KR102450968B1 - 루핀 펩타이드 추출물들 및 피부 견실도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 루핀 펩타이드 추출물의 피부 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 용도에 관한 것이다. 유리하게, 루핀 펩타이드 추출물은 요와형성 (dimpling)의 발병을 예방하고/거나 피부 요와형성을 감소시킬 수 있다.

Description

루핀 펩타이드 추출물들 및 피부 견실도 {Lupin peptide extracts and skin firmness}

본 발명은 루핀 펩타이드 추출물의 피부 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 용도에 관한 것이다. 유리하게, 루핀 펩타이드 추출물은 요와형성 (dimpling)의 발병을 예방하고/거나 피부 요와형성을 감소시킬 수 있다.

진피는 표피 및 피하조직 사이에 포함된 피부의 세 가지 구성 층들 중 하나이다. 진피는 피부를 보강하는 연결 조직이고, 진피의 주요 세포 집단이 되는 섬유모세포들에 의해 생산되는 세포외 기질 (ECM)로 주로 구성된다.

세포외 기질은 단백질 섬유들 (콜라겐 및 엘라스틴) 그리고 무엇보다도 구조적 당단백질들 (피브로넥틴) 및 프로테오글리칸들/글리코사미노글리칸들을 포함하는 기본적인 물질로도 알려진 원섬유외 (extrafibrillar) 기질로 구성된다. 콜라겐들은 다수인 제 I형 콜라겐 (진피 콜라겐의 85 내지 90%) 및 제 Ⅲ형 콜라겐 (진피 콜라겐의 10 내지 15%)을 가진 ECM 성분들의 약 70%를 차지한다. 콜라겐들은 압력에 대항하는 저항성 (피부의 기계적 강도)으로 진피에 견실도 (firmness)를 부여한다. 엘라스틴 섬유들은 여기에 탄력적 특성들을 부여한다.

콜라겐들이 피부 견실도를 유지하는 데 필수적인 한편, 표피-진피 연결부 (EDJ)의 역할도 무시되어서는 안된다. EDJ는 표피로부터 진피를 분리하는 복합적 구조이다. 그의 주요한 기능들은 진피와 표피의 부착을 위한 기계적인 지지대를 제공하고 두 가지 구획들 간의 확산 장벽 및 교환 부위로서 작용하는 점들이다. 진피와 표피의 부착은 무엇보다도 제 Ⅳ형 콜라겐들 또는 라미닌 5와 같은 고정화 단백질들에 의해 보장된다. 진피가 표피와 덜 부착될 때, 피부는 견실도가 손실되고 표피는 느슨해지며 주름이 생긴다.

당화는 피부 수준에서, 상세하게 진피에서 잘 알려진 현상이다. 이것은 아민기, 상세하게는 단백질들을 형성하는 아미노산 예로 라이신의 아민기 및 포도당 또는 리보스와 같은 환원당 간의 자발적인 비-효소적 반응이다.

진피에서, 포도당은 상세하게 약어 "AGE들"로 잘 알려진, 소위 "고급 당화 최종 산물들"을 유도하는 화합물들을 수득하도록 콜라겐 및/또는 엘라스틴과 반응한다. 이들 화학적 변형들이 콜라겐 및/또는 엘라스틴의 특성들에 관한 결과들이 없는 것은 아니다. 예를 들면, AGE들은 콜라겐 섬유들 간의 분자적 결합의 형성을 유도한다. 이들 결합들은 그들을 더욱 경직되게 만들어 콜라겐 섬유들의 기계적인 특성들을 퇴화시킨다.

따라서 당화 현상은 콜라겐과 같은 진피의 세포외 기질의 단백질들에 영향을 줌으로써, 그들의 대사적 및 기계적인 특성들을 퇴화시킬 수 있다.

피부 수준에서, 당화가 콜라겐 섬유들의 조직화 및 진피의 섬유모세포들의 기능성들 (콜라겐 격자들 내에서 수축하는 능력과 같음)을 퇴화시키기 때문에, 조직 견실도 및 탄력도의 손실이 관찰된다. 피부는 그의 견실도를 상실하고 느슨해진다. 따라서 단백질 및 콜라겐의 당화는 상세하게 피부에게 해로운 결과들을 가져온다. 이들 결과들은 가시적으로 관찰될 수 있고, 대체로 추할 수 있다. 상세하게, 덜 구조화될수록 덜 견실한 진피 조직이 피하에 위치하는 지방형성세포들의 성장에 대항하여 더 적은 저항성을 가지며, "오렌지 껍질"이라고 알려진 요와형성된 외양을 만든다.

따라서, 피부 견실도의 손실 예방 및 피부 견실도의 증가를 허용하는 제제들을 찾아야 할 필요성이 존재한다. 유리하게, 상기 제제는 상세하게 셀룰라이트를 가진 사람들에게 피부 요와형성의 예방 또는 피부의 오렌지 껍질 외양의 감소를 허용할 것이다.

