KR102468230B1 - 락토바실러스 속 균주를 이용한 원료의 발효 방법 - Google Patents

락토바실러스 속 균주를 이용한 원료의 발효 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 이용하여 원료에서 유래된 산물의 생성을 증가시키고, 체내 흡수율을 높일 수 있는 발효 공정에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 속 균주를 이용한 원료의 발효 방법{A FERMENTATION METHOD OF RAW MATERIAL USING LACTOBACILLUS STRAIN}
본 발명은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 이용하여 원료에서 유래된 산물의 생성을 증가시키고, 체내 흡수율을 높일 수 있는 발효 공정에 관한 것이다.
대두, 민트와 같은 원료는 식물유래 기능성 소재로서 식료품, 화장품 등 다양하게 이용되어 왔다. 대두는 이소플라본(isoflavone), 사포닌(saponin), 올리고 사케라이드(oligo-saccharides) 등과 같은 기능성 성분을 함유하고 있으며, 발효 과정에서 미생물 유래 효소들에 의해 대두의 섬유질 성분과 세포내 당류, 단백질 등이 분화되어 소화율이 향상되고, 생리활성물질이 생성되어 혈압 강하, 혈전 용해능, 항산화 효과 등이 증가되는 것으로 알려져 있다.
발효식품에 영양과 품질을 결정하는 중요한 요인은 관여하는 미생물의 종류이며, 균주 및 발효 조건에 따라 다양한 생리활성물질이 생성되고 기능성이 달리 나타난다. 예컨대 대두에서 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 셀룰레아제(cellulase)를 분비하여 생리활성을 가지는 다양한 대사물질을 생산하며, 발효 과정에서 특유의 맛과 향을 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한 발효 과정에서 이취를 유발하는 암모니아 화합물, 함황화합물 등의 성분 생성 정도는 원료의 염도, 수분 함량, 발효 조건 등에 따라 달라지며, Kim YS 등(2003)은 이취를 유발하는 성분의 함량을 낮출 수 있는 발효 균주에 대한 연구를 진행한 바 있다.
한편 유산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물 중 한 종류이며, 비병원성규으로 인간의 장내에 서식하면서 정장 및 정균작용을 할 수 있고, 당류를 발효하여 다량의 젖산을 생성하고 낮은 pH 및 혐기적인 조건에서도 잘 생육하며 여러가지 영양물질을 요구하는 등의 특징을 가지고 있다. 유산균에 의해 천연물이 발효되면 독특한 향과 맛을 내게되어 관능적 특성이 향상되고, 유기산에 의하여 여러 생리활성물질이 잘 보존되며, 초기 재료에는 거의 존재하지 않던 비타민 B13, 비타민 K가 생합성되어 부패균과 병원성균의 성장과 증식을 저해하여 위생적인 식품이 되는 등의 장점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 특정 조건에서 원료의 전처리, 건조 및 숙성 과정을 거쳐 발효 전 원료를 최적화하고, 유산균의 일종인 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 이용하여 발효시키는 공정을 확립함으로써 원료의 기능성 물질의 함량을 높이고, 체네 흡수율을 높여 원료의 활용성을 높이는 기술을 개발하고자 한다.
한국공개특허 제10-2394733호
본 발명의 목적은 원료의 2단 숙성 및 발효 공정을 이용한 원료 발효 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 (a) 원료에 대하여 전처리를 수행하는 단계; (b) 전처리된 상기 원료에 대하여 물기를 제거 및 건조하는 단계; (c) 건조 후 상기 원료에 대하여 옹기에 90~120시간 저온 숙성 및 상온 숙성을 진행하는 단계; (d) 숙성시킨 상기 원료에 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주로 발효시키는 단계; 및 (e) 발효시킨 상기 원료를 117~125℃에서 10~20분간 멸균한 후 필터로 여과하는 단계;를 포함하는 원료의 2단 숙성 및 발효 공정을 이용한 원료 발효 방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계에서 원료의 전처리는 원료를 정제수로 세척하고 분쇄한 후 온도가 55~75℃인 물에 넣고, 10~30초 동안 담근 후 건져내는 것을 포함한다. 상기 세척 후 뜨거운 물에 짧게 담근 후 건져냄으로써 원료의 세척 단계에서 제거되지 않는 원료의 이취, 풋내를 제거할 수 있다.
