KR102492374B1 - 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 HPOB, CBHA, 또는 ITF 2357 화합물은 티로시나아제의 mRNA 또는 단백질 발현 수준의 후성유전적 하향 조절이 아닌 티로시나아제 촉매 활성의 직접적인 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다. 이에, 상기 HPOB, CBHA, 또는 ITF 2357 화합물은 피부의 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물 등에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating skin pigmentation disease}

본 발명은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

인간의 피부색은 멜라닌, 헤모글로빈 및 카로티노이드와 같은 다양한 발색단의 구성 및 분포에 의해 제어된다. 멜라닌(melanin)은 멜라닌 세포(melanocyte)에 의해 합성된 어두운 폴리머 색소로서, 멜라닌을 함유한 멜라노좀(melanosome)은 수상 돌기를 통해 멜라닌 세포에서 인접한 각질 세포로 이동하여 표피 전체에 멜라닌을 분포시키고, 멜라닌은 발암성 자외선에 대한 보호에 중요한 역할을 하기 때문에, 멜라닌 대사는 표피 항상성에 중요하다.

멜라닌 합성은 피부 색소 장애와 관련하여 중요한 연구 주제로서, 피부 색소 장애는 심각한 정신적 스트레스를 유발하여 삶의 질을 떨어뜨릴 수 있기 때문에 사회적으로 중요한 질병으로 간주된다. 종래 과색소침착 치료에는 화학 필링, 레이저 수술, 약물 요법 및 미용 시술과 같은 다양한 접근 방법이 있지만, 부작용이 없고 효과적인 방법에 대한 연구가 더 필요한 실정이다. 하이드로퀴논(hydroquinone)은 단독으로 또는 다른 약물과 병용하여 투여되는 피부 색소 장애에 대한 일반적인 치료법이지만 자극, 알레르기 및 암과 같은 부작용이 나타날 수 있다. 또한, 화장품 산업에서 다양한 멜라닌 합성 억제제가 피부 색소 침착을 억제하는데 사용되지만, 소비자 만족도는 낮으며 보다 효과적인 피부 미백 치료법에 대한 수요가 높다.

멜라닌 합성과 관련된 기능 장애는, 선천적 또는 후천적, 피부 또는 전신, 일시적 또는 영구적일 수 있고 저색소 또는 과색소침착과 관련된 임상적 색소침착 장애를 유발한다. 그 중에서 과색소침착 장애는 어두운 색소가 고유한 병리 생리학적 요인 또는 외인성 환경요인을 통해 비정상적으로, 불균일하게 또는 과도하게 침착되는 피부 상태를 나타낸다. 과색소침착은 병리학적 제제 및 물리 화학적 손상에 의해 유발된 급성 염증 반응 후, 또는 자연적인 피부 노화 과정으로 발생할 수 있다.

유전적 피부색 차이는 SLC24A5(solute carrier family 24 member 5) 및 SLC24A5 유전자의 다형성과 같은 유전적 특성에 의해 결정되며, 이들 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성은 칼륨-의존성 나트륨-칼슘 교환기를 변화시킬 수 있고, 멜라노좀 생합성 및 멜라닌 합성에 영향을 미칠 수 있다.

또한, 유전적 특성 외에도 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 microRNA를 포함한 후성유전적 메커니즘은 피부 세포의 장기적인 표현형 변화를 매개 할 수 있다. DNA 메틸화 억제제인 5-아자시티딘(5-azacytidine)은 cAMP 반응 요소-결합 단백질(cAMP response element-binding protein, CREB)의 불활성화를 통해 소안구증-관련 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF) 및 그의 조절 표적 티로시나아제(TYR, EC 1.14.18.1)를 하향 조절함으로써 Mel-Ab 세포에서 멜라닌 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. microRNA 중에서 miR-125b는 멜라닌 수치를 감소시키는 것으로 나타났으며, 프로모터 과메틸화로 인해 색소 세포에서 발현이 감소 된 것으로 나타났다. miR-125b의 표적은 SH3BP4(SRC homology 3 domain-binding protein 4)로 확인되었으며, 이의 발현은 MITF에 의해 제어된다.

한편, 티로시나아제(tyrosinase, TYR)는 멜라닌 합성 경로에서 L-티로신(tyrosine)이 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 수산화되는 과정 및 L-DOPA의 해당 o-퀴논 유도체로의 산화를 촉매하는 구리 함유 효소로서, 원치 않는 피부 색소 침착의 억제에 유용한 표적이 될 수 있으며, 다양한 천연 및 합성 화합물은 다중 메커니즘에 의해 TYR의 촉매 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, β-알부틴(arbutin)과 코직산(kojic acid)은 TYR의 경쟁적인 방식으로 TYR의 촉매 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 후성유전적 약물 라이브러리를 스크리닝 하여 멜라닌 생성 및 티로시나아제의 촉매 활성을 억제하는데 뛰어난 효과를 나타내는 화합물을 확인함으로써 피부 색소침착에 대한 새로운 후보 약물로 선별하고자 하였다.

