KR102432796B1 - 오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 오리나무 추출물/화합물 시료를 대상으로 오리나무 추출물 및 화합물들을 대상으로 (1) 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향실험 (실험예 1, 3 및 4)을 통하여 시료 처치에 의하여 실린더형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로 분화가 농도의존적으로 유도되었고, 다핵성 근관세포 (multinucleated myotubes)의 수가 증가함을 확인하였으며, (2) 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전연구 실험(실험예 2 및 5); (3) 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 추출물 및 화합물의 근육 분화 활성실험 (실험예 6, 7)을 통하여 근육세포로의 분화를 촉진함을 확인함으로서, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the isolated compound 2 from an extract of alder tree for treating and preventing skeleton muscle-related disorder}
오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197
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[문헌 19]J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1975, 9, 316-317
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오리나무 추출물로부터 분리된 화합물 2를 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
근육은 구조나 기능면에서 다음 3종류로 나눌 수 있는데, (1) 손 ·발 ·가슴 ·배 ·등 따위의 피부 바로 밑에 있으면서 뼈와 뼈 사이에 붙어 있는 골격근(骨格筋), (2) 심장벽을 이루고 있는 심근(心筋), 및 (3) 위 ·방광 ·자궁 등의 벽을 이루고 있는 내장근(內臟筋) 등이다 ([네이버 지식백과] 근육의 종류 (두산백과))
근육재생(Muscle regeneration)은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)과 같은 골격근 퇴행 질환을 극복하는 목적으로 주목되어 왔다. (J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197)
근육의 진행성 약화 및 기능 소실은 삶의 질을 위협하고 암환자의 생존율을 저하시킨다. 암환자 중 30% 이상이 근육 소실에 의한 체중 감소로 인하여 사망한다. 이러한 근육 기능 소실은 미오-단백질(myo-proteins) 변성 및 근섬유의 단면적(muscle fiber cross-sectional area), 근 강도(muscle strength), 근섬유 숫자(nuclear number of myofibers) 및 인슐린 반응성(insulin responsiveness) 감소 등을 공통적으로 동반한다.
암 이외에도 근육 손실은 노화의 진행과 다양한 만성 질환에 의해서도 야기될 수 있다. 노화가 진행됨에 따라, 새롭게 생성되는 골격근의 일부가 섬유 조직으로 대체되면서 인체의 골격 근육량 및 강도가 감소되는 근육감소증이 나타난다. 또한, 고혈압, 내당능 장애 (impaired glucose tolerance) 및 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성 경화증 및 심혈관 질환 등 연령이 증가할수록 발병률이 증가되는 만성 질환에서도 근육 손실이 나타난다. (Pharmacol Res. 2015, 99, 86).
근육 퇴행증치료 전략은 염증성 분자 및 미오스타틴(myostatin)의 억제 또는 시클릭(cyclic) AMP, PGC (proliferator-activated receptor gamma coactivator)-1α 및 인슐린 신호 전달계의 활성화 등이 있다. 다수의 잠재적 약물들이 개발되었음에도 불구하고, 미국 식약청에서 승인된 근위축증 치료제로는 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate)가 유일하다. 근육퇴행증 치료 및 예방을 위한 약물들은 근육 단백질 이화작용(protein catabolism)을 저해하거나 또는 위성세포 기능(satellite cell functions)을 증진시키는 활성을 나타낸다. (Pharmacol. Res. 2015, 99, 86-100).
근육에서는 동화작용과 이화작용이 균형을 이루며 근육 생성을 조절하는데, 이 때 근육 세포 내에서는 이와 관련하여 여러 생체 신호전달 과정이 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 활성화 될 경우, 근육 단백질의 합성이 증가되어 근육 크기 증가(hypertrophy, 근비대)나 근섬유 수 증가 (hyperplasia)를 유도하여 과도한 근육 생성을 초래한다 (The Korea Journal of Sports Science 2011, 30, 1551).
근육 생성 유도 인자들은 근 세포 내에서 PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/Akt 경로를 활성화 시키고 그에 따라 하위 단계의 단백질을 인산화 함으로써 근육 단백질 합성을 유도한다. 이 중 PI3K/Akt 신호전달에 의한 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 활성은 세포 내에서 다양한 성장 신호를 통합하는 중심 성장신호전달 기전으로 인정되고 있다. mTOR가 활성화되면 두 개의 하위 타겟인 4EBP1(4E-binding protein)과 p70S6K(phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase)이 활성화됨으로써, 근육 단백질 합성이 유도되어 근육량이 증가한다 (The Korea Journal of Sports Science 30: 1551-1561, 2011, J Biol. Chem 278:40717-40722, 2003).
mTOR 외에도 근원세포 세포의 분화와 근육 형성은 다양한 인자들에 의해 조절된다 (cell Mol Life Sci 70: 4117-4130, 2013). 그 중, myoD는 근육 분화와 관련된 특이적 유전자의 발현을 개시하여, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 근원세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌과 MHC(myosin heavy chain)은 근원세포의 융합(fusion)을 유도하여, 근관세포 (myotube)와 근섬유가 형성되도록 한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다 (Cell Mol Life Sci 70: 4117-4130, 2013; Sci Signal 6: re2, 2013).
