KR101310285B1 - 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 혼합생약재는 해마 신경 세포인 HT22 세포 및 갈색세포종인 PC12 세포에서 H2O2에 의한 세포독성에 대해 세포보호 효과를 보이고, 알코올에 의한 기억력 저하에 대해 회복 효과를 보이며, 알코올에 의한 해마 신경세포 손상에 대해 세포보호 효과를 보임을 확인함으로써, 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising Acer tegmentosum Max, Alnus japonica Cortex, Taraxaci Herba, Cirsii Japonici Herba, Xanthii Fructus, Puerariae Flos, Hovenia Dulcis Thunb and Puerariae Radix as an active ingredient for prevention or treatment of brain diseases}
본 발명은 혼합생약재에 관한 것으로, 보다 구체적으로 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대사회에서 알코올은 흔히 남용되는 물질 중 하나로, 전체 인구의 약 30-45%는 음주 관련 문제를 경험하게 되며, 이는 경제적, 신체적, 정신적 손실을 야기하게 된다. 특히, 알코올의 소비량이 증가하면서 알코올성 간 병변과 더불어 알코올 의존 및 중독증, 정신분열증 등의 알코올성 질환 문제가 급격히 증가하고 있다. 알코올이 분해되는 과정에서 생성되는 부산물인 아세트알데히드 등으로 인한 산화 스트레스(Oxidative stress)와 전염증인자(Proinflammatory cytokine)의 독성으로, 간염, 지방간, 간섬유화, 간경화 및 이에 의한 간부전 등의 알코올성 간 질환(Alcoholic liver disease)을 유발하는 것이 알코올의 일반적 영향으로 알려져 왔다(Hoek JB, Pastorino JG. Ethanol, oxidative stress, and cytokine-induced liver cell injury. Alcohol. 2002 ; 27 : 63-8.; Zima T, Fialova L, Mestek O, Janebova M, Crkovska J, Malbohan I, Stipek S, Mikulıkova L, Popov P. Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. Journal of Biomedical Science. 2001 ; 8 : 59-70.).
지금까지 알코올은 일차적으로 간에 악영향을 미치기 때문에 알코올과 간 손상에 관한 연구에 치우쳐 왔지만, 알코올은 간 뿐만 아니라 뇌, 심장, 말초혈관 등 신체 전반에 질환을 야기한다. 특히, 알코올 의존 및 중독은 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome)의 발병률 증가와 다양한 장기의 기능저하를 야기할 뿐 아니라(Moss M, Burnham EL. Choronic alcohol abuse, acute respiratoey distress syndrome, and multiple organ dysfunction. Critical Care Medicine. 2003 ; 31(4) : 207-12.) 중추신경계 전반에 영향을 주어 소뇌퇴화, 뇌의 백색질 및 회색질의 용량감소와 더불어 코르사코프 증후군(Korsakoff’s syndrome), 기억력 저하, 우울증 등의 정신질환을 일으킨다는 보고들이 발표되면서 알코올성 뇌 손상에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Harper C. The neuropathology of alcohol-related brain damage. Alcohol & Alcoholism. 2009 ; 44(2) : 136-40.). 또한, 알코올성 기억력 감퇴 및 기억장애는 알코올에 의해 기억과 학습에 관여하는 뇌의 신경세포가 손상을 받아 그 세포기능이 상실되어 나타나는 것으로 알려져 있으며 알코올에 의한 질환의 증가와 함께 알코올성 뇌 손상에 대한 관심이 높아지고 있기 때문에 이를 예방하고 치료할 수 있는 제제 연구가 필요한 실정이다.
H2O2는 산화 스트레스를 유도하는 독성물질로 활성산소 및 라디칼 등을 생성하여 세포를 산화 스트레스 상태에 이르게 하여 세포의 산화적 손상을 야기하는데(Cowan KJ, Storey KB. Mitogen-activated protein kinases : new signaling pathways functioning in cellular responses to environmental stress. Journal of Experimental Biology. 2003 ; 206 : 1107-15.), 산화 스트레스는 세포내에서 수산기(hydroxy radical) 등의 활성산소 생성과 이를 방어하는 항산화 메커니즘의 균형이 깨지면서 발생하는 것으로 활성산소의 증가로 인한 라디칼의 생성이 세포내 미토콘드리아의 파괴, 단백질 및 DNA 변형, 지질과산화에 기인한다(Sayre ML, Perry G, Smith AM. Oxidative stress and neurotoxicity. Chemical Research in Toxicology. 2008 ; 21 : 172-88.). 산화 스트레스 메커니즘은 뇌질환 및 심혈관계 질환을 비롯하여 주요 질환의 병인으로 작용하고 있다(Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thrombosis, and Vascular Biology. 2005 ; 25 : 29-38.; MacNee W. Oxidative stress and lung inflammation in airways disease. European Journal of Pharmacology. 2001 ;429 : 195-207.; Mosley RL, Benner EJ, Kadiu I, Thomas M, Boska MD, Hasan K, Laurie C, Gendelman HE. Neuroinflammation, oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson's disease. Clinical Neuroscience Research. 2006 ; 6 : 261-81.). 구체적으로 활성산소 및 활성질소((reactive nitrogen species : RNS)가 뇌졸중(Stroke), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 알쯔하이머병(Alzheimer’s disease), 헌팅톤병(Huntington’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 등 많은 신경계질환에 중요한 역할을 한다고 생각되어 왔다(Beal MF. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochem Biophys Acta 1998 ; 1366 : 211-23.).