J. Dtsch. Dermatol. Ges. 2010, 8, 187-201.

본 발명자들은 효과적인 멜라닌 생성 억제제 개발을 위해 연구한 결과, 후성유전적 약물 라이브러리로부터 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성 억제 효과가 뛰어난 화합물을 분리하였으며, 상기 화합물은 티로시나아제의 mRNA 또는 단백질 발현 수준의 후성유전적 하향 조절이 아닌 티로시나아제 촉매 활성의 직접적인 억제를 통해 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,

상기 약학적 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB), N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드(N-hydroxy-3-(3-(hydroxyamino)-3-oxo-1-propen-1-yl)-benzamide; CBHA), 및 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트((6-((diethylamino)methyl)naphthalen-2-yl)methyl (4-(hydroxycarbamoyl)phenyl)carbamate hydrochloride hydrate; ITF 2357; givinostat)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드, N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드, 및 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의, 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드, N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드, 및 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 화장료 조성물은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 완화하는 피부 미백 효능을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 화장료 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB) 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 화합물; 또는 이의 약학적 또는 화장품학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 HPOB, CBHA, 또는 ITF 2357 화합물은 티로시나아제의 mRNA 또는 단백질 발현 수준의 후성유전적 하향 조절이 아닌 티로시나아제 촉매 활성의 직접적인 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다. 이에, 상기 HPOB, CBHA, 또는 ITF 2357 화합물은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물 등에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 약물 라이브러리의 약물 처리에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 확인한 도면이다(α-MSH 처리 대조군에 대하여 **p<0.01, *p<0.05).
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 약물 라이브러리의 약물 처리에 따른 세포 생존능을 확인한 도면이다(대조군에 대하여 **p<0.01, *p<0.05).
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 CBHA(H4) 및 HPOB(K8)의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 CBHA(H4) 및 HPOB(K8) 처리에 따른 세포 생존능을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 HPOB(K8) 처리에 따른 세포 외(상단) 및 세포 내(하단) 멜라닌 함량을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 HPOB(K8) 처리에 따른 티로시나아제(TYR) 활성을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 HPOB(K8) 처리에 따른 티로시나아제(TYR), 티로시나아제-관련 단백질 1(TYRP1), 및 도파크롬 상호변이효소(DCT)의 mRNA 발현 수준을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 HPOB(K8) 처리에 따른 티로시나아제(TYR), 티로시나아제-관련 단백질 1(TYRP1), 및 도파크롬 상호변이효소(DCT)의 단백질 발현 수준을 확인한 도면이다(**p<0.01).
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 흑색종 세포에서 HPOB(K8) 처리에 따른 마이크로프탈미아-관련 전사 인자(MITF)의 mRNA 발현 수준(좌측 도면) 및 단백질 발현 수준(우측 도면)을 확인한 도면이다(**p<0.01, *p<0.05).
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 HPOB(K8) 처리에 의한 시험관 내(in vitro) 쥐의 TYR 활성(상단) 및 인간의 TYR 활성(하단)을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 HPOB(K8)(좌측 도면) 및 β-알부틴(우측 도면) 처리에 의해 나타나는 TYR 활성 억제에 대한 효소 동역학을 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 HPOB(K8), 코직산, 및 β-알부틴 처리에 의한 구리 킬레이트화 활성을 비교하여 나타낸 도면이다(**p<0.01).
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 약물 라이브러리의 약물 처리에 의한 시험관 내 인간 TYR 활성을 나타낸 도면이다(**p<0.01).

본 발명은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 하기 화학식 1로 표시되는 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB), 하기 화학식 2로 표시되는 N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드(N-hydroxy-3-(3-(hydroxyamino)-3-oxo-1-propen-1-yl)-benzamide; CBHA), 및 하기 화학식 3으로 표시되는 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트((6-((diethylamino)methyl)naphthalen-2-yl)methyl (4-(hydroxycarbamoyl)phenyl)carbamate hydrochloride hydrate; ITF 2357; givinostat)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명에 있어서, 상기 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 상기 화학식 1로 표시되는 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, "피부 색소침착 질환"은 피부의 변색 또는 비정상적으로 착색된 세포의 증식이 이루어지는 피부의 모든 질환 또는 질병을 의미하며, 피부 색소침착은 과다하거나 원치 않는 색소 침착을 포함할 수 있다. 노화, 환경 스트레스 및 UV 노출과 같은 요인은 피부 색소침착의 잠재적인 원인이 될 수 있다. 본 발명의 피부 색소침착은 환자의 기본적인 색소 침착에 비해 피부 및/또는 모낭에서 생합성되고 모발 또는 피부에 침착된 하나 이상의 다양한 종류의 멜라닌의 증가에 기인할 수 있으며, 예컨대 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "멜라닌(melanin)"은 여러 동물들의 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 또는 갈색 색소를 총칭한다. 특히 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 중요한 요소로써 인종에 따라서 멜라닌 발현 유전자가 다르고, 이에 따라 멜라닌 세포의 양이 조절되어 피부색이 결정된다. 피부에서 멜라닌의 기능은 자외선 차단 기능으로서 피부의 체온을 유지시켜주고 자외선으로부터 피부를 보호해 주지만, 과도한 멜라닌 생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 형성에 원인이 되며, 더 나아가 피부암 유발에 기여한다.

본 발명에 있어서, "후성유전"은 DNA 염기 서열의 변화 없이 유전자의 발현 패턴이나 활성도가 변해 다음 세대까지 전해지는 것을 의미하며, 후성유전적 조절의 기전으로는 DNA의 메틸화 및 히스톤의 번역 후 변형(아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화, SUMO화, 리보실화, 시트룰린화 등)이 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드, 상기 화학식 2로 표시되는 N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드, 및 상기 화학식 3으로 표시되는 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 상기 화학식 1로 표시되는 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "피부 미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 완화하는 피부 미백 효능을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 HPOB, CBHA, 및 ITF 2357로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물; 또는 이의 약학적 또는 화장품학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "티로시나아제(tyrosinase, TYR)"는 활성 부위에 구리(copper)를 함유하고 있는 대표적인 효소로서, 미생물, 곰팡이, 절지동물, 식물, 동물에 이르기까지 다양한 생명체에서 널리 발견되고 있다. 티로시나아제는 기본적으로 L-티로신(tyrosine)을 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine)(L-DOPA)로 전환하는 모노페놀라제(monophenolase) 활성과 L-DOPA를 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환하는 디페놀라제(diphenolase) 활성을 갖는 효소로 알려져 있으나, L-티로신과 L-DOPA 이외에 다양한 페놀 및 카테콜 그룹을 함유하는 물질의 산화 반응을 또한 촉매한다.