정상 조건 하에서 원시 줄기세포 (primary stem cell)로서의 휴지상태의 위성세포(quiescent satellite cell)는 연속적으로 증식 및 분화를 진행한다. 손상된 근육은 근원세포로 지칭되는 근원성 위성세포(myogenic satellite cells) 증식을 활성화하는 다양한 성장인자를 분비한다. 활성화된 근원세포는 Myo D, Myf(myogenic factor)-5, 미오게닌 및 Mrf-4 과 같은 근원성 인자 (myogenic factor)를 유도한다. MyoD 및 Myf-5 는 근원 세포 계열 (myogenic lineage)에 특이적으로 발현되는 전사 인자로써, 근원세포 분화 개시에 중요한 역할을 수행한다. (Langley, B.; Thomas, M.; Bishop, A.; Sharma, M.; Gilmour, S.; Kambadur, R. J. Biol. Chem. 2002, 277, 49831). 특히, Myo D는 E 단백질, Mef-2 계열 단백질 및 전사 보조인자등의 비근육성 특이 인자와의 결합을 통하여 MHC 및 미오게닌과 같은 근원성 단백질 발현을 유도한다.
오리나무(Alnus japonica Steud)는 자작나무과(Betulaceae)에 속하는 낙엽교목으로서, 충청남도를 제외한 한국 전지역에 분포하고, 알려진 성분으로는 루페논(lupenone), 글루테놀(glutenol), 타락세롤(taraxerol), 시토스테롤(sitosterol), 헵타코산(heptacosane) 등의 성분이 알려져 있으며, 장염, 설사, 외상출혈 등의 질병치료에도 효과가 있다고 알려져 있다 (정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, p802, 1990년).
본원 발명자는 천연자원으로부터 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)과 같은 골격근 퇴행 질환을 효과적인 예방 및 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 신선초 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 발명(한국특허등록 제 10-2022279호); 신선초 추출물로부터 분리된 4-하이드록시데리신 또는 크산토안젤롤을 함유하는 악액질 또는 노인성근육감소증의 예방 및 치료용 조성물 발명(한국특허등록 제 10-2132126호); 신선초 추출물로부터 분리된 화합물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 발명(한국특허등록 제 10-2040119호); 마늘 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 발명(한국특허등록 제 10-1965699호); 마늘 추출 분획물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환 치료 및 예방용 조성물 발명(한국특허등록 제 10-2002260호); 마늘 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암보조 치료제 발명(한국특허등록 제 10-1996184호); 황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 발명(한국특허공개 제 10-2018-0131770호) 등을 수행한바 있다.
그러나, 상기 문헌의 어디에도 오리나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 치료 효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 근육관련 질환에 효과적인 예방 및 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 오리나무 추출물을 대상으로 오리나무 추출물 및 화합물들을 대상으로 (1) 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향실험 (실험예 1,3 및 4)을 통하여 시료 처치에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로 분화가 농도의존적으로 유도되었고, 다핵성 근관세포 (multinucleated myotubes)의 수가 증가함을 확인하였으며, (2) 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전연구 실험(실험예 2 및 5); (3) 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 추출물 및 화합물의 근육 분화 활성실험 (실험예 6, 7); 근육소실모델에서 근육소실보호실험을 통하여 근육세포로의 분화를 촉진할 뿐 아니라, 근육손상 모델에서 근육의 소실을 억제함을 확인하여 골격근 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 과제는 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 오리나무는 알누스 야포니카(Alnus japonica (Thunb.) Steudel), 털오리나무(Alnus japonica var. koreana) 등의 동속식물의 뿌리, 줄기, 껍질, 목질부, 전초, 잎, 바람직하게는, 뿌리 또는 껍질과 목질부를 포함한 줄기를 포함함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 오리나무 추출물은 오리나무 조추출물, 오리나무 조추출물로부터 정제된 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 포함함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 주정, 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 주정 또는 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 포함한다.
본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출 분획물을 포함한다.
본원에서 정의되는 오리나무 추출물 및 화합물의 HPLC(High performance liquid chromatography)분석에는 메탄올(Methanol) 또는 아세트나이트릴(Acetenitrile) 등의 비극성 용매와 산성 수용매를 혼합하는 조건에서 분석한다.
본원에서 정의되는 골격근 근육관련 질환은 바람직하게는, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 골격근 근육질환, 구체적으로, 노인성근위축 또는 암으로 인한 골격근 근육관련 질환, 보다 구체적으로는, 노인성근 위축 또는 암으로 인한 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia), 노인성근육감소증(sarcopenia) 및 근육소실증을 포함한다.
또한 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료제 또는 항암 보조 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물, 항암치료 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 기존 항암제는 현재 암질환 치료를 위해 사용되고 있는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등을 포함한다.
본원에서 정의되는 암질환는 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암, 혈액암 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.
예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 오리나무 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 오리나무를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 주정 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 주정 또는 30~100% 에탄올을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 6시간 내지 36시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 상온추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 500배, 바람직하게는 0.05 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물들을 각각 수득할 수 있다.
