KR102438731B1 - 호로파 새싹 추출물을 포함하는 피부노화억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광주기 조건에서 재배된 호로파의 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화억제용 화장료 조성물, 피부노화억제용 의약외품 조성물, 텔로머라제 활성 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피부노화억제 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 광주기 조건에서 재배된 호로파의 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 세포내에서 텔로머라제의 발현수준을 증진시켜서, 세포수준에서 피부노화를 억제 또는 방지할 수 있으므로, 상기 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 다양한 피부노화억제용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

호로파 새싹 추출물을 포함하는 피부노화억제용 조성물{A composition for inhibiting skin senescence comprising extract from fenugreek sprout}

본 발명은 호로파 새싹 추출물을 포함하는 피부노화억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 광주기 조건에서 재배된 호로파의 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화억제용 화장료 조성물, 피부노화억제용 의약외품 조성물, 텔로머라제 활성 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피부노화억제 방법에 관한 것이다.

인류의 평균 수명 연장으로 인해 노령화 사회의 출현으로 인류는 전에 겪지 못한 다양한 숙제에 당면해 있다. 사회/경제적으로는 노령 인구의 증가 및 생산연령층의 감소로 인한 1인당 노인인구 부양비의 증가가 예상되며, 또한 노인들의 삶의 질 향상에 대한 관심 역시 증가되는 추세이다. 이와 같이 건강하고 행복한 노년의 삶에 대한 사회적 요구가 증가하면서, 노령화에 따른 질병 양태의 변화 및 노화 관련 질환들의 예방에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.

노화가 진행되면서 나타나는 변화는 매우 다양하다. 외형적으로는 피부의 주름, 헤어의 탈색, 척추의 휨 및 움직임의 변화 등 다양한 외적 변화 외에 내적으로 각 주요 조직의 기능 감소, 음식의 섭취 및 소화 장애, 기억력 감퇴를 포함하는 뇌기능 저하 및 심혈관의 기능 감소 등 다양한 변화가 나타난다. 또한 이러한 변화는 기능 감소와 더불어 각 조직의 질환을 유도하기 때문에 노화에 따른 외적, 내적인 기능 감소에 대한 원인에 대한 이해 및 이를 조절하는 기술을 개발하는 것은 매우 중요하다.

노화 연구 중 각광받고 있는 분야는 노화의 수명 조절 또는 노화 기능 회복에 대한 연구이다. 초파리 모델이나 선충류를 이용한 연구에서 특정 유전자의 발현을 억제하거나 과발현하여 수명이 연장되는 경우, 식이제한을 통해 수명이 연장되는 경우, 최근 라파마이신 등을 처리하여 수명이 연장되는 경우(Nature Reviews Neuroscience volume 12, pages 437-452 (2011)) 등 다양한 방법을 통한 수명 연장에 대한 연구가 급증하고 있고 단순 수명연장이 아닌 기능유지 또는 기능 회복 등에 대한 관심도 증가하고 있는 추세이다. 그러나 하등 동물 모델에서 나타난 결과를 참고하여 특정 유전자의 발현을 조절하는 것은 다른 기능적 부작용을 야기할 수 있어 사람에게 적용하는 데에 한계가 있고 라파마이신과 같은 약물을 처리하는 경우 면역 기능에 큰 영향을 줄 수 있다는 한계가 지적되고 있다.

이에 따라, 생체의 노화가 아닌 부분적인 노화를 억제하는 제제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 피부의 경우에는 다른 생체내 조직보다도 외부의 자극에 의해 쉽게 손상되고, 이로 인하여 노화가 가속되는 증상이 빈번하게 나타나므로, 이러한 피부노화를 억제하기 위한 제제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제10-2124276호에는 N-니코티노일-가바를 함유한 피부노화 방지 및 주름개선용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2020-0049007호에는 황금, 황련, 황백 및 어성초를 1,3 부틸렌 글리콜이 포함된 용매로 추출한 추출물이 포함된 피부노화 억제용 화장품 조성물이 개시되어 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적이면서도 안전하게 피부노화를 억제할 수 있는 제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 천연물의 일종인 호로파 새싹의 추출물이 텔로머라제의 발현수준을 향상시켜서, 피부노화를 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화억제용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 인간을 제외한 개체의 피부에 투여하는 단계를 포함하는, 피부노화억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화억제용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 텔로머라제 활성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 호로파 새싹 추출물은 텔로머라제의 발현수준을 향상시킬 수 있으며, 이는 호로파 종자 추출이 나타내는 유사한 효과 보다도 현저히 증가된 수준임을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 호로파 새싹 추출물은 효과적이면서도 안전한 노화방지에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "호로파(Trigonella foenum-graecum)"란, 일부 전통적인 인도 요리에서 사용되는 허브를 의미하며, 전통적으로 여성에서 모유 공급을 촉진시키기 위하여 사용되어 그의 안전성이 입증되었다. 상기 호로파 추출물, 특히 호로파 종자 추출물은 가능하게는 100종 초과의 식물화학물질 구성성분을 포함하는 다양한 활성 화합물을 함유하는데, 중요한 구성성분으로는 푸로스타놀 사포닌, 스테로이드성 사포닌 등을 들 수 있고, 이외에도 프로토디오신, 슈도 프로토디오신, 그라실린, 프로토그라실린, 디오스게닌, 디오신 등의 사포닌을 함유하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 호로파의 새싹 추출물은 노화방지에 사용될 수 있는데, 종래의 호로파 연구는 호로파의 종자 추출물을 대상으로 수행되어 왔으며, 호로파의 새싹 추출물에 대한 연구는 보고되지 않았고, 본 발명자에 의해 최초로 수행되었다.

