 7.79-7.70 (m, 5 H); 4.60-4.52 (m, 4 H); 2.87 (s, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 737.4(M+H)+, 655.2(M+H-피나콜)+, 573.1(M+H-2 x 피나콜)+.
실시예 18: N2,N6-비스(6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카보닐)-L-리신
Figure 112021111337418-pct00135
6-플루오로-1-히드록시-1.3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실산(1, 6.00 g, 30.6 mmol)을 테트라히드로푸란(80 mL)에 용해시켰다. N,N-디메틸포름아미드(10 mL), N-히드록시숙신이미드(3.87 g, 33.7 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(6.46 g, 33.7 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(200 mL)에 재용해시키고, 1 M 염산 수용액(2 x 60 mL)으로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨을 사용하여 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실레이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.35 g(93%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.65 (s, 1 H); 8.11 (d, J=5.9 Hz, 1 H); 7.71 (d, J=10.1 Hz, 1 H); 5.08 (s, 2 H); 2.90 (s, 4 H). LC-MS: 294.4(M+H)+.
L-리신 히드로클로라이드(3, 1.56 g, 8.50 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 및 물(25 mL)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(8.92 mL, 51.2 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카복실레이트(2, 5.00 g, 17.0 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 3시간 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 1 M 염산 수용액으로 침전시켰다. 침전물을 물로 세척하고, 아세토니트릴/물 혼합물로부터 침전으로 정제하고, 원심분리로 수집하고 동결건조시켜 N2,N6-비스(6-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-5-카보닐)-L-리신(4)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.25 g(76%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.66 (bs, 1 H); 9.41 (d, J=5.7 Hz, 2 H); 8.59 (d, J=7.2 Hz, 1 H); 8.39 (t, J=5.0 Hz, 1 H); 7.61-7.53 (m, 2 H); 7.53-7.44 (m, 2 H); 4.97 (d, J=5.7 Hz, 4 H); 4.41-4.30 (m, 1 H); 3.30-3.20 (m, 2 H); 1.90-1.70 (m, 2 H); 1.59-1.38 (m, 4 H). LC-MS: 503.5(M+H)+.
실시예 19: (S)-2,3-비스(4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판산
Figure 112021111337418-pct00136
물(400 mL) 중 메틸 4-(브로모메틸)-3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(1, 23.0 g, 61.7 mmol) 및 수산화나트륨(12.3 g, 0.31 mol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 6 M의 염산 수용액(60 mL, 6 M)을 반응 혼합물에 첨가하여 백색 침전물을 생성하였다. 침전물이 있는 플라스크를 1시간 동안 냉장고에 보관하였다. 이어서, 이를 여과하고 여과 케이크를 물(200 mL)로 세척하고 동결건조시켜 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(2)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 12.1 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.24 (bs, 1 H), 9.58 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.73 (d, J=9.9 Hz, 1 H), 5.14 (s, 2 H).
4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(2, 4.00 g, 20.4 mmol), N-히드록시숙신이미드(2.35 g, 20.4 mmol) 및 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 히드로클로라이드(3.91 g, 20.4 mmol)을 테트라히드로푸란(120 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(20 mL) 중에서 3.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트(3 x 150 mL) 및 1 M 염산 수용액(150 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(3)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.68 g(97%). LC-MS: 294.3(M+H)+.
N,N-디메틸포름아미드(100 mL) 및 물(10 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(3, 5.10 g, 17.4 mmol), (S)-2,3-디아미노프로판산 히드로클로라이드(4, 1.22 g, 8.70 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(9.28 mL, 52.2 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트(2 x 250 mL) 및 1 M 염산 수용액(150 mL)으로 추출하고, 유기층을 염수(200 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 (S)-2,3-비스(4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판산(5)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.53 g(88%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.82 (bs, 1 H); 9.54 (d, J=6.2 Hz, 2 H); 8.86 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 8.78 (t, J=6.0 Hz, 1 H); 8.10 (s, 1 H); 8.04 (s, 1 H); 7.80-7.63 (m, 2 H); 5.13 (d, J=6.2 Hz, 4 H); 4.77-4.62 (m, 1 H); 3.91-3.77 (m, 1 H); 3.77-3.62 (m, 1 H). LC-MS: 461.3(M+H)+.
실시예 20: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00137
3-브로모-5-요오드벤조산(1, 5.00 g, 15.3 mmol)을 무수 디클로로메탄(100 mL)에 용해시키고, 터트-부탄올(1.52 mL, 16.1 mmol), N,N'-디시클로헥실카보디이미드(3.31 mL, 16.1 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(1.96 mL, 16.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 1 M 염산 수용액(2 x 50 mL) 및 염수(1 x 40 mL)로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 10:1)로 정제하여 터트-부틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.67 g(80%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.22 (s, 1 H); 8.06 (s, 1 H); 8.00 (s, 1 H); 1.58 (s, 9 H).
터트-부틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(2, 4.31 g, 11.3 mmol)를 질소 대기 하에 무수 테트라히드로푸란(50 mL)에 용해시키고, -40°C까지 냉각시켰다. 테트라히드로푸란(9.52 mL, 12.4 mmol) 중 1.3 M 이소프로필마그네슘 염화물-리튬 염화물 복합체를 서서히 적가하였다. 40분 후, 건조 테트라히드로푸란(5 mL)과 함께 5-브로모-2,4-디플루오로벤즈알데히드(3, 2.86 g, 12.9 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새(16시간) 실온까지 가온시켰다. 0.5 M 염산 수용액(15 mL)을 첨가하여 반응물을 급냉시키고 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(40 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 10:1)로 정제하여 터트-부틸 3-브로모-5-((5-브로모-2,4-디플루오로페닐)(히드록시)메틸)벤조에이트(4)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.38 g(81%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.02 (t, J=1.6 Hz, 1 H); 7.92 (s, 1 H); 7.77-7.65 (m, 2 H); 6.89 (dd, J=9.7 and 8.3, 1 H); 6.09 (d, J=3.9 Hz, 1 H); 2.43 (d, J= 4.0 Hz, 1 H); 1.68-1.58 (m, 9 H).
터트-부틸 3-브로모-5-((5-브로모-2,4-디플루오로페닐)(히드록시)메틸)벤조에이트(4)를 건조 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고, 피리디늄 클로로크로메이트(PCC, 2.96 g, 13.7 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 밤새(16시간) 교반하고, 2-프로판올(1.5 mL)로 급냉시켰다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트의 짧은 플러그(5 g)를 통해 여과하고, 디클로로메탄(50 mL)으로 세척하였다. 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 20:1)로 정제하여 터트-부틸 3-브로모-5-(5-브로모-2,4-디플루오로페닐)벤조에이트(5)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.20 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.33 (t, J= 1.7 Hz, 1 H); 8.28-8.24 (m, 1 H); 8.10-8.07 (m, 1 H); 7.86 (t, J=7.3 Hz, 1 H); 7.03 (dd, J=9.3 and 8.1 Hz, 1 H); 1.61 (s, 9 H).
터트-부틸 3-브로모-5-(5-브로모-2,4-디플루오로벤조일)벤조에이트(5, 4.20 g, 8.82 mmol), 팔라듐 아세테이트(59.0 mg, 0.26 mmol), 2-디시클로헥실포스피노-2,4,6-트리이소프로필비페닐(XPhos, 252 mg, 0.52 mmol), 아세트산칼륨(3.46 g, 35.3 mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(4.70 g, 18.5 mmol)을 반응 플라스크에서 혼합하고, 생성된 혼합물을 비우고 아르곤과 함께 다시 채웠다(이 과정을 2회 반복하였음). 무수 테트라히드로푸란(60 mL)을 주사기로 첨가하고, 용기를 고무 격막으로 밀봉하고, 60°C까지 예열된 가열 수조에 잠기게 하였다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 시클로헥산(100 mL)으로 희석하고, 디클로로메탄(100 mL)와 함께 셀라이트의 짧은 플러그를 통해 여과하였다. 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 10:1)로 정제하여 터트-부틸 3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6)를 황색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.78 g(95%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.61 (s, 1 H); 8.41 (d, J=1.5 Hz, 1 H); 8.34 (s, 1 H); 8.05 (dd, J=8.3 and 6.7 Hz, 1 H); 6.96-6.81 (m, 1 H); 1.61 (s, 9 H); 1.36 (d, J= 2.2 Hz, 24 H).
터트-부틸 3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6, 4.78 g, 8.38 mmol)를 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 트리플루오로아세트산(40 mL)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(4 x 50 mL)과 함께 증발시켰다. 생성된 3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(7)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 수율: 4.10 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.75 (s, 1 H); 8.50 (t, J=1.7 Hz, 1 H); 8.46 (s, 1 H); 8.09 (dd, J=8.4 and 6.8 Hz, 1 H); 6.95-6.83 (m, 1 H); 1.37 (d, J= 1.8 Hz, 24 H).
3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(7, 4.10 g, 8.00 mmol)을 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드(1.29 g, 11.2 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(2.14 g, 11.2 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 6시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 10% 중황산칼륨 수용액(2 x 100 mL) 및 염수(30 mL)로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨을 사용하여 건조시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2,4-디플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(8)를 황색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.84 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.81-8.75 (m, 1 H); 8.57-8.51 (m, 1 H); 8.47 (s, 1 H); 8.08 (dd, J=8.5 and 6.7 Hz, 1 H); 6.89 (dd, J=9.9 and 9.0 Hz, 1 H); 2.92 (bs, 4 H); 1.36 (s, 24 H). LC-MS: 448.4(M-2피나콜+H)+.
실시예 21: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3,5-비스((2-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00138
3,5-비스(아미노메틸)벤조산 디히드로클로라이드(2, 1.88 g, 7.43 mmol)를 물(20 mL)에 용해시켰다. 이어서, N,N-디이소프로필에틸아민(10.4 mL, 59.5 mmol), N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(1, 5.40 g, 14.8 mmol)를 첨가하였다.
혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1 M 염산 수용액(200 mL)으로 산성화시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 3회 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/톨루엔 혼합물(1:1, 100 mL)에 용해시키고 피나콜(1.24 g, 10.5 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 톨루엔으로부터 3회 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 용해시키고 물(3 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 생성물이 침전되기 시작하였다. 이어서, 시클로헥산(190 mL)을 첨가하고, 침전물을 여과로 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 3,5-비스((3-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤즈아미도)메틸)벤조산(3)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.38 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.95 (bs, 1 H); 9.05-8.97 (m, 2 H); 7.82 (s, 2 H); 7.64 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 7.56-7.49 (m, 3 H); 7.44-7.37 (m, 2 H); 4.55-4.47 (m, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 677.5(M+H)+, 595.3(M+H-피나콜)+, 513.3(M+H-2 x 피나콜)+.
전술한 산(3, 4.37 g, 6.48 mmol)을 아세토니트릴/N,N-디메틸포름아미드 혼합물(4:1, 100 mL)에 용해시키고 N-히드록시숙신이미드(HOSu, 0.89 g, 7.77 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0°C까지 냉각시킨 다음, N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 1.60 g, 7.77 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 부산물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)에 용해시키고 물(2 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(170 mL)을 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하였다. 백색 분말을 테트라히드로푸란(100 mL)에 용해시켰다. 피나콜(0.19 g, 1.60 mmol) 및 황산마그네슘(10 g)을 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(170 mL)을 용액에 첨가하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 시클로헥산으로 세척하고, 진공에서 건조시켜 표제 화합물(4)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 3.99 g(80%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.07 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 7.96 (s, 2 H); 7.75 (s, 1 H); 7.65 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 7.53 (d, J=7.7 Hz, 2 H); 7.41 (d, J=10.4 Hz, 2 H); 4.61-4.48 (m, 4 H); 2.89 (s, 4 H); 1.31 (s, 24 H). LC-MS: 774.6(M+H)+, 692.4(M+H-피나콜)+, 610.3(M+H-2 x 피나콜)+.
실시예 22: (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리신
Figure 112021111337418-pct00139
1,3-디브로모-5-(트리플루오로메틸)벤젠(1, 13.1 g, 43.1 mmol)을 디메틸 술폭시드/물(10:1, 70 mL) 혼합물 중 구리(II) 황산염 5수화물(541 mg, 2.36 mmol) 및 수산화칼륨(9.24 g, 216 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 반응 플라스크를 질소로 채우고, 마지막에 1,2-에탄디티올(6.00 mL, 90.5 mmol)을 격막을 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 110°C로 밤새 가열하였다. 이어서, 1 M 염산 수용액으로 pH = 2까지 혼합물을 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 후, 감압 하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산)로 정제하여 3-브로모-5-(트리플루오로메틸)벤젠티올(2)을 백색 오일로서 수득하였다. 수율: 5.76 g(52%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.61 (s, 1 H); 7.56 (s, 1 H); 7.46 (s, 1 H); 3.66 (s, 1　H).
3-브로모-5-(트리플루오로메틸)벤젠티올(2, 5.76 g, 22.4 mmol), 메틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(3, 5.09 g, 14.9 mmol), 탄산칼륨(2.95 g, 24.8 mmol) 및 요오드화구리(I)(410 mg, 2.49 mmol)를 건조 디메톡시에탄(44 mL)에 용해시켰다. 반응 플라스크를 48시간 동안 80°C로 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 셀라이트를 통해 여과한 다음, 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 1:0 내지 20:1)로 정제하여 메틸 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)티오)벤조에이트(4)를 황색 오일로서 수득하였다. 수율: 6.64 g(63%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.82 (m, 1 H); 7.68 (m, 3 H); 7.52 (m, 1 H); 2.54 (s, 3 H).
메틸 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)티오)벤조에이트(4, 6.64 g, 14.1 mmol) 및 옥손(Oxone, 8.20 g, 35.3 mmol)을 메탄올(30 mL)에 현탁시키고 물(10 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 에틸 아세테이트(50 mL)로 혼합물을 희석하고, 물(1 L)로 세척한 다음 염수(100 mL)로 세척하였다. 유기상을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1 내지 3:1)로 정제하여 메틸 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트(5)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.46 g(77%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.53 (m, 1 H); 8.43 (m, 1 H); 8.27 (m, 2 H); 8.15 (m, 1 H); 8.00 (m, 1 H); 4.00 (s, 3 H).
메틸 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트(5, 5.46 g 10.9 mmol) 및 수산화리튬 일수화물(1.33 g, 31.7 mmol)을 메탄올/물/테트라히드로푸란(4:2:5, 35 mL)의 혼합물에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이 시간 후, 1 M 염산 수용액으로 pH 2로 혼합물을 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모든 휘발성 물질을 증발시킨 후, 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조산(6)을 백색 고형분으로서 수득하였다. 수율: 5.10 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6 δH): 13.91 (bs, 1 H); 8.68 (s, 2 H); 8.50 (s, 1 H); 8.45 (s, 1 H); 8.41 (s, 1 H); 8.32 (s, 1 H).
건조 N,N-디메틸포름아미드(130 mL) 중 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(V)(HATU, 4.40 g, 11.6 mmol)와 혼합된 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조산(6, 5.10 g, 10.5 mmol)을 30분 동안 교반한 후, 트리에틸아민(7.5 ml, 52.3 mmol)을 첨가한 다음, 글리신 터트-부틸 에스테르 히드로클로라이드(3.51 g, 20.9 mmol)를 첨가하고, 밤새 교반하였다. 반응 종료 후 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(150 mL)로 추출한 후, 감압 하에서 모든 휘발성 물질을 증발시킨 다음, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 3:1)로 정제하여 터트-부틸 (3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리시네이트(7)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.30 g(99%). LC-MS: 602.3(M+H)+.
100 mL의 반응 플라스크를 아세트산칼륨(5.13 g, 26.1 mmol)으로 채우고, 염을 진공 하 110°C에서 1시간 동안 건조시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 플라스크를 질소로 다시 채우고 터트-부틸 (3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리시네이트(7, 6.30 g, 10.5 mmol), 팔라듐 아세테이트(120 mg, 0.52 mmol), 2-디시클로헥실포스피노-2,4,6-트리이소프로필비페닐(XPhos, 500 mg, 1.04 mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(5.9 g, 23.03 mmol)으로 채웠다. 이어서, 반응 플라스크를 배기하고 질소로 다시 채우고(이 절차를 2회 반복함), 무수 테트라히드로푸란(50 mL)을 주사기로 첨가하고. 플라스크를 플라스틱 스토퍼로 밀봉하고 60°C까지 예열하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 후, 실온으로 냉각시키고, 디클로로메탄(150 mL)으로 희석하고, 셀라이트를 상단에 갖는 실리카겔의 짧은 플러그를 통해 여과하고, 디클로로메탄(3 x 50 mL)으로 세척하였다. 여과물을 감압 하에서 농축시켜 터트-부틸 (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리시네이트(8)를 흑색 왁스 발포체로서 수득하였다. 수율: 6.70 g(92%). LC-MS: 640.5(M+H-tBu)+, 558.4(M-피나콜-tBu+H)+, 476.3(M-2피나콜-tBu+H)+.