본 발명의 화합물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기에서 수득한 오리나무 조추출물을 에틸에테르로 비극성물질을 분획한다. 에틸아세테이트 가용분획물을 n-헥산 100%을 이동상으로 유출을 시작하여 아세톤(Acetone)으로 극성을 높이면서 유출시켜 극성을 증가시키는 방법을 이용하여 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피, 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 Diaion HP-20 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물들을 각각 정제 및 수득할 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 추출물 및 화합물들을 대상으로 (1) 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향실험 (실험예 1,3 및 4)을 통하여 시료 처치에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로 분화가 농도의존적으로 유도되었고, 다핵성 근관세포 (multinucleated myotubes)의 수가 증가함을 확인하였으며, (2) 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전연구 실험(실험예 2 및 5); (3) 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 추출물 및 화합물의 근육 분화 활성실험 (실험예 6, 7); 근육소실모델에서 근육소실보호실험을 통하여 근육세포로의 분화를 촉진할 뿐 아니라, 근육손상 모델에서 근육의 소실을 억제함을 확인하여 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 마우스, 생마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 오리나무 추출물 또는 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 노인성근위축증 또는 악액질 치료제를 제공하며, 이러한 치료제는 노인성근위축증 또는 악액질의 병용요법에서 체중 변화나 식욕 회복의 개선 효과를 위한 것으로서, 악액질 치료에서 항암제 단독투여보다는 본 발명의 조성물을 이용한 병용요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}와 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암에 의한 노인성근위축증 또는 악액질 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 항암보조 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}와 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 항암보조 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}와 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.
더욱이, 본 발명의 조성물은 근육관련 질환의 치료 및 개선을 목적으로 한 건강기능식품 또는 건장보조식품일 수 있다.
또한, 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}와 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}를 유효성분으로 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 {(-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS); 화합물 1}, 플라티필레논(platyphyllenone; 화합물 2}, (5R)-O-메틸히르수타노놀 {(5R)-O-methylhirsutanonol; 화합물 3}, 히르수타노놀 {hirsutanonol; 화합물 4}, 또는 플라티필로시드 {platyphylloside; 화합물 5}와 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 개선용 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 식품첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 추출물은 목적 질환이 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 오리나무 추출물 및 화합물들을 대상으로 (1) 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향실험 (실험예 1,3 및 4)을 통하여 시료 처치에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로 분화가 농도의존적으로 유도되었고, 다핵성 근관세포 (multinucleated myotubes)의 수가 증가함을 확인하였으며, (2) 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전연구 실험(실험예 2 및 5); (3) 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 추출물 및 화합물의 근육 분화 활성실험 (실험예 6, 7); 근육소실모델에서 근육소실보호실험을 통하여 근육세포로의 분화를 촉진할 뿐 아니라, 근육손상 모델에서 근육의 소실을 억제함을 확인한 바, 이러한 상기 실험 결과는 본 발명의 시료들이 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia) 등의 골격근 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인함으로서, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.
도 1A는 본 발명의 오리나무 추출물이 MHC와 myoD 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 1B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 2는 본 발명의 오리나무 추출물의 p38 MAP 키나제(kinase) 신호전달계 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 3A는 본 발명의 화합물 1 - 5의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 3B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 4A는 본 발명의 화합물 1의 MHC와 myoD 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 4B는 화합물 1의 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 5는 본 발명의 화합물 1의 p38 MAP 키나제(kinase) 신호전달계 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 6은 본 발명의 오리나무 추출물을 처리하여 분화시킨 근관세포에 덱사메타손을 처리하여 근육 손실을 유도한 모델에서, 도 6A는 본 발명 추출물의 MHC 발현과 근육 분해 효소인 MAFbx 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 6B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 7은 본 발명의 오리나무 유래 화합물 1 - 5들을 처리하여 분화시킨 근관세포에 덱사메타손을 처리하여 근육 손실을 유도한 모델에서, 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 오리나무 조추출물의 제조
건조된 오리나무 (경북 영천 産) 껍질과 목질부를 포함한 줄기 600g에 100% 주정 3L를 넣고 12시간 동안 상온추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 에탄올 추출물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 28g의 오리나무 주정추출물 분말(이하, AJE라 함)을 얻어 다음 실험에 사용하였다.
실시예 2. 오리나무 분획물의 제조예
실시예 1에서 얻은 건조된 오리나무 주정 추출물 28g에 정제수 500mL을 가하여 현탁하고 이 현탁물에 n-헥산 500mL를 가하여 분획하여 n-헥산 가용 분획물로 분획하고, 남은 물 현탁물에 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 500mL 씩을 순차적으로 가하여 분획하고 각각 감압 건조하여 n-헥산 가용분획물(이하, AJH라 함), 클로로포름 가용분획물 (이하, AJC라 함), 에틸아세테이트 가용분획물(이하, AJE라 함) 및 부탄올 가용분획물(이하, AJB라 함)을 4.1g, 2.5g, 2.9g, 1.8g을 각각 얻어 동결건조하였다.
실시예 3. 오리나무 추출물로부터 활성 화합물의 분리
활성물질의 동정을 위하여, 하기 실험에서, 가장 활성이 높은 분획 중 클로로포름 가용분획물 2.5g을 대상으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 n-헥산/아세톤 경사법(gradient system, 50:1→1:2) 조건으로 수행하여 3개 소분획물 (subfraction)을 얻고, 이중 분획물 (CF2)을 대상으로 추가로 역상 컬럼크로마토크래피법 MeOH 경사법(gradient system, 50%→100%) 용매 조건으로 수행하여 화합물 1 ((-)－(2R, 3R)-1,4-O-디페룰로일세코이소라리시레시놀 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS) 화합물 1, 23 mg)을 수득하였다.