본 발명의 용어 "추출물"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 광주기 조건에서 재배된 호로파의 새싹 추출물을 의미한다.

상기 호로파 새싹을 배재하기 위한 광주기 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 조건이 될 수 있고, 다른 예로서, 명조건:암조건의 비율이 14:10 내지 18:6(h)인 조건이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 명조건:암조건의 비율이 16:8(h)인 조건이 될 수 있다.

또한, 상기 광주기의 명조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, LED 광원의 조사에 의해 조성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 적절한 광주기 조건하에서 재배된 호로파 새싹의 추출물과 암조건하에서 재배된 호로파 새싹의 추출물의 효능을 비교한 결과, 적절한 광주기 조건하에서 재배된 호로파 새싹의 추출물 만이, TERT promoter 활성화를 통한 TERT mRNA 발현 증가 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 3b 및 4).

한편, 상기 호로파 새싹 추출물은 상기 호로파 새싹의 식물전체, 이의 건조물, 가공물 등을 단독으로 또는 조합하여, 물 또는 다양한 유기용매 등으로 추출하여 수득할 수 있다. 이때, 사용되는 유기용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 극성용매 또는 비극성용매가 될 수 있고, 다른 예로서, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등), 이들의 혼합용매 등이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 에탄올 또는 그의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 호로파 새싹의 전체, 호로파 새싹의 일부, 이들의 건조물 또는 이들의 가공물 등을 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "분획물"이란, 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 분획물은 상기 호로파 새싹 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득한 분획물로 해석될 수 있다. 상기 추출물의 분획물은 상기 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득할 수 있는데, 상기 분획방법은 특별히 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 될 수 있다. 특히, 상기 용매 분획법에 사용되는 용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 비극성 용매를 사용할 수 있다. 상기 용매 분획법은 비극성 수준이 높은 용매로부터 낮은 용매를 사용하여 상기 추출물을 순차적으로 분획하는 방식으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 헥산 또는 에틸아세테이트를 이용하여 상기 추출물을 순차적으로 분획하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 “노화”란, 일반적으로 나이가 들면서 신체의 구조와 기능이 저하되어 일어나는 쇠퇴적인 변화현상을 포괄하는 개념으로, 노화로 인한 변화는 실질세포수의 감소에 의한 각 조직의 중량 및 체중의 감소, 결합조직의 변화, 체조성의 변화, 혈관이나 피부 등의 탄력성 저하, 각 장기기능의 감퇴, 면역능력을 비롯한 항병회복능의 저하, 감각기 기능의 저하, 기억력, 학습능력 및 비교능력의 저하 등 매우 다양하다. 그러나, 인지기능 및 기억력 저하, 파킨슨병 및 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환은 최근 발병연령이 낮아지고 있으며 연령대가 낮은 환자에서도 일어날 수 있는 현상인바, 본 발명의 “노화”의 개념에는 포함되지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 노화는 피부노화를 의미한다.

본 발명의 용어 “피부노화”란, 피부에 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.

