KR102429794B1 - 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 - Google Patents

약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소를 일시적으로 과발현하는 약물 후보를 탐색하기 위한 냉동보존된 재조합 세포를 개시한다. 유리하게, 이러한 세포는 약물 후보가 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소의 기질인지 억제제인지 여부를 탐색하는 과정을 간소화하며 비용면에서 효율적인 소모성 제품을 제공한다.

Description

약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 {Consumable Cryopreserved Cells Transiently Overexpressing Gene(s) Encoding Drug Transporter Protein(s) and/or Drug Metabolizing Enzyme(s)}
본 발명은 인코딩된 단백질(들)의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후의 세포 집단에서 검출가능하도록 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 일시적으로 과발현하는 냉동보존된 재조합 세포에 관한 것이다.
약물 개발은 약물 후보가 이들의 시장판매를 위한 규제승인을 얻기 전에 미국 식품의약국 (Food and Drug Administration) 및 유럽의약청 (European Medicines Agency)과 같은 정부 기관에 의해 확립된 특정 기준을 충족시켜야 하는 고비용 및 시간 소모적인 노력이다. 중요하게도, 무엇이 약물의 흡수, 분배, 대사 및 제거, 이들의 독성 및 약물-약물간 상호작용에 중대한 양향을 미치는 하나 이상의 약물 트랜스포터 단백질 (drug transporter proteins) 및/또는 약물대사 효소 (drug metabolizing enzymes)의 기질 (substrates) 또는 억제제 (inhibitors)인지 여부를 결정하기 위하여 약물 후보를 탐색하기 위한 분석이 수행된다.
세포주가 상기 탐색을 위해 사용될 수도 있는 약물 트랜스포터 단백질 또는 약물대사 효소를 인코딩하는 유전자를 안정적으로 발현할지라도, 이들의 냉동 저장물 (frozen stocks)을 생성 및 유지하기 위하여 상당한 시간 및 자원이 요구되다. 또한, 발현된 재조합 단백질의 수준은 전형적으로 (실험실마다) 다양하며 그러한 세포의 계대 (passage)에 따른 시간이 흐를수록 악화되고/또는 더욱 다양해질 것이다. 선택적으로, 약물 트랜스포터 단백질 또는 약물대사 효소를 인코딩하는 유전자를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 새로 플레이팅된 (freshly plated) 세포가 이러한 탐색을 위하여 적용될 수도 있다. 그러나, 새로 플레이팅된 세포는 단지 며칠의 제한된 저장 수명을 가지며, 이들의 생존능력을 유지하는 방법으로 운반하기가 어렵다. 또한, 안정적인 세포주를 생성시키기 위하여, 외래의 형질감염된 유전자가 실질적으로 세포의 숙주 게놈 내로 도입되며, 세포 분열 주기 동안 이와 함께 운반된다. 숙주 세포 내의 염색체 도입은 잠재적으로 숙주 행동의 예상치 못한 변화와 신뢰할 수 없는 실험 결과를 유발하는 다른 유전자의 비정상적인 발현을 야기하는, 숙주 게놈의 영구적인 변형을 야기할 것이다. 따라서, 약물 개발과 관련된 시간 및 자원의 투자를 감소시키며 신뢰할만한 결과를 제공하는 약물 후보 탐색에 적절한 세포가 요구된다.
본 발명은 무엇이 신뢰할 만한 결과 및 준비된 편의성을 제공하는 하나 이상의 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소의 기질 (substrates) 또는 억제제 (inhibitors)인지 여부를 결정하기 위하여 약물 후보 탐색하는 데 적절한 냉동보존된 재조합 세포를 제공한다. 바람직하게는, 냉동보존이 뒤따르는 재조합 세포의 집단에서의 활성 수준은 새롭게 형질감염된 세포의 활성 수준과 견줄 만하다. 또한, 상기 냉동보존된 세포는 바이얼 (vial) 내에 쉽게 포장이 가능하고, 드라이 아이스 또는 드라이 쉬퍼 (dry shipper)로 쉽게 운반이 가능하며, 몇 년의 저장 수명으로 -135℃로 편리하게 보관할 수 있다. 따라서, 이러한 세포는 최종 수요자에게 실험 수행에 편리성을 제공하며, 약물 후보 탐색을 위한 세포 저장물을 구축 및/또는 유지에 따른 시간과 자원의 투자를 감소시키는 소모성의 (consumable) "해동하여 사용"하는 제품을 제공한다.
본 발명의 하나의 관점은 약물 트랜스포터 단백질 및 약물대사 효소, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 일시적으로 과발현된 유전자를 포함하며, 여기에서 냉동보존으로부터의 해동 후의 냉동보존된 재조합 세포의 집단에서 상기 약물운반 단백질 또는 약물대사 효소 또는 이들의 조합의 활성이 검출가능한 재조합 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 관점은 약물 트랜스포터 단백질 또는 약물대사 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자로 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계 및 형질감염의 48시간 이내에 일시적으로 형질감염된 재조합 세포를 냉동보존하는 단계를 포함하는 약물 트랜스포터 단백질 및 약물대사 효소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 일시적으로 과발현하는 일시적으로 형질감염된 재조합 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 또는 기타 특징들은 하기 상세한 설명의 연구를 통하여 더욱 구체적으로 이해될 것이다.
본 발명은 무엇이 신뢰할 만한 결과 및 준비된 편의성을 제공하는 하나 이상의 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소의 기질 (substrates) 또는 억제제 (inhibitors)인지 여부를 결정하기 위하여 약물 후보 탐색하는 데 적절한 냉동보존된 재조합 세포를 제공한다. 바람직하게는, 냉동보존이 뒤따르는 재조합 세포의 집단에서의 활성 수준은 새롭게 형질감염된 세포의 활성 수준과 견줄 만하다. 또한, 상기 냉동보존된 세포는 바이얼 (vial) 내에 쉽게 포장이 가능하고, 드라이 아이스 또는 드라이 쉬퍼 (dry shipper)로 쉽게 운반이 가능하며, 몇 년의 저장 수명으로 -135℃로 편리하게 보관할 수 있다. 따라서, 이러한 세포는 최종 수요자에게 실험 수행에 편리성을 제공하며, 약물 후보 탐색을 위한 세포 저장물을 구축 및/또는 유지에 따른 시간과 자원의 투자를 감소시키는 소모성의 (consumable) "해동하여 사용"하는 제품을 제공한다.