본 발명은 피부 견실도, 바람직하게 신체 피부의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 루핀 펩타이드 추출물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 피부 견실도, 바람직하게 신체 피부의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는, 건조 무게로 0.001 내지 30%의 루핀 펩타이드 추출물를 포함하는 미용적 조성물의 용도에 관한 것이다.

루핀 펩타이드 추출물들은 항-금속프로테아제 활성, 상세하게 항-콜라게나제 및 항-젤라티나제를 가지는 것으로 알려져 있다. 이러한 활성을 기초로 하여, 콜라겐의 과다한 파괴 및/또는 지지 조직들의 과다한 파괴와 관련된 질환들을 치료하도록 이를 사용하는 것이 제안되어 왔다. 예를 들면, 관절염, 치주 질환, 피부 손상들, 염증성 질환들, 치유 결합과 관련된 질환들, 치아 법랑질 질병, 종양 또는 병리학적 혈관형성을 치료하도록, 또는 피부의 내재적인 노화로 인한 피부 손상들, 태양광 조사의 작용으로 인한 또는 담배, 공해 및 스트레스의 유독한 효과들로 인한 노화의 치료를 위해 루핀 펩타이드 추출물들을 사용하는 것이 제안되어 왔다.

예기치 못하게도, 본 발명자들은 루핀 펩타이드 추출물들이 단백질 당화 상세하게 콜라겐의 당화를 감소시키고 심지어 억제하며, 진피 세포외 기질 및 진피-표피 연결부의 세 가지 주요한 거대분자들인 콜라겐들 제 I형, 제 Ⅲ형 및 제 Ⅳ형의 발현을 자극하고, 섬유모세포들의 수축력들을 자극하는 특성을 가지는 점을 발견하였다.

본 발명은 이들 새로운 특성들로부터 장점을 도출하고 있으며, 따라서 피부 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 루핀 펩타이드 추출물의 용도에 관한 것이다. 유리하게, 본 발명의 루핀 펩타이드 추출물들은 항-당화 제제들로서 사용된다.

콜라겐의 당화를 억제하여 그리고 콜라겐들 제 I형 및 제 Ⅲ형의 발현을 자극하여, 루핀 펩타이드 추출물들은 세포외 기질을 강화하는 데 기여한다. 세포외 기질이 강화되면서, 피부는 견실도를 얻는다. 추가적으로, 콜라겐 제 Ⅳ형의 합성을 자극하여, 루핀 펩타이드 추출물들은 진피 및 표피의 부착을 강화하는 데 기여한다. 마지막으로, 수축성 섬유들의 수축의 손실에 대항하여 진피를 보호하여, 루핀 펩타이드 추출물들은 피부를 견실도를 강화하는 데 기여한다. 따라서, 루핀 펩타이드 추출물들은 상세하게 피부 견실도, 상세하게 얼굴의 피부와 반대되는 바 신체의 피부의 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 데 효율적이다. 신체 피부는 얼굴 피부보다 외부 공격에 덜 노출되지만 그의 적들도 역시 가진다: 운동부족의 생활, 체중의 변화들, 임신들, 호르몬 변화들... 이들 현상들은 피부 견실도 또는 긴장도의 손실을 유도할 수 있고, 느슨한 피부, 요와형성, 셀룰라이트와 같은 추한 장애들의 발병을 생성한다.

용어 셀룰라이트는 진피 내로 돌출되는 피하 지방에 의해 유발되는 국소정착된 피부 장애를 말하고, 시각적으로 불규칙한 요와형성을 특징으로 하는 구조적 및 건축적 변화들을 가져온다.

본 발명의 펩타이드 추출물들은 유리하게 특이적 바디 케어 산물들로서, 상세하게 슬림화 산물들로서 또는 신체 견실화 및 실루엣 리모델링 효과, 조색화 및 항-느슨화 효과, 항-셀룰라이드 및/또는 항-요와형성 효과를 위해 사용된다.

또한, 세포외 기질이 강화되면서, 진피 조직은 지방형성세포들의 성장에 대항하여 더욱 저항적이 된다. 요와형성의 발병도 이에 의해 방해를 받는다. 따라서 루핀 펩타이드 추출물들은 상세하게 피부 요와형성의 발병을 예방하고/거나 피부 요와형성을 감소시키는 데 효과적인 것으로 입증된다.

셀룰라이드에 미치는 레티놀의 효능을 평가하는 크리그만 등에 의한 연구에 따르면 [Kligman et al., J. Dermatolog. Treat., 1999; 10:　119-25], 이러한 효능은 주로 진피의 재구성화 및 증가된 미세혈관형성과 관련되어 있다.

따라서, 피부 구조를 강화하고 피부 견실도를 촉진하도록 진피에 미치는 작용은 셀룰라이트의 외양을 개선하는 데 일차적으로 중요한 것으로 보인다.

본 발명에 유용한 루핀 펩타이드 추출물은 펩타이드 추출물의 전체 건조 무게와 대비하여 적어도 80 무게%의 펩타이드들, 전형적으로 펩타이드 추출물의 전체 건조 무게와 대비하여 적어도 80 내지 100 무게%의 펩타이드들을 포함한다.