상기 (b) 단계는 전처리된 원료의 물기 제거 및 건조 단계를 총 2단에 걸쳐 진행할 수 있다. 구체적으로 상기 (b) 단계의 물기 제거는 제1단, 제2단 물기 제거를 수행하는 것으로서, 제1단 물기 제거에서는 25~30℃, 습도 70~75%, 시간 10~20분으로 물기 제거를 수행하고, 제2단 물기제거는 30~40℃, 습도 50~55%, 시간 12~20분으로 물기 제거를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 상기 물기를 제거한 원료를 히트펌프 건조기에 넣어 제1단 및 제2단 건조를 수행할 수 있으며, 상기 제1단 건조는 온도 45~55℃, 습도 40~50%, 시간 10~20분으로 건조를 수행하고, 제2단 건조는 온도 40~50℃, 습도 35~45%, 시간 10~20분으로 건조를 수행할 수 있다. 이후 상온에서 원료를 건조시켜 원료의 수분함량이 40~60%인 건조 원료를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
상기 발효 과정에서 수분함량이 40% 미만인 원료에 균주를 처리할 경우, 미생물의 성장이 더뎌지며, 원료의 수분함량이 60% 이상일 경우에는 원료 배합 및 추출이 잘 이루어지지 않아, 원료 발효물의 활용이 용이하지 않을 수 있다.
상기 원료의 물기제거는 제1단 및 제2단에 걸쳐 온도는 높이고, 습도는 낮추어 진행함으로써 뒤이어 진행되는 건조에서 원료의 갈변현상이 발생하는 것을 방지할 수 있다. 또한 제1단 및 제2단에 걸쳐 건조 단계를 진행할 경우 원료의 수분함량을 40~60%로 빠르게 조절할 수 있으며, 원료 추출시 수율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 발효 균주의 에탄올 추출을 수행한 결과, 제1단 및 제2단의 건조 단계를 진행 시 원료의 성분 내 수분 함량이 조절되어 추출 수율이 개선됨을 확인하였다(표 2).
상기 (c) 단계는 건조 후 상기 원료를 옹기에 넣고 온도 12~19℃, 습도 70~90%에서 40~60시간 1차 숙성시킨 후, 온도 20~25℃, 습도 70~90%의 상온에서 50~60시간 2차 숙성시키는 것일 수 있다. 상기 단계에서 숙성의 온도, 습도, 시간 등을 조절하여, 원료 내 에틸렌(ethylene)의 함량을 조절할 수 있다. 특히 에틸렌은 낮은 온도, 높은 이산화탄소 농도 등에서 발생이 감소할 수 있으나, 저온에서 원료를 보관할 경우 품질이 저하될 수 있으므로, 1차 및 2차 단계에 거쳐 숙성을 진행하여 발효에 적절한 상태로 숙성시킬 수 있다.
본 발명에서 에틸렌은 분자량 28.05의 단순한 불포화탄화수소로 상온, 대기압 조건에서는 항상 가스로 존재하는 성분이다. 에틸렌은 가연성이며 색깔이 없고 에테르와 같이 약간 단 냄새가 난다. 에틸렌은 다양한 신선한 원예산물의 수확후 노화 및 부패를 촉진하여 보존성을 저하시키는 물질 중 하나이며, 긍정적인 영향으로는 조직의 성숙을 촉진하여 식미가치를 높인다. 이에 원료의 숙성을 통해 에틸렌의 함량을 조절하여 유해한 미생물에 의한 부패가 증가하는 것을 방지하고, 발효시 원료 내 유용한 미생물의 생육 활성을 높여 기능성 성분의 함량을 증진시키는데 도움을 줄 수 있다.