도 1은 현탁액 (suspension) 내에서 성장한 FreeStyleTM 293-F (FS293) 세포와 293-F 세포에 대하여, 세포 저장물 (cell stock), 전기천공 (electroporation, EP) 후의 세포 및 냉동보존으로부터의 해동 후의 세포로부터 생존능력이 있는 세포의 백분율 그래프이다.
도 2는 냉동보존으로부터의 해동 후 플레이팅 후의 형질감염된 세포 4시간 (A), 24시간 (B) 및 48시간 (C)의 이미지이다.
도 3은 폴리-D-리신 (poly-D-lysine)이 코팅된 24-웰 플레이트에서 웰 마다 (A) 0.4×106 개의 생존능력이 있는 세포 및 웰 마다 (B) 0.2×106 개의 생존능력이 있는 세포에 플레이팅된 pOATP1B1 발현 플라스미드로 형질감염되고, (냉동보존으로부터의 해동 후) 플레이팅 24시간 후에 플레이팅 배지에서 배양된 293-F 세포의 이미지이다.
도 4는 (냉동보존으로부터의 해동 후) 플레이팅 24시간 후에, 24-웰 폴리-D-리신 (poly-D-lysine)으로 코팅된 플레이트에서 웰 당 0.4×106 세포에 플레이팅된 MATE1, MATE2K OATP1B3, 장쇄 아형 (long isoform) OAT1 (563 개의 아미노산을 갖는 전장 cDNA; 이하 "OAT1 장쇄 (OAT1 long)"라고 함), 단쇄 아형 (short isoform) OAT1 (C-말단 522-534에서 13개의 아미노산이 결실됨, 550개의 아미노산을 가짐; 이하 "OAT1 short (OAT1 단쇄)"라고 함), OAT3, 및 pCMV 벡터로 형질감염된 293-F 세포의 이미지이다.
도 5는 EP 후 24시간 (A) 및 48시간 (B) 후에 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 또는 200㎍/㎖의 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)로 형질감염된 부착된 (adhered) HEK293 세포의 형광 이미지이다.
도 6은 다양한 양의 DNA를 이용하여 부착된 HEK293세포의 EP 후에 생존능력이 있는 세포의 백분율 그래프이다.
도 7a는 EP 48시간 후에 다양한 양의 DNA (즉, 0, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ OATP2/OATP1B1)로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 다양한 배양시간 후의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수 활성 (uptake activity)의 그래프이다.
도 7b는 EP 96시간 후에 다양한 양의 DNA (즉, 0, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ OATP2/OATP1B1)로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 다양한 배양시간 후의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수 활성 (uptake activity)의 그래프이다.
도 8은 EP 48시간 후에 다양한 양의 DNA (즉, 0, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ OATP2/OATP1B1)로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 다양한 배양시간 후의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수의 노이즈 비율 (noise ratio)에 대한 신호 (signal)의 그래프이다.
도 9는 소규모 (small scale) EP 장치 (OC400)를 이용한 OATP2/OATP1B1, 대규모 (large scale) EP 장치 (CL2)를 이용한 OATP2/OATP1B1, 또는 공 벡터 (empty vector) 대조구 중 어느 하나로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수 활성의 그래프이다.
도 10은 "대조구" (즉, 전형적인 지질 형질감염 제제 (리포펙타민 2000 (lipofectamine 2000), Invitrogen으로부터 구입 가능)) 또는 MaxCyte 스케일가능한 EP 장치인 STX 중 어느 하나를 이용하여 OATP1B1 유전자로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 다양한 배양시간 후의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수의 노이즈 비율 (noise ratio)에 대한 신호 (signal)의 그래프이다.
도 11은 새롭게 (freshly) 플레이팅되거나 또는 냉동보존으로부터의 해동 후 플레이팅된 OATP1B1으로 형질감염된 부착된 HEK293 세포에서 다양한 배양시간 후의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (estradiol-17β-glucuronide, E17βG) 흡수의 노이즈 비율 (noise ratio)에 대한 신호 (signal)의 그래프이다.
도 12는 냉동보존, 해동, 폴리-D-리신 플레이트 상의 플레이팅 및 플레이팅 후 24시간 동안 배양을 거친 후, MaxCyte 스케일 가능한 EP 장치 및 스케일-업 과정을 이용하여 OATP1B1*1a (유전자 접근 번호. NM_006446.4), OATP1B1*1b (유전자 접근 번호. NM_006446.3), OATP1B3, pCMV 벡터, 장쇄 아형 OAT1 (563 개의 아미노산을 갖는 전장 cDNA), OAT3, OCT1 또는 OCT2로 형질감염된 HEK293 세포의 이미지이다.
도 13a는 3μM 농도의 PAH를 이용한 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OAT1 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 p-아미노마뇨산 (p-Aminohippuric acid, PAH) (OAT1에 대한 원형 (prototypical) 기질) 흡수의 시간-의존적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13b는 5분간의 배양후에 OAT1를 과발현하는 HEK293 세포에서 3 내지 200μM 범위의 농도에서 PAH의 흡수가 측정된 동역학적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯 (Sigma-plot)을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에서 삽입으로 나타나 있다.
도 13c는 OAT1를 과발현하는 HEK293 세포가 15μM 농도의 PAH 및 0 - 300μM 범위 농도의 프로베네시드 (probenecid) (OAT1 억제제)로 5분간 배양된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 상기 그래프에서 삽입으로 나타나 있다.