본 발명에 있어서, "촉매 활성"은 효소와 같은 물질이 반응 과정에서 소모되거나 변하지 않으면서 반응 속도를 빠르게 만드는 활성을 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 "티로시나아제의 촉매 활성”은 티로시나아제의 촉매로서의 활성, 티로시나아제의 활성과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 후성유전적 약물 라이브러리를 이용하여 흑색종 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 화합물을 스크리닝하였으며(실험예 1 참조), 이 중 K8(HPOB) 및 H4(CBHA)의 멜라닌 생성 억제 활성 및 세포 독성을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는 K8(HPOB) 화합물 처리에 따른 흑색종 세포의 세포 외 및 세포 내 멜라닌 수준 및 세포의 TYR 활성 억제 효과를 확인하였다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 K8(HPOB) 화합물 처리에 의해 흑색종 세포의 TYR, TYRP1, 및 DCT(실험예 4 참조)에 더해 MITF(실험예 5 참조)의 mRNA 및 단백질 발현 수준이 유의하게 억제되지 않는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실험예에서는 K8(HPOB) 화합물이 TYR의 촉매 작용을 직접 억제하는 것을 확인하였다(실험예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 K8(HPOB) 화합물이 경쟁적으로 TYR 활성을 억제하는 것을 확인하였으며(실험예 7 참조), 구리 킬레이트화 활성을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 8 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 TYR 억제 활성에 대한 약물 라이브러리의 스크리닝 결과 K8(HPOB) 및 H4(CBHA) 외에도 A5(PCI 34051), C10(ITF 2357; givinostat), 및 M3(MC 1568) 화합물이 TYR 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 9 참조).

본 발명의 일 구현예에 따르면, K8(HPOB) 은 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나아제 활성 억제 효과가 뛰어나면서 고농도에서도 세포 독성이 없으며, H4(CBHA) 및 C10(ITF 2357; givinostat) 또한 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나아제 활성 억제 효과를 모두 나타내는 바, 본 발명에 따른 HPOB, CBHA, 및 ITF 2357으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물은 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 멜라닌 생성 억제, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 세포 독성을 모두 고려하였을 때 HPOB를 상기 약학적 조성물 및 화장료 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 HPOB, CBHA, 및 ITF 2357로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 HPOB, CBHA, 및 ITF 2357로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 HPOB, CBHA, 및 ITF 2357로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의, 피부 색소침착 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1928, 2208, 2906, 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1828, 2906, 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 피부 색소침착 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 피부 색소침착 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 피부 색소침착 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 피부 색소침착 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 미스트, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 핸드로션, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징오일, 클렌징밤, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 0.01-5% 중량 백분율 또는 0.01-3% 중량 백분율로 배합될 수 있다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 시약 및 약물 라이브러리

후성 유전적 스크리닝 라이브러리(아이템 번호 11076)는 Cayman Chemical(앤아버, 미시간 주, 미국)에서 구입하였다. 상기 라이브러리는 DNA 메틸전이효소(methyltransferase), DNA 탈메틸효소(demethylase), 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferase), HDAC 또는 아세틸화된 히스톤 결합 단백질과 같은 후성 유전적 효소의 활성을 조절하는 141개의 세포 투과성 소분자를 포함하며, 상기 라이브러리의 조성은 하기 표 2에 나타내었다. 약물 H4(N-hydroxy-3-(3-(hydroxyamino)-3-oxo-1-propen-1-yl)-benzamide; CBHA) 및 K8(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB)는 Cayman Chemical에서 구입한 것이며, α-MSH(M4135) 및 β-arbutin(4-hydroxyphenyl-β-D-glucopyranoside, A4256)은 Sigma-Aldrich(세인트루이스, 미주리 주, 미국)에서 구입하였다.

실시예 2. 세포 배양

세포를 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습된 환경에서 37℃에서 배양하였다. American Type Culture Collection(매너서스, 버지니아 주, 미국)에서 얻은 B16-F10 쥐과(murine)의 흑색종(melanoma) 세포(ATCC CRL-6475)를 10% 소태아혈청(FBS, Gibco BRL, 그랜드 아일랜드, 뉴욕, 미국) 및 항생제(100 U/mL페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B; Thermo Fisher, 월섬, 매사추세츠, 미국)를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다.

실시예 3. 전체 멜라닌 합성에 대한 스크리닝 분석

스크리닝 분석을 위해, B16-F10 세포를 96-웰 플레이트(웰당 3×10³ 세포)에 플레이팅하고 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 60 분 동안 1.0 μM에서 시험 약물로 처리한 후, 72 시간 동안 0.1 μM의 α-MSH로 자극하였다. 전체 멜라닌 합성은 SPECTROstar Nano 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, 독일)를 사용하여 400 nm에서 각각의 웰(세포 용해 없는 세포+배지)의 흡광도를 측정하여 추정하였다.