상기 원료는 발효 전 숙성 시간 및 온도, 저장조건에 따라서 균주의 분포가 달라질 수 있으며, 이는 원료의 기능성 물질과 밀접한 관련이 있다. 또한 원료 발효 시 발생하는 이취는 원료의 수분, 염도, 온도 등과 같이 미생물 생육 환경에 따라 달라 질 수 있는데, 일정 조건에서 숙성시키는 과정을 통해 원료 성분을 변화하여 이취를 유발하는 화합물의 생성을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대두의 주요 기능성 성분 중 하나인 이소플라본(isoflavone)의 함량이 숙성에 따라 유의적으로 증진됨을 확인하였으며, 이취를 유발하는 화학성분의 감소 효과도 확인하였다(표 3 및 표 4).
상기 (d) 단계는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주 현탁액을 접종하여 제1단 및 제2단 발효를 수행하는 것으로, 제1단 발효는 35~40℃에서 30~35시간 발효시키고, 제2단 발효에서 30~35℃로 60~90시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.
상기 (d) 발효 단계의 락토바실러스 속 균주는 질량분율 16~20%의 균농도 107 내지 108 cfu/mL인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 현탁액, 13~16%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 현탁액, 22~27%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 현탁액, 12~14%의 균농도 109 내지 1010 cfu/mL인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 현탁액, 18~22%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri) 현탁액 및 5~7%의 균농도 107 내지 108 cfu/mL인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 현탁액으로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 락토바실러스 속 균주 대신 비피더스 속 균주를 접종하여 발효물을 제조한 결과 원료의 불쾌한 냄새를 유발하는 화학성분의 함량이 감소되고, 원료의 배당체 성분이 비배당체로 전환되어 유용한 성분의 함량이 증진됨을 확인하였다(표 3및 표 4).
상기 원료는 대두 또는 콘민트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 락토바실러스 속 균주를 적용한 발효에 적합하고, 인체에 유용한 천연 물질은 제한 없이 활용될 수 있다.
본 발명의 발효 공정은 2단 숙성 및 발효 공정을 거쳐 원료에서 이취를 유발하는 물질은 저감하고, 인체 유용한 기능성 물질의 함량을 높일 수 있으며, 나아가 발효를 통해 체내 흡수율을 높일 수 있다. 이는 특정 원료에 제한되지 않으며, 식료품, 화장품 등 인체 적용 가능한 원료에 다양하게 적용할 수 있어 활용가치가 높다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 원료의 발효 공정도를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다
실시예 1.
1-1. 대두 원료의 준비
대두를 시중에서 구입하여 정제수로 세척하고, 적절한 크기로 분쇄한 후 60~65℃의 뜨거운 물에 20초 정도 담근 후 신속히 건져내었다. 건져낸 대두를 히트펌프 건조기에 넣어25℃, 습도 75%의 저온에서 약 15분간 1차 물기를 제거한 후, 35℃, 습도 55%에서 약 15분간 2차 물기 제거를 수행한다. 이후 온도 45℃, 습도 50%에서 약 15분간 1차 건조를 수행하고, 온도를 조금 내려 온도 40℃, 습도 45%에서 약11~13분간 건조를 수행하고, 대두의 수분함량이 40~60%가 될 때까지 건조시켰다. 건조시킨 대두는 옹기에 넣고 온도 12~13℃, 습도 80~90%에서 약 55시간 숙성시킨 후 온도 22~23℃, 습도 70~80%에서 약 50~55시간 숙성시켰다.
1-2. 발효 균주의 현탁액 준비
발효 균주는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 준비하였다. 락토바실러스 속 균주의 현탁액은 질량분율 16~20%의 균농도 107 내지 108 cfu/mL인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 현탁액, 13~16%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 현탁액, 22~27%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 현탁액, 12~14%의 균농도 109 내지 1010 cfu/mL인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 현탁액, 18~22%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri) 현탁액 및 5~7%의 균농도 107 내지 108 cfu/mL인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 현탁액 중 하나를 선택할 수 있다.
상기 실시예에서는 질량분율 17%의 균농도 108 cfu/mL인 락토바실러스 카제이 생리식염수 현탁액 및 14%의 균농도 109 cfu/mL인 락토바실러스 람노서스 생리식염수 현탁액을 혼합한 균주를 사용하였다.