도 14a는 1μM의 농도에서 E3S로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OAT3 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 에스트론-3-황산염 (Estrone-3-sulfate, E3S) (OAT3에 대한 원형 기질) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14b는 1분간의 배양후에 OAT3을 과발현하는 HEK293 세포에서 0.5 내지 32μM 범위의 농도에서 E3S의 흡수가 측정된 동역학적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯 (Sigma-plot)을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에서 삽입으로 나타나 있다.
도 14c는 OAT3를 과발현하는 HEK293 세포가 4μM 농도의 E3S 및 0 - 300μM 범위 농도의 프로베네시드 (probenecid) (OAT3 억제제)로 5분간 배양된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 상기 그래프에서 삽입으로 나타나 있다.
도 15a는 31μM의 농도에서 TEA로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OCT1 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 TEA (OCT1에 대한 원형 기질) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15b는 3.8μM의 농도에서 메트포민 (metformin)으로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OCT1 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 메트포민 (OCT1에 대한 원형 기질) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15c는 10분간의 배양 후에 OCT1 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 1, 10 및 100μM의 농도에서 TEA의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15d는 10분간의 배양 후에 OCT1 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.1, 1 및 10μM의 농도에서 메트포민 (metformin)의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15e는 OCT1을 과발현하는 HEK293 세포가 TEA 및 0.1 - 500μM 범위의 다양한 농도의 OCT1 억제제 (퀴니딘 (quinidine), 베라파밀 (verapamil) 또는 데시늄-22 (decynium-22))로 10분간 배양된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15f는 OCT1를 과발현하는 HEK293 세포가 3.8μM 농도 메트포민 및 4μM 내지 3mM의 범위의 다양한 농도의 OCT1 억제제 시메티딘 (cimetidine)으로 10분간 인큐베이트된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 31μM의 농도에서 TEA로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OCT2 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 TEA (OCT2에 대한 원형 기질) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16b는 3.8μM의 농도에서 메트포민 (metformin)으로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OCT2 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 메트포민 (OCT2에 대한 원형 기질) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16c는 10분간의 배양 후에 OCT2 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 1, 10 및 100μM의 농도에서 TEA의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16d는 10분간의 배양후에 OCT2 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.1, 1 및 10μM의 농도에서 메트포민 (metformin)의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16e는 OCT2를 과발현하는 HEK293 세포가 3.8μM 농도 메트포민 및 4μM 내지 3mM의 범위 농도의 OCT2 억제제 시메티딘 (cimetidine)으로 10분간 배양된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 17a는 1μM 농도의 E17βG로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (E17βG) 흡수의 시간-의존적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17b는 1μM의 농도에서 E3S로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 에스트론-3-황산염 (E3S) 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17c는 1μM의 농도에서 로수바스타틴 (rosuvastatin)으로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 로수바스타틴 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17d는 1분간 배양 후에 OATP1B1*1a를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.25 내지 40μM의 범위 농도로 E17βG의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 17e는 5분간 배양후에 OATP1B1*1a를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.78 내지 50μM의 범위 농도로 로수바스타틴의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 17f는 5분간 0.04 내지 30μM 범위의 농도의 억제제 시클로스포린 A (cyclosporin A)로 배양 후 OATP1B1*1a를 과발현하는 HEK293 세포에서 1μM 농도로 E17βG의 흡수가 측정된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 18a는 1μM 농도의 E17βG로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 E17βG 흡수의 시간-의존적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18b는 1μM의 농도에서 E3S로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 E3S 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18c는 1μM의 농도에서 로수바스타틴 (rosuvastatin)으로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B1*1a 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 로수바스타틴 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18d는 1분간 배양 후에 OATP1B1*1a를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.25 내지 40μM의 범위 농도로 E17βG의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 18e는 5분간 배양후에 OATP1B1*1a를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.04 내지 30μM의 범위 농도의 억제제 시클로스포린 A로 배양 후 OATP1B1*1b를 과발현하는 HEK293 세포에서 1μM의 농도로 E17βG의 흡수가 측정된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 19a는 1μM 농도의 CCK-8로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B3 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 콜레시스토키닌 (cholecystokinin, CCK-8) 흡수의 시간-의존적 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19b는 1μM의 농도에서 E17βG로 다양한 배양시간 (즉, 1, 2, 5, 10 및 15분) 후에 OATP1B3 또는 pCMV 벡터를 과발현하는 HEK293 세포에서 E17βG 흡수의 시간-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19c는 1분간 배양후 OATP1B3를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.5 내지 20μM 범위의 농도로 CCK-8의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 19d는 5분간 배양 후 OATP1B3를 과발현하는 HEK293 세포에서 0.78 내지 50μM 범위의 농도로 로수바스타틴의 흡수가 측정된 농도-의존적인 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 Km 및 Vmax가 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
도 19e는 2분간 0.04 내지 30μM 범위의 농도의 억제제 시클로스포린 A로 배양후 OATP1B3를 과발현하는 HEK293 세포에서 1μM의 농도로 CCK-8의 흡수가 측정된 억제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 시그마-플롯을 이용하여 계산된 IC50이 상기 그래프에 삽입으로 나타나 있다.