터트-부틸 (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리시네이트(8, 6.70 g, 10.5 mmol)를 트리플루오로아세트산(25 mL)과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이 시간 후 모든 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 아세트산에틸(50 mL)에 용해시키고, 셀라이트를 얹은 실리카겔의 짧은 플러그를 통해 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축시키고, 오렌지색 경질 발포체를 수득하고, 이를 분쇄하였다. (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조일)글리신(9)을 옅은 오렌지색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.89 g(63%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.57 (m, 3 H); 8.47 (s, 1 H); 8.31 (s, 1 H); 9.26 (s, 1 H); 7.23 (t, 1 H); 4.35 (d, 2 H); 1.38 (s, 1 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.65 (s). LC-MS: 640.5(M+H)+, 558.4(M-피나콜+H)+, 476.3(M-2 x 피나콜+H)+.
실시예 23: N- (5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00140
클로로아세트산(1, 13.0 g, 136 mmol)을 미리 냉각시킨(0oC) 에틸렌디아민(2, 90 mL)에 작은 양으로 나누어 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 밤새(16시간) 실온에 도달시켰다. 에틸렌디아민을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 디메틸 술폭시드(140 mL)로 분쇄하고 밤새 교반하였다. 여과로 침전물을 수집하고, 디메틸 술폭시드(2 x 60 mL), 아세토니트릴(3 x 100 mL) 및 디에틸 에테르(3 x 100 mL)로 세척하여 (2-아미노에틸)글리신(3)을 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 13.2 g(83%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, D2O, δH): 3.27 (s, 2 H); 3.05-3.01 (m, 2 H); 2.92-2.88 (m, 2 H).
아세토니트릴(300 mL) 중 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(9.39 g, 51.0 mmol), 5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(4, 10.0 g, 51.0 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 10.5 g, 51.0 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 아세토니트릴로 세척하고 증발시켰다. 미정제 생성물 5를 디클로로메탄/헥산의 혼합물(9:1, 500 mL)로부터의 결정화로 정제하여 펜타플루오로페닐 5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(5)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.80 g(37%). LC-MS: 363.2(M+H)+.
N,N-디메틸포름아미드(80 mL) 중 펜타플루오로페닐 5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(5, 6.80 g, 18.8 mmol), (2-아미노에틸)글리신(3, 1.10 g, 9.39 mmol) 및 트리에틸렌아민(10.5 mL, 75.1 mmol)의 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트(2 x 500 mL) 및 1 M 염산 수용액(400 mL)으로 추출하고, 유기층을 염수(300 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물 6을 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:2:0.5 내지 100:10:0.5)로 정제하고 동결건조시켜 N-(5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)-N-(2-(5-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신(6)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 2.16 g(49%). RF(SiO2, 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:2:0.5): 0.30. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.86 (bs, 1 H); 9.45-9.17 (m, 2 H); 8.48-8.11 (m, 1 H); 8.11-7.88 (m, 1 H); 7.65 (d, J=7.0 Hz, 1 H); 7.43-7.15 (m, 2 H); 4.99 (d, J=8.6 Hz, 4 H); 4.36-3.90 (m, 2 H); 3.80-3.34 (m, 4 H). LC-MS: 475.4(M+H)+.
실시예 24: 4-((3S,4S)-3,4-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산
Figure 112021111337418-pct00141
1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(1, 13.5 g, 54.9 mmol), N-히드록시숙신이미드(6.31 g, 54.9 mmol) 및 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 히드로클로라이드(10.5 g, 54.9 mmol)을 테트라히드로푸란(270 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중에서 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트(3 x 300 mL) 및 1 M 염산 수용액(200 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 18.8 g(100%). LC-MS: 344.3(M+H)+.
N,N-디메틸포름아미드(240 mL) 및 물(60 mL) 중 4-((3S,4S)-3,4-디아미노피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산 디히드로클로라이드(3, 2.74 mg, 10.0 mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2, 6.86 mg, 20.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(11.0 mL, 60.0 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:2:0.5 내지 100:10:0.5)로 정제하고, 동결건조시켜 4-((3S,4S)-3,4-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산(4)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 2.56 g(39%). RF(SiO2, 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:10:0.5): 0.3. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH) 11.73 (bs, 1 H); 9.62 (s, 2 H); 9.01 (dd, J=10.4 and 7.2 Hz, 2 H); 8.49 (s, 2 H); 8.24 (s, 2 H); 5.20 (s, 4 H); 4.94-4.51 (m, 2 H); 4.16-3.94 (m, 1 H); 3.95-3.80 (m, 1 H); 3.56-3.44 (m, 1 H); 3.41-3.34 (m, 1 H); 2.49-2.40 (m, 4 H). LC-MS: 658.7(M+H)+.
실시예 25: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(디플루오로(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00142
메틸 3-브로모-5-요오드벤조에이트(1, 6.80 g, 20.0 mmol)를 건조 테트라히드로푸란(40 mL)에 용해시키고, -30°C까지 냉각시켰다. 테트라히드로푸란(16.2 mL, 21.0 mmol) 중 1.3 M 이소프로필마그네슘 염화물-리튬 염화물 복합체의 용액을 교반하며 적가하였다. 30분 후, 3-브로모-5-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드(2, 6.00 g, 24.0 mmol)를 건조 테트라히드로푸란(10 mL)과 함께 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온시키고, 1시간 후에 1 M 염산 수용액(40 mL)을 첨가하여 급냉시켰다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르(150 mL)에 넣고, 물(150 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물(3)을 건조 디클로로메탄(80 mL)에 용해시키고, 피리디늄 클로로크로메이트(6.42 g, 30.0 mmol)를 교반하면서 첨가하였다. 17시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 상단을 채운 실리카 플러그(80 g)를 통해 여과하고, 베드를 디클로로메탄(3 x 120 mL)으로 세척하였다. 황색의 용액을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 메탄올(50 mL) 중에서 16시간 동안 교반하였다. 침전된 고형분을 여과로 수집하고 공기 중에서 건조시켜 메틸 3-브로모-5-(3-브로모-5-(트리플루오로메틸)벤조일)벤조에이트(4)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.52 g(70%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.45 (t, J=1.4 Hz, 1 H); 8.29 (m, 1 H); 8.12 (t, J=1.6 Hz, 1 H); 8.08 (bs, 1 H); 8.04 (bs, 1 H); 7.95 (bs, 1 H); 3.97 (s, 3 H).
메틸 3-브로모-5-(3-브로모-5-(트리플루오로메틸)벤조일)벤조에이트(4, 6.50 g, 13.9 mmol), 및 데옥소-플루오르(Deoxo-Fluor, 13.0 mL)를 100 mL 반응 용기에 채웠다. 용기를 버블러(실리콘 오일로 충진됨)로 밀봉하고, 질소로 퍼징하고, 16시간 동안 90°C로 가열하였다(오일조). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 디클로로메탄(100 mL)으로 희석시켰다. 생성된 용액을 1 M 탄산칼륨 수용액(100 mL)에 서서히 첨가하고, 이상성 혼합물을 1시간 동안 교반하여 과량의 플루오르화 시약을 분해하였다. 층을 분리시키고, 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 30:1 내지 15:1)로 정제하여 메틸 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)디플루오로메틸)벤조에이트(5)를 황색 오일로서 수득하였다. 수율: 6902 mg(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.30 (s, 1 H); 8.08 (s, 1 H); 7.88 (s, 1 H); 7.83 (s, 1 H); 7.81 (s, 1 H); 7.71 (s, 1 H); 3.96 (s, 3 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.87 (s, 3 H); -90.00 (s, 2 H).
500 mL의 반응 용기를 아세트산칼륨(6.83 g, 69.7 mmol)으로 채우고, 염을 진공 하 110°C에서 1시간 동안 건조시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 용기를 질소로 다시 채우고 3-브로모-5-((3-브로모-5-(트리플루오로메틸)페닐)디플루오로메틸) 벤조에이트(5, 6.90 g, 13.9 mmol), 팔라듐 아세테이트(62.0 mg, 279 mol), 2-디시클로헥실포스피노-2,4,6-트리이소프로필비페닐(XPhos, 265 mg, 557 mol) 및 비스(피나콜라토)디보론(838 mg, 30.7 mmol)으로 채웠다. 이어서, 반응 용기를 배기시키고 질소로 다시 채웠다(이 절차를 2회 반복함). 무수 테트라히드로푸란(50 mL)을 주사기로 첨가하고, 용기를 플라스틱 스토퍼로 밀봉하고, 60°C까지 예열된 가열 수조에 잠기게 하였다. 16시간 동안 400rpm에서 교반한 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 디시클로메탄(200 mL)으로 희석하고, 디클로로메탄(3 x 120 mL)와 함께 셀라이트 S를 상단에 채운 실리카의 짧은 플러그(90 g)를 통해 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축시켜 메틸 3-(디플루오로(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6)를 갈색 발포체로서 수득하였다. 이를 메탄올(50 mL) 및 물(15 mL) 및 수산화리튬 일수화물(2.94 g, 70.0 mmol)에 현탁시키고, 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(150 mL)에 넣고 디클로로메탄(2 x 30 mL) 및 디에틸 에테르(30 mL)로 세척하였다. 수성층을 농축 염산 수용액으로 pH = 2로 산성화시키고 에틸 아세테이트(100 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켜 황색 발포체를 수득하였다. 발포체에 피나콜(472 mg, 4.00 mmol)을 첨가하고 아세토니트릴(50 mL) 중에서 밤새 교반하도록 두었다. 침전된 고형분을 여과로 수집하고, 얼음-냉각 아세토니트릴(2 x 20 mL)로 세척하고, 공기 중에서 건조시켜 표제 3-(디플루오로(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(7)을 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.90 g(77%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.64 (s, 1 H); 8.28 (s, 1 H); 8.22 (s, 1 H); 8.15 (s, 2 H); 7.85 (s, 1 H); 1.38 (s, 12 H); 1.37 (s, 12 H). LC-MS: 569.7(M+H)+.
3-(디플루오로(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조산(7, 5.11 g, 9.00 mmol) 및 비스(숙신이미딜)카보네이트(3.22 g, 12.6 mmol)를 질소 분위기 하 무수 아세토니트릴(45 mL) 및 피리딘(1.00 mL, 12.6 mmol)에서 현탁하였다. 반응 혼합물을 히트건으로 부드럽게 가열하여 용해시켰다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 넣고, 0.5 M 탄산수소칼륨 수용액(2 x 40 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켜 회백색 고체를 수득하였다. 혼합물에 피나콜(354 mg, 3.00 mmol)을 첨가하고 아세토니트릴(50 mL) 중에서 밤새 교반하도록 두었다. 침전된 고형분을 여과로 수집하고, 얼음-냉각 아세토니트릴(2 x 20 mL)로 세척하고, 공기 중에서 건조시켜 표제 2,5-디옥시피롤리딘-1-일 3-(디플루오로(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(8)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.36 g(90%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.67 (s, 1 H); 8.29 (s, 1 H); 8.26 (s, 1 H); 8.15 (s, 1 H); 8.10 (s, 1 H); 7.86 (s, 1 H); 2.92 (s, 4 H); 1.36 (s, 24 H). LC-MS: 646.8(M-HF)+.
실시예 26: (S)-2,3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판산
Figure 112021111337418-pct00143
N,N-디메틸포름아미드(400 mL) 및 물(100 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(1, 14.4 g, 42.0 mmol), (S)-2,3-디아미노프로판산 히드로클로라이드(2, 2.81 g, 20.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(21.4 mL, 120 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:2:0.5 내지 100:10:0.5)로 정제하였다. 목적하는 생성물을 갖는 분획을 증발시키고, 1 M 중황산칼륨 수용액(400 mL)으로 세척하였다. 침전물을 여과하고, 아세토니트릴과 물의 혼합물(2:1)에 용해시키고, 동결건조시켜 (S)-2,3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판산(3)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.32 g(39%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.59 (bs, 1 H); 9.62 (d, J=6.1 Hz, 2 H); 9.09 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 8.98 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 8.50 (d, J=14.5 Hz, 2 H); 8.24 (d, J=21.6 Hz, 2 H); 5.20 (d, J=5.7 Hz, 4 H); 4.87-4.58 (m, 1 H); 4.02-3.80 (m, 1 H); 3.79-3.54 (m, 1 H). LC-MS: 561.6(M+H)+.
실시예 27: (3-((3-(펜타플루오로-6-술파닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)술포닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리신
Figure 112021111337418-pct00144
무수 테트라히드로푸란(450 mL) 중 터트-부틸 (3-브로모-5-((3-브로모-5-(펜타플루오로-6-술파닐)페닐)술포닐)벤조일)글리시네이트(1, 8.00 g, 12.1 mmol), 팔라듐 아세테이트(137 mg, 0.61 mmol), 2-디시클로헥실포스피노-2,4,6-트리이소프로필비페닐(XPhos, 577 mg, 1.21 mol), 비스(피나콜라토)디보론(6.78 g, 26.7 mmol) 및 아세트산칼륨(5.95 g, 60.7 mmol)의 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 60°C로 24시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 셀라이트의 짧은 플러그를 통해 여과하였다. 감압 하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/에틸 아세테이트 10:0 내지 6:4)로 정제하여 터트-부틸 (3-((3-(펜타플루오로-6-술파닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)술포닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리시네이트(2)를 회백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 6.70 g(72%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.53-8.49 (m, 2 H); 8.49-8.46 (m, 1 H); 8.43 (t, J=1.9 Hz, 1 H); 8.39-8.36 (m, 1 H); 8.32 (dd, J=2.1 and 0.6 Hz, 1 H); 6.76 (t, J=5.0 Hz, 1 H); 4.16 (d, J=5.0 Hz, 2 H); 1.51 (s, 9 H); 1.36 (s, 24 H). LC-MS: 754.9(M+H)+.
디클로로메탄(100 mL) 및 트리플루오로아세트산(200 mL) 중 터트-부틸 (3-((3-(펜타플루오로-6-술파닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)술포닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리시네이트(2, 6.68 g, 8.87 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄(250 mL)으로부터 10회 증발시킨 후 진공에서 건조시켰다. (3-((3-(펜타플루오로-6-술파닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)술포닐)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조일)글리신(3)을 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.15 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.33 (t, J=5.8 Hz, 1 H); 8.65 (t, J=1.8 Hz, 1 H); 8.55 (t, J=1.9 Hz, 1 H); 8.47 (s, 1 H); 8.41-8.29 (m, 2 H); 8.25-8.16 (m, 1 H); 3.96 (d, J=5.9 Hz, 2 H); 1.41-1.24 (m, 24 H).LC-MS: 534.4(M-2 x pin+H)+.
실시예 28: N- (1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00145
1-브로모피롤리딘-2,5-디온(NBS, 34.0 g, 191 mmol)을 농축 황산(400 mL) 중 3-트리플루오로메틸-4-메틸벤조산(1, 39.0 g, 191 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 얼음물(2 L)에 부었다. 생성된 침전물을 여과하고, 물(500 mL)로 세척하고, 에틸 아세테이트(400 mL)에 용해시키고; 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 3-브로모-4-메틸-5-트리플루오로메틸벤조산(2)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 53.4 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.71 (bs, 1 H); 8.35 (d, J=0.4 Hz, 1 H); 8.15 (d, J=0.9 Hz, 1 H); 2.56 (s, 3 H).
농축된 황산(24 mL)을 메탄올(500 mL) 중 3-브로모-4-메틸-5-트리플루오로메틸벤조산(2, 35.0 g, 124 mmol)에 첨가하고, 반응 혼합물을 환류 하에서 4시간 동안 교반하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 디에틸 에테르(250 mL)에 용해시키고, 물(2 x 100 mL) 및 탄산칼륨(100 mL)과 염수(100 mL)의 포화 용액의 혼합물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 3-브로모-4-메틸-5-트리플루오로메틸벤조에이트(3)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 35.3 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.36 (d, J=1.1 Hz, 1 H); 8.13 (d, J=1.1 Hz, 1 H); 3.90 (s, 3 H); 2.55 (d, J=1.3 Hz, 3 H).
물(300 mL) 중 1-브로모피롤리딘-2,5-디온(NBS, 31.7 g, 178 mmol) 및 메틸 3-브로모-4-메틸-5-트리플루오로메틸벤조에이트(3, 35.3 g, 119 mmol)의 현탁액을 100 W 전구 하에 80oC에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르(2 x 200 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(150 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 3-브로모-4-브로모메틸-5-트리플루오로메틸벤조에이트(4)를 황색 고체로서 수득하였다. 수율: 44.0 g(98%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.47 (d, J=1.5 Hz, 1 H); 8.31 (d, J=1.3 Hz, 1 H); 4.75 (s, 2 H); 3.98 (s, 3 H).
아세토니트릴(0.5 L) 중 3-브로모-4-브로모메틸-5-트리플루오로메틸벤조에이트(4, 44.0 g, 117 mmol) 및 아세트산칼륨(22.9 g, 234 mmol)의 용액을 75oC에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 여과지를 통해 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시키고 다시 여과하였다. 증발을 통해 메틸 3-브로모-4-(아세톡시메틸)-5-(트리플루오로메틸)벤조에이트(5)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 37.9 g(91%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.49 (d, J=1.3 Hz, 1 H); 8.34 (d, J=1.3 Hz, 1 H); 5.37 (s, 2 H); 3.99 (s, 3 H); 2.11 (s, 3 H).