펩타이드 추출물은 필수적으로 당들 및 지질들이 없다.

당 함량은 전형적으로 펩타이드 추출물의 전체 건조 무게와 대비하여 건조 무게로 4% 이하, 바람직하게 0 심지어 1 및 3 무게% 사이의 범위이다.

지질 함량은 전형적으로 펩타이드 추출물의 전체 건조 무게와 대비하여 건조 무게로 1% 이하이다.

루핀 펩타이드 추출물은 속들 루피너스 알부스 (Lupinus albus), 루피너스 루테우스 (Lupinus luteus), 루피너스 뮤타빌리스 (Lupinus mutabilis) 및 그들의 혼합물에 속하는 루핀으로부터 유래한 펩타이드 추출물들 중으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 펩타이드 추출물은 달콤한 흰색 루핀 (루피너스 알부스), 예로 아레스 변종의 펩타이드 추출물이다. 아레스 변종의 루핀은 낮은 알칼로이드 함량을 가진다.

루핀 펩타이드 추출물은 다음의

(a) 루핀 단백질 분획을 추출하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 획득된 단백질 분획을 가수분해하는 단계; 및

(c) 펩타이드 추출물을 회수하는 단계:

를 포함하는 방법을 사용하여 획득될 수 있다.

가수분해는 전형적으로 효소적 가수분해를 통해 수행된다. 상세하게, 효소적 가수분해는 프로테아제들 예로 알칼라제® (노보 노르디스크사 (NOVO NORDISK)) 또는 프로라이베 1000 (라이벤 (LYVEN))을 사용하여 시행될 수 있다. 효소적 가수분해는 2시간부터 4시간까지의 범위를 가지는 시간 동안 50℃부터 60℃까지의 범위를 가지는 온도에서 시행될 수 있다.

펩타이드 추출물의 펩타이드들은 유리하게 130 Da부터 10,000 Da까지의 범위, 바람직하게 130 Da부터 3,500 Da까지의 범위, 더욱 바람직하게 300 Da부터 3,500 Da까지의 범위를 가지는 분자량을 가진다.

본 발명의 한 가지 상세한 특징에 따르면, 펩타이드 추출물의 40% 내지 55%의 펩타이드들은 300 Da부터 1,200 Da까지의 범위를 가지는 분자량을 가지고/거나, 상기 펩타이드 추출물의 25% 내지 40%의 펩타이드들은 1,200 Da부터 3,500 Da까지의 범위를 가지는 분자량을 가진다.

단계 (b)에서 획득된 펩타이드 추출물은 바람직하게 10,000 달톤부터 15,000 달톤까지의 범위를 가지는 컷오프 수치를 가지는 초여과 모듈 상에서의 투석법에 의해 정제될 수 있다. 초여과법은 단백질들의 제거를 허용한다. 따라서, 펩타이드 추출물을 제조하는 방법은 초여과 단계를 포함할 수 있다. 이것은 또한 예로 100 Da부터 300 Da까지, 또는 130 Da부터 300 Da까지의 범위를 가지는 컷오프 수치를 가지는 나노여과 모듈 상에서의 나노여과 단계를 포함할 수 있다.

포장 이전에, 펩타이드 추출물은 무균적으로 미세여과 (0.2 μm)될 수 있고, 다음으로

- 라미나 플로우 하에서 보존제가 없이 무균의 용기들 내로 분배되고; 또는

- "청정" 용기들 내로 분배되기 이전에 보존제들의 첨가를 통하여 미생물적으로 안정화된다. 가능하게 사용될 수 있는 보존제들은 예를 들면 파라벤들의 혼합물 및/또는 펜옥시에탄올 (예로, 0.5% 페노닙)을 포함한다. 무-파라벤 혼합물, 예로 펜옥시에탄올 (1%), 시트르산 (0.5%), 아스코브산 (0.08%)의 혼합물이 바람직하고; 또는

- 습도 및 미생물 오염에 대해 보호된 밀폐 봉합된 사케들로 포장될 수 있는 건조 형태로 펩타이드 추출물을 획득할 수 있도록 스프레이-건조 또는 동결-건조를 통한 건조화에 의해 안정화된다.

따라서, 펩타이드 추출물을 제조하는 방법은 물의 전적 또는 부분적 증발을 통해 단계 (c)에서 획득된 가수분해된 펩타이드 추출물의 농축 단계를 더 포함할 수 있다.

건조화는 말토덱스트린과 같은 물질의 존재 여부와 상관없이 스프레이-건조 또는 동결-건조에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 건조화는 물질이 없이 동결-건조에 의해 획득된다.

단백질 분획의 추출은 다음의 방식,

(i) 적합한 용매를 사용하여 루핀 종자로부터 지질들을 추출하여 루핀 단백질 및 당류 분획들을 회수하는 단계;

(ii) 초여과법을 통해 단백질 분획을 추출하여 상기 단백질 분획을 회수하는 단계:

로 획득될 수 있다.