실시예 4. 세포 생존능 분석

세포 생존능은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)를 사용하여 평가하였다. 48 시간 동안 B16-F10 세포를 각각의 약물로 처리한 후, 세포를 인산완충생리식염수(PBS)로 세척하고, 1 mg/mL의 MTT(Amresco, 솔론, 오하이오 주, 미국) 함유하는 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지를 버리고, 세포 내에 침착된 포르마잔(formazan) 염료를 이소프로판올(isopropanol)로 추출하였으며, SPECTROstar Nano 마이크로플레이트 리더를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5. 멜라닌 함량 분석

세포에 보유된 세포 내 멜라닌 및 세포로부터 분비된 세포 외 멜라닌을 분리하여 확인하였다. 구체적으로, B16-F10 세포를 6-웰 플레이트(웰당 1.2×10⁴ 세포)에 플레이팅한 후 24 시간 동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 약물로 60 분 동안 처리하였으며, 72 시간 동안 100 nM α-MSH로 자극하였다. 상기와 같이 처리된 배지를 평가하여 세포 외 멜라닌 함량을 확인하였다. 부착 세포를 60℃에서 60 분 동안 1.0 M의 수산화 나트륨을 함유하는 10% 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 용액으로 추출하고, 400 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 추출물의 멜라닌 함량을 추정하고 세포의 총 단백질 함량으로 표준화 하였다.

실시예 6. 세포의 TYR 활성 분석

B16-F10 세포를 약물 및/또는 α-MSH로 처리한 후, 세포 추출물의 TYR 활성을 간접 분광 광도법으로 측정하여, 기질로서 L-티로신 + L-DOPA로 도파크롬(dopachrome) 형성을 모니터링 하였다. 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 2.0 mM EDTA, 1.0 mM EGTA, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Mannheim, 독일)을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충제(pH 7.4)의 용해 완충제를 사용하여, 처리된 세포로부터 총 세포 단백질을 4℃에서 추출하였으며, 이어서 15 분 동안 13,000×g에서 원심 분리 하였다. 100 mM 인산 나트륨 완충제(pH 6.8), 1.0 mM L-티로신, 및 42 μM L-DOPA로 구성된 TYR 활성 분석 혼합물(200μL)을 37℃에서 40 μg 세포 단백질 추출물과 함께 배양하였으며, SPECTROstar Nano 마이크로플레이트 리더를 사용하여 시간에 따른 475 nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

실시예 7. qRT-PCR 분석

B16-F10 세포를 약물 및/또는 α-MSH로 처리한 후, RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 사용하여 세포 RNA를 추출하고, 고용량 cDNA 아카이브(archive) 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국)를 사용하여 역전사를 통해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 StepOnePlus^TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 반응 혼합물(20 μL)은 SYBR^® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems), 60 ng cDNA 및 2 pmol 유전자-특이적 프라이머 세트(마크로젠, 서울, 대한민국)를 포함하였다. 본 발명에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

Gene Name	GenBank Accession Number	Primer Sequences	서열번호
TYR	NM_011661.5	Forward: 5'-CTTCTTCTCCTCCTGGCAGATC-3' Reverse: 5'-TGGGGGTTTTGGCTTTGTC-3'	1
			2
TYRP1	NM_001282015.1	Forward: 5'-CAGTGCAGCGTCTTCCTGAG-3' Reverse: 5'-TTCCCGTGGGAGCACTGTAA-3'	3
			4
DCT	NM_010024.3	Forward: 5'-GCAAGAGATACACGGAGGAAG-3' Reverse: 5'-CTAAGGCATCATCATCATCACTAC-3'	5
			6
MITF	NM_008601.3	Forward: 5'-GCTGGAAATGCTAGAATACAG-3' Reverse: 5'-TTCCAGGCTGATGATGTCATC-3'	7
			8
GAPDH	NM_001289726.1	Forward: 5'-GCATCTCCCTCACAATTTCCA-3' Reverse: 5'-GTGCAGCGAACTTTATTGATGG-3'	9
			10

반응 프로토콜은 다음과 같았다: 50℃에서 2 분 동안 초기 배양; 95℃에서 15 분 동안 DNA 폴리머라제(polymerase) 활성화; 및 60℃에서 1 분 동안 어닐링(annealing) 및 연장. 각각의 PCR 수행에서, 용융 곡선을 확인하여 PCR 산물의 동질성을 확인하였다. 목적 유전자의 mRNA 발현 수준은 상대적인 Ct 방법을 사용하여 결정되었고, 내부 참조(internal reference) GAPDH로 표준화되었다. 상기 방법에서, Ct는 신호가 한계치를 초과하기 위해 필요한 PCR 사이클의 수로 정의된다. 대조군과 비교하여 시험군의 배수 변화(fold change)는 2^-△△Ct로 계산되었으며, 여기서 △△Ct = △Ct_(test) - △Ct_(control) = [Ct_{(gene, test)} - Ct_{(reference, test)}] - [Ct_{(gene, control)} - Ct_{(reference, control)}]이다.

실시예 8. 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅은 이전 연구에서 공지된 바와 같이 수행되었다. 구체적으로, TYR에 대한 1 차 항체(#127217)를 MyBioSource(샌디에고, 캘리포니아, 미국)에서 구입하였고, TYRP1(#10443) 및 β-actin(#47778)에 대한 1 차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(캘리포니아, 미국)에서 구입하였으며, MITF(#20663) 및 DCT(#74073)에 대한 1 차 항체는 Abcam(캠브리지, 영국)에서 구입하였다. 또한, 항-토끼 IgG(#2357) 및 항-염소 IgG(#2020) 2 차 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였고, 항-마우스 IgG(#7076) 2차 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, 미국)로부터 구입하였다. 각 항체를 20 mM Tris-Cl(pH 7.5), 200 mM NaCl 및 5% 스킴밀크(skim milk)를 함유하는 항체 희석 완충액에서 1:1000으로 희석시켰다.