건조 테트라히드로푸란(500 mL) 중 메틸 3-브로모-4-(아세톡시메틸)-5-트리플루오로메틸벤조에이트(5, 37.9 g, 107 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(29.8 g, 117 mmol), 아세트산칼륨(31.4 g, 294 mmol) 및 [1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(1.57 g, 1.92 mmol)의 용액을 아르곤 분위기 하 75oC에서 13일 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼(실리카겔, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 8:1)을 통해 여과하여 메틸 4-(아세톡시메틸)-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)벤조에이트(6)를 수득하였다. 수율: 31.1 g(72%). RF(SiO2, 시클로헥산/에틸 아세테이트 8:1): 0.40. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.65 (s, 1 H); 8.43 (s, 1 H); 5.48 (s, 2 H); 3.97 (s, 3 H); 2.05 (s, 3 H); 1.36 (s, 12 H).
물(300 mL) 중 메틸 4-(아세톡시메틸)-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)벤조에이트(6, 31.0 g, 77.1 mmol) 및 수산화나트륨(15.4 g, 386 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 물(100 mL) 중 염산(35 mL)의 용액을 첨가하여 pH를 1로 낮추었다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 침전물을 여과하고 건조시켜 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(7)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 16.6 g(86%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.47 (bs, 1 H); 9.66 (s, 1 H); 8.62 (s, 1 H); 8.24 (s, 1 H); 5.22 (s, 2 H).
아세토니트릴(0.5 L) 중 펜타플루오로페놀(7.48 g, 40.7 mmol), 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(7, 10.0 mg, 40.7 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 8.37 mg, 40.7 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발시키고, 아세토니트릴에 용해시키고, 재-여과하고 증발시켜 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(8)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 16.7 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.79 (s, 1 H); 8.86 (s, 1 H); 8.46 (s, 1 H); 5.30 (s, 2 H).
N,N-디메틸포름아미드(0.5 L) 중 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(8, 16.7 g, 40.6 mmol), (2-아미노에틸)글리신(9, 2.40 g, 20.3 mmol) 및 트리에틸아민(28.4 mL, 203 mmol)의 용액을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고, 미정제 생성물 10을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 용리액: 디클로로메탄/메탄올/포르민산 100:2:0.5 내지 100:10:0.5)로 정제하여 N-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)-N-(2-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신(10)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.77 g(67%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.89 (bs, 1 H); 9.68-9.48 (m, 2 H); 9.00-8.67 (m, 1 H); 8.56-7.36 (m, 4 H); 5.27-5.03 (m, 4 H); 4.30-3.95 (m, 2 H); 3.77-3.48 (m, 4 H). LC-MS: 575.5(M+H)+.
실시예 29: ( 2S )-3-(2,3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판아미도)프로판산 = N -[ N α ,N β -비스-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)-L-디아미노프로피오닐]-β-알라닌
Figure 112021111337418-pct00146
아세토니트릴(400 mL) 및 물(400 mL)의 혼합물 중 L-디아미노프로판산 히드로클로라이드, 별칭 (2S)-2,3-디아미노프로판산 히드로클로라이드(1, 15.0 g, 107 mmol), 디-터트-부틸 디카보네이트(46.6 g, 214 mmol) 및 중탄산 칼륨(32.0 g, 320 mmol)의 용액을 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, pH 1이 달성될 때까지 잔류물을 황산칼륨 포화 수용액으로 산성화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)로 추출하고 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 (2S)-2,3-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)프로판산(2)을 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 28.2 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 5.85 (bs, 1 H); 5.17 (bs, 1 H); 4.31 (bs, 1 H); 3.64-3.46 (m, 2 H); 1.46 (s, 18 H).
디클로로메탄(300 mL) 중 (2S)-2,3-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)프로판산(2, 27.9 g, 91.7 mmol), 터트-부틸 3-아미노프로파노에이트(3, 16.7 g, 91.7 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 21.1 g, 110 mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt, 15.0 g, 110 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(64.0 mL, 367 mmol)의 용액을 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고; 잔류물을 에틸 아세테이트(600 mL)에 용해시키고, 1 M 염산 수용액(4 x 300 mL) 및 중탄산나트륨 포화 수용액(4 x 300 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 터트-부틸 (S)-3-(2,3-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)프로판아미도)프로파노에이트(4)를 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 36.1 g(91%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.01 (bs, 1 H); 5.75 (bs, 1 H); 5.14 (bs, 1 H); 4.15 (bs, 1 H); 3.57-3.39 (m, 4 H); 2.43 (t, J=6.0 Hz, 2 H); 1.45 (s, 27 H).
디클로로메탄(50 mL) 중 터트-부틸 (S)-3-(2,3-비스((터트-부톡시카보닐)아미노)프로판아미도)프로파노에이트(4, 36.1 g, 83.7 mmol)의 용액에 95% 트리플루오로아세트산 수용액(300 mL)을 첨가하고, 용액을 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 아세토니트릴(3 x 300 mL)로 함께 증발시키고, 건조 디에틸 에테르 중 1 M 염산 용액(300 mL)으로 처리하였다. 침전물을 여과하고 아세토니트릴(2 x 600 mL)로 분쇄하여 (2S)-3-(2,3-디아미노프로판아미도)프로판산 디히드로클로라이드(5)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 22.2 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, D2O, δH): 4.35 (t, J=5.8 Hz, 1 H); 3.63-3.46 (m, 4 H); 2.67 (t, J=6.6 Hz, 2 H).
아세토니트릴(1 L) 중 펜타플루오로페놀(35.1 g, 191 mmol), 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(1, 40.8 g, 166 mmol, 실시예 28에 기술된 바와 같은 제조) 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 39.3 g, 191 mmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발시키고, 아세토니트릴에 용해시키고, 재-여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 디클로로메탄(1 L)에서 침전시키고 여과하여 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(6)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 52.8 g(77%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.79 (s, 1 H); 8.86 (s, 1 H); 8.46 (s, 1 H); 5.30 (s, 2 H).
물(50 mL) 중 (2S)-3-(2,3-디아미노프로판아미도)프로판산 디히드로클로라이드(5, 6.41 g, 24.3 mmol) 및 트리에틸아민(33.8 mmol, 243 mmol)의 용액에 1,4-디옥산(100 mL) 중 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(6, 20.0 g, 48.6 mmol)의 용액을 첨가하고 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(300 mL) 및 1 M 황산칼륨 수용액(1500 mL) 사이에서 분리시켰다. 유기층을 1 M 황산칼륨 수용액(1 x 300 mL)으로 세척하고, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 디에틸 에테르(2 x 150 mL)로 분쇄하고 여과하였다. 고형분을 70% 수성 아세토니트릴(600 mL)에 용해시키고 동결건조시켜 3-(2(S),3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판아미도)프로판산(7)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 12.1 g(80%). H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 8.51 (s, 1 H); 8.47 (s, 1 H); 8.29 (s, 1 H); 8.27 (s, 1 H); 5.28 (s, 4 H); 5.15 (t, J=6.1 Hz, 1 H); 4.15-3.99 (m, 2 H); 3.61 (t, J=6.4 Hz, 2 H); 2.67 (t, J=6.3 Hz, 2 H). LC-MS: 632.0(M+H)+.
실시예 30: (S)-3-(2,3-비스(4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판아미도)프로판산
Figure 112021111337418-pct00147
4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(1, 8.56 g, 43.7 mmol), N-히드록시숙신이미드(5.03 g, 43.7 mmol) 및 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 히드로클로라이드(8.38 g, 43.7 mmol)을 테트라히드로푸란(250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(20 mL) 중에서 3.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트(3 x 150 mL) 및 1 M 염산 수용액(150 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 10.2 g(79%). LC-MS: 294.3(M+H)+.
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(3, 10.5 g, 15.7 mmol)을 건조 디클로로메탄(80 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(50 mL) 중 3-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-알라닌-OH, 3.26 g, 10.5 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(6.93 mL, 39.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(3.65 mL, 20.9 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 80 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 80 mL), 디클로로메탄(2 x 80 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 80 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 80 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 80 mL), 2-프로판올(2 x 80 mL) 및 디클로로메탄(3 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(80 mL) 중 (S)-2,3-비스((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-Dap(Fmoc)-OH, 8.61 g, 15.7 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 5.58 g, 15.7 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(4.92 mL, 28.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 80 mL), 디클로로메탄(2 x 80 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 80 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 80 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 80 mL), 2-프로판올(2 x 80 mL) 및 디클로로메탄(3 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(80 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2, 9.14 g, 31.4 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(9.84 mL, 56.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1일 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 80 mL) 및 디클로로메탄(10 x 80 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(80 mL)로 16시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 80 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 미정제 생성물(4)을 아세트산에틸(300 mL)로 세척하고, 여과하고, 진공에서 건조시켰다. 순수 생성물(4)을 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.10 g(74%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.57 (bs, 2 H); 8.78-8.49 (m, 2 H); 8.19-7.93 (m, 3 H); 7.71 (dd, J=30.8 and 10.8 Hz, 2 H); 5.12 (d, J=7.7 Hz, 4 H); 4.74-4.55 (m, 1 H); 3.72-3.61 (m, 2 H); 3.29-3.15 (m, 2 H); 2.36 (t, J=6.9 Hz, 2 H). LC-MS: 532.6(M+H)+.
실시예 31: 4-(( 3R,4R )-3,4-비스(7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산
Figure 112021111337418-pct00148
N,N-디메틸포름아미드(300 mL) 중 4-((3R,4R)-3,4-디아미노피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산 디히드로클로라이드(2, 2.46 g, 12.2 mmol), 펜타플루오로페닐 7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(1, 8.86 g, 24.5 mmol) 및 트리에틸아민(17.0 mL, 122 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 에틸 아세테이트로부터 침전시켜 6.40 g의 미정제 화합물 3(6.4 g)을 수득하고, 이를 HPLC(YMC, C18, 5 m, 250 x 50 mm, 아세토니트릴/물, 30분 동안 2:98, 180분 동안 2:98 내지 30:0)로 정제하고, 동결건조시켜 표제 화합물 4-((3R,4R)-3,4-비스(7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)피롤리딘-1-일)-4-옥소부탄산(3)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.23 g(18%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH) 9.35 (bs, 2 H); 8.68 (t, J=8.4 Hz, 2 H); 7.81-7.62 (m, 2 H); 7.30 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 5.02 (s, 4 H); 4.66-4.45 (m, 2 H); 3.94 (dd, J=10.6 and 6.7 Hz, 1 H); 3.77 (dd, J=12.0 and 6.7 Hz, 1 H); 3.54-3.41 (m, 1 H); 3.27-3.18 (m, 1 H); 2.47-2.34 (m, 4 H). LC-MS: 558.6(M+H)+.
실시예 32: N- (7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00149
n-부틸리튬(헥산 중 2.38 M, 107 mL, 255 mmol)을 무수 테트라히드로푸란(150 mL) 중 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘(43.5 mL, 257 mmol)의 교반된 질소로 퍼징된 용액에 내부 온도를 -60℃미만으로 유지하는 속도로 (약 20분 동안) 캐뉼러 삽입하였다. 혼합물을 60분 동안 교반하였다(내부 온도가 -40°C로 증가함). 혼합물을 -78°C까지 재-냉각시키고, 건조 테트라히드로푸란(200 mL) 중 2-플루오로-4-메틸벤조니트릴(1, 30.0 g, 222 mmol)의 용액을 격렬하게 교반된 혼합물에 내부 온도를 -70°C 미만으로 유지하는 속도로 연동 펌프를 통해 (약 40분 동안) 적가하였다. 혼합물을 -50°C까지 가온시키고, 45분 동안 이 온도에서 유지시켰다. 혼합물을 -78°C로 재-냉각시키고, 건조 테트라히드로푸란(150 mL) 중 요오드(62.0 g, 244 mmol)의 용액을 내부 온도를 -70°C 미만으로 유지하며 (연동 펌프를 사용하여) 적가하였다. 잔류 요오드를 건조 테트라히드로푸란(50 mL)으로 세척하고, 혼합물을 -70°C에서 1시간 동안 교반하였다. 교반된 혼합물을 밤새 실온까지 가온시킨 후, 물(750 mL) 중 티오황산나트륨(20 g)의 교반된 용액에 부어 급냉시켰다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 아세트산에틸(3 x 300 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 10:1)로 정제한 후, 메탄올로부터 재결정화하여 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조니트릴(2)을 무색 결정질 고체로서 수득하였다. 수율: 29.6 g(51%). RF(SiO2, 시클로헥산/에틸 아세테이트 10:1): 0.35. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.48 (dd, J=7.9 and 6.5 Hz, 1 H); 7.17-7.12 (m, 1 H), 2.56 (s, 3 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -82.34 (s).
75% 황산(65 mL) 중 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조니트릴(2, 52.7 g, 202 mmol)의 슬러리를 150°C에서 3시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 얼음/물 혼합물(500 g)에 부었다. 침전된 베이지색 고형분을 여과하고, 다량의 물로 세척하고 건조시켜 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조산(3)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 51.2 g(91%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.30 (s, 1 H); 7.75 (t, J=7.8 Hz, 1 H); 7.27 (d, J=8.0 Hz, 1 H); 2.47 (s, 3 H).
아세틸 클로라이드(23.0 mL, 321 mmol)를 건조 메탄올(350 mL) 중 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조산(3, 90.0 g, 321 mmol)의 교반된 현탁액에 0oC에서 적가하였다. 혼합물을 밤새 환류시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(1300 mL)에 넣었다. 중탄산칼륨(2 x 1000 mL) 및 염수(1000 mL)의 포화 수용액으로 세척한 후, 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 30:1 내지 15:1)로 정제하여 메틸 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조에이트(4)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 67.6 g(72%). RF(SiO2, 시클로헥산/에틸 아세테이트 15:1): 0.40. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.80 (t, J=7.7 Hz, 1 H); 7.10 (d, J=8.0 Hz, 1 H); 3.93 (s, 3 H); 2.52 (s, 3 H).
무수 디메틸술폭시드(500 mL) 중 디클로로메탄(1.94 g, 2.38 mmol)과 2-플루오로-3-요오드-4-메틸벤조에이트(4, 35.0 g, 119 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(5, 33.3 g, 131 mmol), 무수 아세트산칼륨(35.0 g, 357 mmol) 및 [1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) 복합체의 용액을 아르곤 분위기 하 110oC에서 주말 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 진공에서 증발시키고, 미정제 생성물 6을 에틸 아세테이트(4 x 500 mL) 및 물(1.0 L)로 추출하였다. 유기층을 합치고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1)로 정제하여 메틸 2-플루오로-4-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6)를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 29.4 g(84%). RF(SiO2, 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.30. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.84 (t, J=8.0 Hz, 1 H); 7.00 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 3.90 (s, 3 H); 2.47 (s, 3 H); 1.39 (s, 12 H).
벤조트리플루오라이드(300 mL) 중 메틸 2-플루오로-4-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6, 27.5 g, 93.5 mmol), 1-브로모피롤리딘-2,5-디온(NBS, 18.3 g, 103 mmol) 및 2,2-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN, 0.77 g, 4.68 mmol)의 용액을 85°C에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르(2 x 150 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켜 메틸 4-(브로모메틸)-2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7)를 황색 고체로서 수득하였다. 수율: 33.5 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.93 (t, J=7.8 Hz, 1 H); 7.21 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 4.71 (s, 2 H); 3.91 (s, 3 H); 1.42 (s, 12 H).
아세토니트릴(1 L) 중 메틸 4-(브로모메틸)-2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7, 33.5 g, 89.8 mmol) 및 아세트산칼륨(17.6 g, 180 mmol)의 용액을 75°C에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 면-울을 통해 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시키고 다시 여과하였다. 용매를 증발시켜 메틸 4-(아세톡시메틸)-2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(8)를 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 30.0 g(95%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.96 (t, J=7.8 Hz, 1 H); 7.24 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 5.25 (s, 2 H); 3.92 (s, 3 H); 2.11 (s, 3 H); 1.39 (s, 12 H).
물(250 mL) 중 메틸 4-(아세톡시메틸)-2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(8, 30.0 g, 85.2 mmol) 및 수산화나트륨(17.0 g, 426 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 물(50 mL) 중 염산 수용액(35% w/w, 45 mL)을 첨가하여 pH를 1로 낮추었다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하고 동결건조시켜 7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(9)을 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 9.76 g(58%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.17 (bs, 1 H); 9.38 (bs, 1 H); 8.29 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 7.36 (d, J=11.2 Hz, 1 H); 5.02 (s, 2 H). LC-MS: 197.3(M+H)+.
아세토니트릴(300 mL) 및 디클로로메탄(200 mL) 중 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(9.61 g, 52.2 mmol), 7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(9, 10.2 g, 52.2 mmol), 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 10.8 g, 52.2 mmol)의 용액을 주말 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴에 용해시키고, 여과하고 진공에서 다시 증발시켜 펜타플루오로페닐 7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(10)를 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 18.8 g(100%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.55 (bs, 1 H); 8.32-8.20 (m, 1 H); 7.51 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 5.13 (s, 2 H).