단계 (i)에서 사용된 용매는 유리하게 무독성 식품 용매들의 그룹으로부터 선택되고, 상세하게 에탄올이다. 지질들의 추출은 바람직하게 마쇄된 루핀의 케이크 또는 미세화된 루핀 분말의 형태로의 루핀 종자들로부터 획득된다. 또한 추출은 헥산을 사용하여 수행될 수 있다.

일정 구현예들에서, 루핀 펩타이드 추출물은 다음의 표에서 주어진 아미노산 조성을 가진다 (아미노산들의 전체 무게와 대비한 무게 백분율).

루핀 펩타이드 추출물은 미용적 (비-치료적) 용도를 위해, 바람직하게 피부에 국소적 적용으로 또는 경구적 경로를 통해 섭취되도록 의도된다.

루핀 펩타이드 추출물은 미용적 조성물의 형태로 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 피부, 상세하게 얼굴 피부와 상반되는 신체 피부의 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는, 루핀 펩타이드 추출물을 포함하는 미용적 조성물의 용도에 관한 것이다. 유리하게, 루핀 펩타이드 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 상세하게 셀룰라이트를 가진 사람들에서, 요와형성의 발병을 예방하거나 피부의 요와형성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.

미용적 조성물은 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 0.001 내지 30%, 바람직하게 0.05 내지 5%, 바람직하게 건조 무게로 0.05 내지 5%의 루핀 펩타이드 추출물을 포함할 수 있다. 유리하게, 본 발명의 조성물은 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 0.01 내지 0.2%, 더욱 유리하게 무게로 0.05 내지 0.2%, 전형적으로 무게로 0.01 내지 0.15%, 상세하게는 무게로 0.05 내지 0.15%의 루핀 펩타이드 추출물을 포함한다. 상기 농도들은 루핀 펩타이드 추출물의 효율적인 농도들을 형성할 수 있다.

또한, 미용적 조성물은 젤화제들, 예로 친수성 또는 친유성 젤화제들, 보존제들, 항-산화제들, 용매들, 향수들, 필러들, 화학적 또는 미네랄 필터들, 색소들, 킬레이팅제들, 냄새 흡수제들, 열수 및/또는 채색 물질들과 같은, 미용 분야에서 사용되는 보통의 아쥬반트들을 포함할 수 있다. 이들 서로 다른 아쥬반트들의 양들은 화장품들에서 통상적으로 사용되는 양들이다. 예를 들면, 각각의 아쥬반트의 양은 미용적 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 0.01%부터 20%까지의 범위로 다양할 수 있다.

미용적 조성물은 견실화제들, 배출제들, 조색제들, 긴축화제들 또는 그들의 혼합물들 중으로부터 선택되는 활성 성분들을 더 포함할 수 있다. 각각의 활성 성분의 개별적인 양은 미용적 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 0.01%부터 20%까지의 범위로 다양할 수 있다.

미용적 조성물은 보통 미용 분야에서 사용되는 임의의 형태, 상세하게는 외부의 국소적 적용에 적합한 임의의 형태로 일 수 있다. 따라서, 미용적 조성물은 하이드로알코올 또는 오일 용액, 물 속의 오일 또는 오일 속의 물 또는 복수의 에멀전, 수용성 또는 오일 젤, 액체, 페이스트 또는 고체 무수 산물, 또는 소구에 의한 수용성 상으로의 오일 분산물의 형태로 일 수 있고, 소구 (spherule)는 가능하게 나노구 또는 나노캡슐과 같은 중합체성 나노입자들 또는 이온성 및/또는 비-이온성 유형의 지질 소포들이다. 미용적 조성물은 대체로 크림, 연고, 밀크, 로션, 언구언트, 세럼, 페이스트, 폼, 에어로졸 또는 스틱의 형태로의 액체일 수 있다.

미용적 조성물이 에멀전일 때, 지방 상의 비율은 미용적 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 5%부터 80%까지의 범위, 바람직하게 무게로 5% 내지 50%의 범위를 가질 수 있다. 미용적 조성물에 사용되는 오일들, 에멀전화제들 및 공동-에멀전화제들은 미용 분야에서 전통적으로 사용되는 것들 중으로부터 선택된다. 에멀전화제들 및 공동-에멀전화제들은 미용적 조성물의 전체 무게와 대비하여 무게로 0.5%부터 30%까지의 범위, 바람직하게 무게로 0.5% 내지 20%의 범위를 가지는 비율로 조성물에 포함될 수 있다. 오일들은 미네랄 오일들, 식물성 오일들 (행인유, 해바라기 종자, 플럼 오일), 동물성 오일들, 합성 오일들, 실리콘 오일들 및 불화된 오일들 (퍼플루오로폴리에테르들) 중으로부터 선택될 수 있다. 세틸 알코올과 같은 지방성 알코올들, 지방산들 또는 밀랍과 같은 왁스들도 역시 지방들로서 사용될 수 있다. 에멀전화제들 및 공동-에멀전화제들은 PEG-40 스테아레이트 또는 PEG-100 스테아레이트와 같은 지방산들과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르들, 글리세롤 스테아레이트 및 소르비탄 트리스테아레이트와 같은 지방산과 폴리올의 에스테르들 중으로부터 선택될 수 있다.