현재까지 한약에서의 알코올에 의한 간 손상에 관한 연구는 활발히 진행되어 왔으나, 알코올 유도 뇌 손상에 관한 연구는 몇 가지 약물에서만 연구되었다. 그 예로, 울금(鬱金)과 강황(薑黃)의 성분으로 잘 알려진 커큐민(curcumin)이 HT22 해마 세포(hippocampal cell)에서 알코올로 유도된 세포독성을 MKP-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1)의 활성을 통해 감소시켰다는 보고(Pae HO, Jeong SO, Zheng M, Ha HY, Lee KM, Kim EC, Kim DH, Hwang SY, Chung HT. Curcumin attenuates ethanol-induced toxicity in HT22 hippocampal cells by activating mitogen-activated protein kinase phosphatase-1. Neuroscience Letters. 2009 ; 453 : 186-9.)가 있으며 치주식상(治酒食傷)의 대표적인 처방인 대금음자(對金飮子) 약침이 알코올 독성 흰쥐의 해마에서 뇌신경세포의 생성과 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS) 발현 증가 효과(Kim HJ, Kim EH, L EY. Effect of Daekumeumja Herb-acupuncture on alcohol-induced suppressed cell proliferation and expression of nitric oxide synthase in hippocampus of rats. The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society. 2006 ; 23(5) : 187-98.), 갈화(葛花) 물 추출물이 알코올 유도 학습과 인지 손상, 그리고 스코폴라민(Scopolamine) 유도 기억상실에 대한 기억력 개선 효과(Yamazaki T, Yaguchi M, Nakajima Y, Hosonoa T, Niiho Y, Hibi Y, Kinjo J, Nohara T. Effects of an aqueous extract of Puerariae flos(Thomsonide) on impairment of passive avoidance behavior in mice. Journal of Ethnopharmacology. 2005 ; 100 : 244-8.), 그리고 알코올과 아세트알데히드에 의한 흰쥐 뇌조직의 산화적 스트레스에 대한 은행엽 추출물의 항산화 효능에 관한 연구(Park SU, Kim JB, Heo Y, Lee SD, Kim HJ, Lee IS, Han JH, Park YC, Effects of Ginkgo Biloba extracts on ethanol and acetaldehyde-induced oxidative stress in rat brain. The Korean Journal of Oriental Preventive Medicine. 2004 ; 8(1) : 109-14.) 등이 있다. 그러나 알코올성 뇌 손상에 관한 기전 및 치료 후보 물질에 대한 연구는 아직까지 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 뇌신경세포 보호 효과 및 알코올 유도 기억력 감퇴 억제 작용 및 해마 신경세포 보호 효과가 있는 물질에 대하여 예의 노력한 결과, 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 혼합생약재가 시험관 내(in vitro)에서 해마 신경 세포인 HT22 세포 및 갈색세포종인 PC12 세포에서 각각 H2O2에 의한 세포독성에 대해 세포보호 효과를 보이고, 생체 내(in vivo)에서는 알코올에 의한 기억력 저하에 대한 회복효과를 보이며, 알코올에 의한 해마 신경세포 손상에 대해 보호 효과를 가지는 것을 확인함으로써, 뇌질환 예방 및 치료용 약재 또는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
1) 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부, 노근 5 ~ 10 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 분쇄된 혼합물을 꿀 500 ~ 800 중량부와 혼합하여 반죽하는 단계;
3) 단계 2)의 반죽을 지름 1 ~ 2 ㎝의 환 형태로 제형화 하는 단계; 및
4) 단계 3)의 환을 건조시키는 단계를 포함하는, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 제조방법으로 제조된, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 백출, 맥아, 감피, 백복령, 매실, 인진, 지실, 당목향, 사인, 노근 및 나복자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 택사, 진피, 후박, 곽향, 치자, 천궁, 홍화, 청피 및 감초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 백출, 맥아, 감피, 백복령, 매실, 인진, 지실, 당목향, 사인, 노근 및 나복자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 택사, 진피, 후박, 곽향, 치자, 천궁, 홍화, 청피 및 감초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부, 노근 5 ~ 10 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 분쇄된 혼합물을 꿀 500 ~ 800 중량부와 혼합하여 반죽하는 단계;
3) 단계 2)의 반죽을 지름 1 ~ 2 ㎝의 환 형태로 제형화 하는 단계; 및
4) 단계 3)의 환을 건조시키는 단계를 포함하는, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형을 제공한다.
본 발명의 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 혼합생약재는 해마 신경 세포인 HT22 세포 및 갈색세포종인 PC12 세포에서 각각 H2O2에 의한 세포독성에 대해 세포보호 효과를 보이고, 알코올에 의한 기억력 저하에 대해 회복 효과를 보이며, 알코올에 의한 해마 신경세포 손상에 대해 세포보호 효과를 보임을 확인함으로써, 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HT22 세포에서 혼합생약재가 H2O2로 유도된 세포독성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
(A) 세포에 7 시간 동안 혼합생약재를 처리한 것을 나타낸 그래프이다. (B) 세포에 한 시간 동안 혼합생약재를 처리한 후 6 시간 동안 300 μM H2O2를 처리한 것을 나타낸 그래프이다. 세포 생존율은 MTT 분석을 이용하여 측정하였고, 대조군에 대한 백분율로 표시하였다. 측정값은 mean±SEM로 표시하였다. 대조군과 비교하여 *** p <0.001. H2O2만 처리한 군과 비교하여 ## p <0.01.
도 2는 PC12 세포에서 혼합생약재가 H2O2로 유도된 세포독성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
(A) 세포에 7 시간 동안 혼합생약재를 처리한 것을 나타낸 그래프이다. (B) 세포에 한 시간 동안 혼합생약재를 처리한 후 6 시간 동안 50 μM H2O2를 처리한 것을 나타낸 그래프이다. 세포 생존율은 MTT 분석을 이용하여 측정하였고, 대조군에 대한 백분율로 표시하였다. 측정값은 mean±SEM로 표시하였다. 대조군과 비교하여 *** p <0.001. H2O2만 처리한 군과 비교하여 ## p <0.01.
도 3은 ICR 마우스에서 혼합생약재가 알코올 유도 기억력 손상에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 측정값은 mean±SEM로 표시하였다. 대조군과 비교하여 ** p <0.01. EtOH만 처리한 군과 비교하여 ## p <0.01.
도 4는 ICR 마우스에서 혼합생약재가 알코올로 유도된 해마 신경세포 손상에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. (A 내지 C) 각 군의 해마(hippocampus)의 대표 현미경 사진, (D 내지 F) CA3의 대표 현미경 사진, (G 내지 I) CA1의 대표 현미경 사진을 나타낸 그림이다. (A, D, G) 대조군; (B, E, H) 5 g/㎏의 EtOH 처리 군, (C, F, I) 5 g/㎏의 EtOH + 100 ㎎/㎏의 혼합생약재 처리 군. 범위 막대(Scale bar) = 200 ㎛.
도 5는 혼합생약재가 ICR 마우스의 해마 부분에서 알코올에 반하는 NeuN-면역학적 세포에 미치는 영향을 확인하는 그림이다. (A 내지 C) 각 군의 해마(hippocampus)의 대표 현미경 사진, (D 내지 F) CA3의 대표 현미경 사진, (G 내지 I) CA1의 대표 현미경 사진을 나타낸 그림이다. (A, D, G) 대조군; (B, E, H) 5 g/㎏의 EtOH 처리 군, (C, F, I) 5 g/㎏의 EtOH + 100 ㎎/㎏의 혼합생약재 처리 군. 범위 막대(Scale bar) = 200 ㎛.