N,N-디메틸포름아미드(200 mL) 중 펜타플루오로페닐 7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(10, 9.46 g, 26.1 mmol), (2-아미노에틸)글리신(11, 1.54 g, 13.1 mmol) 및 트리에틸아민(14.5 mL, 105 mmol)의 용액을 실온에서 밤새(16시간) 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 이를 디클로로메탄에 용해시켜 TLC를 만들도록 시도하였다. 미정제 생성물은 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 아세토니트릴에서 불용성임을 발견하였다. 따라서, 이를 에틸 아세테이트(0.5 L)로부터 침전시키고, 원심분리로 고형분을 수집하였다. 제1 침전물(A)을 0.5 M 염산염 용액(2 x 50 mL)으로 세척하여 여과되고 유지된 제2 침전물(B)을 수득하였다. 여과물을 동결건조시켜 염으로 오염된 생성물 12를 수득하였다. 테트라히드로푸란에 용해시키고 여과하여 염을 제거하였다. 남은 용액을 진공에서 증발시켜 생성물 12의 제1 수확물을 수득하였다. 침전물(B)을 아세토니트릴 및 물(3:1)에 용해시키고, 여과하고, 나머지 용액을 동결건조시켰다. 생성된 고형분을 테트라히드로푸란에 용해시키고, 침전된 염을 여과하고, 여과물을 진공에서 증발시켜 N-(7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)-N-(2-(7-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신(12)의 제2 수확물을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 2.09 g(34%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.41-9.33 (m, 2 H); 8.42-8.18 (m, 1 H); 7.81-7.64 (m, 1 H); 7.43-7.11 (m, 3 H); 5.07-4.97 (m, 4 H); 4.22 (s, 1 H); 3.98 (s, 1 H); 3.68 (t, J=6.5 Hz, 1 H); 3.60-3.40 (m, 3 H). LC-MS: 475.5(M+H)+.
실시예 33: 2,5-디옥시피롤리딘-1-일 2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ 6 -술파닐리덴)아미노)아세테이트
Figure 112021111337418-pct00150
터트-부틸 2-((옥소비스(3-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세테이트(1, 2.05 g, 4.38 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(2.78 g, 11.0 mmol), (1,5-시클로옥타디엔)(메톡시)이리듐(I) 이량체(87.0 mg, 0.13 mmol) 및 4,4-디-터트-부틸-2,2-디피리딘(dtbpy, 82.0 mg, 0.31 mmol)을 아르곤 분위기 하의 배기된 테트라히드로푸란(12 mL)에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 60°C까지 가온시키고 이 온도로 밤새 가열하였다. 혼합물을 증발건조시키고; 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/에틸 아세테이트 10:0 내지 4:1)로 정제하여 터트-부틸 2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세테이트(2)를 회백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 2.92 g(93%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.59 (s, 2 H); 8.42 (s, 2 H); 8.21 (s, 2 H); 3.76 (s, 2 H); 1.51 (s, 9 H); 1.6 (s, 12 H); 1.35 (s, 12 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.55 (s). LC-MS: 556.6(M-2 x 피나콜+H)+, 638.8(M-피나콜+H)+, 721.0(M+H)+.
트리플루오로아세트산(24 mL)을 디클로로메탄(8 mL) 중 터트-부틸 2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세테이트(2, 2.91 g, 4.05 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 증발건조시키고, 잔류물을 톨루엔(3 x 20 mL) 및 디클로로메탄(3 x 20 mL)으로부터 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(200 mL)과 0.5 M 수산화나트륨 수용액(250 mL) 사이에서 분리시켰다. 분리된 수성상을 디클로로메탄(2 x 100 mL)으로 세척하고, 1 M 염산(200 mL)으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(3 x 250 mL)로 추출하였다. 합쳐진 에틸 아세테이트 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 진공 중에서 증발시켜 2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세트산(3)을 회백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 2.30 g(86%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.55 (s, 2 H); 8.33 (s, 2 H); 8.29 (s, 2 H); 3.85 (s, 2 H); 1.39 (s, 24 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.69 (s). LC-MS: 500.5(M-2 x 피나콜+H)+, 582.6(M-피나콜+H)+, 664.8(M+H)+.
건조 아세토니트릴(16.2 mL)을 아르곤 하 2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세트산(3, 2.15 g, 3.24 mmol) 및 N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC, 1.25 g, 4.86 mmol)에 첨가하였다. 피리딘(392 mL, 4.86 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 초음파 처리하여 미세 현탁액을 형성하였다. 생성된 현탁액을 4시간 동안 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC, 415 mg, 1.62 mmol) 및 피리딘(131 mL, 1.62 mmol)의 추가량을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. LC/MS 분석은 활성화된 에스테르로의 완전한 전환을 나타냈다. 혼합물을 증발건조시키고 잔류물을 에틸 아세테이트(200 mL)와 0.1 M 염산 수용액(100 mL) 사이에서 분리시켰다. 상을 분리시키고, 유기상을 0.1 M 염산 수용액(2 x 50 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(40 mL)에 용해시키고, 이어서 피나콜(383 mg, 3.24 mmol)을 첨가하였다. 용액을 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄(3 x 40 mL)으로부터 증발시켰다. 생성된 발포체를 시클로헥산(2 x 50 mL)으로 세척하고, 디클로로메탄(40 mL)에 재용해시키고, 증발시키고 진공에서 건조시켜 표제 화합물(4)을 회백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 1.82 g(74%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.57 (s, 2 H); 8.37 (s, 2 H); 8.24 (s, 2 H); 4.20 (s, 2 H); 2.83 (s, 4 H); 1.36 (s, 24 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.66 (s). LC-MS: 761.9(M+H)+.
실시예 34: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트
Figure 112021111337418-pct00151
메틸 3-요오드벤조에이트(2, 10.5 g, 40.0 mmol), 무수 탄산칼륨 (11.0 g, 80.0 mmol), 요오드화구리(1.52 g, 8.00 mmol) 및 3-트리플루오르메틸벤젠티올(1, 8.22 mL, 60.0 mmol)를 건조 1,2-디메톡시에탄(100 mL) 중에서 현탁시키고, 생성된 현탁액을 80°C에서 48시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 시클로헥산(300 mL)으로 희석하고, 셀라이트를 상부에 채운 실리카겔 패드(125 g)(에틸 아세테이트/시클로헥산 1:10, 3 x 200 mL으로 세척됨)를 통해 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 아세트산(120 mL)에 용해시키고, 30% 과산화수소 수용액(16.0 mL, 156 mmol)을 나누어 첨가하였다(열 방출). 80°C(오일조)에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 에틸 아세테이트(400 mL)에 넣고, 물(400 mL) 및 염수(400 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 증발시켜 메틸 에스테르 4를 황색 오일로서 수득하였고, 이를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 300, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 4:1)에 적용하여 메틸 3-((3-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트(4)를 무색 오일로서 수득하였다. 수율: 5.40 g(39%). LC-MS: 346.0(M+H)+.
메틸 3-((3-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트(4, 5.40 g, 15.7 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(9.97 g, 39.0 mmol), (1,5-시클로옥타디엔)(메톡시)이리듐(I) 이량체(310 mg, 0.47 mmol) 및 4,4-디-터트-부틸-2,2-디피리딘(dtbpy, 295 mg, 1.10 mmol)을 질소 분위기 하의 배기된 건조 테트라히드로푸란(30 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50°C(오일조)에서 16시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 얼음-냉각 물(30 mL)을 서서히 첨가하여 생성된 피나콜보란을 분해하였다(수소 가스 방출). 30분 후, 수산화리튬 일수화물(6.59 g, 157 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 물(300 mL)에 넣고 디클로로메탄(3 x 60 mL)으로 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 폐기하고, 수성층을 농축 염산으로 pH 2로 산성화시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하고 폐기하였다. 유기층을 염수(3 x 50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 생성된 황색 발포체를 피나콜(118 mg, 1.00 mmol)로 처리하고 따뜻한 아세토니트릴(20 mL)에 용해시켰다. 결정화를 위해 용액을 냉동기에 밤새 방치하였다. 침전된 생성물을 여과로 수집하고, 냉각된 아세토니트릴로 세척하고, 대기 중에서 건조시켜 3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조산(5)을 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.90 g(65%). LC-MS: 582.6(M+H)+.
3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조산(5, 5.90 g, 10.1 mmol) 및 비스(숙신이미딜)카보네이트(3.63 g, 14.2 mmol)를 질소 하 무수 아세토니트릴(45 mL) 및 피리딘(1.14 mL, 14.2 mmol) 중에서 현탁하였다. 반응 혼합물을 가열하여 용해시켰다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(200 mL)에 넣고, 염수(3 x 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켜 회백색 고체를 수득하였다. 피나콜(473 mg, 4.00 mmol)을 첨가하고 혼합물을 아세토니트릴(30 mL) 중에서 1시간 동안 교반하도록 두었다. 아세토니트릴을 진공에서 증발시켰다. 생성된 백색 발포체를 헥산(30 mL)에 용해시키고, 결정화를 위해 용액을 실온에서 밤새 방치하여 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-((3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)술포닐)벤조에이트(6)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.50 g(94%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.76-8.72 (m, 2 H); 8.67 (s, 1 H); 8.55 (s, 1 H); 8.32 (s, 1 H); 8.27 (s, 1 H); 2.92 (s, 4 H); 1.37 (s, 12 H), 1.37 (s, 12 H)와 겹침. 19F NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δF): 62.64 (s, 3 H). LC-MS: 680.6(M-H)+.
실시예 35: N- (1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00152
4-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤조산(1, 25.0 g, 123 mmol)을 황산(183 mL)에 용해시킨 후, N-요오드숙신이미드(33.1 g, 147 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 얼음에 부었다. 얼음이 완전히 용융시켰을 때, 혼합물을 에틸 아세테이트(500 mL)로 추출하였다. 유기층을 5% 티오황산나트륨 수용액(2 x 250 mL) 및 물(1 x 250 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발건조시켜 5-요오드-4-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤조산(2)을 베이지색 분말로서 수득하였다. 수율: 37.7 g(93%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.68 (bs, 1 H); 8.22 (s, 1 H); 7.76 (s, 1 H); 2.47 (s, 3 H).
메탄올(135 mL) 중 5-요오드-4-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤조산(2, 22.2 g, 67.2 mmol), 트리메틸 오르토포르메이트(14.7 mL, 134 mmol) 및 메탄술폰산(2.8 mL)의 혼합물을 질소 분위기 하 80°C에서 밤새 환류하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 5% 탄산나트륨 수용액(200 mL)에 용해시키고 에틸 아세테이트(3 x 250 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 물(1 x 300 mL) 및 염수(1 x 200 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 퀵 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1)로 정제하여 메틸 5-요오드-4-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(3)를 백색 결정으로서 수득하였다. 수율: 35.9 g(91%). RF(시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.50. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.26 (s, 1 H); 7.57 (s, 1 H); 3.93 (s, 3 H); 2.53 (s, 3 H).
벤조트리플루오라이드(95 mL) 중 메틸 5-요오드-4-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(3, 35.9 g, 104 mmol), N-브로모숙신이미드(20.4 g, 114 mmol) 및 2,2-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN, 5.12 g, 31.2 mmol)의 혼합물을 85 C에서 밤새 교반하였다. 전체 전환을 달성하지 못했지만 반응은 이루어졌다. 디클로로메탄(150 mL)을 첨가하고, 혼합물을 물(3 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴(440 mL)에 용해시키고 아세트산칼륨(10.2 g, 104 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 75oC에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 시클로헥산/디클로로메탄 4:1 내지 1:1.5)로 정제하여 메틸 4-(아세톡시메틸)-5-요오드-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(4)를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 17.5 g(42%). RF(시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.35. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.28 (s, 1 H); 7.70 (s, 1 H); 5.16 (s, 2 H); 3.95 (s, 3 H); 2.20 (s, 3 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -59.96 (s).
건조 N,N-디메틸술폭시드(110 mL) 중 메틸 4-(아세톡시메틸)-5-요오드-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(4, 17.5 g, 43.5 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(14.3 g, 56.5 mmol) 및 건조 아세트산칼륨(21.3 g, 217 mmol)의 혼합물을 탈기한 후, [1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(1.59 g, 2.17 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 95°C에서 밤새 교반하였다. 냉각 후, 디에틸 에테르(500 mL)를 첨가하고, 침전물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 5% 염화나트륨 수용액(3 x 500 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 4-(아세톡시메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(5)를 흑색 오일로서 수득하였다. 이 오일을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 22.5 g. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.22 (s, 1 H); 7.74 (s, 1 H); 5.44 (s, 2 H); 3.94 (s, 3 H); 2.14 (s, 3 H); 1.36 (s, 12 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -60.07 (s).
메틸 4-(아세톡시메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트(5, 17.5 g, 43.5 mmol)를 물(150 mL) 중 수산화나트륨(8.70 g, 217 mmol)의 용액에 현탁시켰다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 디에틸 에테르(2 x 200 mL)로 추출하였다. 농축 염산(18.9 mL)으로 수성상을 산성화시키고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조시켜 1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(6)을 회색 분말로서 수득하였다. 수율: 7.62 g(71%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.50 (bs, 1 H); 9.57 (s, 1 H); 8.16 (s, 1 H); 7.92 (s, 1 H); 5.11 (s, 2 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, DMSO-d6, δF): -57.91 (s). LC-MS: 245.9(M-H)-.
1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(6, 6.71 g, 27.3 mmol)을 테트라히드로푸란/디클로로메탄 혼합물(1:1, 50 mL)에 용해시킨 후, 2,3,4,5,6-펜트라플루오로페놀(5.03 g, 27.3 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(5.23 g, 27.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 아세트산에틸(150 mL)에 용해시키고, 물(3 x 100 mL) 및 염수(1 x 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르(10 mL)에 용해시키고 n-헥산(200 mL)을 첨가하였다. 침전물을 여과하고 여과물을 증발시켰다. 동일한 절차를 침전물에 대해 2회 반복하였다. 모든 여과물을 함께 합치고 증발건조시켜 펜타플루오로페닐 1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(7)를 황색 경질 오일로서 수득하였다. 수율: 9.76 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.74 (s, 1 H); 8.53 (s, 1 H); 8.16 (s, 1 H); 5.18 (s, 2 H).
펜타플루오로페닐 1-히드록시-5-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(7, 9.51 g, 23.1 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(30 mL)에 용해시켰다. 이어서, 물(30 mL) 중 N,N-디이소프로필에틸아민(10.1 mL, 57.7 mmol) 및 (2-아미노에틸)글리신 히드로클로라이드(8, 1.78 g, 11.5 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(200 mL)에 용해시키고 1 M 염산 수용액(1 x 200 mL), 물(2 x 200 mL) 및 염수(1 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 시클로헥산으로 처리하였다. 침전물을 여과하고, 시클로헥산으로 세척하고, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 디클로로메탄/메탄올/포르민산 10:1:0.05)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합치고 증발시켰다. 잔류물을 시클로헥산으로 처리하였다. 침전물을 여과하고, 시클로헥산으로 세척하고, 아세토니트릴(50 mL)에 용해시키고, 동결건조시켜 표제 화합물(9)을 베이지색 분말로서 수득하였다. 수율: 3.63 g(55%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80 C, δH): 8.04-7.66 (m, 4 H); 5.28-5.04 (m, 4 H); 4.63-4.34 (m, 1 H); 4.22-3.78 (m, 3 H); 3.72-3.49 (m, 2 H). LC-MS: 574.0(M+H)+.
실시예 36: N- (4-클로로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(4-클로로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00153
N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 6.20 g, 23.1 mmol)을 디클로로메탄(70 mL) 중 4-클로로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(1, 4.90 g, 23.1 mmol) 및 펜타플루오로페놀(Pfp-OH, 5.53 g, 23.1 mmol)의 현탁액에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발건조시켰다. 에틸 아세테이트(200 mL)와 10% 황산수소칼륨 수용액(200 mL) 사이에서 잔류물을 분리하였다. 유기층을 분리하고, 물(2 x 100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 밤새 냉장고에 두었다. 고형분을 여과하고 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 세척하였다. 여과물을 합치고 증발건조시켰다. 시클로헥산(100 mL)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 따라내고, 침전물을 진공에서 건조시켜 펜타플루오로페닐 4-클로로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2)를 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.29 g(95%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.83 (bs, 1 H); 8.61 (s, 1 H); 8.26 (s, 1 H); 5.13 (s, 2 H). LC-MS: 377.4(M-H)-.
트리에틸아민(10.0 mL, 131.6 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드/물(2:1, 60 mL) 용액 중 펜타플루오로페닐 1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2, 8.29 g, 21.9 mmol) 및 N-2-아미노에틸글리신(3, 1.30 g, 1.70 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 1 M 중황산칼륨 수용액(200 mL)으로 산성화시키고 에틸 아세테이트(3 x 250 mL)로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔(3 x 100 mL)으로 공동 증류하고 디에틸 에테르(60 mL)로 분말화하였다. 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 공기 건조시켰다. 수득된 분말을 아세토니트릴/물 혼합물(2:1, 20 mL)에 용해시키고 동결건조시켜 화합물 4를 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.50 g(15%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.87 (bs, 1 H); 9.59-9.41 (m, 2 H); 8.77-8.54 (m, 5 H); 5.07-4.88 (m, 4 H); 4.25-3.92 (m, 2 H); 3.60-3.24 (m, 4 H). LC-MS: 507.3(M+H)+.
실시예 37: (S)-4-((2S)-2,3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판아미도)-5-( 터트 -부톡시)-5-옥소펜탄산
Figure 112021111337418-pct00154
아세토니트릴(1 L) 중 펜타플루오로페놀(35.1 g, 191 mmol), 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(1, 40.8 g, 166 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC, 39.3 g, 191 mmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발시키고, 아세토니트릴에 용해시키고, 재-여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 디클로로메탄(1 L)에서 침전시키고 여과하여 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 52.8 g(77%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.79 (s, 1 H); 8.86 (s, 1 H); 8.46 (s, 1 H); 5.30 (s, 2 H).