본 발명의 용어 “노화억제”란, 본 발명의 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물의 투여에 의해 전술한 피부 노화 증상을 억제 또는 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로, 전술한 노화와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 노화 증상이 호전, 완화되거나 이롭게 변경되는 행위를 포함한다. 또한, 상기 용어는“노화방지”와 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 화장료 조성물에 포함된 상기 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물의 함량은 상기 화장료 조성물이 피부 노화 방지 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 일 예로서, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 20 중량%, 다른 예로서, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 또 다른 예로서, 0.4 내지 0.6 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분으로는 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될수 있으며, 예를 들어 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선스크린 크림 또는 선오일 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체의 피부에 투여하는 단계를 포함하는, 피부노화억제 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 노화방지 방법은 인간을 제외한 개체의 피부에 호로파 새싹 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 노화방지용 화장료 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

이때, 상기 호로파 새싹, 추출물, 분획물, 피부노화 및 노화억제의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 피부의 노화방지 또는 개선 효과를 가지는 바, 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부노화를 방지하거나 또는 개선하기 위한 목적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 “개체”란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.

상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있다. 또한 인간을 제외한 동물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명의 화장료 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부노화 억제용 의약외품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 호로파 새싹, 추출물, 분획물, 피부노화 및 노화억제의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명의 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 세포내 텔로머라제 활성을 억제함에 의하여 유도되는 피부노화의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 개인위생용품, 피부외용제, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 마스크 또는 연고제를 포함한다. 상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 비누, 물티슈, 휴지, 샴푸, 치약, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 텔로머라제 활성 증진용 조성물을 제공한다.

통상적으로, 텔로머라제의 활성이 감소되어 세포내 게놈의 텔로미어의 길이가 감소되면, 세포분열이 중지되고, 결과적으로 세포가 사멸한다고 알려져 있다.

본 발명에서 제공하는 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 세포내에서 발현되는 텔로머라제의 발현수준을 증진시켜서, 세포의 노화 및 사멸을 방지하고, 궁극적으로는 개체의 노화를 방지하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 호로파 새싹 추출물은 TERT 프로모터의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라, TERT 발현수준도 증가시켜서, 세포내 텔로머라제 활성을 증진시키는 효과를 나타낼 수 있다(도 3).

본 발명에서 제공하는 광주기 조건에서 재배된 호로파의 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 세포내에서 텔로머라제의 발현수준을 증진시켜서, 세포수준에서 피부노화를 억제 또는 방지할 수 있으므로, 상기 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물은 다양한 피부노화억제용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 호로파 종자를 LED 조사조건 또는 암조건에서 재배한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 호로파 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 TERT reporter 벡터 및 TERT promoter mutation (-124C>T) 벡터의 제작과정을 나타내는 개략도이다.
도 3b는 pGL3-wtTERT 벡터를 이용하여 세포 내 TERT 프로모터의 활성화에 미치는 호로파 유래 종자 추출물(seed), 암조건 재배 새싹 추출물(dark sprout) 또는 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 pGL3-mtTERT 벡터를 이용하여 세포 내 TERT 프로모터의 활성화에 미치는 호로파 유래 종자 추출물(seed), 암조건 재배 새싹 추출물(dark sprout) 또는 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 TERT 발현수준에 미치는 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 호로파 새싹 추출물 및 종자 추출물의 제조

소독되지 않은 호로파 종자 (300 g)를 차아염소산칼슘 용액(20,000 ppm)에 종자 g 당 10 mL의 농도로 침지하여 15 분간 소독한 후, 수돗물과 증류수를 사용하여 각각 수 차례 세척하였다. 이어, 세척된 종자를 충분한 양의 증류수에 넣고 상온 24 시간 동안 침지하여 세척하고, 파종 전에도 증류수를 사용하여 2~3 회 세척하였다.

LED 새싹 재배기를 이용하여 상기 세척된 호로파 종자 100 g을 파종하여 발아시킨 후, 6일 동안 재배하여 호로파 새싹을 수확하였다. 이때, 재배조건은 다음과 같다: 온도는 24 시간 기준으로 16 시간 동안 23~25℃, 8 시간 동안 20~22℃로 설정하였고; 습도는 50~60 %로 설정하였으며; LED 조사 시간은 48 시간 암 처리 이후 16시간 LED on, 8시간 LED off의 조건으로 설정하였다.

또한, 비교군으로서, 종자 100 g을 암 조건 재배기에 파종하여 재배 진행하여 발아시켰으며, 이때, 온도와 습도는 위와 동일하며, 암 조건하에 재배를 진행하였다(도 1).