도 6은 ICR 마우스에서 혼합생약재가 알코올 유도 기억력 손상에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. (A) 웨스턴 블롯(Western blotting)의 결과를 대조군인 베타-엑틴(β-actin)과의 비율로 나타낸 그래프이다. (B) 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸 그림이다. 측정값은 mean±SEM로 표시하였다. 대조군과 비교하여 * p <0.05. EtOH만 처리한 군과 비교하여 ## p <0.01.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 백출, 맥아, 감피, 백복령, 매실, 인진, 지실, 당목향, 사인, 노근 및 나복자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 택사, 진피, 후박, 곽향, 치자, 천궁, 홍화, 청피 및 감초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부, 노근 5 ~ 10 중량부를 유효성분으로 함유하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로 산청목 20 ~ 24 중량부, 오리목 20 ~ 24 중량부, 택사 20 ~ 24 중량부, 백출 20 ~ 24 중량부, 맥아 20 ~ 24 중량부, 감피 20 ~ 24 중량부, 진피 10 ~ 12 중량부, 백복령 10 ~ 12 중량부, 후박 10 ~ 12 중량부, 매실 10 ~ 12 중량부, 인진 5 ~ 6 중량부, 치자 5 ~ 6 중량부, 곽향 5 ~ 6 중량부, 나복자 5 ~ 6 중량부, 지실 5 ~ 6 중량부, 천궁 5 ~ 6 중량부, 홍화 5 ~ 6 중량부, 청피 5 ~ 6 중량부, 당목향 5 ~ 6 중량부, 사인 5 ~ 6 중량부, 감초 5 ~ 6 중량부, 포공영 5 ~ 6 중량부, 대계 5 ~ 6 중량부, 창이자 5 ~ 6 중량부, 지구목 5 ~ 6 중량부, 갈근 5 ~ 6 중량부, 갈화 5 ~ 6 중량부, 노근 5 ~ 6 중량부를 유효성분으로 함유하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
가장 구체적으로 산청목 24 중량부, 오리목 24 중량부, 택사 24 중량부, 백출 24 중량부, 맥아 24 중량부, 감피 24 중량부, 진피 12 중량부, 백복령 12 중량부, 후박 12 중량부, 매실 12 중량부, 인진 6 중량부, 치자 6 중량부, 곽향 6 중량부, 나복자 6 중량부, 지실 6 중량부, 천궁 6 중량부, 홍화 6 중량부, 청피 6 중량부, 당목향 6 중량부, 사인 6 중량부, 감초 6 중량부, 포공영 6 중량부, 대계 6 중량부, 창이자 6 중량부, 지구목 6 중량부, 갈근 6 중량부, 갈화 6 중량부, 노근 6 중량부를 유효성분으로 함유하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 산청목(山靑木)(Acer tegmentosum Max., 제천, 24 g), 택사(澤瀉)(Alismatis Rhizoma, 순천, 24 g), 백출(白朮)(Atractylodis Rhizoma Alba, 영천, 24 g), 맥아(麥芽)(Hordei Fructus Germinatus, 여수, 24 g), 감피(柑皮)(Persimmon Peels, 청도, 24 g), 오리목(赤陽皮)(Alnus japonica Cortex, 군위, 24 g), 진피(陳皮)(Citri Unshii Pericarpium, 제주, 12 g), 백복령(Hoelen, 청송, 12 g), 후박(厚朴)(Magnoliae Cortex, 중국, 12 g), 매실(梅實)(Mume Fructus, 중국, 12 g), 인진(茵蔯)(Artemisiae Capillaris Herba, 경주, 6 g), 치자(梔子)(Gardeniae Fructus, 제천, 6 g), 곽향(藿香)(Agastachis Herba, 청송, 6 g), 나복자(Raphani Semen, 중국, 6 g), 지실(枳實)(Ponciri Fructus, 영주, 6 g), 천궁(川芎)(Cnidii Rhizoma, 안동, 6 g), 홍화(紅花)(Carthami Flos, 중국, 6 g), 청피(靑皮)(Citrii Unshiu Immaturi Pericarpium, 제주, 6 g), 목향(木香)(Aucklandiae Radix, 중국, 6 g), 사인(砂仁)(Amomi Fructus, 중국, 6 g), 감초(甘草)(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma, 중국, 6 g), 포공영(蒲公英)(Taraxaci Herba, 경북영천, 6 g), 대계(Cirsii Japonici Herba, 중국, 6 g), 창이자(蒼耳子)(Xanthii Fructus, 중국, 6 g), 지구목(Hovenia Dulcis Thunb, 충북제천, 6 g), 갈근(葛根)(Puerariae Radix, 강원원주, 6 g), 갈화(葛花)(Puerariae Flos, 중국, 6 g), 노근(蘆根)(Phragmitis Rhizoma, 중국, 6 g) 등의 약재를 분쇄한 후 혼합하여 제조하는 것이나 이에 한정되지 않고 개체간 균일한 시료 처리 및 투약을 위하여, 상기 혼합생약재에 20배의 증류수를 가하여 상온에서 2시간 동안 초음파 분해(sonication) 후 감압여과(Whatman No. 2)하였다. 여과액을 -60℃ 이하에서 얼려 동결건조 하였고(FDU-550R; Eyela Co, Japan), -20℃에 보관 후 사용하였다.
상기 뇌질환은 구체적으로 뇌졸중(Stroke), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 헌팅톤병(Huntington’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff’s syndrome)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 산화 스트레스 또는 알코올에 의한 손상으로부터 뇌신경세포를 보호하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 혼합생약재가 마우스 해마 신경(hippocampal neuronal) 세포인 HT22 세포에서 H2O2로 유도된 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 혼합생약재의 농도별 약물처리에 따른 세포 생존률과 H2O2에 대한 세포보호 효과를 MTT 분석(assay)으로 측정해본 결과, HT22 세포에 상기 혼합생약재 1 ∼ 100 ㎍/㎖만을 처리한 경우에 세포 생존율에 영향을 미치지 않았고(도 1의 A 참조), 300 μM H2O2에 의하여 세포 생존율이 대조군 대비 60.16%로 감소한 반면, 상기 혼합생약재(1 ∼ 100 ㎍/㎖)의 전처리에 의하여 각각 73.72 ∼ 72.35%의 생존율을 나타내어 H2O2로 유도된 세포독성에 대해 보호 효과를 보였다는 것을 확인하였다(도 1의 B 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 혼합생약재가 랫트(rat) 갈색세포종(pheochromocytoma)인 PC12 세포에서 H2O2로 유도된 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 혼합생약재의 농도별 약물처리에 따른 세포 생존률과 H2O2에 대한 세포보호 효과를 MTT 분석(assay)으로 측정해본 결과, PC12 세포에 상기 혼합생약재 1∼100 ㎍/㎖만을 처리한 경우에 세포 생존율에 영향을 미치지 않았고(도 2의 A 참조), 50 μM H2O2에 의하여 세포 생존율이 대조군 대비 64.87%로 감소한 반면, 상기 혼합생약재(1 및 10 ㎍/㎖)의 전처리에 의하여 각각 78.14% 및 78.35%의 생존율을 나타내어 H2O2로 유도된 세포독성에 대해 보호 효과를 보였다는 것을 확인하였다(도 2의 B 참조).
또한, 본 발명자들은 수컷 ICR마우스에서 본 발명에 따른 혼합생약재와 알코올 투여에 따른 몸무게 변화를 확인하기 위하여, 4주간 상기 혼합생약재 100 ㎎/㎏와 알코올 5 g/㎏를 투여한 후 2일 간격으로 체중을 측정한 결과, 알코올 독성을 가하지 않은 대조군은 무게가 꾸준히 증가하는 경향을 보인 반면, 알코올을 투여한 알코올 단독 투여군과 상기 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군은 투여시작 2일째부터 4일까지 체중이 감소하였고 6일째부터 회복하기 시작하여 10일째에는 세 군간 체중차이가 나타나지 않았다. 특히 알코올과 상기 혼합생약재를 투여한 군은 알코올 단독 투여군보다 체중감소가 더 심하게 나타났으나 빠른 회복 속도를 보였으며, 대조군과 알코올 단독 투여군과 통계적으로 유의한 체중 차이를 보이지 않았다(표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 알코올 유도 기억력 감퇴에 대한 본 발명에 따른 혼합생약재의 효과를 평가하기 위하여 혼합생약재 및 알코올 투여 24시간 후 물체인식실험을 수행한 결과, 본 실험 24시간 전에 두 개의 비슷한 물체를 가지고 훈련(training)을 실시하였을 때, 각 군은 64.29%, 55.54% 및 48.96%로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않은 반면, 훈련 24시간 후 실시한 본 실험에서는 알코올 단독 투여군이 37.91%로 대조군(62.62%)에 비해 새로운 물체를 탐색하는 정도가 적었고, 이에 대해 알코올 및 상기 혼합생약재를 투여한 군은 66.63%로 통계적으로 유의한 회복 효과를 보였다. 따라서, 물체인식 행동실험에서 상기 혼합생약재가 알코올에 의한 기억력 저하에 대한 방어효과를 나타내었다는 것을 확인하였다(그림 3 참조).