B16-F10 세포를 약물 및/또는 α-MSH로 처리 한 후, TYR, TYRP1 및 DCT의 반대(foe) 평가를 위해 10 mM Tris-Cl(pH 7.4), 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Mannheim, 독일)로 이루어진 용해 완충제(pH 7.2)를 사용하여 전체 세포 용해물을 제조하였다. MITF 추출을 위해, 세포를 25 mM Tris-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 데옥시콜레이트 나트륨(sodium deoxycholate), 0.1% SDS 및 프로테아제 억제제 칵테일로 이루어진 RIPA 완충제로 추출하였다. 단백질을 95℃에서 5 분 동안 가열함으로써 Laemmli 샘플 완충제에서 변성시키고 7.5% SDS-PAGE 겔에 의해 분리하였다. 그리고 나서, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막(Amersham Pharmacia, Little Chalfont, 영국)으로 옮겼다. 상기 막을 4℃에서 1 차 항체 용액과 함께 밤새 배양한 후, 실온에서 1 시간 동안 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)에 결합된 2 차 항체의 용액과 배양하였다. 표적 단백질 밴드는 picoEPD Western Reagent 키트(ELPIS-Biotech, 대전, 대한민국)를 사용하여 화학 발광(chemiluminescence) 방법에 의해 검출되었으며, 블롯(blot)은 NIH Image J 프로그램을 사용하여 분석되었다.

실시예 9. 시험관 내(in vitro) TYR 촉매 활성 분석

TYR의 촉매 활성에 대한 약물의 직접적인 영향을 조사하기 위해, 시험관 내 실험을 수행하였다. α-MSH로 24 시간 동안 자극된 B16F10 세포의 용해물을 쥐(murine) TYR 제제(preparation)로 사용하였으며, 인간 TYR 제제는 인간 TYR (HEK293-TYR)을 본질적으로 발현하는 인간 배아 신장 293 세포의 용해물이었다. 세포를 4℃에서 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 2.0 mM EDTA, 1.0 mM EGTA, 0.5 % Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 용해시켰고, TYR 제제로 사용된 상층액을 얻기 위해 15 분 동안 13,000×g에서 원심분리 하였다. TYR 활성 분석 혼합물(200 μL)은 100 mM 인산 나트륨 완충제(pH 6.8), TYR 제제(40 μg 단백질), 다양한 농도의 약물, 1.0 mM L-티로신 및 42 μM L-DOPA로 구성되었다. 효소 동역학 연구를 위해, L-티로신 + L-DOPA의 농도를 변화시키면서 상대적인 비율은 표준 분석 조건과 동일하게 유지 하였다. 혼합물을 37℃에서 배양하고, 475 nm에서의 흡광도를 SPECTROstar Nano 마이크로플레이트 리더를 사용하여 모니터링 하였다. 비 효소 반응의 영향을 보정하기 위해 TYR 제제 없이 반응을 수행하였다. 효소 활성은 다음과 같이 계산되었다: 활성(% 대조군) = (C-D)/(A-B)×100, 여기서 A 및 B는 각각 효소가 있거나 없는 대조군의 흡광도 변화이며, C 및 D는 각각 효소가 있거나 없는 시험군의 흡광도 변화이다.

실시예 10. 구리 킬레이트화 활성 분석

구리 킬레이트화 활성은 피로카테콜 바이올렛(pyrocatechol violet)(Sigma-Aldrich)을 사용하여 측정하였다. 이 방법의 원리는, 피로카테콜 바이올렛이 구리와 혼합될 때, 632 nm에서 최대 흡수를 나타내고, 구리에 대한 피로카테콜 바이올렛과 경쟁하는 시험 물질이 구리-피로카테콜 바이올렛 혼합물의 흡수를 감소시킬 수 있다는 것이다. 다양한 농도, 200 μM CuSO₄ 및 200 μM의 피로카테콜 바이올렛에서 잠재적 킬레이터(chelator)를 함유하는 반응 혼합물을 25℃에서 20 분 동안 배양하고, Shimadzu UV-1650PC 분광광도계(Shimadzu Corporation, 교토, 일본)를 사용하여 이의 흡수 스펙트럼을 기록하였다. 구리 킬레이트화 활성은 632 nm에서 피로카테콜 바이올렛의 흡광도 변화에 의해 평가되었다.

실시예 11. 통계 분석

데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균±표준편차(SD)로 표현된다. 실험 결과는 SigmaStat v. 3.11 소프트웨어(Systat Software Inc., San Jose, CA, 미국)를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 테스트에 의해 통계적으로 분석되었다.

[실험예]

실험예 1. 멜라닌 생성 억제 활성에 대한 약물 라이브러리의 스크리닝

본 발명에서는 시판되는 후성 유전적 스크리닝 라이브러리를 사용하였으며, 라이브러리의 조성은 하기 표 2에 나타내었다. 상기 라이브러리는 DNA 메틸전이효소(methyltransferase), DNA 탈메틸효소(demethylase), 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferase)와 같은 후성 유전적 효소의 활성을 조절하는 141 개의 세포 투과성 소분자 약물을 포함한다.