도 1은 호로파 종자를 LED 조사조건 또는 암조건에서 재배한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 LED 재배 및 암조건 재배를 통해 수확한 각각의 호로파 새싹을 35℃로 설정한 건조기에서 건조시켜서 12 g의 호로파 새싹 건조물을 수득하였다. 수득한 건조물을 분쇄하여 호로파 새싹 분말을 수득하고, 수득한 호로파 새싹 분말을 상기 분말 중량의 10배의 에탄올에 침지한 후, 2시간 동안 초음파 처리하는 과정을 2회 반복하여 호로파 새싹 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 호로파 새싹 추출물을 여과하여 액상성분을 수득한 다음, 이를 감압농축하여 각각 1 g의 호로파 새싹 추출물(LED 추출물 및 dark 추출물)을 제조하였다.

또한, 대조군으로서, 호로파 종자 추출물을 제조하였다.

대략적으로, 호로파 새싹 대신에 호로파 종자 5 g을 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 공정과 동일한 방법을 사용하여 최종적으로 0.4 g의 호로파 종자 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 호로파 새싹 추출물의 세포독성 분석

공지된 세포생존율 분석법을 이용하여, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)의 세포독성을 분석하였다.

대략적으로, 인간 배아 신장 세포주인 HEK293T 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 각각 웰당 1 ×10⁴ 세포수의 농도로 분주하고 24 시간 동안 배양한 다음, 10 또는 50 ㎍/㎖의 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)을 처리한 후 다시 24 시간 동안 배양하였다.

그런 다음, 각 웰에 EZ-CYTOX solution을 넣어 1시간 동안 반응시키고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 생존 세포를 확인하였다(도 2).

도 2는 호로파 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)의 세포독성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2에서 보듯이, 모든 호로파 유래 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)은 50 ㎍/㎖의 농도에서도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 3: TERT reporter를 이용한 호로파 새싹 추출물의 활성분석

실시예 3-1: TERT reporter를 포함하는 벡터의 제작

정상 TERT 프로모터를 포함하는 Hep3B 세포주로부터 추출한 gDNA를 주형으로 하고, 5’ 연장 가닥과 SacⅠ 및 XhoⅠ 제한효소 자리를 포함하는 특이적인 프라이머 및 Q5® High-Fiedelity DNA 중합효소(NEB, Ipswich, MA, USA)를 이용한 PCR 방법을 수행하여, TERT 프로모터 영역(ATG 시작 부분으로부터 -424 내지 +65 bp)을 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물에 제한효소 SacⅠ 및 XhoⅠ을 처리하여 절단된 DNA 단편을 수득하고, 수득한 DNA 단편을 pGL3-enhancer 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하여, TERT reporter 벡터인 pGL3-wtTERT를 제작하였다.

또한, 공지된 방법(site-directed mutagenesis)을 이용하여, 상기 제작된 TERT reporter 벡터에 포함된 스타트 코돈으로부터 - 124번째 위치에 존재하는 시토신(c)를 티민(t)로 치환시켜서, TERT promoter mutation (-124C>T) 벡터인 pGL3-mtTERT를 제작하였다(도 3a).

도 3a는 본 발명에서 제공하는 TERT reporter 벡터 및 TERT promoter mutation (-124C>T) 벡터의 제작과정을 나타내는 개략도이다.

실시예 3-2: 발광효소 분석

상기 실시예 1에서 제조한 각각의 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물), 상기 실시예 3-1에서 제작한 벡터(pGL3-wtTERT 또는 pGL3-mtTERT) 및 발광효소를 이용하여, 세포 내 TERT 프로모터의 활성화에 미치는 호로파 유래 추출물의 효과를 분석하였다.

대략적으로, HEK293T 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 각각 웰당 1 ×10⁴ 세포수의 농도로 분주하고 24 시간 동안 배양한 다음, 50 ㎍/㎖의 추출물(LED 추출물, dark 추출물 또는 종자 추출물)을 2시간 동안 전처리하였다.

이어, 상기 전처리된 HEK293T 세포에 상기 실시예 3-1에서 제작한 벡터(pGL3-wtTERT 또는 pGL3-mtTERT)를 FuGENE® HD 형질주입 시약 (Promega)을 이용하여 도입하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 이때, 대조군으로는 상기 실시예 3-1에서 제작한 벡터 대신에 pNL1.1.TK 벡터 (Promega)가 도입된 HEK293T 세포를 사용하였다.

상기 배양이 종료된 후, 상기 HEK293T 세포에서 발현된 발광효소의 활성 변화를 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega)을 이용하여 측정하고, 측정된 발광효소의 활성은 NanoLucTM 발광효소 발현으로 표준화하여 분석하였다(도 3b 및 3c). 이때, 음성대조군(Mock)으로는 상기 추출물을 처리하지 않고 배양한 HEK293T 세포를 사용하였고, 양성대조군(C)으로는 pNL1.1.TK 벡터 (Promega)가 도입된 HEK293T 세포를 사용하였다.