1-3. 발효 대두의 제조
상기 1-1에서 준비한 대두에 상기 1-2에서 준비한 락토바실러스 속 균주 현탁액을 접종하여, 35~40℃에서 30시간 발효시키고, 제2단 발효에서 30~35℃로 80시간 동안 대두를 발효시켰다. 이후 120℃에서 10분간 멸균한 뒤 필터로 여과하여, 대두 발효액을 준비하였다.
실시예 2.
2-1. 콘민트 원료의 준비
콘민트를 시중에서 구입하여 정제수로 세척하고, 적절한 크기로 분쇄한 후 60~65℃의 뜨거운 물에 20초 정도 담근 후 신속히 건져내었다. 건져 낸 콘민트를 히트펌프 건조기에 넣어25~30℃, 습도 70~75%의 저온에서 약 10분간 1차 물기를 제거한 후, 30~40℃, 습도 50~55%에서 약 15분간 2차 물기를 제거하였다. 이후 온도 45~55℃, 습도 40~50%에서 약 11~13분간 1차 건조를 수행하고, 온도를 조금 내려 온도 40~50℃, 습도 35~45%에서 약10분간 건조를 수행한 뒤 콘민트의 수분함량이 50~55%가 될 때까지 건조시켰다. 건조시킨 콘민트를 옹기에 넣고 온도 15~17℃, 습도 80~90%에서 약 40시간 숙성시키고, 이어서 온도 20~22℃, 습도 70~80%에서 약 50~55시간 숙성시켰다.
2-2. 발효 균주의 현탁액 준비
질량분율 25%의 균농도 108 cfu/mL인 락토바실러스 아시도필루스 생리식염수 현탁액 및 14%의 균농도 109 cfu/mL인 락토바실러스 람노서스 생리식염수 현탁액을 혼합하였다.
2-3. 발효 콘민트의 제조
상기 2-1에서 준비한 콘민트에 상기 2-2에서 준비한 락토바실러스 속 균주 현탁액을 접종하여, 35~40℃에서 30시간 1차 발효시키고, 30~35℃로 60시간 동안 콘민트를 2차 발효시켰다. 이후 120℃에서 10분간 멸균한 뒤 필터로 여과하여, 콘민트 발효액을 준비하였다.
비교예 1.
실시예 1과 제조 방법은 동일하며, 다만 대두의 전처리 과정에서 60~65℃의 뜨거운 물에 20초 담궜다가 신속히 건져내는 과정은 생략하였다. 그 외 발효공정은 동일하다.
비교예 2.
실시예 1과 제조방법은 동일하며, 다만 전처리한 대두의 건조 조건을 상이하게 하였다. 비교예 2에서는 히트펌프 건조기에 넣고 온도 40~50℃, 습도 35~45%, 시간 40분동안 건조를 수행하여 대두의 수분함량이 40~60%인 건조 원료를 수득하였다.
비교예 3.
실시예 1과 제조방법은 동일하며, 다만 옹기에 90~120시간 저온 숙성 및 상온 숙성을 진행하는 단계는 생략하였다.
비교예 4.
실시예 1과 제조방법은 동일하다. 다만, 락토바실러스 카제이 생리식염수 현탁액 및 락토바실러스 람노서스 생리식염수 현탁액을 대신하여 22~27%의 균농도 108 내지 109 cfu/mL인 비피도박테리음 브레브(Bfidobacterium breve)　를 발효균주로 하여, 현탁액을 제조하였다.