일정 구현예들에서, 미용적 조성물은 젤 형태로 일 수 있다. 상기 젤은 상세하게 항-요와형성 슬림화 젤로서 유용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 젤은 다음의 조성을 가질 수 있다.

일정 구현예들에서, 미용적 조성물은 견실화 바디 케어로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 다음의 조성을 가질 수 있다.

루핀 펩타이드 추출물 및 상기 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 피부 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 피부 견실도의 손실을 예방하거나 피부 견실도를 증가시키는 미용적 치료 방법으로서, 루핀 펩타이드 추출물, 상세하게 효율적인 농도의 루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물의 피부 명확하게 신체 피부에 적용 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다.

루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 미용적 신체-견실화 치료 방법으로서, 루핀 펩타이드 추출물, 상세하게 효율적인 농도의 루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물의 피부에 적용 단계를 포함하는 방법에도 역시 사용될 수 있다. 획득된 견실화는 실루엣의 리모델링을 허용한다.

루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 요와형성의 발병을 예방하고/거나 피부의 요와형성된 외양을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 다른 말로 하면, 루핀 펩타이드 추출물은 셀룰라이트를 가진 사람들의 피부에 존재할 수 있는 "오렌지 껍질" 외양의 감소를 허용한다. 이에 의해 피부는 부드러워진다. 예를 들면, 루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 미용적 조성물은 요와형성의 발병을 예방하고/거나 피부의 요와형성된 외양을 감소시키는 미용적 치료 방법으로서, 루핀 펩타이드 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물의 효율적인 농도로 피부 명확하게 신체 피부에 루핀 펩타이드 추출물의 적용 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다.

상기에 기술된 바와 같은 미용적 치료 방법들도 역시 본 발명의 주제이다.

도 1 및 도 2는 글래스박스® 시스템에서 신장되는 진피 동등물 내의 섬유모세포들에 의해 발생되는 수축력들을 나타낸 것이다.
도 3은 제 I형 콜라겐 (진피)의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 제 Ⅲ형 콜라겐 (진피)의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 제 Ⅳ형 콜라겐 (EDJ)의 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 라미닌 5 (EDJ)의 발현을 나타낸 것이다.

실시예들

하기 실시예들에서 사용되는 펩타이드 추출물은 상표명 액팀프® (ACTIMP®, 분말) 또는 액팀프® 1.9.3 (액체)으로 익스팬사이언스 연구소사에 의해 공급된 바와 같다.

이것은 다음의 방식으로 제조될 수 있다.

1. 루핀 펩타이드 추출물들의 제조

마쇄된 탈지질화 루핀 케이크의 제조

루핀 종자들이 마쇄되고 지질들이 에탄올을 사용하여 추출되었다.

루핀 단백질들의 추출 및 정제

본 단계는 알칼리성 pH에서 용해성 분획의 수용성 용해화를 포함하고, 불용물들의 분리로 이어진다.

마쇄된 탈지질화 루핀 케이크로부터, 단백질들이 pH 9.0 (수산화나트륨의 첨가에 의해 조정된 pH)에서 1/10 (w/w)의 분말/물 비율로 추출되었다. 용액은 상온에서 1시간 동안 교반 하에 배양되었다. 케이크의 불용성 부분이 탈수화에 의해 용해성 부분으로부터 분리되었다. 획득된 케이크는 세척되었다. 단백질들 및 용해성 당들을 포함하는 용해성 분획이 10,000 달톤의 컷오프 수치를 가진 초여과 모듈 상에서 투석되어 용해성 당들 (초여과물)로부터 단백질들 (보유물)이 분리된다.

효소적 가수분해에 의한 펩타이드들의 생산 및 정제

단백질들을 포함하는 초여과 보유물은 100 g/L의 농도로 조정되고, 다음으로 알칼라제# (노보 노르디스크사)의 존재 시 약 3시간 동안 55℃에서 pH 8.0으로 가수분해된다. 가수분해 이후에, 효소는 85℃에서 15분 동안 가수분해에 의해 변성된다. 용액이 식혀지면 바로 이것은 염산의 첨가를 통하여 중화된다. 획득된 펩타이드들은 10,000 달톤의 컷오프 수치를 가지는 초여과 모듈 상에서 투석법에 의해 정제된다. 획득된 용액은 펩타이드 분획을 농축하도록 탈염화를 위해 나노여과된다. 펩타이드들의 용액은 3% 활성탄을 사용하여 (50℃에서 1시간) 탈색되고, 탄소는 여과에 의해 제거된다.