또한, 본 발명자들은 물체인식실험을 통해 알코올에 의해 기억력 감퇴가 유도되었음을 확인하고 알코올과 본 발명에 따른 혼합생약재가 기억에 관여하는 뇌의 해마부분에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 세포의 핵을 염색하여 세포사멸의 유무를 판단하는 크레실 바이올렛(cresyl violet)과 신경세포의 핵을 발현시켜 세포의 손상 유무를 판단할 수 있는 NeuN인자를 염색하였다. 그 결과, 알코올 단독 투여군에서 해마세포 중 CA3부분에서 대조군보다 세포수가 감소하고 엷게 발색된 것으로 알코올에 의해 세포사멸이 유도되었음을 확인하였고, 특히, 알코올에 의한 세포사멸은 CA1에 비해 CA3부분에서 예민하게 일어나는 경향을 보인 반면, 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군에서 상기 혼합생약재 투여에 의하여 세포사멸 억제되었음을 확인하였다(도 4 참조). 또한, NeuN단백질의 면역염색 결과에서도 알코올에 의해 NeuN 양성세포가 적게 발현되어 알코올 독성에 의해 신경세포의 손상이 일어났으며, 이에 대해 상기 혼합생약재가 알코올에 의한 신경세포사멸을 억제함을 확인하였다(도 5 참조).
아울러, NeuN 면역조직화학법으로 본 발명에 따른 혼합생약재의 해마 신경세포보호 효과를 확인한 후, NeuN 단백질의 정량을 통한 단백질 발현의 차이를 알아보기 위하여 웨스턴 블롯법을 실시한 결과, 조직사진으로 확인한 결과와 같이 알코올 단독 투여군을 살펴 보면 알코올을 투여한 해마조직에서 NeuN단백질의 발현이 감소되었으며, 알코올 및 상기 혼합생약재를 투여한 군에서는 상기 혼합생약재에 의해 NeuN단백질 발현 감소가 억제된 결과를 얻었다. 따라서, 상기 혼합생약재의 알코올성 독성에 대한 해마 신경세포보호 효과가 있음을 확인하였다(도 6 참조).
그러므로, 본 발명에 따른 혼합생약재는 HT22 및 PC12 세포에서 각각 H2O2에 의한 세포독성에 대해 세포보호 효과를 보이고, 알코올에 의한 기억력 저하에 대해 회복 효과를 보이며, 알코올에 의한 해마 신경세포 손상에 대해 세포보호 효과를 가지므로 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 혼합생약재에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 혼합생약재의 환약 제형은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이나 이에 한정되지 않는다.
1) 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부, 노근 5 ~ 10 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 분쇄된 혼합물을 배합하여 반죽하는 단계;
3) 단계 2)의 반죽을 제환하는 단계;
4) 단계 3)의 제환된 환을 정환하는 단계; 및
5) 단계 4)의 정환된 환을 건조하여 포장하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)은 구체적으로 산청목 20 ~ 24 중량부, 오리목 20 ~ 24 중량부, 택사 20 ~ 24 중량부, 백출 20 ~ 24 중량부, 맥아 20 ~ 24 중량부, 감피 20 ~ 24 중량부, 진피 10 ~ 12 중량부, 백복령 10 ~ 12 중량부, 후박 10 ~ 12 중량부, 매실 10 ~ 12 중량부, 인진 5 ~ 6 중량부, 치자 5 ~ 6 중량부, 곽향 5 ~ 6 중량부, 나복자 5 ~ 6 중량부, 지실 5 ~ 6 중량부, 천궁 5 ~ 6 중량부, 홍화 5 ~ 6 중량부, 청피 5 ~ 6 중량부, 당목향 5 ~ 6 중량부, 사인 5 ~ 6 중량부, 감초 5 ~ 6 중량부, 포공영 5 ~ 6 중량부, 대계 5 ~ 6 중량부, 창이자 5 ~ 6 중량부, 지구목 5 ~ 6 중량부, 갈근 5 ~ 6 중량부, 갈화 5 ~ 6 중량부, 노근 5 ~ 6 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로 산청목 24 중량부, 오리목 24 중량부, 택사 24 중량부, 백출 24 중량부, 맥아 24 중량부, 감피 24 중량부, 진피 12 중량부, 백복령 12 중량부, 후박 12 중량부, 매실 12 중량부, 인진 6 중량부, 치자 6 중량부, 곽향 6 중량부, 나복자 6 중량부, 지실 6 중량부, 천궁 6 중량부, 홍화 6 중량부, 청피 6 중량부, 당목향 6 중량부, 사인 6 중량부, 감초 6 중량부, 포공영 6 중량부, 대계 6 중량부, 창이자 6 중량부, 지구목 6 중량부, 갈근 6 중량부, 갈화 6 중량부, 노근 6 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 구체적으로 하기의 단계를 포함하는 환약 제형의 제조방법을 제공한다.
1) 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부, 노근 5 ~ 10 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 분쇄된 혼합물을 꿀 500 ~ 800 중량부와 혼합하여 반죽하는 단계;
3) 단계 2)의 반죽을 지름 1 ~ 2 ㎝의 환 형태로 제형화 하는 단계; 및
4) 단계 3)의 환을 건조시키는 단계를 포함하는, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)은 구체적으로 산청목 20 ~ 24 중량부, 오리목 20 ~ 24 중량부, 택사 20 ~ 24 중량부, 백출 20 ~ 24 중량부, 맥아 20 ~ 24 중량부, 감피 20 ~ 24 중량부, 진피 10 ~ 12 중량부, 백복령 10 ~ 12 중량부, 후박 10 ~ 12 중량부, 매실 10 ~ 12 중량부, 인진 5 ~ 6 중량부, 치자 5 ~ 6 중량부, 곽향 5 ~ 6 중량부, 나복자 5 ~ 6 중량부, 지실 5 ~ 6 중량부, 천궁 5 ~ 6 중량부, 홍화 5 ~ 6 중량부, 청피 5 ~ 6 중량부, 당목향 5 ~ 6 중량부, 사인 5 ~ 6 중량부, 감초 5 ~ 6 중량부, 포공영 5 ~ 6 중량부, 대계 5 ~ 6 중량부, 창이자 5 ~ 6 중량부, 지구목 5 ~ 6 중량부, 갈근 5 ~ 6 중량부, 갈화 5 ~ 6 중량부, 노근 5 ~ 6 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로 산청목 24 중량부, 오리목 24 중량부, 택사 24 중량부, 백출 24 중량부, 맥아 24 중량부, 감피 24 중량부, 진피 12 중량부, 백복령 12 중량부, 후박 12 중량부, 매실 12 중량부, 인진 6 중량부, 치자 6 중량부, 곽향 6 중량부, 나복자 6 중량부, 지실 6 중량부, 천궁 6 중량부, 홍화 6 중량부, 청피 6 중량부, 당목향 6 중량부, 사인 6 중량부, 감초 6 중량부, 포공영 6 중량부, 대계 6 중량부, 창이자 6 중량부, 지구목 6 중량부, 갈근 6 중량부, 갈화 6 중량부, 노근 6 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 꿀은 구체적으로 600 ~ 700 중량부, 보다 구체적으로 600 중량부이나 이에 한정되지 않고, 올리고당, 천연과즙 및 자일리톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 대체될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형을 제공한다.