여기에 사용된 하기 용어는 다음과 같은 정의를 갖는다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 구축된 세포주 (예를 들어, 인간 배아 신장 HEK293 세포 (human embryonic kidney HEK293 cells), 중국햄스터난소 CHO (Chinese hamster ovary CHO), 원위세뇨관세포 MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cells MDCK), 돼지신장상피세포 LLC-PK1 (Pig Kidney Epithelial Cells LLC-PK1), 인간상피직장결장선암종세포 Caco-2 (human epithelial colorectal adenocarcinoma cells Caco-2) 및 중국햄스터폐섬유아세포 V79 세포 (Chinese hamster lung fibroblast V79 cells))뿐만 아니라, 일차 세포 (primary cells)도 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "약물 트랜스포터 단백질 (drug transporter protein)"은 이에 한정되는 것은 아니나, ATP 결합 카세트 (ATP binding cassette, ABC) 트랜스포터 및 용질 담체 (solute carrier, SLC) 트랜스포터를 포함하는 막결합 운반 단백질을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "약물대사 효소 (drug metabolizing enzyme)"는 이에 한정되는 것은 아니나, 시토크롬 (CYP) P450과 같은 시토크롬 (cytochrome); UDP-글루쿠로닐 전이효소 (UDP-glucouronyl transferase) 및 알코올 탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 모노아민 산화효소 (monoamine oxidase) 및 알데히드 산화효소 (aldehyde oxidase)와 같은 기타 비-CYP 약물대사 효소를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "검출가능한 (detectable)"은 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소로 형질감염된 세포 내의 선택된 프로브 기질 (probe substrate)의 활성이 공 벡터 (empty vector)로 형질감염된 세포 내의 동일한 프로브 기질의 활성보다 높다는 것, 바람직하게는 활성 차이가 적어도 5배일 것을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, 트랜스포터 명명법에서 대문자의 사용 즉, 예를 들어 MRP2/ABCC2는 인간 단백질/유전자를 지칭하며, 소문자 즉, 예를 들어 Mrp2/Abcc2는 임상 전 (preclinical) (비인간 포유류) 종으로부터 유래되는 트랜스포터를 지칭한다. 달리 특정되지 않는 한, 유전자는 모든 종 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유류)로부터 유래된다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "OATP1B1", "OATP2" 및 "SLCO1B1"은 상호 전용 가능하며, 비인간 단백질/유전자 Oatp2에 상응하는 인간 단백질/유전자를 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, OATP1B1에 관한 참조는 OATP1B1*1b에 관한 것이다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "OAT1" 및 "SLC22A6"는 상호 전용 가능하며, 유기 음이온 트랜스포터 1 (organic anion transporter 1)을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, OAT1에 대한 참조는 563 개의 아미노산 (여기에 또한, "OAT1 장쇄 (OAT1 long)"로도 언급됨)으로 인코딩하는 전장 (full length) cDNA에 관한 것이다.
예시적인 ABC 트랜스포터는 이에 한정되는 것은 아니나, 하기 표 1에 열거된 것들을 포함한다.
유전자명 단백질명
MDR1/P-gp/ABCB1 복합약물 저항 단백질 1 (Multidrug Resistance Protein1)
MRP1/ABCC1 복합약물 저항 단백질 1
MRP2/ABCC2 복합약물 저항-관련 단백질 2
MRP3/ABCC3 복합약물 저항 단백질 3
MRP4/ABCC4 복합약물 저항 단백질 4
MRP5/ABCC5 복합약물 저항 단백질 5
MRP6/ABCC6 복합약물 저항 단백질 6
MRP7/ABCC7 복합약물 저항 단백질 7
MRP8/ABCC8 복합약물 저항 단백질 8
BCRP/ABCG2 유방암 저항 단백질 (Breast Cancer Resistance Protein)
BSEP/ABCB11 담즙산염 배출 펌프 (Bile Salt Export Pump)
예시적인 SLC 트랜스포터는 이에 한정되는 것은 아니나, 하기 표 2에 열거된 것들을 포함한다.
유전자명 단백질명
OSTα 유기 용질 트랜스포터 α
OSTβ 유기 용질 트랜스포터 β
OATP1B1*/SLCO 1B1/OATP2 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1B1
OATP1B3/SLCO 1B3 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1B3
OAT1/SLC22A6 유기 음이온 트랜스포터 1
OAT2/SLC22A7 유기 음이온 트랜스포터 2
OAT3/SLC22A8 유기 음이온 트랜스포터 3
OAT4/SLC22A11 유기 음이온 트랜스포터 4
OCT1/SLC22A1 유기 양이온 트랜스포터 1
OCT2/SLC22A2 유기 양이온 트랜스포터 2
OCT3/SLC22A3 유기 양이온 트랜스포터 3
OATP1A2/SLCO1A2 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1A2
OATP2B1/SLCO2B1 유기 음이온-운반 폴리펩티드 2B1
PEPT1/SLC15A1 펩티드 트랜스포터 1
PEPT2/SLC15A2 펩티드 트랜스포터 2
OCTN1/SLC22A4 유기 양이온/에르고티오네인 (ergothioneine) 트랜스포터
OCTN2/SLC22A5 유기 양이온/카르니틴 (carnitine) 트랜스포터
MATE1/SLC47A1 복합약물 및 독소 압출 (extrusion) 1
MATE2K/SLC47A2 복합약물 및 독소 압출 (extrusion) 2K
URAT1/SLC22A12 요산염 (Urate) 트랜스포터 1
ASBT/SLC10A2 정단 (Apical) 나트륨/담즙산 공동-트랜스포터
NTCP/SLC10A1 나트륨/타우로콜레이트 (taurocholate) 공동-운반 펩티드
* 이 경우, OATP1B1은 OATP1B1*1a 및 OATP1B1*1b를 포함한다.
예시적인 SLC는 이에 한정되는 것은 아니나, 하기 표 3에 열거된 것들이 테스트되었다.
유전자명 전체 명칭 유전자 접근 번호
OATP1B1*1a/SLCO1B1*1a 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1B1 야생형 (388A) NM_006446.4
OATP1B1*1b/SLCO1B1*1b 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1B1 SNP 388A>G NM_006446.3
OATP1B3/SLCO1B3 유기 음이온-운반 폴리펩티드 1B3 NM_019844
OAT1/SLC22A6 유기 음이온 트랜스포터 1 NM_004790
OAT3/SLC22A8 유기 음이온 트랜스포터 3 NM_004254
OCT1/SLC22A1 유기 양이온 트랜스포터 1 NM_003057
OCT2/SLC22A2 유기 양이온 트랜스포터 2 NM_003058
본 발명에 사용하기에 적합한 세포로는 예를 들어, 인간 또는 비인간 (예를 들어, 생쥐, 래트, 개, 원숭이, 햄스터 및 돼지 등)으로부터 유래된 것과 같은 포유류 세포가 포함된다. 특정 구현 예에 있어서, 상기 세포는 간세포 (hepatocytes), 또는 내피세포 (endothelial cells)이다.