Code	CAS number	Drug	Code	CAS number	Drug
A2	21293-29-8	(+)-Abscisic Acid	H4	174664-65-4	CBHA
A3	3544-24-9	3-amino Benzamide	H5	251456-60-7	M 344
A4	929016-96-6	SB939	H6	151720-43-3	Oxamflatin
A5	950762-95-5	PCI 34051	H7	1105698-15-4	Salermide
A6	1219807-87-0	4-iodo-SAHA	H8	299953-00-7	Mirin
A7	410536-97-9	Sirtinol	H9	937039-45-7	Pimelic Diphenylamide 106
A8	328968-36-1	C646	H10	940943-37-3	KD 5170
A9	1239262-52-2	Tubastatin A (trifluoroacetate salt)	H11	404950-80-7	Panobinostat
A10	78824-30-3	Garcinol	I2	209783-80-2	MS-275
A11	476-66-4	Ellagic Acid	I3	926908-04-5	HNHA
B2	287383-59-9	Scriptaid	I4	48208-26-0	RG-108
B4	183506-66-3	Apicidin	I5	10302-78-0	2',3',5'-triacetyl-5-Azacytidine
B5	83209-65-8	HC Toxin	I6	979-92-0	S-Adenosyl homocysteine
B6	1238673-32-9	UNC0321 (trifluoroacetate salt)	I7	1197196-48-7	UNC0224
B7	72877-50-0	(-)-Neplanocin A	I8	743420-02-2	Chidamide
B8	1373232-26-8	Cl-Amidine (hydrochloride)	I9	537049-40-4	Tubacin
B9	877617-46-4	F-Amidine (trifluoroacetate salt)	I10	102052-95-9	3-Deazaneplanocin A
B10	1256375-38-8	JGB1741	I11	58944-73-3	Sinefungin
B11	1260635-77-5	coumarin-SAHA	J2	382180-17-8	Pyroxamide
C2	1260907-17-2	I-BET762	J3	5262-39-5	N-Oxalylglycine
C3	1255580-76-7	UNC0638	J4	890190-22-4	WDR5-0103
C4	880487-62-7	Phthalazinone pyrazole	J5	1396772-26-1	EPZ005687
C5	961-29-5	Isoliquiritigenin	J6	1561178-17-3	SGC0946
C6	1207113-88-9	CCG-100602	J7	1415800-43-9	UNC1215
C7	1243583-88-1	CAY10669	J8	420831-40-9	AK-7
C8	3690-10-6	Zebularine	J9	1346704-33-3	GSK343
C9	528-53-0	Delphinidin (chloride)	J 10	1619994-69-2	Bromosporine
C10	732302-99-7	ITF 2357	J 11	1619994-68-1	GSK2801
C11	1320288-19-4	UNC0631	K2	14513-15-6	SIRT1/2 Inhibitor IV
D2	1320288-17-2	UNC0646	K3	2147701-33-3	I-CBP112 (hydrochloride)
D3	1310877-95-2	Methylstat (hydrate)	K4	1613695-14-9	SGC-CBP30
D4	120964-45-6	3-Deazaneplanocin A (hydrochloride)	K5	1481677-78-4	UNC0642
D5	129-46-4	Suramin (sodium salt)	K6	1431612-23-5	UNC1999
D6	98-92-0	Nicotinamide	K7	1627607-87-7	(R)-PFI-2 (hydrochloride)
D7	207671-42-9	2,4-Pyridinedicarboxylic Acid	K8	1429651-50-2	HPOB
D8	1403764-72-6	PFI-1	K9	96017-59-3	2-hexyl-4-Pentynoic Acid
D9	320-67-2	5-Azacytidine	K10	1819363-80-8	PFI-3
D10	1020149-73-8	SGI-1027	K11	199596-05-9	JIB-04
D11	2353-33-5	Decitabine	L2	1477949-42-0	CAY10683
E2	1300031-49-5	I-BET151	L3	1346574-57-9	GSK126
E3	1268524-70-4	(+)-JQ1	L4	1446144-04-2	CPI-203
E4	1268524-71-5	(-)-JQ1	L5	154-42-7	6-Thioguanine
E5	160003-66-7	BSI-201	L6	1252003-15-8	Tubastatin A
E6	86-55-5	1-Naphthoic Acid	L7	1968-05-4	3,3'-Diindolylmethane
E7	1716-12-7	Sodium 4-Phenylbutyrate	L8	202590-98-5	OTX015
E8	459868-92-9	Rucaparib (phosphate)	L9	2140-61-6	5-Methylcytidine
E9	5852-78-8	IOX1	L10	304896-21-7	AGK7
E10	1271738-62-5	MI-2 (hydrochloride)	L11	838-07-3	5-Methyl-2'-deoxycytidine
E11	1934302-23-4	MI-nc (hydrochloride)	M2	1380288-87-8	EPZ5676
F2	95058-81-4	Gemcitabine	M3	852475-26-4	MC 1568
F3	192441-08-0	Lomeguatrib	M4	40951-21-1	α-Hydroxyglutaric Acid (sodium salt)
F4	1216744-19-2	GSK4112	M5	52248-03-0	S-(5'-Adenosyl)-L-methionine (tosylate)
F5	876150-14-0	Octyl-α-ketoglutarate	M6	1044870-39-4	RVX-208
F6	1596-84-5	Daminozide	M7	1012054-59-9	CUDC-101
F7	1797832-71-3	GSK-J1 (sodium salt)	M8	404951-53-7	LAQ824
F8	2108665-15-0	GSK-J2 (sodium salt)	M9	300816-11-9	Nullscript
F9	1797983-09-5	GSK-J4 (hydrochloride)	M10	1431368-48-7	GSK-LSD1 (hydrochloride)
F10	112522-64-2	CI-994	M11	1357389-11-7	RGFP966
F11	2108899-91-6	CPTH2 (hydrochloride)	N2	1440209-96-0	BRD73954
G2	33419-42-0	Etoposide	N3	501-36-0	trans-Resveratrol
G3	111358-88-4	Lestaurtinib	N4	89464-63-1	DMOG
G4	778649-18-6	Butyrolactone 3	N5	58880-19-6	Trichostatin A
G5	1069-66-5	Valproic Acid (sodium salt)	N6	193551-00-7	CAY10398
G6	380315-80-0	Tenovin-1	N7	1418131-46-0	RSC-133
G7	1011557-82-6	Tenovin-6	N8	537034-17-6	BML-210
G8	156-54-7	Sodium Butyrate	N9	10083-24-6	Piceatannol
G9	1808255-64-2	BIX01294 (hydrochloride hydrate)	N10	839699-72-8	CAY10591
G10	16611-84-0	Anacardic Acid	N11	848193-68-0	EX-527
G11	304896-28-4	AGK2	O2	149647-78-9	SAHA
H2	1045792-66-2	CAY10603	O3	1986-47-6	2-PCPA (hydrochloride)
H3	5690-03-9	Splitomicin