에틸아세테이트 가용 분획 2.9g을 클로로포름/메탄올 경사법으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 진행하여 13개의 분획물을(EF1~EF13) 얻었다. EF3 분획물을 헥산/에틸아세테이트 용매조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통하여 7개의 분획을 얻고, 그 중 EF3-3분획물을 헥산/아세톤 용매조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통하여 최종적으로 화합물 2(10.9mg)을 얻었다. EF8분획물을 디클로로메탄/메탄올 용매조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통하여 3개의 분획으로 나누고, EF8-2 분획물을 다시 10%-100% 메탄올 조건으로 RP-MPLC를 진행하고, EF8-2-2를 50% 메탄올 용매조건으로 HPLC Prep을 통하여 화합물 3(9.5mg)을 얻었다. EF10분획물을 10%-100% 아세토나이트릴 조건으로 MPLC를 진행하고, EF10-2 분획물을 50% 메탄올 조건으로HPLC prep을 통하여 화합물 4(8.5mg)와 화합물5(15mg)을 얻었다.
HPLC와 하기 1H-NMR 물성치 자료를 활용하여 화합물 1을 순도 95% 이상의 리그난 화합물의 하나인 (-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS)로 기존 문헌을 참조하여 동정하였다 (참고문헌; J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1975, 9, 316-317).
화합물 2, 3, 4, 5는 다이아릴헵타노이드 계열의 화합물로써 1H-NMR자료와 문헌을 참조하여 각각 platyphyllenone(참고문헌: Chem. Pharm. Bull. 1996, 44, 1033-1038), (5R)-O-methylhirsutanonol (참고문헌: Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 139-140), hirsutanonol (참고문헌: J. Nat. Prod., 1998, 61, 1292-1294), platyphylloside (참고문헌: Phytochem. 1993, 32, 365-369) 로 구조를 확인하였다.
Figure 112022070571817-pat00001
Figure 112022070571817-pat00002
Figure 112022070571817-pat00003
Figure 112022070571817-pat00004
Figure 112022070571817-pat00005
(A) 화합물 1: (-)－(2R, 3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS)
성상: 백색 파우더
분자량: C11H6O3 (MW. 714);
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ9.59 (1H, brs, -OH), 8.69 (1H, brs, -OH), 7.52 (2H, d, J=15.8 Hz, H-7", 7"'), 7.29 (2H, d, J=1.9 Hz, H-2", 2"'), 7.09 (2H, dd, J=8.3, 1.9 Hz, H-6", 6"'), 6.77 (2H, d, J=8.1 Hz, H-5", 5"'), 6.66 (2H, s, J=1.4 Hz, H-2, 2'), 6.64 (2H, s, H-5, 5'), 6.53 (2H, dd, J=8.0, 1.8 Hz, H-6, 6'), 6.48 (1H, s, J=15.9 Hz, H-8"'), 6.46 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8"), 4.26 (2H, dd, J=11.2, 6.4 Hz, H-9), 4.07 (2H, dd, J=11.3, 5.0 Hz, H-9'), 3.80 (3H, s, -OCH3), 3.67 (3H, s, -OCH3), 2.75 (2H, dd, J=13.6, 6.1 Hz, H-7), 2.55 (2H, dd,J=13.6 Hz, H-7'), 2.19 (2H, s, H-8, 8')
13C-NMR (DMSO-d6, 100MHz): δ166.6 (C-9", 9"'), 149.3 (C-4", 4"'), 147.9 (C-3", 3"'), 147.4 (C-3, 3'), 145.0 (C-7", 7"'), 144.6 (C-4, 4'), 130.8(C-1, 1'), 125.5 (C-1", 1"'), 123.1 (C-6", 6"'), 120.9 (C-6, 6'), 115.5 (C-5", 5"'), 115.2 (C-5, 5'), 114.4 (C-8", 8"'), 112.8 (C-2, 2'), 111.2 (C-2", 2"'), 64.8 (C-9, 9'), 55.6 (-OCH3), 55.3 (-OCH3), 39.10 (C-8, 8'), 34.7 (C-7, 7')
(B) 화합물 2: platyphyllenone,
성상: 노란색 오일
분자량: C19H20O3 (MW.296.15);
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 6.98 (4H, m, aromatic protons), 6.87 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-5), 6.68 (4H, m, aromatic protons), 6.05 (1H, dt, J = 15.9, 1.4 Hz, H-4), 2.78(4H, m, H-1, 2), 2.66 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.45 (2H, m, H-7).;
13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 202.8 (C-3), 156.69 (C-4'), 156.64 (C-4''), 149.22 (C-5), 133.18 (C-1'), 132.9 9(C-1''), 131.64 (C-4), 130.37 (C-2', 2''), 130.31 (C-6', 6''), 116.17 (C-3', 3''), 116.15 (C-5', 5''), 42.7 (C-2), 35.7 (C-7), 34.5 (C-6), 30.6 (C-1).
(C) 화합물 3: (5R)-O-methylhirsutanonol
성상: 갈색 오일
분자량: C20H24O6 (MW. 360.16);
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 6.67 (2H, dd, J = 7.9, 4.8 Hz, aromatic proton), 6.62 (2H, d, J = 2.9 Hz, aromatic protons), 6.50 (2H, dd, J = 9.7, 3.8 Hz, aromatic protons), 3.65 (1H, dt, J =12.0, 6.0 Hz, H-5), 3.28 (3H, s, -OCH3), 2.68 (5H, m, H-1, 2), 2.50 (3H, m, H-7), 2.50 (1H, m, H-4), 1.71 (2H, m, H-6); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 211.59 (C-3), 146.18 (C-4'), 146.15 (C-4''), 134.80 (C-1'), 134.02 (C-1''), 120.61, 120.56 (aromatic carbon), 116.51, 116.49, 116.34(aromatic carbon), 77.93 (C-OCH3), 57.06 (C-5), 48.25 (C-4), 46.35 (C-1), 36.97 (C-6), 31.63 (C-7), 30.10 (C-2).