상기 환약 제형은 구체적으로 산화 스트레스 또는 알코올에 의한 손상으로부터 뇌신경세포를 보호하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 건강식품은 구체적으로 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 백출, 맥아, 감피, 백복령, 매실, 인진, 지실, 당목향, 사인, 노근 및 나복자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 건강식품은 구체적으로 산청목, 오리목, 포공영, 대계, 창이자, 갈화, 지구목 및 갈근에 추가적으로 택사, 진피, 후박, 곽향, 치자, 천궁, 홍화, 청피 및 감초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약재를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 뇌질환은 구체적으로 뇌졸중(Stroke), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 헌팅톤병(Huntington’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff’s syndrome)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 건강식품은 구체적으로 산화 스트레스 또는 알코올에 의한 손상으로부터 뇌신경세포를 보호하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 혼합생약재는 HT22 및 PC12 세포에서 각각 H2O2에 의한 세포독성에 대해 세포보호 효과를 보이고, 알코올에 의한 기억력 저하에 대해 회복 효과를 보이며, 알코올에 의한 해마 신경세포 손상에 대해 세포보호 효과를 가지므로 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 혼합생약재는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 혼합생약재의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 혼합생약재를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 혼합생약재는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 혼합생약재 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 혼합생약재의 제조
<1-1> 혼합생약재의 제조
본 발명자들은 산청목(山靑木)(Acer tegmentosum Max, 제천, 24 g), 택사(澤瀉)(Alismatis Rhizoma, 순천, 24 g), 백출(白朮)(Atractylodis Rhizoma Alba, 영천, 24 g), 맥아(麥芽)(Hordei Fructus Germinatus, 여수, 24 g), 감피(柑皮)(Persimmon Peels, 청도, 24 g), 오리목(赤陽皮)(Alnus japonica Cortex, 군위, 24 g), 진피(陳皮)(Citri Unshii Pericarpium, 제주, 12 g), 백복령(Hoelen, 청송, 12 g), 후박(厚朴)(Magnoliae Cortex, 중국, 12 g), 매실(梅實)(Mume Fructus, 중국, 12 g), 인진(茵蔯)(Artemisiae Capillaris Herba, 경주, 6 g), 치자(梔子)(Gardeniae Fructus, 제천, 6 g), 곽향(藿香)(Agastachis Herba, 청송, 6 g), 나복자(Raphani Semen, 중국, 6 g), 지실(枳實)(Ponciri Fructus, 영주, 6 g), 천궁(川芎)(Cnidii Rhizoma, 안동, 6 g), 홍화(紅花)(Carthami Flos, 중국, 6 g), 청피(靑皮)(Citrii Unshiu Immaturi Pericarpium, 제주, 6 g), 당목향(Aucklandiae Radix, 중국, 6 g), 사인(砂仁)(Amomi Fructus, 중국, 6 g), 감초(甘草)(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma, 중국, 6 g), 포공영(蒲公英)(Taraxaci Herba, 경북영천, 6 g), 대계(Cirsii Japonici Herba, 중국, 6 g), 창이자(蒼耳子)(Xanthii Fructus, 중국, 6 g), 지구목(Hovenia Dulcis Thunb, 충북제천, 6 g), 갈근(葛根)(Puerariae Radix, 강원원주, 6 g), 갈화(葛花)(Puerariae Flos, 중국, 6 g), 노근(蘆根)(Phragmitis Rhizoma, 중국, 6 g) 등의 약재를 분쇄한 후 혼합하여 제조하였다. 개체간 균일한 시료 처리 및 투약을 위하여, 상기 혼합생약재에 20배의 증류수를 가하여 상온에서 2시간 동안 초음파 분해(sonication) 후 감압여과(Whatman No. 2)하였다. 여과액을 -60℃ 이하에서 얼려 동결건조 하였고(FDU-550R; Eyela Co, Japan), 동결건조 후의 수득율은 40.42%였다. -20℃에 보관 후 매 실험 시 용매에 녹여 사용하였다.
<1-2> 혼합생약재의 환 제조
산청목 24 중량부, 오리목 24 중량부, 택사 24 중량부, 백출 24 중량부, 맥아 24 중량부, 감피 24 중량부, 진피 12 중량부, 백복령 12 중량부, 후박 12 중량부, 매실 12 중량부, 인진 6 중량부, 치자 6 중량부, 곽향 6 중량부, 나복자 6 중량부, 지실 6 중량부, 천궁 6 중량부, 홍화 6 중량부, 청피 6 중량부, 당목향 6 중량부, 사인 6 중량부, 감초 6 중량부, 포공영 6 중량부, 대계 6 중량부, 창이자 6 중량부, 지구목 6 중량부, 갈근 6 중량부, 갈화 6 중량부, 노근 6 중량부를 분말기(수인산업)에 넣어 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 분말과 꿀 600g을 섞어 반죽하였다.
상기에서 제조한 반죽을 장완기(수인산업)에 넣고 뽑은 후, 환으로 만들기 위해 제환기(수인산업)에 넣었다.
상기에서 제조한 환을 선별기(수인산업)에 넣고 선별한 후, 건조기(두리텍)에 넣고 건조하여 최종적으로 환을 제조하였다.
< 실시예 2> 혼합생약재의 세포독성 확인
<2-1> 세포배양
HT22 해마 신경(hippocampal neuronal) 세포 및 랫트(rat) 갈색세포종(pheochromocytoma) PC12 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. HT22 세포배양은 37℃의 5% CO2, 95% 공기(air) 조건에서 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S)를 포함하는 고농도-글루코오스(high-glucose) DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하였고 PC12 세포배양은 같은 조건에서 10% 말 혈청(horse serum), 5% FBS, 1% P/S를 포함하는 고농도-글루코오스(high-glucose) RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지를 사용하였다. 각 세포는 2 ∼ 3일 마다 1:3의 비율로 계대하여 배양하였다.