펩타이드 분획의 무균화 및 안정화

포장 이후에, 용액이 무균적으로 미세여과되고 (0.2 μm) 다음으로

- 무-파라벤 혼합물 (펜옥시에탄올 (1%), 시트르산 (0.5%), 아스코브산 (0.08%))의 첨가를 통하여 "청정" 용기들 내로 분배되기 이전에 미생물적으로 안정화되고 (익스팬사이언스 연구소사에 의해 시판되는 액팀프®1.9.3 (10% 루핀 펩타이드들로 형성됨)),

- 습도 및 미생물 오염에 대해 보호된 봉합된 사케들로 포장된 건조 형태로 펩타이드를 획득할 수 있도록 동결-건조에 의해 안정화될 수 있다 (익스팬사이언스 연구소사에 의해 시판되는 액팀프® 분말).

건조 추출물 및 그의 활성 부분은 다음의 특징들을 가진다:

_ 모양: 균질한, 비-흡수성 분말;

- 색상: 회색

화학적 조성:

- 전체 당 함량 (안트론으로 검정): < 4%

-　염소 함량 (시그마 키트 제품번호: 955-30): < 6%

-　물 함량 (100℃, 4시간): < 8%

- 펩타이드 함량: ≥ 80%

- pH (20 g/L에서의 용액): 7.06

- 용해도 (삼투적 물): > 100　g/L

하기 표 1은 가수분해물의 아미노산 조성을 나타낸다.

상기-기술된 테스트들에서, 펩타이드 추출물은 배양 배지에 용해됨으로써 세포들 및 체외이식편들에 0.1%, 0.2% 및/또는 2%의 농도들로 적용될 수 있을 것이다.

2. 당화에 미치는 루핀 펩타이드 추출물의 효과들의 입증

시험관내 배양된 인간 진피 섬유모세포들에 의해 축적되는 합성된 콜라겐 섬유들에서 AGE들의 비-효소적 삽입이 조사되었다. 세포외 기질의 단백질들에서 삼중수소화 포도당의 도입을 기초로 하는 방사선 검출 방법이 사용되었다.

정상 인간 진피 섬유모세포들이 콜라겐의 합성을 자극하도록 비타민 C의 존재 시 배양되었다. 다음으로 세포들은 모든 효소적 활성을 불활성화하도록 서로 다른 작동들 (냉동/해동/가열)을 거쳤다.

이에 따라 획득된 기질 층들은 산소의 부재 시 (신속한 산소화가 처리 7일 동안 수행되었음), 상기-기술된 0.2 및 2%에서 루핀 펩타이드 추출물, 1 mg/mL에서 아미노구아니딘 HCl (대조군), 0.2% 포도당 및 [³H]-포도당 방사성 마커의 존재 시 37℃에서 15일 동안 처리되었다.

배양 이후에, 세포외 기질의 단백질들 (주로 콜라겐들)이 무질서유발 완충액을 사용하여 추출되었고, 트리클로로아세트산으로 침전되었으며, 필터들 상에서 수집되었다. ECM 섬유들에 도입된 방사성은 액체 섬광법에 의해 측정되었다.

결과들이 원-팩터 분산 분석을 사용하여 통계적으로 분석되었고, 듀넷 테스트가 이어졌으며, 하기 표에 주어진다. 비-효소적 당화에 미치는 [³H]-포도당의 효과를 나타낸다.

결과들은 당화에 대항하여 루핀 펩타이드 추출물의 보호적 효과를 보여준다.

루핀 펩타이드 추출물은 당화에 대항하여 진피의 세포외 기질을 보호한다. 따라서 루핀 펩타이드 추출물은 피부의 탄력도 및 견실도를 보존하도록 기질의 경직화를 예방할 수 있다 (콜라겐의 생체기계적 특성들의 보호).

3. 수축력들에 미치는 루핀 펩타이드 추출물의 효과들의 입증

섬유모세포들을 포함하는 진피 동등물들의 모델은 섬유모세포들 및 콜라겐 섬유들 간의 상호작용들의 질적 평가를 허용한다. 이들 진피 동등물들의 자유 수축/반동은 콜라겐 망의 장력들을 적용하는 세포들의 역학적 활성으로부터 유래한다.

루핀 펩타이드 추출물의 진피 동등물들의 수축에 미치는 효과가 측정되었다. 섬유모세포들의 수축력들의 손실의 조건을 유도하도록, 진피 동등물들이 노인의 소위 "노화된" 섬유모세포들 (헤이플릭 모델에 따른 연속적인 계대에 의해 획득됨)과 함께 접종되었다.

"노화된" 또는 정상 진피 동등물들은 섬유모세포들을 (정상 진피 동등물들의 경우 8회 계대 또는 "노화된" 진피 동등물들의 경우 17회 계대에서) 콜라겐 용액과 혼합하여 제조되었다.

전적인 젤화 이후에, 진피 동등물들이 10 ng/mL에서 TGFβ 또는 0.1% 루핀 펩타이드 추출물로 처리되었고, 4일 동안 배양되었다.