구분 실시예 1 실시예 2 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4
원료 준비 대두 콘민트 대두 대두 대두 대두
원료의 전처리 세척 O O O O O O
뜨거운 물에 담그기 O O ㅡ O O O
물기제거 제1단 O O O O O O
제2단 O O O O O O
건조 제1단 O O O O O O
제2단 O O O ㅡ O O
숙성 O O O O ㅡ O
발효 락토바실러스 속 균주 비피더스 속 균주
실험예 1. 추출 수율 효능
상기 실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4의 추출 수율을 비교하며, 각 공정별 미치는 영향을 확인하였다. 먼저 실시예 1, 비교예 1 내지 4의 멸균한 뒤 필터로 여과시킨 대두 발효물을 왓맨(Whatman)사의 20~25 um 여과지를 사용하여 대두 발효액과 대두를 분리한 후, 분리된 대두에 70% 에탄올 2L를 가하여 24h 동안 60℃에서 추출하였다. 상기 얻어진 대두 발효액과 추출물을 감압여과장치(Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Germany)로 여과하여 농축하였고, 동결건조하였다.
상기 실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4의 원료의 추출 과정에서 수율은 하기 표 2와 같다.
구분 원물(g) 추출물(g) 수율(%)
실시예 1 200.0 10.5 5.3
실시예 2 200.0 11.3 5.7
비교예 1 200.1 10.0 5.0
비교예 2 200.0 7.4 3.7
비교예 3 200.0 9.2 4.6
비교예 4 199.8 9.0 4.5
그 결과, 제1, 2단에 걸쳐 건조를 수행하고, 숙성단계를 거친 실시예 1, 2에서 비교예 2, 3 대비 추출 수율이 개선되었으며, 유산균의 종류에 따라 추출 수율이 상이해지며, 락토바실러스 속 균주를 이용한 실시예 1에서 비피더스 속 균주를 이용한 비교예 4 대비 증가된 추출 수율을 확인하였다.
실험예 2. 향미성분 평가
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에서 제조된 대두 발효물의 향미 관련 성분을 추출하기 위해 SPME(Solid Phase Microextraction)를 이용하였고, Carboxen-Polydimethylsiloxane(Carboxen-PDMS 75 um) fiber을 사용하였다. 시료는 3℃에서 보관하고 실험을 수행하기 30분 전에 상온에 꺼내놓았다. 시간이 경과한 후 60 ml-vial에 20ml를 넣고, 염화나트륨(NaCl) 2.00g과 내부표준물질로 1%의 제라니올(geraniol)을 3.3 ug 첨가한 뒤 60℃에서 45분 동안 평형상태에서 유지시키고, SPME fiber를 넣고 30분 동안 향미성분을 흡착하였다. 탈착은 200℃의 GC-인젝터(GC-injector)에 넣고 크라이오-포커싱(Cryo-focusing)으로 5분간 진행하였다. 대두의 이취성분으로 8종을 선정하여 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3의 값은 Relative peak area를 의미하며, 각 성분의 peak area/Internal standard peak area에 의해 구한 값이다.
구분 2-ethylfuran 2-penthylfuran hexanal 2-heptanone 1-octen-3-ol 2-nonanone 2-undecanone
실시예 1 7.01 1.89 3.88 0.39 23.67 4.46 4.53
비교예 1 7.43 3.65 4.15 3.05 29.85 6.18 5.07
비교예 2 7.31 1.95 5.05 0.66 23.78 5.69 4.69
비교예 3 8.99 24.12 14.62 4.96 32.78 6.51 4.84
비교예 4 55.34 21.80 22.01 4.21 29.32 7.29 5.14
표준시료 ㅡ 37.38 5.80 0.73 31.07 ㅡ 0.51
그 결과, 전체적으로 비피더스 속 균주로 발효시킬 경우 원료의 이취가 높은 편에 속하였으며, 원료 발효 전 세척 및 전처리 단계, 숙성 단계를 거치면서 이취 성분을 상당 부분 제어됨을 확인하였다.
실험예 3. 기능성 성분 함량
상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4의 발효물 시료 1g에 내부표준용약(internal standard solution)을 0.1 g을 넣고 아세토나이트릴 (acetonitrile) 7 ml, 3차 증류수 3 ml, 0.1N 염산 2 ml을 첨가하여 보텍싱(vortexing)한 후 교반기를 사용하여 1시간 동안 교반시켰다. 그리고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상충액을 여과지로 거른 후 여액을 1 ml 취하여 10 ml 시료병에 넣고 질소를 불어 넣어 용매를 제거하였다. 용매 제거 후 1 ml 메탄올을 첨가하여 녹인 후 시린지 필터(Acrodisc, CR PTEE 0.2 um, 25 mm syringe filter filtering)로 여과하여 HPLC 분석을 시행하였다. 이때 표준시약은 발효하지 않고, 70% 에탄올로 추출한 대두 추출물로 진행하였다.