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(3, 4.47 g, 6.71 mmol)을 건조 디클로로메탄(30 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(30 mL) 중 (2S)-5-(터트-부톡시)-2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}-5-옥소펜탄산(Fmoc-Glu-OtBu, 1.90 g, 4.47 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.96 mL, 17.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(1.56 mL, 8.95 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 40 mL). 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 30 mL), 디클로로메탄(2 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 (2S)-2,3-비스((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)프로판산(Fmoc-Dap(Fmoc)-OH, 3.68 g, 6.71 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU, 2.55 g, 6.71 mmol) 및 2,4,6-트리메틸피리딘(1.60 mL, 12.1 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 40 mL), 디클로로메탄(2 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2, 5.53 g, 13.4 mmol) 및 트리에틸아민(4.99 mL, 35.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(6 x 40 mL) 및 디클로로메탄(10 x 50 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(60 mL)로 16시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 50 mL)으로 세척하였다. 미정제 생성물(4)을 진공에서 건조시키고, 아세트산에틸(2 x 70 mL) 및 1 M 황산칼륨 수용액(50 mL)으로 추출하고, 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 이어서, 미정제 생성물을 디에틸 에테르(20 mL) 중에서 분쇄하여 (S)-4-((2S)-2,3-비스(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)프로판아미도)-5-(터트-부톡시)-5-옥소펜탄산(4)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.89 g(57%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 8.50 (s, 1 H); 8.46 (s, 1 H); 8.29 (s, 1 H); 8.26 (s, 1 H); 5.28 (d, J=2.6 Hz, 4 H); 5.20 (t, J=5.9 Hz, 1 H); 4.55 (dd, J=8.5 and 5.2 Hz, 1 H); 4.08 (dd, J=6.0 and 2.1 Hz, 2 H); 2.57-2.42 (m, 2 H); 2.34-2.16 (m, 1 H); 2.17-2.08 (m, 1 H); 1.47 (s, 9 H). LC-MS: 746.3(M+H)+.
실시예 38: N- (4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)- N- (2-(4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신
Figure 112021111337418-pct00155
농축 황산(35 mL)을 메탄올(1.2 L) 중 3-브로모-5-요오드-4-메틸벤조산(1, 55.4 g, 162 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 디에틸 에테르(700 mL)에 용해시키고, 물(2 x 300 mL) 및 탄산칼륨 포화 용액(1 x 300 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 3-브로모-5-요오드-4-메틸벤조에이트(2)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 50.0 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 8.32 (d, J=1.7 Hz, 1 H); 8.09 (d, J=1.3 Hz, 1 H); 3.86 (s, 3 H); 2.65 (s, 3 H).
건조 테트라히드로푸란(250 mL) 중 메틸 3-브로모-5-요오드-4-메틸벤조에이트(2, 37.3 g, 105 mmol)의 용액에 건조 테트라히드로푸란(89.0 mL, 115 mmol) 중 이소프로필마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 복합체의 1.3 M 용액을 불활성 분위기 하 -30oC에서 적가하고 20분 동안 교반하였다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드(12.2 mL, 158 mmol)를 -30oC에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 에틸 아세테이트(300 mL)에 용해시키고, 물(2 x 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 3-브로모-5-포르밀-4-메틸벤조에이트(3)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 24.9 g(92%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 10.27 (s, 1 H); 8.53-8.34 (m, 2 H); 3.97 (s, 3 H); 2.82 (s, 3 H).
디클로로메탄(300 mL) 중 메틸 3-브로모-5-포르밀-4-메틸벤조에이트(3, 24.8 g, 96.5 mmol) 및 (디에틸아미노)황 트리플루오라이드(DAST, 25.5 mL, 193 mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 물(200 mL)을 첨가하여 반응물을 급냉시키고 디클로로메탄(2 x 200 mL)으로 추출하였다. 유기층을 합치고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 메틸 3-브로모-5-(디플루오로메틸)-4-메틸벤조에이트(4)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 23.3 g(87%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.35 (d, J=1.1 Hz, 1 H); 8.14 (d, J=0.9 Hz, 1 H); 6.78 (t, J=54.8 Hz, 1 H); 3.93 (s, 3 H); 2.55 (t, J=1.4 Hz, 3 H).
α,α,α-트리플루오로톨루엔(120 mL) 중 N-브로모숙신이미드(16.4 g, 91.9 mmol), 메틸 3-브로모-5-(디플루오로메틸)-4-메틸벤조에이트(4, 23.3 g, 83.5 mmol) 및 2,2-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN, 1.36 g, 8.36 mmol)의 용액을 85oC에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시킨 후, 디에틸 에테르(2 x 300 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(1 x 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켜 미정제 메틸 3-브로모-4-(브로모메틸)-5-(디플루오로메틸)벤조에이트(5)를 수득하고, 이를 아세토니트릴(300 mL) 중 아세트산칼륨(16.4 g, 167 mmol)과 함께 75oC에서 밤새 교반하였다. 현탁액을 짧은 셀라이트 패드를 통해 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시키고 다시 여과하였다. 여과물을 증발시키고 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1)로 정제하여 메틸 4-(아세톡시메틸)-3-브로모-5-(디플루오로메틸)벤조에이트(6)를 백색 고형체로서 수득하였다. 수율: 17.1 g(61%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.50. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.40 (s, 1 H); 8.26 (s, 1 H); 7.02 (t, J=54.7 Hz, 1 H); 5.38 (s, 2 H); 3.97 (s, 3 H); 2.11 (s, 3 H).
건조 디옥산(200 mL) 중 4-(아세톡시메틸)-3-브로모-5-(디플루오로메틸)벤조에이트(6, 17.1 g, 50.7 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(14.2 g, 55.7 mmol), 아세트산칼륨(14.9 g, 152 mmol) 및 [1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(1.24 g, 1.52 mmol)의 용액을 아르곤 분위기 하 75oC에서 2일 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼(실리카겔, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1)을 통해 여과하여 메틸 4-(아세톡시메틸)-3-(디플루오로메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7)를 수득하였다. 수율: 16.3 g (84%). RF(SiO2, 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.30. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.57 (s, 1 H); 8.38 (s, 1 H); 7.04 (t, J=55.1 Hz, 1 H); 5.54 (s, 2 H); 3.97 (s, 3 H); 2.06 (s, 3 H); 1.39 (s, 12 H).
물(200 mL) 중 메틸 4-(아세톡시메틸)-3-(디플루오로메틸)-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(7, 16.3 g, 42.3 mmol) 및 수산화나트륨(8.45 g, 212 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 물(50 mL) 중 농축 염산(20 mL)의 용액을 첨가하여 pH를 1로 낮추었다. 반응 혼합물을 밤새 냉장고에 두었다. 침전물을 여과하고 건조시켜 4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(8)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.55 g(89%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 13.25 (bs, 1 H); 9.54 (s, 1 H); 8.51 (s, 1 H); 8.20 (s, 1 H); 7.22 (t, J=55.1 Hz, 1 H); 5.19 (s, 2 H).
디클로로메탄(100 mL) 중 펜타플루오로페놀(8.28 g, 45.0 mmol), 4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(8, 8.55 g, 37.5 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl, 10.1 g, 52.5 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 아세트산에틸(200 mL)에 용해시키고, 1 M 염산 수용액(3 x 200 mL) 및 염수(1 x 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물 9를 뜨거운 시클로헥산(300 mL) 및 에틸 아세테이트(30 mL)로부터 재결정화하여 펜타플루오로페닐 4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(9)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.20 g(56%). LC-MS: 395.5(M+H)+.
테트라히드로푸란(40 mL) 및 물(20 mL) 중 퍼플루오로페닐 4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(9, 8.20 g, 20.8 mmol), (2-아미노에틸)글리신(10, 1.23 g, 10.4 mmol) 및 트리에틸아민(14.5 mL, 104 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 테트라히드로푸란을 증발시키고, 1 M 황산칼륨 수용액(30 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합치고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 미정제 생성물 11을 에틸 아세테이트(10 mL)에 용해시키고 시클로헥산(100 mL)으로 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 시클로헥산(50 mL)으로 세척하고, 동결건조시켜 N-(4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보닐)-N-(2-(4-(디플루오로메틸)-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)글리신(11)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.59 g(82%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.87 (bs, 1 H); 9.66-9.33 (m, 2 H); 8.95-6.68 (m, 7 H); 5.15 (d, J=11.9 Hz, 4 H); 4.39-3.94 (m, 2 H); 3.76-3.37 (m, 4 H). LC-MS: 539.1(M+H)+.
실시예 39: 1-( 터트 -부틸)-5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-(2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ 6 -술파닐리덴)아미노)아세틸)- L -글루타메이트
Figure 112021111337418-pct00156
이어서, 건조 디클로로메탄(37 mL) 및 트리메틸아민(1.53 mL, 11.0 mmol)을 실시예 33에서 제조된 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세테이트(1, 2.78 g, 3.66 mmol) 및 (S)-4-아미노-5-(터트-부톡시)-5-옥소펜탄산(2, H-Glu-OtBu, 891 mg, 4.39 mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 초음파 처리하여 용액을 수득하고, 이를 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(200 mL)에 재용해시켰다. 생성된 용액을 0.5 M 염산 수용액(3 x 50 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(50 mL)에 재용해시키고, 에틸 아세테이트(20 mL) 중 피나콜(432 mg, 3.66 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 진공에서 증발시켜 (S)-5-(터트-부톡시)-5-옥소-4-(2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)아세트아미도)펜탄산(3)을 연황색 발포체로서 수득하였다. 수율: 3.07 g(99%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.57 (d, J=12.7 Hz, 2 H); 8.40 (dd, J=8.3 and 0.7 Hz, 2 H); 8.25 (s, 2 H); 7.96 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 4.57 (m, 1 H); 3.71 (dd, J=22.9 and 17.4 Hz, 2 H); 2.53-2.43 (m, 2 H); 2.37-2.24 (m, 1 H); 2.15-2.02 (m, 1 H); 1.47 (s, 9 H); 1.37 (s, 24 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.64 (s). LC-MS: 683.4(M-2 x 피나콜-H)-.
이어서, N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC, 1.84 g, 7.19 mmol) 및 피리딘(0.58 mL, 7.19 mmol)을 건조 아세토니트릴(18 mL) 중 (S)-5-(터트-부톡시)-5-옥소-4-(2-((옥소비스(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-λ6-술파닐리덴)아미노)-아세트아미도)펜탄산(3, 3.05 g, 3.59 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 밤새 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 용액을 증발건조시키고 잔류물을 에틸 아세테이트(250 mL)와 0.5 M 염산 수용액(100 mL) 사이에서 분리시켰다. 상을 분리시키고, 유기상을 0.5 M 염산 수용액(4 x 100 mL) 및 염수(70 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(40 mL)에 용해시키고, 이어서 피나콜(636 mg, 5.39 mmol)을 첨가하였다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(50 mL)으로부터 증발시켰다. 생성된 발포체를 시클로헥산(3 x 50 mL)으로 분말화하고; 생성된 반고체를 부어내고, 디클로로메탄(50 mL)에 용해시키고, 진공에서 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(3 x 50 mL)으로부터 증발시키고 진공에서 건조시켜 표제 화합물(4)을 백색 발포체로서 수득하였다. 수율: 2.82 g(83%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.57 (s, 1 H); 8.51 (s, 1 H); 8.43 (s, 1 H); 8.31 (s, 1 H); 8.25 (s, 1 H); 8.24 (s, 1 H); 7.77 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 4.60 (m, 1 H); 3.73 (dd, J=39.6 and 17.3 Hz, 2 H); 2.82 (s, 4 H); 2.79-2.62 (m, 2 H); 2.43-2.30 (m, 1 H); 2.20-2.06 (m, 1 H); 1.49 (s, 9 H); 1.36 (s, 24 H). 19F NMR 스펙트럼 (282 MHz, CDCl3, δF): -62.63 (s). LC-MS: 864.5(M-피나콜+H)+, 946.7(M+H)+.
실시예 40: ( S )-5-( 터트 -부톡시)-4-(2-(1-히드록시- N- (2-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄산
Figure 112021111337418-pct00157
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100 내지 200 메쉬 1.5 mmol/g(1, 4.39 g, 6.59 mmol)을 건조 디클로로메탄(30 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(30 mL) 중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노) 펜탄디오산 1-터트-부틸 에스테르(Fmoc-Glu-OtBu, 1.87 g, 4.39 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.91 mL, 16.7 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(1.53 mL, 8.78 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 40 mL). 이어서, 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 30 mL), 디클로로메탄(2 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 20분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 N-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-N-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)에틸)글리신(Fmoc-AEG(Fmoc)-OH, 3.71 g, 6.59 mmol), 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸-1H-[1,2,3]트리아졸[4,5-b]피리딘 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU, 2.50 g, 6.59 mmol) 및 2,4,6-트리메틸피리딘(1.57 mL, 11.9 mmol)을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 40 mL), 디클로로메탄(2 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL)으로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 펜타플루오로페닐 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실레이트(2, 5.43 g, 13.2 mmol) 및 트리에틸아민(4.90 mL, 35.1 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(6 x 40 mL) 및 디클로로메탄(10 x 50 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(60 mL)로 16시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 50 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발시키고; 잔류물을 1 M 황산칼륨 수용액(50 mL) 및 에틸 아세테이트(2 x 70 mL)로 추출하고, 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 미정제 생성물을 에틸 아세테이트/시클로헥산(1:10, 40 mL)으로부터 침전시키고, 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.063 내지 0.200 mm; 용리액: 아세토니트릴/물 10:1)로 정제하고, 동결건조시켜 (S)-5-(터트-부톡시)-4-(2-(1-히드록시-N-(2-(1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)에틸)-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복사미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄산(3)을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.50 g(45%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, δH): 8.44 (s, 1 H); 8.24 (s, 1 H); 8.05 (s, 1 H); 7.77 (s, 1 H); 5.25 (d, J=17.1 Hz, 4 H); 4.70-4.25 (m, 3 H); 4.03-3.67 (m, 4 H); 2.49 (bs, 2 H); 2.22 (bs, 1 H); 1.49 (s, 9 H). LC-MS: 760.3(M+H)+.
실시예 41: 1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산
Figure 112021111337418-pct00158
N-브로모숙신이미드(NBS, 88.1 g, 495 mmol)를 50% 황산 수용액(270 mL) 중 4-메틸벤조니트릴(58.6 g, 500 mmol)의 차가운 현탁액(10oC)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10oC의 어두운 곳에서 40시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 여과하고 필터 케이크를 물(100 ml)로 세척하고 에틸 아세테이트(800 mL)에 용해시켰다. 에틸 아세테이트 중 미정제 생성물의 용액을 물(400 mL), 탄산나트륨 포화 수용액(2 x 400 mL) 및 염수(200 mL)로 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조시켜 미정제 3-브로모-4-메틸벤조니트릴을 황색 결정으로서 수득하였다. 생성물을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 90.70 g(92%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.45. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.82 (d, J=1.5 Hz, 1 H); 7.50 (dd, J=7.9 and 1.7 Hz, 1　H); 7.34 (d, J=7.9, 1 H); 2.47 (s, 3 H).
과산화벤조일(1 g) 및 N-브로모숙신이미드(NBS, 96.3 g, 541 mmol)를 테트라클로로메탄(1.00 L) 중 3-브로모-4-메틸벤조니트릴(90.7 g, 463 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 환류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 냉각시키고, 디클로로메탄(500 mL)으로 희석하고, 물(2 x 500 mL)로 추출하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조시켜 미정제 3-브로모-4-(브로모메틸)벤조니트릴을 갈색 오일로서 수득하였다. 수율: 135 g. RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 9:1): 0.45.
아세트산칼륨(98.1 g, 1.00 mol)을 아세토니트릴(700 mL) 중 전술한 미정제 3-브로모-4-(브로모메틸)벤조니트릴(135 g)의 차가운 용액(4oC)에 첨가하였다. 혼합물을 70oC에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(800 mL)로 희석시키고, 물(2 x 500 mL)로 추출하였다. 유기상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.060 mm; 용리액: 헥산/에틸 아세테이트 20:1 내지 5:1)로 정제하여 2-브로모-4-시아노벤질 아세테이트를 백색 결정으로서 수득하였다. 수율: 60.90 g(2단계에 걸쳐 52%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 4:1): .0.30. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.87 (d, J=1.5 Hz, 1 H); 7.64 (dd, J=8.1 and 1.7 Hz, 1　H); 7.53 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 5.22 (s, 2 H); 2.19 (s, 3 H).
아르곤 분위기 하에서, 2-브로모-4-시아노벤질 아세테이트(60.0 g, 236 mmol), 아세트산칼륨(46.3 g, 472 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(65.9 g, 259 mmol) 및 디클로로메탄(5 g)을 첨가한 [1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) 복합체를 탈기한 1,4-디옥산(800 mL)에 용해시키고 혼합물을 18시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 여과하고 여과물을 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(800 mL)에 재용해시켰다. 용액을 물(2 x 400 mL) 및 염수(400 mL)로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.060 mm; 용리액: 헥산/에틸 아세테이트 8:1)로 정제하여 4-시아노-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트 백색 결정을 수득하였다. 수율: 48.80 g(69%). RF(SiO2, 헥산/에틸 아세테이트 4:1): 0.35. 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 8.13 (d, J=1.7 Hz, 1 H); 7.71 (dd, J=7.9 and 1.9 Hz, 1　H); 7.49 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 5.42 (s, 2 H); 2.13 (s, 3 H).