(D) 화합물 4: hirsutanonol
성상: 노란색 오일
분자량: C19H22O6 (MW.346.14);
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 6.65 (4H, m, aromatic proton), 6.51(2H, ddd, J = 8.0, 3.7, 2.0 Hz, aromatic protons), 4.02 (1H, dq, J = 12.5, 6.3 Hz, H-3), 2.72 (4H, m, H-1, 2), 2.54 (4H, m, H- 4, 7), 1.67 (2H, m, H-6); 13C NMR(CD3OD, 125 MHz) δ: 212.03 (C-3), 146.17 (C-3'), 146.12 (C-3''), 144.46 (C-4'), 144.23 (C-4''), 134.94 (C-1'), 134.07 (C-1''), 120.64 (C-6'), 120.51 (C-6''), 116.54(C-2'), 116.46(C-5'), 116.34 (C-2''), 116.30 (C-5''), 68.31 (C-5), 51.26 (C-4), 46.37 (C-2), 40.44 (C-6), 32.17 (C-7) 30.04 (C-1).
(E) 화합물 5: platyphylloside
성상: 갈색 오일
분자량: C25H32O9 (MW.499.19);
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.02 (1H, t, J = 8.5 Hz, aromatic protons), 6.69 (1H, dd, J = 8.4, 0.8 Hz, aromatic protons), 4.30 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'''), 4.18 (1H, m, H-5), 3.88 (1H, dd, J = 11.8, 2.3 Hz, H-6'''b), 3.72 (1H, dd, J = 11.8, 5.3 Hz, H-6'''a), 3.36 (2H, dd, J = 16.5, 8.6 Hz, H-3''', 4''',), 3.26 (1H, m, H-5'''), 3.16 (1H, t, J = 8.4Hz, H-2'''), 2.82 (1H, dd, J = 16.6, 6.8 Hz, H-4b), 2.77 (4H, d, J = 8.1 Hz, H-1, 2), 2.60 (3H, m, H-4a, 7), 1.85 (1H, ddd, J=13.6, 8.6, 6.9 Hz, H-6b), 1.75 (1H, m, H-6a); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 211.88 (C-3), 156.58 (C-4'), 156.30 (C-4''), 134.33 (C-1''), 133.23(C-1'), 130.43 (C-2, 2''), 130.33 (C-6', 6''), 116.18 (C-3', 3''), 116.05 (C-5', 5''), 103.46 (C-1'''), 78.05 (C-3'''), 77.83, (C-5'''), 76.21(C-5), 75.21(C-2'''), 71.59 (C-4'''), 62.75 (C-6'''), 48.69(C-4), 46.41 (C-2), 38.51 (C-6), 31.43 (C-7), 29.82 (C-1).
실험예 1. 오리나무 추출물의 근원세포 분화 (myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 오리나무 추출물의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. ((11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).
1-1. 실험 과정
마우스 근원세포주인 C2C12 세포(Cat# CRL-1771, ATCC)에 추출물 1, 10, 100 ng/ml 씩을 처리하여 분화된 세포에서, 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC와 myoD의 단백질 발현 수준을 평가하였으며 (도 1A), 마우스 항(mouse anti)-MHC 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 근관 세포에서 추출물에 의한 MHC 발현 변화를 평가하였다 (도 1B) (11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).
구체적으로, C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 오리나무 추출물 (1, 10, 100 ng/mL)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
1-1-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC(sc-376157, Santa Cruz) 또는 항-myoD(sc-32758, Santa Cruz)를 4℃에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
1-1-2. 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)
위와 같은 방법으로 각각의 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다.
각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde (0141, BBC Biochemical)로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100 (2315025, Sigma)에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액 (16050122, Gibco)에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
1-2. 실험 결과 (표 1, 도 1)
도 1A에서는 오리나무 추출물에 의한 MHC와 myoD 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 1, 10, 100, 1000 ng/mL의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC 및 myoD의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군 세포에서의 MHC과 myoD 발현을 1로 하였을 때, 오리나무 추출물을 처리하였을 때 각각 표 1와 같이 증가하였다 (표 1).
도 1B에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI을 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 추출물의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 추출물이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다 (표 2).
상기 실험에서 오리나무 추출물은 농도 의존적으로, 근관세포에서의 MHC, myoD 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다 (표 1-2 및 도 1 ).
오리나무 추출물에 의한 MHC와 myoD 발현 증가 활성 (도 1A)
오리나무 추출물(AJE, ng/mL)
농도 0 1 10 100
MHC
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.3 1.4 1.6
myoD
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.8 1.7 1.5
오리나무 추출물에 의한 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 증가활성 (도 1B)
오리나무 추출물(AJE, ng/mL)
농도 0 1 10 100
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1 3.3 5.2 5.2
실험예 2. 오리나무 추출물의 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전 연구
상기 실시예의 오리나무 추출물의 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (12. Mol. Biol. Cell. 2010, 21, 2399; Trends Cell Biol. 2006, 16, 36).
p38 MAPK 신호전달계는 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 매우 중요한 기전으로 알려져 있으므로, 상기 실시예의 추출물이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 동안 p38 MAPK 신호전달계에 영향을 주는지 알아보기 위하여 참고문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다 (도 2) (12. Mol. Biol. Cell. 2010, 21, 2399).
p38 미토겐-활성화 프로테인 키나제 (mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)은 MyoD 활성화에 중요한 역할을 수행하는데, p38MAPK는 근원세포 분화인자(myogenic factors) 발현을 유도하기 위한 MyoD의 이량화(dimerization)를 촉진한다 (13. Trends Cell Biol. 2006, 16, 36).