구분 비배당체
(aglycones)		 β-글루코시드
(β-glucoside)		 아세틸-β 글루코시드
(Acetyl-β-glucoside)		 말로니- β-글루코시드(Malony-β-glucoside)
실시예 1 86.51 7.05 3.80 2.64
비교예 1 81.30 8.48 6.31 3.91
비교예 2 78.55 9.66 7.94 3.85
비교예 3 64.92 22.69 8.22 4.17
비교예 4 50.36 29.94 8.05 11.65
표준시약 5.28 81.96 7.46 5.30
그 결과, 본 발명의 발효공정을 거치지 않은 대두 추출물에는 비배당체가 거의 없으나, 실시예 1에서 배당체가 비배당체로 전환되었음을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 본 발명의 발효 공정을 통해 기능성 물질의 생성을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. (a) 대두 또는 콘민트에 대하여 전처리를 수행하는 단계;
    (b) 전처리된 상기 원료에 대하여 물기를 제거 및 건조하는 단계;
    (c) 건조 후 상기 원료에 대하여 옹기에 90~120시간 저온 숙성 및 상온 숙성을 진행하는 단계;
    (d) 숙성시킨 상기 원료에 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 현탁액을 접종하여 발효시키는 단계; 및
    (e) 발효시킨 상기 원료를 117~125℃에서 10~20분간 멸균한 후 필터로 여과하는 단계;를 포함하며,
    상기 (a) 단계는 원료를 정제수로 세척하고 분쇄한 후 온도가 55~75℃인 물에 10~30초 동안 담근 후 건져내는 것을 포함하며,
    상기 (b) 단계는 전처리된 상기 원료의 물기를 제거한 후, 히트펌프 건조기에 넣어 제1단 및 제2단 건조를 수행하는 것이며, 상기 제1단 건조는 온도 45~55℃, 습도 40~50%, 시간 10~20분으로 건조를 수행하고, 제2단 건조는 온도 40~50℃, 습도 35~45%, 시간 10~20분으로 건조를 수행하는 것이며, 이후 상온에서 원료를 건조시켜 원료의 수분함량이 40~60%인 건조 원료를 얻는 단계를 포함하며,
    상기 (c) 단계는 건조 후 상기 원료를 옹기에 넣고 온도 12~19℃, 습도 70~90%에서 40~60시간 숙성시킨 후, 온도 20~25℃, 습도 70~90%에서 50~60시간 숙성시켜, 원료의 에틸렌(ethylene)의 함량을 조절하는 단계이며,
    상기 (d) 단계는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 현탁액을 접종하여 제1단 및 제2단 발효를 수행하는 것으로, 제1단 발효는 35~40℃에서 30~35시간 발효시키고, 제2단 발효에서 30~35℃로 60~90시간 동안 발효시키는 것을 포함하는,
    원료의 2단 숙성 및 발효 공정을 이용한 원료 발효 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 물기 제거는 제1단, 제2단 물기 제거를 수행하는 것으로서, 제1단 물기 제거에서는 25~30℃, 습도 70~75%, 시간 10~20분으로 물기 제거를 수행하고, 제2단 물기제거는 30~40℃, 습도 50~55%, 시간 12~20분으로 물기 제거를 수행하는 단계를 포함하는 것인, 원료의 2단 숙성 및 발효 공정을 이용한 원료 발효 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 발효 단계의 락토바실러스 속 균주 현탁액은 질량분율 16~20%의 균농도 107 내지 108 cfu/mL인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 현탁액및 12~14%의 균농도 109 내지 1010 cfu/mL인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 현탁액으인,
    원료의 2단 숙성 및 발효 공정을 이용한 원료 발효 방법.
  5. 삭제
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