진피 동등물들은 수축의 결정을 위해 그들의 표면 면적을 측정하도록 D1, D2 및 D4일째 사진이 촬영되었다.

결과들은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었고 하기 표에 주어진다. 정상 또는 "노화된" 진피 동등물의 수축에서 변화를 나타낸다.

전반적으로, "노화된" 진피 동등물들 (DE들)의 수축은 정상 DE들의 수축보다 낮고 ("노화된" DE들의 표면 면적이 더 넓음), 세포들의 노화에 의한 섬유모세포/콜라겐 섬유 상호작용에서의 감소를 반영한다.

TGFβ는 "노화된" DE들의 수축을 자극하고, 이러한 자극은 4일의 치료 처리 이후에 유의해지고, 이러한 결과는 검정법을 확증한다.

0.1% 루핀 펩타이드 추출물은 처리의 첫째 날이 되자마자 "노화된" DE들의 수축을 유의하게 자극시킨다.

이것은 진피 동등물들의 "느슨화"에 미치는 노화 효과의 초기 상반작용을 허용한다.

루핀 펩타이드 추출물은 본 명세서에서 세포들의 노화에 의해 유도된 진피 동등물들의 "느슨화"를 억제한다.

수축의 손실에 대항하여 진피를 보호하여, 루핀 펩타이드 추출물은 피부의 탄력적 특성들을 유지하여 "긴축화" 효과를 획득하고, 피부 견실도를 유지하는 데 기여한다.

4. 등척력들 상에 미치는 루핀 펩타이드 추출물의 효과들의 입증

루핀 펩타이드 추출물의 효과가 긴장된 진피 동등물 (글래스박스® (GlasBox®) 모델)에서 진피 섬유모세포들에 의해 발달된 등척력들에 관하여 연구되었다.

글래스박스® 시스템 (성장하는 격자 연구 박스)는 긴장된 진피 동등물에서 섬유모세포들에 의해 발달된 수축력들의 측정을 허용한다. 이들은 기질을 재구성하는 데 섬유모세포들의 활성을 가리킨다.

글래스박스® 시스템에서, 진피 동등물들은 센서들로도 역시 작용하는 두 가지 슬라이드들 간의 장력들 하에서 발달하고: 섬유모세포들에 의해 발달된 반발력의 영향 하에서 슬라이드들은 변형되게 된다. 이것은 긴장 측정기의 전기적 저항에서 변화로서 해석된다. 진피 동등물 내에서 발달된 힘을 가리키는 이러한 변화는 실시간으로 측정된다.

진피 동등물들은 정상 인간 진피 섬유모세포들을 콜라겐 용액과 혼합하여 제조되었다. 이러한 혼합물은 글래스박스®의 직사각형 웰 내에 부어졌다.

젤의 형성 이후에 0.1% 루핀 펩타이드 추출물을 포함하거나 포함하지 않는 배지가 첨가되었다.

등척력들이 24시간에 걸쳐서 측정되었다.

결과들은 투-팩터 분산 분석을 사용하여 통계적으로 분석되었고, 피셔 테스트가 이어졌으며, 하기 도 1 및 도 2에 주어진다.

전반적으로 0.1% 루핀 펩타이드 추출물은 섬유모세포들에 의해 발달된 힘들을 유의하게 증가시켰다. 이러한 증가는 보다 상세하게 곡선의 첫 번째 부분에서 유의하다 (1시간 이후 및 측정 5.75시간).

이것은 루핀 펩타이드 추출물의 긴축화 효과를, 상세하게 섬유모세포들에 의한 기질 재구성의 초기 단계 동안 보여준다.

긴장된 진피 동등물 내에서 섬유모세포들에 의해 발달된 힘들은 루핀 펩타이드 추출물에 의해 유의하게 자극된다. 이들 결과들은 피부 견실도 및 탄력도의 손실과 대항하는 루핀 펩타이드 추출물의 긴축화 효과를 입증한다.

5. 콜라겐들 제 Ⅰ형, 제 Ⅲ형 및 제 Ⅳ형 그리고 라미닌 5의 발현에 미치는 루핀 펩타이드 추출물의 효과들의 입증

루핀 펩타이드 추출물의 활성은 인간 피부의 체외이식편들 상에서 측정되었다: 진피의 세포외 기질의 마커들 (콜라겐들 제 I형 및 제 Ⅲ형) 및 표피-진피 연결부의 마커들 (콜라겐 제 Ⅳ형 및 라미닌 5)가 면역염색법에 의해 분석되었다.

0.2% 루핀 펩타이드 추출물가 생존으로 유지되는 정상 인간 피부 체외이식편들의 체외이식편 표면에 적용되었다.

7일 내지 10일의 처리 이후에, 피부 체외이식편들이 수집되었고 -80℃로 냉동되거나 고정되어 파라핀에 포매되었다.

진피 기질 또는 표피-진피 연결부의 서로 다른 마커들의 면역염색법은 피부 절편들 상에서 수행되었다.