도 3b는 pGL3-wtTERT 벡터를 이용하여 세포 내 TERT 프로모터의 활성화에 미치는 호로파 유래 종자 추출물(seed), 암조건 재배 새싹 추출물(dark sprout) 또는 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3b에서 보듯이, 양성대조군(C)의 발광효소 활성에 비하여, 호로파 유래 종자 추출물(seed) 및 암조건 재배 새싹 추출물(dark sprout)을 처리한 실험군의 발광효소 활성은 동등하거나 또는 다소 낮은 수준을 나타낸 반면, 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)을 처리한 실험군의 발광효소 활성은 양성대조군(C)의 발광효소 활성의 약 2.1배 이상 증가된 수준을 나타냄을 확인하였다.

도 3c는 pGL3-mtTERT 벡터를 이용하여 세포 내 TERT 프로모터의 활성화에 미치는 호로파 유래 종자 추출물(seed), 암조건 재배 새싹 추출물(dark sprout) 또는 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3c에서 보듯이, 양성대조군(C)의 발광효소 활성에 비하여, 호로파 유래 추출물(seed, dark sprout 및 LED sprout)을 처리한 모든 실험군의 발광효소 활성은 동등하거나 상대적으로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과로부터, 호로파 유래 추출물 중에서 종자 추출물은 TERT 프로모터의 활성화에 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였고, 호로파 유래 새싹 추출물 중에서도 LED 재배 조건에서 얻어진 새싹 추출물만이 TERT 프로모터의 활성을 증가시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: TERT 발현수준에 미치는 호로파 새싹 추출물의 효과 분석

상기 실시예 3-2의 결과로부터, 호로파 유래 새싹 추출물 중에서도 LED 재배 조건에서 얻어진 새싹 추출물만이 TERT 프로모터의 활성을 증가시킴을 확인하였으므로, 상기 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물이 TERT 발현수준을 증가시킬 수 있는지의 여부를 mRNA 수준에서 확인하고자 하였다.

대략적으로, HEK293T 세포를 6웰 세포 배양 플레이트에 각각 웰당 3 ×10⁵ 세포수의 농도로 분주하고 24 시간 동안 배양한 다음, 50 ㎍/㎖의 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물 또는 호로파 유래 종자 추출물을 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다.

배양이 종료된 후, 배양된 세포를 회수하고, 회수된 세포를 대상으로 RNeasy Mini Kit(Hilden, Germany)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA에 SuperscriptⅢ 효소 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 처리하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 사용한 qRT-PCR 분석을 수행하여 TERT mRNA의 발현수준을 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 상기 추출물을 처리하지 않고 배양한 HEK293T 세포를 사용하였다.

도 4는 TERT 발현수준에 미치는 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4에서 보듯이, 대조군의 TERT mRNA 수준에 비하여, 호로파 유래 종자 추출물(seed)을 처리한 실험군의 TERT mRNA 수준은 별다른 차이를 나타내지 않은 반면, 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물(LED sprout)을 처리한 실험군의 TERT mRNA 수준은 대조군의 TERT mRNA 수준의 약 2배 이상으로 증가된 수준을 나타냄을 확인하였다.

상술한 실시예의 결과를 종합하면, 호로파 유재 추출물 중에서 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물 만이 TERT promoter 활성화를 통한 TERT mRNA 발현 증가 효과를 나타냄을 확인하였다.

이같은 TERT 발현증가는 세포내 텔로머라제 활성을 증가시키는 결과를 초래하므로, 결국 호로파 유래 LED 재배 새싹 추출물은 세포내 텔로머라제 활성을 증가시킴으로써, 세포수준에서 노화를 억제하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는, 피부의 내인성 노화 억제용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 명조건은 LED 광원의 조사에 의해 조성되는 것인, 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항의 화장료 조성물을 인간을 제외한 개체의 피부에 투여하는 단계를 포함하는, 피부의 내인성 노화 억제 방법.
   
4. 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는, 피부의 내인성 노화 예방, 개선 또는 방지용 의약외품 조성물.
   
5. 명조건:암조건의 비율이 12:12 내지 20:4(h)인 광주기 조건에서 재배된 호로파 새싹 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는, 텔로머라제 활성 증진용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 세포내 텔로머라제의 발현수준을 증진시켜서, 세포노화 또는 세포사멸을 억제하는 효과를 나타내는 것인, 조성물.
   

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