2-1. 실험 과정
본 발명자들은 근원세포에 추출물(1, 10, 100 ng/mL)을 처리하여 분화 3일 째에 근관세포(differentiated myotubes) 용해물을 얻어 인산화된 p38 MAPK 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
이를 위해 일차 토끼-항 인산화 p38 MAPK(Cat# 9211, Cell Signaling Technology)와 이에 대한 항 토끼 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, SantaCruz)을 반응시켜 인산화 p38 MAPK 발현을 측정하였고, 이 때 적재 대조군(loading control)인 총 p38 MAPK의 발현량을 분석하기 위해 일차 토끼-항 p38 MAPK(Cat# 9212, Cell Signaling Technology) 사용하였다.
2-2. 실험 결과 (표 3 및 도 2 )
추출물의 p38 MAPK에 대한 효과를 효과를 웨스턴 분석법으로 확인한 결과, 근원 세포 분화에 중요한 p38 MAPK 신호 전달계가 추출물 처리에 의해 분화기간 동안 더욱 활성화되었다 (표 3).
상기 실험 결과는 오리나무 추출물에 의해 근원세포 분화(myoblast differentiation)가 촉진되며 이 때 p38 MAPK 활성화가 중요한 작용함을 의미한다.
추출물의 p38 MAPK 활성 (도 2)
오리나무 추출물(AJE, ng/mL)
농도 0 1 10 100
인산화-p38
/p38 발현량 (배)		 1.0 5.9 9.0 5.7
실험예 3 오리나무 추출물에서 분리된 화합물의 근원세포 분화 (myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 오리나무 추출물에서 분리된 화합물 1 - 5의 근원세포 분화 (myoblast differentiation) 촉진 효능을 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).).
3-1. 실험 과정
상기 실시예의 오리나무 추출물에서 분리된 화합물 1 - 5의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 각 화합물 10 nM 을 처리하여 분화된 세포에서, 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC와 myoD의 단백질 발현 수준을 평가하였으며 (도 3A), 마우스 항(mouse anti)-MHC 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 근관 세포에서 추출물에 의한 MHC 및 myoD 발현 변화를 평가하였다 (도 3B) (11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).
C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 오리나무 추출물에서 분리한 화합물 1 - 5(10 nM)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
3-1-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC(sc-376157, Santa Cruz) 또는 항-myoD(sc-32758, Santa Cruz)를 4℃에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
3-1-2. 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)
위와 같은 방법으로 각각의 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde (0141, BBC Biochemical)로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100(2315025, Sigma)에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액(16050122, Gibco)에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
3-2. 실험 결과 (표 4 및 5, 도 3 )
도 3A에서는 화합물 1 - 5에 의한 MHC 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 각 화합물을 10 nM의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군 세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 각 화합물을 처리하였을 때 각각 표 와 같이 증가하였다 (표 4).
도 3B에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI을 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 각 화합물의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 각 화합물들이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다.
상기 실험에서 화합물 1 - 5는 근관세포에서의 MHC 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다 (표 4, 5 및 도 3).
각 화합물에 의한 MHC 발현 증가 활성 (도 3A)
화합물 (10 nM) - 1 2 3 4 5
MHC
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.7 1.8 1.7 1.7 1.7
각 화합물에 의한 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 증가활성 (도 3B)
화합물 (10 nM) - 1 2 3 4 5
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1.0 2.8 3.2 3.1 3.1 3.2
실험예 4 오리나무 추출물에서 분리된 화합물 1의 근원세포 분화 (myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 오리나무 추출물에서 분리된 화합물 1의 근원세포 분화 (myoblast differentiation) 촉진 효능을 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).).
4-1. 실험 과정
상기 실시예의 오리나무 추출물에서 분리된 화합물 1의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 화합물 1, 10, 100 nM 씩을 처리하여 분화된 세포에서, 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC와 myoD의 단백질 발현 수준을 평가하였으며 (도 4A), 마우스 항(mouse anti)-MHC 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 근관 세포에서 추출물에 의한 MHC 및 myoD 발현 변화를 평가하였다 (도 4B) (11. Chem. Biol. Interact. 2016, 248, 60).
C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 오리나무 추출물에서 분리한 화합물 1 (1, 10, 100 nM)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
4-1-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25㎍의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC(sc-376157, Santa Cruz) 또는 항-myoD(sc-32758, Santa Cruz)를 4℃에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
4-1-2. 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)
위와 같은 방법으로 각각의 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde (0141, BBC Biochemical)로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100(2315025, Sigma)에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액(16050122, Gibco)에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
4-2. 실험 결과 (표 6 및 7, 도 4 )
도 4A에서는 화합물 1에 의한 MHC와 myoD 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 1, 10, 100 nM의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC 및 myoD의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군 세포에서의 MHC과 myoD 발현을 1로 하였을 때, 화합물 1을 처리하였을 때 각각 표 와 같이 증가하였다 (표 6).