메탄올(300 mL) 중 수산화나트륨(13.1 g, 327 mmol)의 용액을 메탄올(300 mL) 중 4-시아노-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트(44.8 g, 149 mmol)의 용액에 30°C에서 적가하였다. 반응 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 테트라히드로푸란(200 mL)에 용해시켰다. 2 M 염산 수용액(660 mL)을 첨가하고, 생성된 현탁액을 10분 동안 교반하였다. 현탁액을 10°C까지 냉각시키고 여과하였다. 필터 케이크를 물(100 mL) 및 n-헥산(100 mL)으로 세척하여 1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보니트릴을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 20.15 g(85%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 9.55 (bs, 1 H); 8.09 (s, 1 H); 7.90 (d, J=8.1 Hz, 1　H); 7.63 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 5.07 (s, 2 H).
농축 염산(1.50 L) 중 1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카보니트릴(20.15 g, 127 mmol)의 현탁액을 24시간 동안 환류시키고 10oC까지 냉각시켰다. 현탁액을 여과하고 여과 케이크를 물(300 mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 물(500 mL)에 현탁시키고 동결건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(500 mL)에 현탁시키고 여과하였다. 필터 케이크를 디클로로메탄(200 mL)으로 세척하고 진공에서 건조시켜 1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 12.30 g(55%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.92 (s, 1H); 9.36 (s, 1 H); 8.37 (s, 1 H); 8.04 (dd, J=7.9 and 0.9 Hz, 1 H); 7.52 (d, J=8.1 Hz, 1 H); 5.05 (s, 2 H). LC-MS m/z: 178.2(M+H).
실시예 42: 1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산
Figure 112021111337418-pct00159
1-히드록시-4-(트리플루오로메틸)-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산은 실시예 28에 기술된 바와 같이 제조되었다.
실시예 43: 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산
Figure 112021111337418-pct00160
황산(96%, 400 mL) 중 3-플루오로-4-메틸벤조산(1, 61.7 g, 400 mmol)의 강하게 교반된 용액을 외부 얼음 수조로 냉각시키고, N-브로모숙신이미드(72.0 g, 405 mmol)를 3 부분으로 나누어 20분 동안 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, N-브로모숙신이미드의 또 다른 양(72.0 g, 405 mmol)을 한 번에 첨가하고, 전체 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 생성된 현탁액을 얼음물(3.00 L)로 희석하고 10분 동안 교반하였다. 고형분을 여과하고, 물(200 mL)로 세척하고, 물(3 x 600 mL)로 분쇄하고, 가능한 한 많이 빨아들였다. 습식 고형분을 물(400 mL)에 현탁시키고, 실온에서 교반하고, 수산화나트륨(50.0 g, 물 200 mL 중 1.25 mol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 밤새 40°C로 가열하였다. 약간 혼탁한 용액을 여과하여 투명한 황색 여과물을 수득하고, 여기에 이황화칼륨 용액(180 g, 400 mL 물 중 1.32 mol)을 첨가하였다. 백색 침전물을 디클로로메탄/테트라히드로푸란 4:1의 혼합물(2 x 500 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켜 건조시켜 백색 고체 잔류물을 수득하였다. 염화티오닐(30.0 mL, 413 mmol)을 무수 메탄올(500 mL) 중 이 잔기의 교반되고 냉각된(-78°C) 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시킨 후 60°C까지 밤새 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고 밤새 4°C로 유지시켰다. 결정질 물질을 여과하고, 메탄올(2 x 50 mL), 터트-부틸 메틸 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고 진공에서 건조시켜 메틸 2,3-디브로모-5-플루오로-4-메틸벤조에이트(2)를 무색 결정으로서 수득하였다. 수율: 78.2 g(60%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.37 (d, J=9.0 Hz, 1 H); 3.94 (s, 3 H); 2.46 (d, J=2.3 Hz, 3 H). LC-MS m/z: 327.2(M+H)+.
프로피온산(100 mL) 중 미세 분말 구리(44.0 g, 692 mmol) 및 메틸 2,3-디브로모-5-플루오로-4-메틸벤조에이트(2, 75.2 g, 231 mmol)의 현탁액을 교반하고, 85 내지 90°C에서 6시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 시클로헥산/톨루엔(3:1, 800 mL)의 혼합물로 희석시켰다. 반응 혼합물을 물(3 x 200 mL), 10% 중황산칼륨 수용액(2 x 200 mL) 및 염수(2 x 300 mL)로 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켜 황색 오일을 수득하고, 이를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.060 mm; 용리액: 시클로헥산/톨루엔 3:1)로 정제하여 메틸 3-브로모-5-플루오로-4-메틸벤조에이트(3)를 무색 결정으로서 수득하였다. 수율: 52.5 g(92%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, δH): 7.51 (s, 1 H); 7.37 (d, J=9.0 Hz, 1 H); 3.86 (s, 3 H); 2.37 (d, J=2.4 Hz, 3 H). LC-MS m/z: 347.3(M+H)+.
메틸 3-브로모-5-플루오로-4-메틸벤조에이트(3, 51.9 g, 210 mmol)를 무수 1,4-디옥산(400 mL), 무수 아세트산칼륨(65.3 g, 666 mmol) 및 비스(피나콜라토)디보론(4, 75.1 g, 296 mmol)에 실온에서 용해시키고, 이 혼합물을 탈기하였다. 1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(1.88 g, 2.57 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 75°C로 40시간 동안 가열하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축시키고 톨루엔(1.1 L)에 용해시키고 물(2 x 200 mL)로 추출하였다. 유기 용액을 무수 황산나트륨을 사용하여 건조시키고, 감압 하에서 증발시킨 후, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040 내지 0.063 mm; 용리액: 톨루엔/에틸 아세테이트 9:1)로 정제하여 메틸 3-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(5)를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 50.0 g(81%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 8.20 (s, 1 H); 7.70 (d, J=10.0 Hz, 1 H); 3.85 (s, 3 H); 2.50 (s, 3 H); 1.36 (s, 12 H). LC-MS m/z: 295.4(M+H)+.
아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 0.86 g, 5.20 mmol) 및 N-브로모숙신이미드(NBS, 25.4 g, 143 mmol)를 1,2-디클로로에탄(200 mL) 중 메틸 3-플루오로-4-메틸-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(5, 40.0 g, 136 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 디클로로메탄(500 mL)으로 희석시키고, 물(2 x 500 mL)로 추출하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조시켜 메틸 4-(브로모메틸)-3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6)를 황색 결정으로서 수득하였다. 생성물을 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 35.5 g(70%). LC-MS m/z: 373.4(M+H)+.
메틸 4-(브로모메틸)-3-플루오로-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤조에이트(6, 7.46 g, 20.0 mmol)를 2.5 M 수산화나트륨 수용액(40.0 mL, 100 mmol)과 함께 실온에서 밤새 교반하였다. 6 M 염산 수용액(20.0 mL, 120 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하고 4°C에서 밤새 유지시켰다. 백색 침전물을 여과로 수집하고 물(2 x 100 mL)로 세척하고 공기 건조시켜 4-플루오로-1-히드록시-1,3-디히드로벤조[c][1,2]옥사보롤-6-카복실산(7)을 백색 고체로서 수득하였고, 이는 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 수율: 3.76 g(96%). 1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, DMSO-d6, δH): 12.8 (s, 1 H); 9.57 (s, 1 H); 8.20 (s, 1 H); 7.72 (d, J=7.1 Hz, 1 H); 5.14 (s, 2 H). LC-MS m/z: 197.4(M+H)+.
인슐린 유도체의 제조
C18 컬럼 및 물 중 0.1% TFA를 완충액 A로서, 아세토니트릴 중 0.1% TFA를 완충액 B로서 사용하여 LCMS 분석을 수행하였다.
보론-인슐린 유도체의 LCMS는 대체로 탈수된 종을 주요 피크로서 나타낸다:
[M + nH - 2 x m M물]n+, 이온화 상태에 대해 "n", 및 보론산의 수에 대해 "m"
[M + nH - 1 x m M물]n+, 이온화 상태에 대해 "n", 및 보록솔의 수에 대해 "m"
즉, [M + 5H - 2 x (4 x 18.015)]5+는, 4개의 보론산을 갖는 유도체의 5가 이온 상태임.
[M + 4H - x(물)]4+ 및 [M + 5H - x(물)]5+에 대해 측정되고 계산된 값은 표 2에 도시되어 있다(실시예 B에 도시됨).
실시예에서의 인슐린 접합체는 아미노산에 대한 표준 단일 글자 약어를 사용하여 나타낸다. 시스테인 잔기의 황 원자는 이황화 브릿지를 예시하기 위해 구체적으로 나타낸다. 접합에 의해 변형된 잔기는 관련 아미노산에서의 변형이 발생한 위치를 정확하게 나타내기 위해 표현된다. 펩티드 화학식에서의 표준인 바와 같이, 인슐린의 N-말단은 작은 글씨체 H-로 표시되고, C-말단은 작은 글씨체 -OH로 표시된다. H- 및 -OH는 말단 잔기가 접합에 의해 변형될 경우 사용되지 않으며, 이 경우 전술한 바와 같이 잔기는 확장된다. 인간 인슐린에서의 치환은 일부 경우에 작은 글씨체 별표(*)로 도시된다.
이미 숙신이미딜 에스테르가 아닌 빌딩 블록은, 인슐린과 접합하기 전에 아세토니트릴 또는 THF 중 HONSU/DIC 또는 TSTU를 사용하여 활성화된다.
실시예 101:
Figure 112021111337418-pct00161
A22K desB30 인간 인슐린(500 mg, 0.086 mmol)을 0.1 M 탄산나트륨(5 mL), pH 10.5에 용해시켰다. 실시예 2의 빌딩 블록(146 mg, 0.189 mmol)을 MeCN(5 mL)에 용해시키고 전술한 인슐린 용액에 첨가하였다. pH를 모니터링하고 10.5에 가깝게 유지하였다. 30분 후, LCMS는 목적하는 생성물의 형성을 나타냈다. 혼합물을 물(11 mL) 중 20% MeCN으로 희석하고 TFA를 사용하여 pH를 1.5로 조정하였다. 생성물을 C18 컬럼 상에서 물 중 0.1% TFA을 완충액 A로, 아세토니트릴 중 0.1% TFA을 완충액 B로 사용하는 역상 HPLC(RP-HPLC)로 정제하였다. 생성물을 동결건조하여 단리하였다. LCMS는 1670.4[M + 4H - 8 x 물]4+로 측정하였고, 1670.6으로 계산되었다(표 2 참조)(실시예 B에 나타냄).
실시예 102:
Figure 112021111337418-pct00162
실시예 102의 인슐린 유도체는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 3의 빌딩 블록으로부터 실시예 101의 인슐린 유도체와 유사하게 제조되었다. 생성물의 LCMS는 1689.0[M + 4H - 8 x 물]4+로 측정되었고, 1689.2로 계산되었다.
실시예 103:
Figure 112021111337418-pct00163
실시예 103의 인슐린 유도체는 desB30 인간 인슐린(232 mg, 0.041 mmol)을 DMSO에 용해시키고 DMSO 중 실시예 4의 빌딩 블록(35.6 mg, 0.045 mmol)을 NMM(1.22 mmol, 135.5 uL)과 함께 첨가함으로써 제조되었다. 생성물을 C18 컬럼 상에서 물 중 0.1% TFA을 완충액 A로, 아세토니트릴 중 0.1% TFA을 완충액 B로 사용하는 역상 HPLC(RP-HPLC)로 정제하고 동결건조하여 단리하였다. 생성물의 LCMS는 1663.0[M + 4H - 4 x 물]4+로 측정되었고, 1664.1로 계산되었다.
실시예 104:
Figure 112021111337418-pct00164
실시예 104의 인슐린 유도체는 desB30 인간 인슐린 및 4-카르시-벤조보록솔, 리신 및 베타-알라닌을 사용하여 제조된 실시예 4의 빌딩 블록 유사체로부터, 실시예 103의 인슐린 유도체와 유사하게 제조되었다.
실시예 105:
Figure 112021111337418-pct00165
DesB30 인간 인슐린(400 mg)을 0.1 M AcOH(5 mL)에 용해시키고, 0.1 N NaOH를 사용하여 pH를 3.5로 조정하였다. 실시예 6의 알데히드 링커 용액(200 mg)을 DMF(0.5 ml)에 용해시키고 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, NMP(0.5 mL)에 용해시킨 피콜린 보란(44 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물(20 mL)을 첨가하고, 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 1로 조정하고, 생성물을 HPLC로 정제하였다. 연장부에서의 리신 상의 Boc 기를 TFA를 사용하여 제거하였다. 비스-리신 인슐린 중간체(33 mg)를 0.2 M Na2CO3(0.400 mL)에 용해시키고, pH를 10.5로 조정하였다. 실시예 2의 디보로네이트 숙신이미딜 에스테르(2.5 당량, 0.6 mg)를 아세토니트릴(340 uL)에 용해시키고 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 교반하고, 반응의 진행을 LCMS로 모니터링하고, 생성물을 실시예 101과 유사하게 HPLC로 단리하였다. LCMS는 1827.3[M + 4H - 4 x 물]4+로 측정되었고, 1827.3으로 계산되었다.
실시예 106:
Figure 112021111337418-pct00166
실시예 106은 실시예 7의 빌딩 블록을 사용하여 실시예 105와 유사하게 제조되었다. LCMS는 1724.3으로 측정되었고, 1724.2로 계산되었다.
실시예 107:
Figure 112021111337418-pct00167
실시예 107은 실시예 7의 빌딩 블록을 사용하여 실시예 105와 유사하게 제조되었다. LCMS는 1640.8로 측정되었고, 1640.9로 계산되었다.
실시예 108:
Figure 112021111337418-pct00168
실시예 108은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 7의 빌딩 블록으로부터, 실시예 107과 유사하게 제조되었다. LCMS는 1987.5로 측정되었고, 1987.5로 계산되었다.
실시예 109:
Figure 112021111337418-pct00169
A22K desB30 인간 인슐린(500 mg, 0.086 mmol)을 0.2 M 탄산나트륨 완충액(6 mL), pH 10.8에 용해시켰다. 실시예 7의 빌딩 블록(307 mg, 0.189 mmol)을 MeCN(6 mL)에 용해시켰다. 10분 후, LCMS는 기대 생성물을 나타냈고, 이를 HPLC로 정제하였다.
실시예 110:
Figure 112021111337418-pct00170
A22K desB30 인간 인슐린(435 mg, 0.075 mmol)을 0.2 M 탄산나트륨 완충액(10 mL), pH 10.8에 용해시켰다. 숙신이미딜 에스테르(MeCN 중 TSTU/DIEA 사용)로서 활성화된 실시예 8의 빌딩 블록(279 mg, 0.164 mmol)을 MeCN(6 mL)에 용해시켰다. 10분 후, LCMS는 기대 생성물을 나타냈고, 이를 HPLC로 정제하였다. LCMS는 1643.7[M + 5H - 8 x 물]5+로 측정되었고, 1643.7로 계산되었다.
실시예 111:
Figure 112021111337418-pct00171
실시예 111은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 7의 빌딩 블록으로부터, 실시예 103과 유사하게 제조되었다.
실시예 112:
Figure 112021111337418-pct00172
실시예 112는 A22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 7의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 113:
Figure 112021111337418-pct00173
실시예 113은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 114:
Figure 112021111337418-pct00174
실시예 114는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 115:
Figure 112021111337418-pct00175
실시예 115는 B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 3의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 116:
Figure 112021111337418-pct00176
실시예 116은 B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 117:
Figure 112021111337418-pct00177
실시예 117은 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 118:
Figure 112021111337418-pct00178
실시예 118은 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 119:
Figure 112021111337418-pct00179
실시예 119는 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 120:
Figure 112021111337418-pct00180
실시예 120은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 11의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 121:
Figure 112021111337418-pct00181
실시예 121은 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 122:
Figure 112021111337418-pct00182
실시예 122는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 12의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 123:
Figure 112021111337418-pct00183
실시예 123은 B1-GKPRGFFYTPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 124:
Figure 112021111337418-pct00184
실시예 124는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 13의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 125:
Figure 112021111337418-pct00185
실시예 125는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 14의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 126:
Figure 112021111337418-pct00186
실시예 126은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 127:
Figure 112021111337418-pct00187
실시예 127은 우선적으로 인슐린을 감마-아미노부티르산으로 아실화한 후, 실시예 15의 빌딩 블록에 의해, A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 128:
Figure 112021111337418-pct00188
실시예 128은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 129:
Figure 112021111337418-pct00189
실시예 129는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 3의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 130:
Figure 112021111337418-pct00190
실시예 130은 A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 131:
Figure 112021111337418-pct00191
실시예 131은 우선적으로 인슐린을 감마-아미노부티르산으로 아실화한 후, 실시예 9의 빌딩 블록에 의해, A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 132:
Figure 112021111337418-pct00192
실시예 132는 우선적으로 인슐린을 감마-아미노부티르산으로 아실화한 후, 실시예 15의 빌딩 블록에 의해, B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 133:
Figure 112021111337418-pct00193
실시예 133은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 134:
Figure 112021111337418-pct00194
실시예 134는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 135:
Figure 112021111337418-pct00195
실시예 135는 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 136:
Figure 112021111337418-pct00196
실시예 136은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 137:
Figure 112021111337418-pct00197
실시예 137은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 138:
Figure 112021111337418-pct00198
실시예 138은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 139:
Figure 112021111337418-pct00199
실시예 139는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 140:
Figure 112021111337418-pct00200
실시예 140은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 141:
Figure 112021111337418-pct00201
실시예 141은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 142:
Figure 112021111337418-pct00202
실시예 142는 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 143:
Figure 112021111337418-pct00203
실시예 143은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 144:
Figure 112021111337418-pct00204
실시예 144는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 145:
Figure 112021111337418-pct00205
실시예 145는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 146:
Figure 112021111337418-pct00206
실시예 146은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 147:
Figure 112021111337418-pct00207
실시예 147은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 10의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 148:
Figure 112021111337418-pct00208
실시예 148은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 17의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 149:
Figure 112021111337418-pct00209
실시예 149는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 150:
Figure 112021111337418-pct00210
실시예 150은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 18의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 151:
Figure 112021111337418-pct00211
실시예 151은 A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 152:
Figure 112021111337418-pct00212
실시예 152는 A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 153:
Figure 112021111337418-pct00213
실시예 153은 A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 154:
Figure 112021111337418-pct00214
실시예 154는 A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린 및 실시예 19의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 155:
Figure 112021111337418-pct00215
실시예 155는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 19의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 156:
Figure 112021111337418-pct00216
실시예 156은 A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 15의 빌딩 블록으로부터, 실시예 103과 유사하게 제조되었다.