유전자(들)을 세포 집단 내로 도입하기 위한 유전자 운반 시스템은 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 바이러스-기반 유전자 운반 방법이 사용될 수 있으나, 이는 안전에 관한 사항 때문에 세포를 전문적으로 취급할 것을 요한다. 지질-기반 형질감염 (transfection) 방법이 사용될 수 있기는 하나, 지질-기반 형질감염 제제는 비교적 고가이며 이러한 방법은 대규모 생산 과정에 적용하기가 쉽지 않다. 또한, 지질-기반 형질감염 방법은 비교적 낮은 수준의 유전자 운반 효율 및 상대적으로 지연된 단백질 발현 (일반적으로 형질감염 72 내지 96 시간 후) (자료 나타나지 않음)을 나타낸다. 전기천공법 (Electroporation, EP)은 대규모 생산 공정에 적용하기가 용이하며 바이러스성-기반 유전자 운반 방법의 안전에 관한 문제가 발생하지 않는다. 또한, EP는 상대적으로 효율적인 유전자 운반을 나타낸다.
세포 집단 내로 유전자가 운반된 후, 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소를 인코딩하는 유전자(들)은이들로부터 인코딩된 단백질(들)의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후에 검출가능하도록 과발현될 것이다. 어떤 것이 과발현된 유전자(들)로부터 인코딩된 단백질(들)의 기질 또는 억제제인지를 결정하기 위하여 그와 함께 재조합 세포를 배양함으로써 약물 후보를 테스트할 수 있다. 특히, 만약 약물 후보가 약물 트랜스포터 단백질 및/또는 약물대사 효소의 기질이라면, 상기 약물 후보는 영향을 받게 된다. 예를 들어, 만약 상기 약물 후보가 약물 트랜스포터 단백질의 기질이라면, 상기 약물 후보는 상기 약물 트랜스포터 단백질을 통해 상기 재조합 세포의 안 또는 밖으로 이동할 것이다. 그러나, 만약 상기 약물 후보가 상기 약물 트랜스포터 단백질의 억제제라면, 상기 약물 후보는 상기 약물 트랜스포터 단백질의 기질이 상기 재조합 세포의 안 또는 밖으로 이동하는 것을 억제할 것이다.
선택적으로, 전체 세포 또는 이의 준세포 분획 (subcellular fractions) (미크로좀 (microsome)/시토졸 (cytosol))을 이용하여 분석을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 세포는 특정 분석을 위해 바람직한 것과 같이 그 발현을 녹다운/녹아웃 (knockdown/knockout)시키기 위하여 일시적으로 과발현된 유전자(들)의 RNAi 또는 siRNA로 더욱 형질감염될 수 있다. 일차 세포 (예를 들어, 간세포)는 특정 유전자의 발현을 녹다운/녹아웃시키기 위하여 모든 ABC 트랜스포터, SLC 트랜스포터 또는 모든 기타의 약물대사 효소를 표적으로 하는 (directed) RNAi 또는 siRNA로 형질감염될 수 있다.
제(1) 관점에 있어서, 상기 개시는 약물 트랜스포터 단백질 및 약물대사 효소, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 일시적으로 과발현된 유전자를 포함하며, 여기에서 냉동보존으로부터의 해동 후의 냉동보존된 재조합 세포의 집단에서 상기 약물 트랜스포터 단백질 또는 약물대사 효소 또는 이들의 조합의 활성이 검출가능한 재조합 세포를 제공한다.
제(2) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 약물대사 효소를 인코딩하는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(3) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 약물대사 효소가 시토크롬 P450 (cytochrome P450), UDP-글루쿠로닐 전이효소 (UDP-glucouronyl transferase), 알코올 탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 모노아민 산화효소 (monoamine oxidase) 및 알데히드 산화효소 (aldehyde oxidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 제(2) 관점의 발명을 제공한다.
제(4) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 세포가 ATP 결합 카세트 트랜스포터 (ATP binding cassette transporter) 및 용질 담체 트랜스포터 단백질 (solute carrier transporter protein)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 일시적으로 과발현하는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(5) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 MDR1/Mdr1a/Mdr1b, MRP1/Mrp1, MRP2/Mrp2, MRP3/Mrp3, MRP4/Mrp4, MRP5/Mrp5, MRP6/Mrp6, MRP7/Mrp7, MRP8/Mrp8, BCRP/Bcrp, BSEP/Bsep, OATP2/Oatp2, OATP1B3/Oatp1b3, OAT1/Oat1, OAT2/Oat2, OAT3/Oat3, OAT4/Oat4, OCT1/Oct1, OCT2/Oct2, OATP1/Oatp1, PEPT1/Pept1, PEPT2/Pept2, OCTN1/Octn1, OCTN2/Octn2, MATE1/Mate1, MATE2K/Mate2, URAT1/Urat1, ASBT/Asbt, 및 NTCP/Ntcp로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 제(4) 관점의 발명을 제공한다.
제(6) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 MDR1/Mdr1a/Mdr1b, MRP1/Mrp1, MRP2/Mrp2, MRP3/Mrp3, MRP4/Mrp4, MRP5/Mrp5, MRP6/Mrp6, MRP7/Mrp7, MRP8/Mrp8, BCRP/Bcrp, 및 BSEP/Bsep로 이루어진 군으로부터 선택되는 ATP 결합 카세트 트랜스포터 (ATP binding cassette transporter)인 상기 제(4) 관점의 발명을 제공한다.