도 4B에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI을 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 화합물 1의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 화합물 1이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다 (표 7).
상기 실험에서 화합물 1은 농도 의존적으로, 근관세포에서의 MHC, myoD 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다 (표 6, 7 및 도 4).
화합물 1에 의한 MHC와 myoD 발현 증가 활성 (도 4A)
화합물 1(nM)
농도 0 1 10 100
MHC
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.2 6.0 4.6
myoD
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.2 1.3 1.7
화합물 1에 의한 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 증가활성 (도 4B)
화합물 1(nM)
농도 0 1 10 100
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1 1.5 9.0 8.0
실험예 5 . 오리나무 추출물 분리 화합물 1의 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전 연구
상기 실시예의 오리나무 추출물 분리 화합물 1의 근원세포 분화 촉진에 대한 p38 MAPK 신호전달 체계 기전에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (12. Mol. Biol. Cell. 2010, 21, 2399; Trends Cell Biol. 2006, 16, 36).
p38 MAPK 신호전달계는 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 매우 중요한 기전으로 알려져 있으므로, 상기 실시예의 화합물 1이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 동안 p38 MAPK 신호전달계에 영향을 주는지 알아보기 위하여 참고문헌에 기재된 방법을 실험을 수행하였다 (도 5) (12. Mol. Biol. Cell. 2010, 21, 2399) (13. Trends Cell Biol. 2006, 16, 36).
5-1. 실험 과정
본 발명자들은 근원세포에 화합물 1 (1, 10, 100 nM)을 처리하여 분화 3일 째에 근관세포(differentiated myotubes) 용해물을 얻어 인산화된 p38 MAPK 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다. 이를 위해 일차 토끼-항 인산화 p38 MAPK(Cat# 9211, Cell Signaling Technology)와 이에 대한 항 토끼 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, SantaCruz)을 반응시켜 인산화 p38 MAPK 발현을 측정하였고, 이 때 적재 대조군(loading control)인 총 p38 MAPK의 발현량을 분석하기 위해 일차 토끼-항 p38 MAPK(Cat# 9212, Cell Signaling Technology) 사용하였다.
5-2. 실험 결과 (표 8 및 도 5)
화합물 1의 p38 MAPK에 대한 효과를 웨스턴 분석법으로 확인한 결과, 근원 세포 분화에 중요한 p38 MAPK 신호 전달계가 추출물 처리에 의해 분화기간 동안 더욱 활성화되었다 (표 8).
상기 실험 결과는 오리나무 추출물에 의해 근원세포 분화(myoblast differentiation)가 촉진되며 이 때 p38 MAPK 활성화가 중요한 작용함을 의미한다.
화합물 1의 p38 MAPK 활성 (도 5)
화합물 1(nM)
농도 0 1 10 100
인산화-p38
/p38 발현량 (배)		 1.0 10.6 14.8 15.0
실험예 6. 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 추출물의 근육 분화 활성
상기 실시예의 오리나무 추출물의 근육 소실에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (15. Int. J. Mol. Med. 2015, 36, 29-42; Biomed. Pharm. 2017, 95, 1486 )
상기 실시예의 추출물에 의한 근육 소실에 대한 억제 효과를 밝히기 위해 덱사메타손 (dexamethasone)을 근관세포에 처리하여 근육 소실의 in vitro 모델을 확립하고 (15. Int. J. Mol. Med. 2015, 36, 29-42) 하기와 같이 실험을 진행하였다.
특히 근육 단백질 분해 효소인 MAFbx의 활성은 근 단백질 소실을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 실시예의 추출물이 덱사메타손 처리에 의한 근 단백질 분해 동안 MAFbx 발현에 영향을 주는지 알아보기 위하여 참고문헌에 기재된 방법으로 실험을 수행하였다 (도 6) (16. Biomed. Pharm. 2017, 95, 1486).
6-1. 실험 과정
6-1-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 추출물 (0, 1, 10, 100 ng/mL)을 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC(sc-376157, Santa Cruz)를 4℃에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
6-1-2. 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)
위와 같은 방법으로 각 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다.
각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde (0141, BBC Biochemical)로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100 (2315025, Sigma)에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액 (16050122, Gibco)에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
6-2. 실험 결과
각 세포군에서 MHC 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법을 통해 분석한 결과, 덱사메타손을 처리하지 않은 대조군 (NC) 근관세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 덱사메타손을 처리하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서의 MHC 발현은 0.7배로 감소하였으나, 각각의 화합물들에 의해 대조군 근관세포군 수준으로 회복됨이 관찰되었다.
또한 덱사메타손을 처리하지 않은 대조군 (NC) 근관세포에서의 MAFbx발현을 1로 하였을 때, 덱사메타손을 처리하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서의 MHC 발현은 1.9배로 크게 증가하였으나, 추출물의 농도 의존적으로 0.3배까지 감소됨이 관찰되어 추출물에 의한 근 단백질 분해 억제 효과를 확인하였다 (표 9 및 도 6A).
도 6A에 나타난 바와 같이, 덱사메타손에 의해 감소한 근 단백질 분해 억제능을 확인하기 위하여, 추출물과 덱사메타손을 첨가한 근관세포에서 적색형광의 수준으로 MHC 발현을 평가하였고, DAPI 판독 염색으로는 화합물 처리에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 형성을 평가하였다. 분화된 근관세포에 덱사메타손을 처리하면 근관세포의 손실이 증가하였으나, 이와 반대로 분화 동안 추출물을 처리하여 얻어진 근관세포는 덱사메타손에 의한 다핵성 (multinucleated) MHC-양성 세포(positive cells) 손실을 억제하였다 (표 10 및 도 6B). 본 발명의 시료에 의한 근육 보호가 효과적으로 일어남을 입증한 것이다.