<2-2> 혼합생약재가 세포 생존율에 미치는 영향 확인
96-웰 플레이트(well plate)에 HT22 세포는 0.5×104/웰(well), PC12 세포는 50 ㎍/㎖의 콜라젠(collagen)으로 코팅된 96-웰 플레이트에 2×104/웰로 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 실시예 <1-1>의 혼합생약재를 0.1 ∼ 100 ㎍/㎖ 농도별로 7시간 동안 처리하였다. 혼합생약재의 처리 후 상층액을 제거하고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 1 ㎎/㎖을 처리하여 2시간 동안 반응시킨 후, DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 이용해 결정화한 것을 분리시켜(decrystalize) 분광광도계(spectrophotometer)(Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 1의 A에서 보는 바와 같이 HT22 세포에 혼합생약재를 처리하였을 때 혼합생약재를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하였고(도 1의 A), 도 2의 A에서 보는 바와 같이 PC12 세포에 혼합생약재를 처리하였을 때 혼합생약재를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하였다(도 2의 A).
< 실시예 3> 혼합생약재의 H 2 O 2 독성에 대한 세포보호 효과 확인
<3-1> H 2 O 2 독성에 대한 혼합생약재의 세포보호 효과 확인
상기 실시예 <2-2>의 조건과 동일하게 HT22 및 PC12 세포를 각각 96-웰 플레이트에 분주하고 상기 실시예 <1-1>의 혼합생약재의 0.1 ∼ 100 ㎍/㎖을 1시간 처리 후 각각의 세포에 300 μM의 H2O2 및 50 μM의 H2O2을 6시간 더 처리하였다. 혼합생약재 및 H2O2의 반응 종료 후 상층액을 제거하고 MTT 1 ㎎/㎖을 처리하여 2시간 동안 반응시킨 후, DMSO를 이용해 결정화한 것을 분리시켜(decrystalize) 분광광도계(spectrophotometer)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 1의 B에서 보는 바와 같이 300 μM H2O2에 의하여 세포 생존율이 혼합생약재 및 H2O2를 처리하지 않은 대조군 대비 60.16%로 감소하였고, 혼합생약재(1 ∼ 100 ㎍/㎖)의 전처리에 의하여 각각 73.72 ∼ 72.35%의 생존율을 나타낸 것을 확인하였고(도 1의 B), 도 2의 B에서 보는 바와 같이 50 μM H2O2에 의하여 세포 생존율이 혼합생약재 및 H2O2를 처리하지 않은 대조군 대비 64.87%로 감소하였고, 혼합생약재(1 및 10 ㎍/㎖)의 전처리에 의하여 각각 78.14% 및 78.35%의 생존율을 나타낸 것을 확인하였다(도 2의 B).
< 실시예 4> ICR 마우스에서의 알코올 독성에 대한 혼합생약재의 보호 효과 확인
<4-1> ICR 마우스의 몸무게에 미치는 혼합생약재의 효과
실험동물 및 사료는 (주)대한 바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 6주령 ICR계 자성 마우스(25 ∼ 28 g)를 일정한 조건(온도: 22±1℃, 습도: 55±3%, 12시간 명암주기)으로 5일간 적응시켰으며, 각 군당 8마리씩 사용하였다. 인체투여량(3 g)을 마우스의 대사율 및 체표면적당 환산법을 적용하였으며(Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. The FASEB Journal. 2007 ; 22 : 659-61.), 이전 연구에서 한약추출물이 동물에게 투여하는 용량을 참고하여(Kim JJ, Seo BI, Choi HS, Kim SM, Woo CH, Koo JS, Park GY. Preventive effect of Daekumeumja on fatty degeneration of liver and immunosuppression induced by alcohol. The Journal of Korean Oriental Medicine. 2010 ; 16(2) : 167-79.; Ahn TK, Shin JW, Cho CK, Cho JH, Yoo HS, Lee YW, Lee NH, Yun DH, Son CG. Effect of Galhwahyejung-tang(GHT) on protection for alcohol-induced liver injury. The Journal of Korean Oriental Medicine. 2005 ; 26(1) : 76-84.), 상기 실시예 <1-1>의 혼합생약재를 생리식염수에 용해하여 100 mg/kg로 28일간 1일 1회 경구 투여하였다. 혼합생약재 투여 한 시간 후 30% 알코올(EtOH) 5 g/kg를 2회에 걸쳐 4시간 간격으로 경구 투여하였으며('EtOH + 혼합생약재'로 표시), 생리식염수만을 동일 용량 투여한 것을 대조군으로 하였고, 알코올만을 동일 용량 투여한 것을 알코올 단독 투여군('EtOH'로 표시)으로 하였다. 대조군, 알코올 단독 투여군('EtOH'로 표시) 및 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군('EtOH + 혼합생약재'로 표시)의 체중변화를 관찰하기 위해 마우스의 체중은 2일 간격으로 측정하였다.
그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 알코올 독성을 가하지 않은 대조군은 무게가 꾸준히 증가하는 경향을 보인 반면, 알코올을 투여한 알코올 단독 투여군과 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군은 투여시작 2일째부터 4일까지 체중이 감소하였고 6일째부터 회복하기 시작하여 10일째에는 세 군간 체중차이가 나타나지 않았다는 것을 확인하였다. 특히 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군은 알코올 단독 투여군보다 체중감소가 더 심하게 나타났으나 빠른 회복 속도를 보였다는 것을 확인하였다(표 1)
TCR 마우스의 몸무게 표
날짜 대조군 EtOH EtOH + 혼합생약재
0 25.86±0.22 25.78±0.75 24.75±0.26
2 25.26±0.21 25.18±0.69 22.95±0.24 ** ##
4 26.51±0.43 24.76±1.28 20.73±0.25 ** #
6 29.24±0.48 27.88±0.74 22.25±0.30 *** ###
8 30.75±0.38 30.08±0.47 28.32±0.32 ** #
10 29.15±0.35 29.35±0.39 29.50±0.41
12 30.69±0.27 30.67±0.47 30.86±0.49
14 29.30±0.30 29.40±0.32 30.24±0.69
16 30.46±0.41 30.02±0.37 30.28±0.45
18 31.58±0.31 30.89±0.46 31.18± 0.53
20 32.34±0.38 30.60±0.50 31.37±0.47
22 32.33±0.51 30.53±0.42 31.42±0.62
24 32.24±0.51 30.71±0.36 31.54±0.58
26 31.28±0.40 29.21±0.42 29.95±0.50
28 32.02±0.47 29.90±0.35 31.21±0.70
측정값은 각 군(group)의 mean±SEM으로 표시하였다. 대조군과 비교하여 *** p <0.001, ** p <0.01. EtOH만 처리한 군과 비교하여 ### p <0.001, ## p <0.01, # p <0.05.