예비 스크리닝 분석에서, 시험관 내(in vitro) 배양된 쥐 흑색 종-유래 B16-F10 세포에서의 멜라닌 합성에 대한 각 약물의 효과에 대해 시험하였다. 약물 용액(최종 농도, 1.0 μM) 또는 비히클(vehicle)로 세포를 처리한 후, 멜라닌 합성을 α-MSH(최종 농도, 100 nM)로 자극하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 400 nm에서의 광학 밀도(OD)를 모니터링 하였을 때 α-MSH는 세포 멜라닌 합성을 증가시켰고, 다양한 약물에 의해 유도가 조절되었다. 또한, 세포 생존능에 대한 약물의 효과를 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 활성 및 세포 독성을 비교하였을 때 약물 H4(N-hydroxy-3-(3-(hydroxyamino)-3-oxo-1-propen-1-yl)-benzamide; CBHA) 및 K8(4-((hydroxyamino)carbonyl)-N-(2-hydroxyethyl)-N-phenyl-benzeneacetamide; HPOB)이 사용된 농도에서 세포 생존능을 감소시키지 않으면서 세포 멜라닌 합성을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다(도 1a 및 1b에서 빨간색으로 표시).

실험예 2. CBHA 및 HPOB의 활성 및 세포 독성 비교

CBHA 및 HPOB의 멜라닌 생성 억제 활성과 세포 독성을 비교하였다. 구체적으로, B16-F10 세포를 다양한 농도의 약물로 처리하고, 72 시간 동안 100 nM α-MSH로 자극하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 멜라닌 합성으로 인한 OD 400의 증가는 상기 두 약물에 의해 용량 의존적으로 감소되었다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이 HPOB는 최대 10 μM의 농도까지 세포 독성을 보이지 않았다. 이에, HPOB를 이후 실험에 사용하였다.

실험예 3. 세포에서 멜라닌 함량 및 TYR 활성에 대한 HPOB의 효과 확인

K8로 처리된 세포의 세포 외 및 세포 내 멜라닌 수준을 개별적으로 정량하기 위해 추가 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 총 세포 단백질 함량에 대해 표준화된 세포 외(도 3a의 상단 도면) 및 세포 내(도 3a의 하단 도면) 멜라닌 함량은 α-MSH 처리에 의해 증가되었고, 이는 HPOB에 의해 용량 의존적으로 억제되었다(1-10 μM).

세포의 멜라닌 함량의 변화는 세포의 TYR 활성과 밀접한 관련이 있을 수 있다. 이러한 가능성을 직접 조사하기 위해, 상이한 농도의 약물 및 고정량의 α-MSH를 처리한 후 세포성 TYR 활성을 평가하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 α-MSH는 세포 TYR 활성을 증가시켰으며, 상기 TYR 활성 증가는 HPOB에 의해 억제되었다.

실험예 4. TYR, TYRP1, 및 DCT의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 대한 HPOB의 효과 확인

TYR 및 멜라닌 생성에 관련된 다른 관련 효소의 유전자 발현에 대한 HPOB의 효과를 확인하였으며, GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 대조군으로 사용하여 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)에 의해 B16-F10 세포에서 TYR(tyrosinase), TYRP1(tyrosinase-related protein 1) 및 DCT(dopachrome tautomerase)의 mRNA 발현 수준을 평가하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, α-MSH는 TYR 및 TYRP1의 mRNA 수준을 유의적으로 증가시켰지만, DCT의 mRNA는 유의적인 차이가 없었으며, α-MSH에 의해 증가된 TYR, TYRP1 및 DCT의 mRNA 수준은 HPOB에 의해 감소되었으나, 유의적인 차이는 없었다.

또한, 웨스턴 블롯팅 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 α-MSH가 B16-F10 세포에서 TYR, TYRP1 및 DCT의 단백질 수준을 유의적으로 증가시켰으며, HPOB는 α-MSH 자극에 의해 증가된 TYR, TYRP1 및 DCT의 단백질 수준을 감소시켰으나, 유의적인 차이는 없었다.

실험예 5. MITF의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 대한 HPOB의 효과 확인

MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 TYR 및 기타 멜라닌성 효소의 유전자 발현을 조절하는 주요 전사 인자이며, 도 5에 나타낸 바와 같이, α-MSH는 MITF의 mRNA(도 5의 좌측 도면) 및 단백질 발현(도 5의 우측 도면)을 유도하였지만, HPOB에 따른 유의적인 영향은 나타나지 않았다.