제(7) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 OATP2/Oatp2, OATP1B3/Oatp1b3, OAT1/Oat1, OAT2/Oat2, OAT3/Oat3, OAT4/Oat4, OCT1/Oct1, OCT2/Oct2, OCT3/Oct3, OATP1/Oatp1, PEPT1/Pept1, PEPT2/Pept2, OCTN1/Octn1, OCTN2/Octn2, MATE1/Mate1, MATE2K/Mate2, URAT1/Urat1, ASBT/Asbt, 및 NTCP/Ntcp로 이루어진 군으로부터 선택되는 용질 담체 트랜스포터 (solute carrier transporter)인 단백질을 인코딩하는 상기 제(4) 관점의 발명을 제공한다.
제(8) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 OATP1B1*1a, OATP1B1*1b, OATP1B3, OAT1, OAT3, OCT1, OCT2, MATE1 및 MATE2K로부터 선택되는 상기 제(4) 관점의 발명을 제공한다.
제(9) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 하나 이상의 유전자가 인간 또는 생쥐, 래트, 기니피그, 개, 및 원숭이로부터 선택되는 동물 종으로부터 개별적으로 유래되는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(10) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 세포가 포유동물로부터 유래되는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(11) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 세포가 HEK293, CHO, MDCK, LLC-PK1, Caco-2 및 V79 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 제(10) 관점의 발명을 제공한다.
제(12) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 포유동물이 인간, 원숭이, 개, 래트, 생쥐, 돼지 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 제(10) 관점의 발명을 제공한다.
제(13) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 세포가 간세포를 포함하는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(14) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 세포가 내피세포를 포함하는 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(15) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 단백질(들)의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후의 플레이팅 후 적어도 24시간 상기 세포의 집단에서 검출가능한 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(16) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 단백질(들)의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후의 플레이팅 후 적어도 48시간 상기 세포의 집단에서 검출가능한 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(17) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 단백질(들)의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후의 플레이팅 후 적어도 72시간 상기 세포의 집단에서 검출가능한 상기 제(1) 관점의 발명을 제공한다.
제(18) 관점에 있어서, 상기 개시는 약물 트랜스포터 단백질 또는 약물대사 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자로 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계 및 형질감염의 48시간 이내에 일시적으로 형질감염된 재조합 세포를 냉동보존하는 단계를 포함하는 약물 트랜스포터 단백질 및 약물대사 효소로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 일시적으로 과발현하는 일시적으로 형질감염된 재조합 세포의 제조방법을 제공한다.
제(19) 관점에 있어서, 상기 개시는 상기 일시적으로 형질감염시키는 단계가 전기천공법을 포함하는 상기 제(18) 관점의 발명을 제공한다.
실시예
세포를 세포 배양을 위한 표준 멸균 실험조건 하에서 배양하였으며, EP를 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다. EP 후에, 냉동, 해동 및 플레이팅 전과 후 모두에서 단백질 활성에 관하여 세포를 분석하였다. 자세히 후술 된 바와 같이, 현탁액에서 배양된 세포 및 부착된 세포 배양물은 모두 성공적이고 일시적으로 형질감염되었고 냉동보존으로부터의 해동 후 재조합 단백질의 실질적인 활성을 나타내었다.
현탁액에서 배양된 세포
간략히, 1일째, 보충된 CD293 배지 (즉, 4 mM L-글루타민 (Gibco, Cat. No. 25030-081, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능)으로 보충된 CD293 배지 (Gibco, Cat. No. 11913-019, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능)) 또는 6 mM L-글루타민으로 보충된 ExcellTM 293 무혈청 (serum free) 배지 (Sigma, Cat. No. 14571C, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO로부터 구입가능)를 이용하여, FreeStyle 293 세포 및 293-F 세포를 0.7-1.0×106 세포/㎖의 밀도로 각각 적당한 크기의 쉐이커 플라스크 내로 통과 (passaged)시켰다. 셀로미터 (Cellometer) (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA로부터 구입가능)를 이용하여 세포 생존능력 및 세포 수를 결정하였다.
2일째, 세포의 EP를 수행하였다. 간략히, 세포 생존능력 및 세포 밀도를 결정한 후, 5분간 100g에서 회전시킴으로써 세포를 펠릿다운 (pelleted down)시켰고, 그 후 상기 배지를 흡입 (aspirated)시켰고 세포를 30㎖ EP 버퍼 (MaxCyte, Cat. No. B201, MaxCyte Inc., Gaithersburg, MD로부터 구입가능) 내에서 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 50㎖ 팔콘 (Falcon) 튜브로 옮겼으며, 전술된 바와 같이 펠릿다운시켰고, 적당한 양의 EP 버퍼에서 세포 저장물 (stock)로 사용된 100×106 세포/㎖가 되도록 재현탁시켰다. EP에 사용될 DNA들을 멸균수 내에서 5㎎/㎖의 최종 농도로 제조하였다. 각 샘플에 대하여, 0.4㎖의 세포 저장물 및 DNA를 멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브 (eppendorf tube)에 넣어 최종농도 200㎍/㎖ (표 4) 또는 300㎍/㎖ DNA (표 10 및 표 11) 및 샘플당 40×106 세포의 세포 밀도가 되도록 하였다.