< 실시예 5> 물체인식실험( Novel object recognition test )을 통한 혼합생약재가 알코올 유도 기억력 손상에 미치는 영향 확인
상기 실시예 <4-1>의 마지막 투여 다음 날, 물체인식 행동실험을 수행하였다. 실험이 진행될 환경에서 실험동물을 1시간 적응시킨 후 본 실험에 앞서 훈련(training)을 진행하기 위하여 실험용 아크릴 박스에 넣어 5분간 박스 안 공간에 적응시켰다. 5분 적응시간이 지나면 2개의 유사한 물체를 넣어 3분간 마우스가 각 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 24시간 후 같은 방법으로 실험을 진행하되 2개의 물체 중 하나는 새로운 물체를 넣어 각 물체를 탐색하는 시간을 측정하여 결과값을 Recognition index(%)=새로운 물체 탐색시간/(새로운 물체 탐색시간+다른 물체 탐색시간)×100으로 처리하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 훈련(training)을 실시하였을 때, 각 군은 64.29%, 55.54% 및 48.96%로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않은 반면, 훈련 24시간 후 알코올만 단독 투여한 군이 37.91%로 대조군(62.62%)에 비해 새로운 물체를 탐색하는 정도가 적었고, 이에 대해 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군은 66.63%로 통계적으로 유의한 회복 효과를 보였다는 것을 확인하였다(도 3).
< 실시예 6> 혼합생약재가 알코올 유도 해마 신경세포 손상에 미치는 영향 확인
<6-1> 뇌 조직 분리
상기 실시예 <4-1>의 방법으로 투여를 완료한 뒤, 투여가 완료된 각 군의 쥐를 치사시킨 후, 해마 세포에 미치는 영향을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 알아보기 위해 뇌의 해마조직을 분리하여 -20℃에 보관하였다. 면역조직화학법을 위해 마우스를 PBS(phosphate buffer saline)와 4% PFA로 관류하여 뇌를 적출하고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)에 하루 동안 보관한 후, 동결시 생기는 조직의 손상을 막기 위해 30% 수크로오스(sucrose)에 냉장보관하였다. 뇌 조직을 저온유지장치(cryostat)(CM3000, Leica, Wetzlar, Germany)로 30 μm 동결박편 후, 4℃에서 보관용 용액(storing solution)에 보관하였다.
<6-2> 크레실 바이올렛 염색( Cresyl violet staining ) 및 면역조직화학법
크레실 바이올렛 염색(Cresyl violet staining)을 위해 고정한 뇌 조직의 해마부분을 골라 PBS로 3회 세척한 후 젤라틴이 코팅된 슬라이드(gelatin coated slide)에 마운팅하여 크레실 바이올렛(cresyl violet)(Sigma-Aldrich사(St. Louis, CA, USA)) 용액과 3분간 반응시켰다. 증류수로 세척하고 70% ∼ 100% 알코올과 자일렌의 탈수 및 투명화과정 후 커버슬라이드로 조직을 덮어 보관하였다. NeuN의 항체반응을 위해 해마조직을 PBS로 3회 세척한 후 내인성 페록시다아제(peroxidase)를 제거하기 위하여 과산화수소로 처리하고, 1차 항체 마우스(mouse) anti-NeuN(1:1000 dilution)(Chemicon사(Temecula, CA, USA))을 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체 비오틴결합(biotinylated) anti-mouse(1:200 dilution, 1시간)(Vector사(Burlingame, CA, USA)), ABC(avidin-biotin peroxidase complex)(Vector사(Burlingame, CA, USA)) 반응(1시간)을 거쳐 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB)를 이용하여 3분간 발색시켰다. 각 과정 사이에 PBS로 3회 세척을 행하였다. 뇌 조직은 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 마운팅 후 70 ∼ 100% 알코올과 자일렌의 탈수 및 투명화과정 후 커버슬라이드로 조직을 덮어 보관하였다. 현미경(Olympus Microscope System BX51; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 혼합생약재의 해마부위의 세포에 대한 영향을 관찰하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 알코올 단독 투여군을 살펴 보면 해마세포 중 CA3부분에서 대조군보다 세포수가 감소하고 엷게 발색된 것으로 알코올에 의해 세포사멸이 유도되었음을 확인하였고, 특히, 알코올에 의한 세포사멸은 CA1에 비해 CA3부분에서 예민하게 일어나는 경향을 보인 반면, 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군에서는 혼합생약재의 투여에 의하여 세포사멸이 억제되었음을 확인하였다(도 4). 도 5에서 보는 바와 같이 NeuN단백질의 면역염색 결과에서도 알코올 단독 투여군에서는 알코올에 의해 NeuN 양성세포가 적게 발현되어 알코올 독성에 의해 신경세포의 손상이 일어났으며, 이에 대해 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군에서는 혼합생약재가 알코올에 의한 신경세포사멸을 억제하였음을 확인하였다(도 5).
<6-3> 웨스턴 블롯( Western blotting )
분리한 마우스 해마조직을 단백질 정량 후 전기영동장치를 이용하여 12% SDS(sodium dodesyl sulfate)-아크릴아미드 젤(acrylamide gel)에 로딩하고 막(membrane)에 이동시킨 후 1차 항체로 NeuN(1:1000)(Chemicon사(Temecula, CA, USA)), β-actin(1:10000)(Assay Designs Inc.(Ann Arbor, MI, USA)), 2차 항체로 anti-mouse/rabbit HRP-conjugated(1:2000)(Assay Designs Inc.(Ann Arbor, MI, USA))를 각각 반응시켰다. 각 과정마다 막을 TBST로 15분간 4번씩 세척하였다. 항체반응을 마친 막은 ECL 검출 키트(ECL detection kit)(Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA, USA))를 이용하여 LAS-4000 mini system(Fujifilm Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 노출되도록 하였다. 베타-엑틴(β-actin)을 대조군으로서 포함시켰다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 알코올 단독 투여군을 살펴 보면 알코올을 투여한 해마조직에서 NeuN 단백질의 발현이 감소되었으며, 알코올 및 혼합생약재를 투여한 군에서는 혼합생약재에 의해 NeuN단백질 발현 감소가 억제되었다는 것을 확인하였다(도 6).
이하, 본 발명의 혼합생약재의 제조예는 하기와 같다.
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 혼합생약재 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 혼합생약재 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 혼합생약재 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 과립의 제조
본 발명의 혼합생약재 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
< 제조예 2> 식품의 제조
본 발명의 혼합생약재를 포함하는 식품들은 하기와 같이 제조하였다.
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 혼합생약재 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조
본 발명의 혼합생약재 0.1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 혼합생약재 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<2-4> 유제품( dairy products )의 제조
본 발명의 혼합생약재 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-5> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 혼합생약재를 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 혼합생약재를 다음의 비율로 배합하여 제조하였다:
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
본 발명의 혼합생약재(3 중량부),
영지(0.5 중량부), 및
지황(0.5 중량부).