실험예 6. 쥐 및 인간 TYR의 촉매 활성에 대한 HPOB의 효과 확인

세포 멜라닌 합성에 대한 HPOB의 강력한 억제 효과에도 불구하고, TYR 및 다른 관련 효소의 mRNA 및 단백질 수준은 유의하게 억제되지 않았다. 이는 유전자 발현 조절 이외의 메커니즘이 존재함을 시사한다. 이에, 약물이 TYR의 촉매 작용을 직접 억제하는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 두 가지의 다른 TYR 원천(source)을 사용하였다. 하나는 α-MSH에 의해 자극된 B16F10 세포의 단백질 추출물로서 다량의 TYR을 발현하고, 다른 하나로는 인간 TYR을 과발현하는 안정적인 세포주인 HEK293-TYR의 단백질 추출물을 사용하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, TYR의 촉매 활성에 대한 HPOB의 효과는 β-알부틴(β-arbutin) 또는 코직산(kojic acid)의 효과와 비교되었다. HPOB는 쥐의 TYR 활성을 β-알부틴(IC₅₀, 700 μM)보다 훨씬 더 강력하게 억제하는 것으로 나타났으며(IC₅₀, 1.5 μM)(도 6의 상단 도면), 인간의 TYR 활성을 β-알부틴(IC₅₀, 500 μM) 및 코직산(IC₅₀, 63 μM)보다 훨씬 더 강력하게 억제하는 것을 확인하였다(IC₅₀, 1.1 μM)(도 6의 하단 도면).

실험예 7. HPOB 및 β-알부틴의 억제 유형 확인

도 7에 나타낸 바와 같이, TYR 활성에 대한 Lineweaver-Burk의 선은 억제되지 않은 효소로부터 얻은 TYR 활성 및 상이한 농도의 HPOB가 거의 1/활성 축 상에서 동일한 절편(intercept)으로 수렴하여 경쟁적 억제를 나타내었으며(도 7의 좌측 도면), 다양한 농도의 β-알부틴은 1/활성 축 상에서 동일한 절편을 갖는 선 그룹을 나타내어 경쟁적 억제를 나타냈다(도 7의 우측 도면).

실험예 8. HPOB 및 코직산의 구리 킬레이트화 활성 확인

피로카테콜 바이올렛을 사용하여 HPOB, 코직산, 및 β-알부틴의 구리 킬레이트화 활성을 비교하였다. 그 결과, 도 8의 좌측 도면에 나타낸 바와 같이, 피로카테콜의 흡수 스펙트럼은 구리 이온의 존재 하에 변화되었으며, 도 8의 우측 도면에 나타낸 바와 같이 632 nm에서 구리 킬레이트화로 인한 피로카테콜 바이올렛의 흡광도 증가는 HPOB 및 코직산에 의해 억제되었지만 β-알부틴에 의해서는 억제되지 않았다. HPOB 및 코직산의 등몰 농도(200 μM)는 각각 200 μM 구리 이온의 27% 및 36%를 킬레이트화 하는 것으로 추정된 반면, β-알부틴은 구리 킬레이트화 활성을 나타내지 않았다.

실험예 9. TYR 억제 활성에 대한 약물 라이브러리의 스크리닝

다른 TYR 억제제에 대한 라이브러리를 조사하였으며, 1.0 μM에서 라이브러리로부터 141 개 화합물 각각의 인간 TYR 억제 효과를 평가한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 K8(HPOB) 및 H4(CBHA)뿐만 아니라 A5(PCI 34051; N-Hydroxy-1-((4-methoxyphenyl)methyl)-1H-indole-6-carboxamide), C10(ITF 2357; givinostat; (6-((diethylamino)methyl)naphthalen-2-yl)methyl (4-(hydroxycarbamoyl)phenyl)carbamate hydrochloride hydrate), 및 M3(MC 1568; 3-(5-(3-(3-Fluorophenyl)-3-oxopropen-1-yl)-1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)-N-hydroxy-2-propenamide) 또한 강력한 TYR 억제 효과를 가지는 것을 확인하였다(도 9에서 빨간색으로 표시).

상기 A5(PCI 34051), C10(ITF 2357; givinostat), M3(MC 1568) 중에서 A5(PCI 34051) 및 M3(MC 1568) 화합물은 세포 독성을 나타내지는 않았으나(도 1b 참조), 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내지 않았다(도 1a 참조). 반면, C10(ITF 2357; givinostat) 화합물은 뛰어난 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내었는 바(도 1a 참조), K8(HPOB) 및 H4(CBHA)에 더하여 C10(ITF 2357; givinostat) 화합물을 피부 색소침착 질환에 대한 후보 약물로서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for preventing or treating skin pigmentation disease <130> MP20-090 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYR forward primer <400> 1 cttcttctcc tcctggcaga tc 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYR reverse primer <400> 2 tgggggtttt ggctttgtc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP1 forward primer <400> 3 cagtgcagcg tcttcctgag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP1 reverse primer <400> 4 ttcccgtggg agcactgtaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCT forward primer <400> 5 gcaagagata cacggaggaa g 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCT reverse primer <400> 6 ctaaggcatc atcatcatca ctac 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF forward primer <400> 7 gctggaaatg ctagaataca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF reverse primer <400> 8 ttccaggctg atgatgtcat c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 9 gcatctccct cacaatttcc a 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 10 gtgcagcgaa ctttattgat gg 22

Claims (9)

1. 피부 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 약학적 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드, N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드, 및 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고,
   상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 피부 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드, N-하이드록시-3-(3-(하이드록시아미노)-3-옥소-1-프로펜-1-일)-벤즈아마이드, 및 (6-((디에틸아미노)메틸)나프탈렌-2-일)메틸 (4-(하이드록시카바모일)페닐)카바메이트 하이드로클로라이드 하이드레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 화장료 조성물로서,
   상기 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피 반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반점, 약물 사용 후의 과다 색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 완화하는 피부 미백 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염은 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매 활성 억제를 통해 세포의 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
   
9. 제5항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 4-((하이드록시아미노)카보닐)-N-(2-하이드록시에틸)-N-페닐-벤젠아세트아마이드 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.

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