콜라겐들 제 Ⅰ형 및 제 Ⅳ형, 그리고 라미닌 5가 냉동된 절편들 상에서 염색되었고, 형광 (FITC) 하에서 검출되었으며, 핵들이 프로피듐 요오드로 반대-염색되었다.

콜라겐 제 Ⅲ형은 파라핀 절편 상에서 염색되었고, 퍼옥시다제를 사용하여 검출되었다.

염색은 현미경 관찰법 하에서 영상화되었고 영상 분석법에 의해 정량화되었다.

염색 강도에서 변화들이 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었다.

결과들은 도 3 내지 도 5에 주어진다.

루핀 펩타이드 추출물은 7일 및 10일 처리 이후에 콜라겐 제 I형의 염색의 강화를 유도하였다 (도 3). 유두상 진피에서 콜라겐 제 I형 염색의 영상 분석에 의한 정량화를 나타낸다.

루핀 펩타이드 추출물은 7일 및 10일 처리 이후에 콜라겐 제 Ⅲ형의 염색의 강화를 유도한다 (도 4). 유두상 진피에서 콜라겐 제 Ⅲ형 염색의 영상 분석에 의한 정량화를 나타낸다.

루핀 펩타이드 추출물은 7일 및 10일 처리 이후에 EDJ에서 콜라겐 제 Ⅳ형의 염색의 강화를 유도한다 (도 5). EDJ에서 콜라겐 제 Ⅳ형 염색의 영상 분석에 의한 정량화를 나타낸다.

루핀 펩타이드 추출물은 7일 및 10일 처리 이후에 EDJ에서 라미닌 5의 염색의 강화를 유도한다 (도 6). EDJ에서 라미닌 5 염색의 영상 분석에 의한 정량화를 나타낸다.

피부 체외이식편들로의 루핀 펩타이드 추출물의 국소적 적용은 진피의 세포외 기질의 두 가지 주요한 거대분자들인 콜라겐들 제 Ⅰ형 및 제 Ⅲ형의 발현을 자극하였고, 표피-진피 연결부의 마커들인 콜라겐 제 Ⅳ형 및 라미닌 5의 발현을 자극하였다.

따라서 루핀 펩타이드 추출물은 피부 견실도 및 조색도의 특성들을 촉진하도록 표피-진피 연결부 및 진피의 세포외 기질을 강화시킬 수 있다.

Claims (13)

1. 콜라겐의 당화 (glycation)을 억제함으로써 신체 피부 (body skin) 견실도의 손실을 예방하거나 신체 피부 견실도를 증가시키기 위한 화장 방법으로서, 항-당화 (anti-glycation) 제제로서 루핀 (루피너스 (Lupinus)) 펩타이드 추출물을 포함하는 화장 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 화장 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   피부 요와 발생을 예방하거나 피부 요와를 감소시키기 위한, 화장 방법.
3. 콜라겐의 당화 (glycation)을 억제함으로써 신체 윤곽 (body silhouette)을 리모델링하기 위한 화장 방법으로서, 항-당화 (anti-glycation) 제제로서 루핀 (루피너스 (Lupinus)) 펩타이드 추출물을 포함하는 화장 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 화장 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 루핀 펩타이드 추출물은 펩타이드 추출물의 전체 건조 무게와 대비하여 적어도 80 무게%의 펩타이드들을 포함하는, 화장 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 루핀 펩타이드 추출물의 펩타이드들은 10,000 Da 이하의 분자량을 가지는, 화장 방법.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 펩타이드 추출물은 무게로 4% 이하의 당들을 포함하고/거나 무게로 1% 이하의 지질들을 포함하는, 화장 방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 펩타이드 추출물의 펩타이드들은 130 Da 이상의 분자량을 가지는, 화장 방법.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 펩타이드 추출물은 루피너스 알부스 (Lupinus albus)의 펩타이드 추출물인, 화장 방법.
9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 루핀 펩타이드 추출물은,
   (a) 루핀 단백질 분획을 추출하는 단계;
   (b) 단계 (a)에서 획득된 단백질 분획을, 효소적 가수분해에 의해 가수분해하는 단계; 및
   (c) 가수분해된 펩타이드 추출물을 회수하는 단계:
   를 포함하는 방법을 사용하여 획득될 수 있는, 화장 방법.
10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    국소적으로 적용되거나 경구적 경로를 통해 섭취되는, 화장 방법.
11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 화장 조성물은 건조 무게로 0.001 내지 30%의 루핀 펩타이드 추출물을 포함하는, 화장 방법.
12. 제 11항에 있어서,
    상기 화장 조성물은 건조 무게로 0.05 내지 0.2%의 루핀 펩타이드 추출물을 포함하는, 화장 방법.
13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 화장 조성물은 젤화제들, 보존제들, 항-산화제들, 용매들, 향수들, 필러들, 화학적 또는 미네랄 필터들, 색소들, 킬레이팅제들, 냄새 흡수제들, 열수 및/또는 채색 물질들을 포함하는, 화장 방법.

Images