< 제조예 3> 음료의 제조
<3-1> 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 혼합생약재 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<3-2> 야채 주스의 제조
본 발명의 혼합생약재 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<3-3> 과일 주스의 제조
본 발명의 혼합생약재 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 혼합생약재는 알코올에 의한 신경세포손상보호 효과가 우수하고 세포독성이 거의 없으므로, 환을 포함하여 다양하게 제형화하여 뇌질환 치료제, 알코올에 의한 신경손상 보호용 약재 또는 건강기능 식품 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 산청목(Acer tegmentosum Max), 오리목(Alnus japonica Cortex), 포공영(Taraxaci Herba), 대계(Cirsii Japonici Herba), 창이자(Xanthii Fructus), 갈화(Puerariae Flos), 지구목(Hovenia Dulcis Thunb), 갈근(Puerariae Radix), 백출(Atractylodis Rhizoma Alba), 맥아(Hordei Fructus Germinatus), 감피(Persimmon Peels), 백복령(Hoelen), 매실(Mume Fructus), 인진(Artemisiae Capillaris Herba), 지실(Ponciri Fructus), 당목향(Aucklandiae Radix), 사인(Amomi Fructus), 노근(Phragmitis Rhizoma), 나복자(Raphani Semen)택사(Alismatis Rhizoma), 진피(Citri Unshii Pericarpium), 후박(Magnoliae Cortex), 곽향(Agastachis Herba), 치자(Gardeniae Fructus), 천궁(Cnidii Rhizoma), 홍화(Carthami Flos), 청피(Citrii Unshiu Immaturi Pericarpium) 및 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)를 유효성분으로 함유하는 알코올성 뇌신경질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 산화 스트레스 또는 알코올에 의한 손상으로부터 뇌신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 알코올성 뇌신경질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 산청목(Acer tegmentosum Max), 오리목(Alnus japonica Cortex), 포공영(Taraxaci Herba), 대계(Cirsii Japonici Herba), 창이자(Xanthii Fructus), 갈화(Puerariae Flos), 지구목(Hovenia Dulcis Thunb), 갈근(Puerariae Radix), 백출(Atractylodis Rhizoma Alba), 맥아(Hordei Fructus Germinatus), 감피(Persimmon Peels), 백복령(Hoelen), 매실(Mume Fructus), 인진(Artemisiae Capillaris Herba), 지실(Ponciri Fructus), 당목향(Aucklandiae Radix), 사인(Amomi Fructus), 노근(Phragmitis Rhizoma), 나복자(Raphani Semen)택사(Alismatis Rhizoma), 진피(Citri Unshii Pericarpium), 후박(Magnoliae Cortex), 곽향(Agastachis Herba), 치자(Gardeniae Fructus), 천궁(Cnidii Rhizoma), 홍화(Carthami Flos), 청피(Citrii Unshiu Immaturi Pericarpium) 및 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)를 유효성분으로 함유하는 알코올성 뇌신경질환 예방 및 개선용 건강식품.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 1) 산청목 20 ~ 30 중량부, 오리목 20 ~ 30 중량부, 택사 20 ~ 30 중량부, 백출 20 ~ 30 중량부, 맥아 20 ~ 30 중량부, 감피 20 ~ 30 중량부, 진피 10 ~ 15 중량부, 백복령 10 ~ 15 중량부, 후박 10 ~ 15 중량부, 매실 10 ~ 15 중량부, 인진 5 ~ 10 중량부, 치자 5 ~ 10 중량부, 곽향 5 ~ 10 중량부, 나복자 5 ~ 10 중량부, 지실 5 ~ 10 중량부, 천궁 5 ~ 10 중량부, 홍화 5 ~ 10 중량부, 청피 5 ~ 10 중량부, 당목향 5 ~ 10 중량부, 사인 5 ~ 10 중량부, 감초 5 ~ 10 중량부, 포공영 5 ~ 10 중량부, 대계 5 ~ 10 중량부, 창이자 5 ~ 10 중량부, 지구목 5 ~ 10 중량부, 갈근 5 ~ 10 중량부, 갈화 5 ~ 10 중량부 및 노근 5 ~ 10 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 단계;
    2) 단계 1)의 분쇄된 혼합물을 꿀 500 ~ 800 중량부와 혼합하여 반죽하는 단계;
    3) 단계 2)의 반죽을 지름 1 ~ 2 ㎝의 환 형태로 제형화하는 단계; 및
    4) 단계 3)의 환을 건조시키는 단계를 포함하는, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1)은 산청목 20 ~ 24 중량부, 오리목 20 ~ 24 중량부, 택사 20 ~ 24 중량부, 백출 20 ~ 24 중량부, 맥아 20 ~ 24 중량부, 감피 20 ~ 24 중량부, 진피 10 ~ 12 중량부, 백복령 10 ~ 12 중량부, 후박 10 ~ 12 중량부, 매실 10 ~ 12 중량부, 인진 5 ~ 6 중량부, 치자 5 ~ 6 중량부, 곽향 5 ~ 6 중량부, 나복자 5 ~ 6 중량부, 지실 5 ~ 6 중량부, 천궁 5 ~ 6 중량부, 홍화 5 ~ 6 중량부, 청피 5 ~ 6 중량부, 당목향 5 ~ 6 중량부, 사인 5 ~ 6 중량부, 감초 5 ~ 6 중량부, 포공영 5 ~ 6 중량부, 대계 5 ~ 6 중량부, 창이자 5 ~ 6 중량부, 지구목 5 ~ 6 중량부, 갈근 5 ~ 6 중량부, 갈화 5 ~ 6 중량부 및 노근 5 ~ 6 중량부를 각각 분쇄한 후 혼합하는 것을 특징으로 하는 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 꿀은 600 ~ 700 중량부인 것을 특징으로 하는 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형의 제조방법.
  13. 제 10항의 제조방법으로 제조된, 뇌신경 세포 보호 활성을 갖는 환약 제형.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101667873B1 (ko) * 2015-02-26 2016-10-20 경희대학교 산학협력단 한방 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
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KR101805801B1 (ko) * 2017-05-12 2017-12-13 경희대학교 산학협력단 틸리아닌을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102469256B1 (ko) * 2017-10-20 2022-11-22 한국과학기술연구원 창이자 추출물을 유효성분으로 포함하는 우울증의 예방 또는 치료용 조성물
KR102424758B1 (ko) * 2020-08-11 2022-07-26 숙명여자대학교산학협력단 오리나무 추출물을 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100526945B1 (ko) * 2004-05-29 2005-11-08 한국식품연구원 민들레 환 및 그의 제조방법
KR20050122941A (ko) * 2004-06-26 2005-12-29 충남대학교산학협력단 지구자를 포함하는 인지개선용 식품 조성물 및 이를이용한 건강기능성 식품
KR20070106255A (ko) * 2006-04-28 2007-11-01 이화여자대학교 산학협력단 이소플라본계 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및치료용 조성물
KR20100120751A (ko) * 2009-05-07 2010-11-17 원광대학교산학협력단 근력약화, 근위축, 구음장애, 연하장애의 증상을 개선·지연시키기 위한 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100526945B1 (ko) * 2004-05-29 2005-11-08 한국식품연구원 민들레 환 및 그의 제조방법
KR20050122941A (ko) * 2004-06-26 2005-12-29 충남대학교산학협력단 지구자를 포함하는 인지개선용 식품 조성물 및 이를이용한 건강기능성 식품
KR20070106255A (ko) * 2006-04-28 2007-11-01 이화여자대학교 산학협력단 이소플라본계 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및치료용 조성물
KR20100120751A (ko) * 2009-05-07 2010-11-17 원광대학교산학협력단 근력약화, 근위축, 구음장애, 연하장애의 증상을 개선·지연시키기 위한 조성물

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