실시예 157:
Figure 112021111337418-pct00217
실시예 157은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 19의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 158:
Figure 112021111337418-pct00218
실시예 158은 A14E A22K B25H B27P B28G desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 159:
Figure 112021111337418-pct00219
실시예 159는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 160:
Figure 112021111337418-pct00220
실시예 160은 B1-TYFFGRKPDGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 161:
Figure 112021111337418-pct00221
실시예 161은 A-2K A-1P desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 162:
Figure 112021111337418-pct00222
실시예 162는 A22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 163:
Figure 112021111337418-pct00223
실시예 163은 A22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 164:
Figure 112021111337418-pct00224
실시예 164는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 165:
Figure 112021111337418-pct00225
실시예 165는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 166:
Figure 112021111337418-pct00226
실시예 166은 A14E A22K B25H desB27 desB30 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 167:
Figure 112021111337418-pct00227
실시예 167은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 168:
Figure 112021111337418-pct00228
실시예 168은 A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린 및 실시예 2의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 169:
Figure 112021111337418-pct00229
실시예 169는 A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 170:
Figure 112021111337418-pct00230
실시예 170은 A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 171:
Figure 112021111337418-pct00231
실시예 171은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 9의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 172:
Figure 112021111337418-pct00232
실시예 172는 A22K B22K B29R desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 173:
Figure 112021111337418-pct00233
실시예 173은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 174:
Figure 112021111337418-pct00234
실시예 174는 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 175:
Figure 112021111337418-pct00235
실시예 175는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 176:
Figure 112021111337418-pct00236
실시예 176은 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 177:
Figure 112021111337418-pct00237
실시예 177은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 103과 유사하게 제조되었다.
실시예 178:
Figure 112021111337418-pct00238
실시예 178은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 103과 유사하게 제조되었다.
실시예 179:
Figure 112021111337418-pct00239
실시예 179는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 180:
Figure 112021111337418-pct00240
실시예 180은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 181:
Figure 112021111337418-pct00241
실시예 181은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 182:
Figure 112021111337418-pct00242
실시예 182는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 183:
Figure 112021111337418-pct00243
실시예 183은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 184:
Figure 112021111337418-pct00244
실시예 184는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 19의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 185:
Figure 112021111337418-pct00245
실시예 185는 desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 186:
Figure 112021111337418-pct00246
실시예 186은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 187:
Figure 112021111337418-pct00247
실시예 187은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 188:
Figure 112021111337418-pct00248
실시예 188은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 189:
Figure 112021111337418-pct00249
실시예 189는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 190:
Figure 112021111337418-pct00250
실시예 190은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 191:
Figure 112021111337418-pct00251
실시예 191은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 192:
Figure 112021111337418-pct00252
실시예 192는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 193:
Figure 112021111337418-pct00253
실시예 193은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 19의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 194:
Figure 112021111337418-pct00254
실시예 194는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 195:
Figure 112021111337418-pct00255
실시예 195는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 196:
Figure 112021111337418-pct00256
실시예 196은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 26의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 197:
Figure 112021111337418-pct00257
실시예 197은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 198:
Figure 112021111337418-pct00258
실시예 198은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 199:
Figure 112021111337418-pct00259
실시예 199는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 200:
Figure 112021111337418-pct00260
실시예 200은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 201:
Figure 112021111337418-pct00261
실시예 201은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 25의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 202:
Figure 112021111337418-pct00262
실시예 202는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 27의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 203:
Figure 112021111337418-pct00263
실시예 203은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 23의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 204:
Figure 112021111337418-pct00264
실시예 204는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 205:
Figure 112021111337418-pct00265
실시예 205는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 206:
Figure 112021111337418-pct00266
실시예 206은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 207:
Figure 112021111337418-pct00267
실시예 207은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 27의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 208:
Figure 112021111337418-pct00268
실시예 208은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 209:
Figure 112021111337418-pct00269
실시예 209는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 210:
Figure 112021111337418-pct00270
실시예 210은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 26의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 211:
Figure 112021111337418-pct00271
실시예 211은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 212:
Figure 112021111337418-pct00272
실시예 212는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 213:
Figure 112021111337418-pct00273
실시예 213은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 214:
Figure 112021111337418-pct00274
실시예 214는 desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 215:
Figure 112021111337418-pct00275
실시예 215는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 216:
Figure 112021111337418-pct00276
실시예 216은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 217:
Figure 112021111337418-pct00277
실시예 217은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 218:
Figure 112021111337418-pct00278
실시예 218은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 219:
Figure 112021111337418-pct00279
실시예 219는 desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 220:
Figure 112021111337418-pct00280
실시예 220은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 221:
Figure 112021111337418-pct00281
실시예 221은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 222:
Figure 112021111337418-pct00282
실시예 222는 desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 223:
Figure 112021111337418-pct00283
실시예 223은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 224:
Figure 112021111337418-pct00284
실시예 224는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 225:
Figure 112021111337418-pct00285
실시예 225는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 226:
Figure 112021111337418-pct00286
실시예 226은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다,
실시예 227:
Figure 112021111337418-pct00287
실시예 227은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 228:
Figure 112021111337418-pct00288
실시예 228은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 229:
Figure 112021111337418-pct00289
실시예 229는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 230:
Figure 112021111337418-pct00290
실시예 230은 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 231:
Figure 112021111337418-pct00291
실시예 231은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 232:
Figure 112021111337418-pct00292
실시예 232는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 20의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 233:
Figure 112021111337418-pct00293
실시예 233은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 234:
Figure 112021111337418-pct00294
실시예 234는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 235:
Figure 112021111337418-pct00295
실시예 235는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 236:
Figure 112021111337418-pct00296
실시예 236은 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 31의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 237:
Figure 112021111337418-pct00297
실시예 237은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 31의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 238:
Figure 112021111337418-pct00298
실시예 238은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 31의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 239:
Figure 112021111337418-pct00299
실시예 239는 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 240:
Figure 112021111337418-pct00300
실시예 240은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 241:
Figure 112021111337418-pct00301
실시예 241은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 242:
Figure 112021111337418-pct00302
실시예 242는 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 24의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 243:
Figure 112021111337418-pct00303
실시예 243은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 244:
Figure 112021111337418-pct00304
실시예 244는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 245:
Figure 112021111337418-pct00305
실시예 245는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 246:
Figure 112021111337418-pct00306
실시예 246은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 247:
Figure 112021111337418-pct00307
실시예 247은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 248:
Figure 112021111337418-pct00308
실시예 248은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 249:
Figure 112021111337418-pct00309
실시예 249는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 250:
Figure 112021111337418-pct00310
실시예 250은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 251:
Figure 112021111337418-pct00311
실시예 251은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 252:
Figure 112021111337418-pct00312
실시예 252는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 253:
Figure 112021111337418-pct00313
실시예 253은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 254:
Figure 112021111337418-pct00314
실시예 254는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 255:
Figure 112021111337418-pct00315
실시예 255는 A14E desB1-B2 B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 256:
Figure 112021111337418-pct00316
실시예 256은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 257:
Figure 112021111337418-pct00317
실시예 257은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 26의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 258:
Figure 112021111337418-pct00318
실시예 258은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 26의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 259:
Figure 112021111337418-pct00319
실시예 259는 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 260:
Figure 112021111337418-pct00320
실시예 260은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 261:
Figure 112021111337418-pct00321
실시예 261은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 262:
Figure 112021111337418-pct00322
실시예 262는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 263:
Figure 112021111337418-pct00323
실시예 263은 desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 105와 유사하게 제조되었다.
실시예 264:
Figure 112021111337418-pct00324
실시예 264는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 265:
Figure 112021111337418-pct00325
실시예 265는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 266:
Figure 112021111337418-pct00326
실시예 266은 A14E B1K B2P B25H desB27 des B30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 267:
Figure 112021111337418-pct00327
실시예 267은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 268:
Figure 112021111337418-pct00328
실시예 268은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 269:
Figure 112021111337418-pct00329
실시예 269는 A14E A22K B25H desB27 des B30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 270:
Figure 112021111337418-pct00330
실시예 270은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 271:
Figure 112021111337418-pct00331
실시예 271은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 272:
Figure 112021111337418-pct00332
실시예 272는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 273:
Figure 112021111337418-pct00333
실시예 273은 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 274:
Figure 112021111337418-pct00334
실시예 274는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 275:
Figure 112021111337418-pct00335
실시예 275는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 276:
Figure 112021111337418-pct00336
실시예 276은 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 277:
Figure 112021111337418-pct00337
실시예 277은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 278:
Figure 112021111337418-pct00338
실시예 278은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 279:
Figure 112021111337418-pct00339
실시예 279는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 280:
Figure 112021111337418-pct00340
실시예 280은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 281:
Figure 112021111337418-pct00341
실시예 281은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 282:
Figure 112021111337418-pct00342
실시예 282는 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 283:
Figure 112021111337418-pct00343
실시예 283은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 284:
Figure 112021111337418-pct00344
실시예 284는 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 285:
Figure 112021111337418-pct00345
실시예 285는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 286:
Figure 112021111337418-pct00346
실시예 286은 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 287:
Figure 112021111337418-pct00347
실시예 287은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 288:
Figure 112021111337418-pct00348
실시예 288은 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 289:
Figure 112021111337418-pct00349
실시예 289는 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 290:
Figure 112021111337418-pct00350
실시예 290은 A22K desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 291:
Figure 112021111337418-pct00351
실시예 291은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 292:
Figure 112021111337418-pct00352
실시예 292는 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 293:
Figure 112021111337418-pct00353
실시예 293은 실시예 101의 접합과 유사하게, A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린의 2개의 리신 잔기에 Boc-OEG를 접합한 후, 95% TFA를 사용하여 Boc-기를 제거하고, 실시예 101의 접합과 유사하게, 실시예 29의 빌딩 블록과 OEG의 아미노기를 접합함으로써 제조되었다.
실시예 294:
Figure 112021111337418-pct00354
실시예 294는 A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 295:
Figure 112021111337418-pct00355
실시예 295는 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 27의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 296:
Figure 112021111337418-pct00356
실시예 296은 A21Q (GES)6K desB30 인간 인슐린 및 실시예 33의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 297:
Figure 112021111337418-pct00357
실시예 297은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 298:
Figure 112021111337418-pct00358
실시예 298은 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 299:
Figure 112021111337418-pct00359
실시예 299는 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 300:
Figure 112021111337418-pct00360
실시예 300은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 301:
Figure 112021111337418-pct00361
실시예 301은 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 302:
Figure 112021111337418-pct00362
실시예 302는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 303:
Figure 112021111337418-pct00363
실시예 303은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 304:
Figure 112021111337418-pct00364
실시예 304는 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 305:
Figure 112021111337418-pct00365
실시예 305는 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 306:
Figure 112021111337418-pct00366
실시예 306은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 307:
Figure 112021111337418-pct00367
실시예 307은 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 308:
Figure 112021111337418-pct00368
실시예 308은 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 309:
Figure 112021111337418-pct00369
실시예 309는 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 310:
Figure 112021111337418-pct00370
실시예 310은 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 311:
Figure 112021111337418-pct00371
실시예 311은 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 22의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 312:
Figure 112021111337418-pct00372
실시예 312는 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 16의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 313:
Figure 112021111337418-pct00373
실시예 313은 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 314:
Figure 112021111337418-pct00374
실시예 314는 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 315:
Figure 112021111337418-pct00375
실시예 315는 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 316:
Figure 112021111337418-pct00376
실시예 316은 A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 317:
Figure 112021111337418-pct00377
실시예 317은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 318:
Figure 112021111337418-pct00378
실시예 318은 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 35의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 319:
Figure 112021111337418-pct00379
실시예 319는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 320:
Figure 112021111337418-pct00380
실시예 320은 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 321:
Figure 112021111337418-pct00381
실시예 321은 A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 322:
Figure 112021111337418-pct00382
실시예 322는 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 323:
Figure 112021111337418-pct00383
실시예 323은 B1-GKPG desB30 인간 인슐린 및 실시예 34의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 324:
Figure 112021111337418-pct00384
실시예 324는 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 325:
Figure 112021111337418-pct00385
실시예 325는 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 326:
Figure 112021111337418-pct00386
실시예 326은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 327:
Figure 112021111337418-pct00387
실시예 327은 A14E B-1G B1K B2P desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 328:
Figure 112021111337418-pct00388
실시예 328은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 329:
Figure 112021111337418-pct00389
실시예 329는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 330:
Figure 112021111337418-pct00390
실시예 330은 A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린 및 실시예 28의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 331:
Figure 112021111337418-pct00391
실시예 331은 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 332:
Figure 112021111337418-pct00392
실시예 332는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 333:
Figure 112021111337418-pct00393
실시예 333은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 334:
Figure 112021111337418-pct00394
실시예 334는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 335:
Figure 112021111337418-pct00395
실시예 335는 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 39의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 336:
Figure 112021111337418-pct00396
실시예 336은 B1-GKPG desB30 인간 인슐린 및 실시예 29의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 337:
Figure 112021111337418-pct00397
실시예 337은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 36의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 338:
Figure 112021111337418-pct00398
실시예 338은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 39의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 339:
Figure 112021111337418-pct00399
실시예 339는 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 340:
Figure 112021111337418-pct00400
실시예 340은 A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린 및 실시예 30의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 341:
Figure 112021111337418-pct00401
실시예 341은 A21Q (GES)12K desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 342:
Figure 112021111337418-pct00402
실시예 342는 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 343:
Figure 112021111337418-pct00403
실시예 343은 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 344:
Figure 112021111337418-pct00404
실시예 344는 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 345:
Figure 112021111337418-pct00405
실시예 345는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 39의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 346:
Figure 112021111337418-pct00406
실시예 346은 A14E B1K B2P B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 347:
Figure 112021111337418-pct00407
실시예 347은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 39의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 348:
Figure 112021111337418-pct00408
실시예 348은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 39의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 349:
Figure 112021111337418-pct00409
실시예 349는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 350:
Figure 112021111337418-pct00410
실시예 350은 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 37의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 351:
Figure 112021111337418-pct00411
실시예 351은 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린 및 실시예 40의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 352:
Figure 112021111337418-pct00412
실시예 352는 A14E A22K B25H desB27 desB30 인간 인슐린 및 실시예 40의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 353:
Figure 112021111337418-pct00413
실시예 353은 A21Q (GES)3K desB30 인간 인슐린 및 실시예 38의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다.
실시예 354:
Figure 112021111337418-pct00414
실시예 354는 A14E desB1-B2 B3G B4K B5P desB30 인간 인슐린 및 실시예 40의 빌딩 블록으로부터, 실시예 101과 유사하게 제조되었다. 인슐린 유도체의 감마-Glu 잔기 상의 터트-부틸 보호기를 실온에서 30 내지 60분 동안 95% TFA/물로 처리하여 제거하였다.
실시예 A: 탄수화물 및 디보로네이트 결합 친화도, 알리자린 분석(ARS)
알리자린-레드 결합 분석은 보론/보록솔 화합물의 포도당에 대한 억제 친화도를 결정하기 위해 사용되는 비색 분석이다. 분석은 보로네이트에 결합할 때의 알리자린-레드의 색상 변이에 기초하며, 이는 330 내지 340 nm 영역에서의 흡광도 변화가 뒤따를 수 있다.
알리자린에 대한 보론 화합물의 해리 상수(K d )의 결정
알리자린 레드 나트륨(ARS)과 보로네이트 화합물 간의 해리 상수(Kd)를 결정하기 위해, 200 μM의 ARS를 20 mM의 인산염 완충액(pH 7.4)에 용해시키고, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.812, 3.906, 1.953, 0.9767, 0.488 및 0.244 mM의 보론산을 갖는 96 웰 플레이트에 3회 적정하였다. 4000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 흡광 검출을 위해 플레이트를 다중 웰 분광계(SpectraMax, Molecular Devices)에 넣었다.