샘플 # 세포 타입 플라스미드(들) 세포 저장물
부피 (㎖)		 [DNA]
(㎍/㎖)
A 1, 2 FS293

 pOATP1B1 0.4 200
B 3, 4 pCMV6 0.4 200
C 5 EP Buffer (16 ㎕) 0.4 -
D 6, 7 293-F
 pOATP1B1 0.4 200
E 8, 9 pCMV6 0.4 200
F 10 EP Buffer (16 ㎕) 0.4 -
샘플을 HEK 세포의 EP에 관한 제조 지침을 따른 OC-400 프로세싱 어셈블리 (MaxCyte, Cat. No. OC-400R, MaxCyte Inc., Gaithersburg, MD로부터 구입가능)로 옮겼다. EP 후에, 상기 세포를 조심스럽게 피펫으로 꺼내어 125㎖ 쉐이커 플라스크의 바닦으로 옮겼으며 8% CO2로 37℃에서 20분간 배양하였고, 그 후 1×106 세포/㎖의 세포 밀도가 되도록 예열된 40㎖ CD293 배지를 상기 쉐이커 플라스크에 첨가하였다. 상기 세포를 37℃ 및 8% CO2에서 30분간 배양하였다. 30분간의 회복 후에, 세포 생존능력 및 세포 밀도를 결정하였다. 세포의 일부 (즉, 20×106 세포)를 플레이팅용으로 사용하고 나머지를 냉동보존하거나, 또는 모든 세포를 냉동보존하였다. 재조합 세포가 형질감염의 48시간 이내에 냉동보존되며 냉동보존으로부터의 해동 후 검출가능한 수준에서 형질감염된 유전자(들)로부터 인코딩된 단백질(들)의 활성을 나타내는 것으로 여겨진다.
EP 후에 세포를 플레이팅하기 위하여, 100g에서 5분간 회전시킴으로써 20×106 세포를 펠릿다운시켰으며, 그 후 20㎖ 예열된 플레이팅 배지 (고 글루코오스 (Gibco, Cat. No. 11965092, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능)를 가지며, 0.1mM 비-필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140050, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능), 10% FBS (SAFC Biosciences, Cat. No. 12016C, Sigma, St. Louis, MO로부터 구입가능)으로 보충된 DMEM) (1×106 세포/㎖의 세포 밀도) 내에서 재현탁시켰다. 세포를 폴리-D-리신이 코팅된 24-웰 조직 배양 플레이트, Corning BiocoatTM (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA로부터 구입가능)에 0.2×106 세포/웰 및 0.4×106 세포/웰의 밀도로 위치시켰고, 흡수 활성 (uptake activity)에 대한 시딩 밀도 (seeding density)의 영향을 결정할 수 있도록 8% CO2로 37℃에서 배양시켰다. 배지를 4시간 이후 및 그 후 매 24시간 마다 분석 날짜까지 배지를 교체하였다. 4일째, 후술된 바와 같이 OATP1B1 활성에 대한 분석을 수행하였다.
냉동보존을 위하여, 세포를 펠릿화했으며 그 후 새롭게 제조된 매우 차가운 냉매 (CD293 배지로 보충된 9부 (parts) 및 멸균을 위하여 주사 여과된 (syringe filtered) DMSO 1부)에서 10×106 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 저온 바이얼 (Cryo vials)을 1㎖의 이러한 현탁액으로 충진시켰으며, 매우 차가운 Mr Frosty 냉동 용기 (Thermal Scientific으로부터 구입가능)에 두었고, 이를 -80℃ 냉동고 내에서 하룻밤 동안 저장하였고 그 후, 상기 바이얼을 액체 질소 내로 옮겼다.
후술된 바와 같이, OATP1B1 활성에 대하여 냉동보존된 세포를 분석하였다. 간략히, 1일째, 냉동보존된 세포를 액체 질소로부터 꺼내어 드라이 아이스에 두었으며, 그 후 약 2분간 37℃의 수욕조에서 해동시켰다. 전술된 바와 같이 세포를 약 37℃의 온도로 예열된 10㎖의 플레이팅 배지로 옮겼으며 생존능력 및 세포 밀도를 결정하였다. 세포를 펠릿다운시켰고 1×106 생존 가능한 세포/㎖의 세포 밀도로 보충된 DMEM 배지 내에서 재현탁시켰다. EP 후에 세포를 플레이팅하기 위하여 전술된 바와 동일한 방법으로 세포를 플레이팅하였으며, 그 플레이팅 후 24, 48 및 72 시간째 OATP1B1 활성에 대한 분석을 수행하였다.
부착된 세포 배양
간략히, 100:1:1:1:10의 비율로 Gibco Cat. No. 11965118, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입 가능한 DMEM (고 글루코오스); Gibco Cat. No. 15140-122, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능한 페니실린-스트렙토마이신 (Penicillin-Streptomycin) (10,000 단위/㎖); Gibco Cat. No. 25030-081, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능한 L-글루타민 (L-Glutamine) (200 mM); Gibco Cat. No. 11360, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA로부터 구입가능한 피르브산 나트륨 (Sodium Pyruvate); Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO로부터 구입가능한 FBS를 함유하는 플레이팅 배지를 이용하여 HEK293 세포를 5 Layer Corning® CellStack® (Corning Inc. Life Sciences, Tewksbury, MA로부터 구입가능)에서 배양하였다. 1일째, EP 약 24시간 전에, HEK293 세포를 트립신화하였으며, 세포 생존능력 및 세포 수를 결정하였고 그 후, 신선한 다층 챔버 플라스크로 30-40% 컨플루언시 (confluency)로 통과시켰다. 세포를 5% CO2로 37℃에서 배양하였다.
2일째, 세포의 EP를 수행하였다. 간략히, 세포를 수확하였으며, 세포 생존능력 및 세포 수를 결정하였고, 그 후 5분간 100g에서 회전시킴으로써 세포를 펠릿다운시켰고 상기 배지를 흡입시켰다. 세포를 EP 버퍼에서 재현탁시켰고, 5분간 100g에서 회전시킴으로써 펠릿다운시켰고, 그 후 50×106 세포/㎖가 되도록 적절한 양의 EP 버퍼 내에서 재현탁시켰고 이를 세포 저장물로 사용하였다. EP에 사용된 DNA를 멸균수 내에서 5㎎/㎖의 최종 농도로 제조하였다. OC-400 프로세싱 어셈블리에 사용된 각각의 샘플에 대하여, 도 5-9에 나타난 바와 같이 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ DNA 및 샘플당 40×106 세포의 세포 밀도가 되도록 4㎖의 세포 저장물 및 DNA를 멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 넣었다. CL-2 프로세싱 어셈블리에 사용된 각각의 샘플에 대하여, 10㎖의 세포 저장물 및 DNA를 100㎍/㎖ DNA의 최종 농도가 되도록 50㎖ 멸균 코니컬 튜브에 넣었다.