추출물에 의한 근관 세포 보호 활성 (도 6A)
대조군 오리나무 추출물(AJE, ng/mL)
0 1 10 100
MHC
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 0.9 1.3 1.4 1.6
MAFbx
/pan-cadherin 발현 (배)		 1.0 1.9 0.3 0.3 0.6
덱사메타손으로 유도된 근관세포 손실에서, 추출물의 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 유도활성 (도 6B)
대조군 오리나무 추출물(AJE, ng/mL)
0 1 10 100
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며, MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1.0 0.1 0.7 0.9 0.8
실험예 7. 근육 소실 시험관 내(in vitro) 모델에서의 오리나무 화합물들의 근육 분화 활성
상기 실시예의 오리나무 유래 화합물들의 근육 소실에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이, 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (15. Int. J. Mol. Med. 2015, 36, 29-42; Biomed. Pharm. 2017, 95, 1486 )
상기 실시예의 화합물들에 의한 근육 소실에 대한 억제 효과를 밝히기 위해 덱사메타손 (dexamethasone)을 근관세포에 처리하여 근육 소실의 in vitro 모델을 확립하고 (15. Int. J. Mol. Med. 2015, 36, 29-42) 하기와 같이 실험을 진행하였다 (도 7).
7-1. 실험 과정
약 3 x 104 의 근원세포(C2C12; CRL-1772, American Type Culture Collection)를 60 mm 플레이트에 분주하고 24 시간 후 2% 말 혈청을 함유한 DMEM 분화 배지 (0273, Gibco)에 각각의 화합물 (10 nM)을 함께 처리하여, 3 일 동안 배양하여 분화시켰다.
근육 소실의 in vitro 모델을 확립하기 위해, 이렇게 분화된 근관세포에 각각 1 mM의 덱사메타손 (dexamethasone, D4902, Sigma)을 12 시간 처리하였다.
시료 처리가 완료된 세포를 인산 완충 생리 식염수로 세척하여 준비한 후, MHC 발현 확인을 위한 면역 형광 염색(도 7)을 수행하였다.
7-1-1. 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)
위와 같은 방법으로 각 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다.
각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde (0141, BBC Biochemical)로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100 (2315025, Sigma)에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액 (16050122, Gibco)에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
7-2. 실험 결과
덱사메타손에 의해 감소한 근 단백질 분해 억제능을 확인하기 위하여, 추출물과 덱사메타손을 첨가한 근관세포에서 적색형광의 수준으로 MHC 발현을 평가하였고, DAPI 판독 염색으로는 화합물 처리에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 형성을 평가하였다. 분화된 근관세포에 덱사메타손을 처리하면 근관세포의 손실이 증가하였으나, 이와 반대로 분화 동안 각 화합물들을 처리하여 얻어진 근관세포는 덱사메타손에 의한 다핵성 (multinucleated) MHC-양성 세포(positive cells) 손실을 억제하였다 (표 11 및 도 7). 본 발명의 시료에 의한 근육 보호가 효과적으로 일어남을 입증한 것이다.
덱사메타손으로 유도된 근관세포 손실에서, 오리나무 유래 화합물들의 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 유도활성 (도 7)
대조군 화합물 (10 nM)
- 1 2 3 4 5
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며, MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1.0 0.4 0.7 0.8 0.5 0.7 0.7
하기에 본 발명의 시료 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
화합물 5------------------------------------------------ 20 mg
유당 --------------------------------------------------- 100 mg
탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
화합물 1----------------------------------------------- 10 mg
옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg
유당 -------------------------------------------------- 100 mg
스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
화합물 4------------------------------------------------ 10 mg
결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg
락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
화합물 3 ----------------------------------------------- 10 mg
만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg
주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg
Na2HPO4,12H2O ------------------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
추출물 (AJE) -------------------------------------------- 20 mg
이성화당 ------------------------------------------------- 10 g
만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g
정제수 --------------------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
추출물 (AJE) ----------------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍
비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎
비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎
비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎
비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎
비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎
비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎
엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎
무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량
황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎
제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
화합물 2------------------------------------------------- 1000㎎
구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎
올리고당 ------------------------------------------------- 100 g
매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g
타우린 ----------------------------------------------------- 1 g
정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (4)

  1. 오리나무(Alnus japonica (Thunb.) Steudel) 껍질과 목질부를 포함한 줄기의 물 및 주정 또는 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물로부터 분리된 플라티필레논{platyphyllenone; 화합물 2}을 유효성분으로 함유하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 오리나무(Alnus japonica (Thunb.) Steudel) 껍질과 목질부를 포함한 줄기의 물 및 주정 또는 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물로부터 분리된 플라티필레논{platyphyllenone; 화합물 2}을 유효성분으로 함유하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태인 건강기능식품.
  4. 오리나무(Alnus japonica (Thunb.) Steudel) 껍질과 목질부를 포함한 줄기의 물 및 주정 또는 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물로부터 분리된 플라티필레논{platyphyllenone; 화합물 2}을 유효성분으로 함유하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 골격근 근육관련 질환의 예방 또는 개선용 건강보조식품.











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