분석은 각각 330, 340 및 520 nm에서의 흡광 판독으로 실온에서 수행되었다. 이어서, 흡광 대 보로네이트의 농도에 대해 수득된 데이터를 시그모이드 함수로 피팅하여(Prism 7, GraphPad) 보로네이트 및 ARS의 Kd 값을 수득하였다.
보론 화합물에 대한 포도당의 변위 상수(K d )의 결정
보로네이트와 탄수화물 간의 억제 상수(Ki)를 결정하기 위해, 400 μM의 보론산을 20 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에 약하게 교반하면서 용해시켰다. 화합물이 완전한 용해된 후, 200 μM의 알리자린 레드(ARS)를 용액에 첨가하였다. 이어서, ARS-보로네이트 용액을 적절한 탄수화물과 함께 96 다중 웰 플레이트(검고 평평하며 투명한 바닥)에 1:1로 소분하였다. 특히, D-포도당 및 L-락테이트 용액은 각각 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.25, 0.1 mM 및 2500, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 mM의 농도의 20 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에서 제조되었다. 탄수화물과 혼합된 ARS-보로네이트의 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양하였다. 4000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 흡광 검출을 위해 플레이트를 다중 웰 분광계(SpectraMax, Molecular Devices)에 넣었다.
분석은 각각 330, 340 및 520 nm에서의 흡광 판독으로 실온에서 수행되었다. 이어서, 탄수화물의 농도 대비 흡광에 대해 수득된 데이터를 ARS-보로네이트에 대해 수득된 Kd의 값 및 ARS(100 μM)의 농도에 대해 제한된 1자리 Ki 방정식으로 피팅하여(Prism 7, GraphPad) 선택된 탄수화물에 대한 보로네이트의 Ki 값을 수득하였다.
Figure 112021111337418-pct00415
표 1의 데이터는 본 발명의 화합물에 사용된 디보론 화합물이 낮은 밀리몰 범위(0.8 내지 4.2 mM)의 Kd 값으로 포도당에 결합하고, 주어진 디보론 화합물이 락테이트 대한 친화도에 비해 포도당에 대한 친화도가 더 높다는 것을 나타낸다. 표 1의 데이터는 또한 모노보론(실시예 41, 42, 43)이 본 발명의 화합물에 사용된 디보론 화합물보다 포도당에 대해 더 약한 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 모노보론은 포도당 농도에 대한 생리학적 범위의 변동에 잘 반응하지 않는다.
실시예 B: 포도당의 부재 또는 존재 하에서의 인간 인슐린 수용체(hIR-A)에 대한 친화도를 결정하기 위한 분석
인슐린 수용체 제조
인간 인슐린 수용체 A(hIR-A)를 과발현하는 BHK 세포를 50 mM Hepes(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA 및 10% 글리세롤에서 용해시켰다. 투명해진 세포 용해물을 밀 생식 아글루티닌(WGA)-아가로즈(독일 Sigma-Aldrich Steinheim, L1394, Triticum vulgaris-Agarose로부터의 렉틴)로 90분 동안 배치 흡수하였다. 수용체를 20 부피의 50 mM Hepes(pH 8.0), 150 mM NaCl 및 0.1% Triton X-100으로 세척하고, 수용체를 50 mM Hepes(pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5 M n-아세틸 글루코사민 및 10% 글리세롤로 용리시켰다. 모든 완충제는 Andersen 등, 2017 PLos One 12에 기술된 바와 같이 Complete(Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, 독일)를 함유하였다.
인슐린 수용체 섬광 근접 분석(SPA) 결합 분석
SPA PVT 항-마우스 비드(Perkin Elmer)를 100 mM Hepes(pH 7.4 또는 pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 0.025% (v/v) Tween-20으로 구성된 SPA 결합 완충액에서 희석하였다. SPA 비드를 IR-특이적 항체 83-7(Soos 등, 1986 Biochem J. 235, 199-208) 및 가용화된 반-정제 HIR-A와 함께 배양하였다. 수용체 농도를 5000 cpm 125I-(Tyr31)-인슐린(Novo Nordisk A/S)의 10% 결합이 이루어지도록 조정하였다. 일련의 희석된 차가운 리간드를 96-웰 Optiplate에 첨가한 후, 트레이서(125I-인슐린, 5000 cpm/웰)를 첨가하고, 마지막으로 수용체/SPA 혼합물을 첨가하였다. 포도당 민감도를 시험하기 위해, 20 mM 포도당의 부재 또는 존재 하에서의 결합 실험을 설정하였다. 플레이트를 22oC에서 22.5시간 동안 부드럽게 흔들고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 TopCounter(Perkin Elmer)에서 계수하였다. 데이터 포인트를 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅하여, (동일한 플레이트 내의) 인간 인슐린과 비교한 유사체의 상대적 친화도를 결정하였다. 인간 인슐린과 비교한 유사체에 대한 상대적 친화도를 배수 변화로서 결정하였고, 0 내지 20 mM 포도당(HIR 포도당 인자)에서의 상대적 친화도의 증가는 유사체의 포도당 민감도를 반영하였다. 실험은 1.5% HSA의 존재 하에 수행되었다. 표 2는 데이터를 나타낸다.
Figure 112021111337418-pct00416
Figure 112021111337418-pct00417
Figure 112021111337418-pct00418
Figure 112021111337418-pct00419
Figure 112021111337418-pct00420
Figure 112021111337418-pct00421
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Figure 112021111337418-pct00426
Figure 112021111337418-pct00427
Figure 112021111337418-pct00428
표 1의 데이터는, 1.5% HSA의 존재 시 본 발명의 디보론 인슐린 접합체가 포도당이 존재하지 않는 경우보다 20 mM 포도당의 존재 시 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 포도당은 디보론 인슐린 접합체가 알부민에 결합하는 것을 변위시켜, 비-알부민 결합 디보론 인슐린 접합체의 더 높은 유리 분율을 제공하여, 결과적으로 더 높은 인슐린 수용체 친화도를 제공할 수 있다.
실시예 C: 포도당 민감성 신호 전달을 결정하기 위한 분석(낮은/높은 포도당에서의 AKT 인산화), 표 3.
인슐린이 인슐린 수용체(IR)에 결합할 경우, 이는 하류 신호 전달 경로의 활성화를 유도한다. 하류 신호 전달 분자 중 하나는 AKT이고, 따라서 AKT 인산화는 인슐린 신호 전달 경로의 활성화를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
AKT 분석
HIR-A를 과발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포를 37°C에서 배양하고, 3 mM 또는 20 mM 포도당 농도를 갖는 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 농도-반응 곡선을 생성하기 위해 본 발명의 인간 인슐린 또는 인슐린 유도체의 양을 증가시키고 10분 동안 배양하였다. 배지를 폐기하고 세포를 얼음 위에 놓았다. AKT 활성화 분석은 AlphaScreen® SureFire®를 사용하여 공급자에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. Envision 기기(EnVision, Perkin Elmer)로 신호를 측정하였다. 20 mM 및 3 mM 포도당 농도에서 (인간 인슐린 대비) 포도당 민감성 유사체의 효능 사이의 배수 변화를 결정하였다.
실시예 D: 세포에서의 탄수화물 민감성 포도당 흡수를 결정하기 위한 분석(랫트 지방 생성 분석)
인슐린이 인슐린 수용체에 결합할 경우, 이는 하류 신호 전달 경로의 활성화를 유도한다. 인슐린 신호 전달의 하나의 대사 종말점은 지질 대사이며, 인슐린의 존재 하에 세포에 의한 3H-포도당 흡수가 자극되고 지질에 통합되기 때문에 지질 생성 분석을 사용하여 종말점 판독을 측정하였다.
랫트 지방 생성 분석(rFFC)
스프래그 다울리 랫트(Sprague Dawley rat)의 부고환 지방 패드를 Hepes Krebs 링거 완충액 내의 콜라겐분해효소로 격렬하게 진탕한 상태에서 1 내지 1.5시간 동안 36.5oC에서 분해하였다. 현탁액을 2개 층의 거즈을 통해 여과하였다. 상을 실온에서 5분 동안 분리하여, 지방세포가 상부 상에서 수집되도록 하였다. 하부 상을 주사기로 제거하였다. 지방세포를 20 ml Hepes Krebs 링거 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 1.5% HSA, 0.5 mM 포도당, 0.1 μCi/웰 글루코스(D-[3-3H] 포도당(20.0 Ci/mmol), Perkin Elmer), +/-10 mM 소르비톨을 함유하는 Hepes Krebs 링거 완충액 중 96 웰 플레이트에 옮겼다. 농도-반응 곡선을 생성하기 위해, 증가하는 양의 본 발명의 인간 인슐린 또는 인슐린 유도체를 첨가하고 36.5°C에서 2시간 동안 배양하였다. 반응은 100 μL 마이크로시언트(Microscient) E(cat# 6013661, Perkin Elmer)를 첨가하여 중단되었다. 플레이트는 계수하기 전 상단 카운터에서 3시간 동안 휴식하였다. 포도당 감수성 유사체의 EC50 소르비톨 미함유/EC50 10 mM 소르비톨 사이의 비율을 결정하였다.
Figure 112021111337418-pct00429
Figure 112021111337418-pct00430
표 3의 AKT 데이터는 본 발명의 디보론 인슐린 접합체가 더 낮은 포도당 농도(3 mM)에 비해 더 높은 포도당 농도(20 mM)의 존재 시에 더 높은 레벨의 AKT 인산화를 제공한다는 것을 나타낸다. 표 3의 지방 생성 데이터는, 본 발명의 디보론 인슐린 접합체가 당이 첨가되지 않는 경우(0 mM 소르비톨)에 비해 더 높은 수준의 당(10 mM 소르비톨)의 존재 시에 더 높은 수준의 지방 생성(즉, 더 많은 포도당 수송)을 제공한다는 것을 나타낸다.
세포는 생존을 위해 포도당을 필요로 하기 때문에, 3 mM 글루코스를 더 낮은 수준으로, 20 mM을 더 높은 수준으로 사용하였다. rFFC 분석은 그 자체로 포도당 레벨에 민감하기 때문에, rFFC 분석에서 디보론-인슐린 유도체를 HSA로부터 변위시키기 위해 소르비톨(그 자체는 포도당 수송에 영향을 미치지 않음)을 당으로서 사용하였다.
실시예 E: PK 및 PD 데이터
65 내지 100 kg의 미처리 암컷 가축 돼지를 대상으로 정상혈당 및 고혈당 클램프를 수행하였다. 동물에게 2개의 정맥 카테터, 주입을 위한 하나 및 혈액 샘플링을 위한 하나를 삽입하였다. 기초 대체는 소마토스타틴, 글루카곤 및 인간 인슐린의 지속적인 주입으로 수행하였다. 주입 시작 후, g 포도당 주입을 조절하여 혈장 포도당 레벨을 10 mM 또는 3.5 내지 4 mM으로 변경하였다. 혈장 포도당 정상 상태 후(90 또는 120분), 인슐린 유사체의 i.v. 볼루스를 전달하였다. 약동학(PK) 분석을 위해, 360 내지 510분 동안 선택된 시점에서 혈장을 샘플링하고, 유사체에 대해 특정적으로 분석하였다. 약력학(PD) 분석을 위해, 정상 상태로부터의 포도당 주입 속도의 변화를 사용하였다.
3.5 내지 4 또는 10 mM 포도당으로 클램핑된 돼지에 대한 i.v. 투여에 의한 본 발명의 인슐린 유도체에 대한 포도당 민감성 PK 데이터는, 대조군과 함께 도 1 내지 9에 도시되어 있고, 3.5 내지 4 mM 포도당 대 10 mM 포도당에서의 클램프에 대한 곡선 하의 베이스라인-조정 포도당 주입 속도 영역으로서의 PD 데이터는 도 10에 도시되어 있다.
돼지 PK 데이터는 본 발명의 디보론 인슐린 접합체가 더 낮은 혈액 포도당 레벨(3.5 내지 4 mM)과 비교하여 더 높은 혈액 포도당 레벨(10 mM)에서 더 빠르게 제거됨을 나타낸다. 포도당에 의한 알부민 결합으로부터의 디보론 인슐린 접합체의 변위는, 더 큰 비결합 인슐린 분획을 생성하며, 따라서, 인슐린 수용체 결합 및 활성화에 이용 가능하다. 돼지 PD 데이터는 본 발명의 디보론 인슐린 접합체가 낮은 혈액 포도당 레벨과 비교하여 높은 혈액 포도당 레벨에서 더 많은 포도당 처리를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 포도당에 민감하지 않은 인슐린 대조군(인슐린 아스파르트 및 인슐린 데글루덱)은 높은 혈액 포도당 및 낮은 혈액 포도당 레벨로 클램핑된 돼지에서 동일한 PK 및 PD를 나타낸다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> GLUCOSE SENSITIVE INSULIN DERIVATIVES <130> 180121WO01 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> human insulin A-chain <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> human insulin B-chain <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gln 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue <400> 4 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue <400> 5 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue <400> 6 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn Lys 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue <400> 7 Lys Pro Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 8 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gln Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Lys 20 25 30 <210> 9 <211> 40 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> A-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 9 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr 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<223> B-chain of human insulin analogue <400> 13 Lys Pro Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Pro Lys 20 25 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue <400> 14 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Pro Lys 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue <400> 15 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Pro Gly Lys 20 25 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue <400> 16 Asn Lys Pro Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue <400> 17 Gly Lys Pro Leu Cys Gly Ser His Leu Val 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Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 20 25 30 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 35 40 <210> 25 <211> 37 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 25 Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 20 25 30 Phe Tyr Thr Pro Lys 35 <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 26 Gly Lys Pro Gly Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Lys <210> 27 <211> 49 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 27 Gly Lys Pro Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 20 25 30 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 35 40 45 Lys <210> 28 <211> 53 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> B-chain of human insulin analogue with peptide spacer <400> 28 Thr Tyr Phe Phe Gly Arg Lys Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys 50 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 29 Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 30 Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly 1 5 10 15 Glu Ser Lys <210> 31 <211> 37 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 31 Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly 1 5 10 15 Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu Ser Gly Glu 20 25 30 Ser Gly Glu Ser Lys 35 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 32 Gly Lys Pro Gly 1 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 33 Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 34 Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 35 Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 36 Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 37 Gly Lys Pro Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 38 <211> 24 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> peptide spacer <400> 38 Thr Tyr Phe Phe Gly Arg Lys Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20

Claims (19)

  1. i) 인간 인슐린 유사체로서, 상기 인간 인슐린 유사체는 상기 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 N-말단에서 펩티드 스페이서를 포함하고; 상기 펩티드 스페이서는 GKP(G4S)q, 또는 KP(G4S)r을 포함하며, q는 1 내지 3의 정수이고; r은 3인, 인간 인슐린 유사체;
    ii) 다음의 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 변형기 M:
    Figure 112022084460910-pct00484
    ,
    (이는 D- 또는 L-아미노산 형태를 나타내며, 여기서 n은 1이고; W1은 NH-CH2CH2-C(=O)-*, 또는 NH-CH(COOH)-CH2CH2-C(=O)-*의 D- 또는 L-형태를 나타내고, *는 상기 인간 인슐린 유사체에 대한 부착 지점을 나타내고;
    R1은 다음 화학식이고:
    Figure 112022084460910-pct00485
    ,
    여기서 Y1 및 Y2는 H이고, Y3은 CF3이다)
    을 포함하는 화합물로서,
    1개의 변형기 M은 상기 펩티드 스페이서 내의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되고; 1개의 변형기 M은 상기 인간 인슐린 유사체의 B-사슬의 위치 29에서의 리신의 엡실론 아미노기에 부착되는, 화합물.
  2. 제1 항에 있어서, 키랄 아미노산은 L-형태인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1 항에 있어서, 변형기 M은 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 인간 인슐린 유사체는 desB30을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 인간 인슐린 유사체는
    서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 desB30 인간 인슐린; 또는
    서열번호 4 및 서열번호 12로 구성된 A14E B25H desB30 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 스페이서를 포함하는 상기 인간 인슐린 유사체는
    서열번호 1 및 서열번호 21로 구성된 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린;
    서열번호 4 및 서열번호 22로 구성된 B1-KPGGGGSGGGGSGGGGS A14E B25H desB30 인간 인슐린;
    서열번호 1 및 서열번호 23으로 구성된 B1-GKPGGGGSGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린;
    서열번호 1 및 서열번호 24로 구성된 B1-GKPGGGGSGGGGS desB30 인간 인슐린; 및
    서열번호 1 및 서열번호 25로 구성된 B1-GKPGGGGS desB30 인간 인슐린의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00486

    Figure 112022084460910-pct00487

    Figure 112022084460910-pct00488

    Figure 112022084460910-pct00489

    Figure 112022084460910-pct00490

    Figure 112022084460910-pct00491

    Figure 112022084460910-pct00492

    Figure 112022084460910-pct00493
    의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00494
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00495
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00496
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00497
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00498
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00499
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00500
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제1 항에 있어서, 화합물은
    Figure 112022084460910-pct00501
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 대사 증후군, 대사 증후군 X 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  17. 의약으로 사용하기 위한, 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 화합물.
  18. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 화합물.
  19. 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 또는 인슐린 저항성 증후군의 치료 또는 예방을 위한 의약으로서, 이 의약은 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 화합물의 치료적 유효량을 포함하는, 의약.
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