샘플을 HEK 세포의 EP에 대한 제조 지침을 따른 OC-400 또는 CL-2 프로세싱 어셈블리 (MaxCyte, Cat. No. OC-400R 및 CL2-R, MaxCyte Inc., Gaithersburg, MD로부터 구입 가능)로 옮겼다. EP 후에, 상기 세포를 조심스럽게 피펫으로 꺼내어 6-웰 조직 배양 플레이트로 옮겼으며, 5% CO2로 37℃에서 20분간 배양하였고, 그 후 세포를 떼어내고 예열된 플레이팅 배지를 함유하는 50㎖ 코니컬 튜브에 넣었다. 세포 생존능력 및 세포 밀도를 결정하였다. 세포의 일부 (즉, 20×106 세포)를 플레이팅에 사용하였으며 나머지를 냉동보존하였다.
EP 후에 세포 플레이팅를 위하여, 세포를 5분간 100g에서 회전시킴으로써 펠릿다운시켰으며 그 후, 예열된 플레이팅 배지 (1×106 세포/㎖의 세포 밀도)에서 재현탁시켰다. 세포를 0.4×106 세포/웰의 밀도로 24-웰 조직 배양 플레이트 (폴리-D-리신 코팅된, Corning BiocoatTM (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA로부터 구입가능))에 위치시켰으며, 5% CO2로 37℃에서 배양하였다. 4시간 후 및 그 후 분석하는 날까지 매 24시간 마다 배지를 교체하였다. 4 및 6일째, OATP1B1 활성에 대하여 세포를 분석하였다.
냉동보존을 위하여, 세포를 펠릿화 하였으며 그 후 새롭게 제조된 매우 차가운 냉매 (플레이팅 배지 9부 (parts) 및 멸균을 위하여 주사 여과된 (syringe filtered) DMSO 1부)에서 10×106 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 저온 바이얼 (Cryo vials)을 1㎖의 이러한 현탁액으로 충진시켰으며, 매우 차가운 Mr Frosty 냉동 용기 (Thermal Scientific으로부터 구입가능)에 두었고, 이를 -80℃ 냉동고 내에서 하룻밤 동안 저장하였고 그 후, 상기 바이얼을 액체 질소 내로 옮겼다.
OATP1B1 활성에 대하여 냉동보존된 세포를 분석하였다. 특히, EP 후 세포 플레이팅를 위하여 (냉동보존되지 않은) 전술된 바와 동일한 방법으로 세포를 플레이팅하였으며, (후술된 바와 같이) 그 플레이팅 48시간 후에 OATP1B1 활성에 대하여 분석하였다.
트랜스포터 활성 분석
간략히, 기질 용액을 OATP1B1*1a 및 OATP1B1*1b에 대하여 2μM 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 (99%의 차가운 E17βG 및 1%의 [3H]-E17βG)를 이용하여; OATP1B3에 대하여 2μM CCK-8 (99%의 차가운 CCK-8 및 1%의 [3H]-CCK-8)를 이용하여; OAT1 단쇄에 대하여 1μM 부-아미노히퓨레이트 (Para-aminohippurate, PAH) (90%의 차가운 PAH 및 10%의 [3H]-PAH)를 이용하여; OAT1 장쇄에 대하여 1μM 또는 3μM 부-아미노히퓨레이트 (PAH) (90%의 차가운 PAH 및 10%의 [3H]-PAH)를 이용하여; OAT3에 대하여 1μM 또는 2μM 에스트론-3-황산염 (99%의 차가운 E3S 및 1%의 [3H]-E3S)를 이용하여; OCT1 및 OCT2에 대하여 30μM 테트라에틸암모늄 브로마이드 (Tetraethylammonium Bromide) (100% [14C]-TEA)를 이용하여; MATE1 및 MATE2K에 대하여 10μM 메트포민 (100% [14C]-메트포민) 또는 10 μM 테트라에틸암모늄 브로마이드 (100% [14C]-TEA)를 이용하여; Krebs-Henseleit 버퍼 pH7.4 (Sigma, Cat. No. K3753, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO로부터 구입가능)에서 제조하였으며, 적어도 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양 배지를 분석될 세포로부터 흡입시켰으며, 예열된 KHB 버퍼로 세포를 3회 세척하였다. 세포를 연속하여 10분간 37℃에서 흡수 버퍼 (Uptake Buffer)로 배양하였다. MATE1 및 MATE2K에 대하여, 세포를 세척하였으며, 20mM NH4Cl을 함유하는 KHB 버퍼로 10분간 전-배양하였다. 0.3㎖ 기질 용액을 각각의 웰에 첨가함으로써 분석을 개시하였고 10분간 배양된 OCT1 및 OCT2에 대한 샘플로 5분간 37에서 배양하였다.
배양기 후에 세포로부터 기질 용액을 흡입시키고, 그 후 차가운 흡수 버퍼로 3회 세척함으로써 상기 반응을 신속하게 중단하였다. 그 후, 세포를 용해 (lysing) 용액 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) 버퍼 내에 0.1% v/v 1M NaOH를 갖는 0.1% SDS)으로 흔들면서 15-20분간 배양하였다. 상기 기질 용액을 연마 (triturated)하였으며 섬광 카운터로 분석하기 위하여 0.4㎖의 상기 결과적인 세포 용해물을 5㎖의 섬광액 (scintillation liquid)과 함께 5㎖ 섬광 튜브에 넣었다.
도 1에 도시된 바와 같이, EP 후 세포 저장물의 생존능력보다 세포 생존능력이 1-5% 낮아졌다. 또한, 냉동보존 후, 세포 생존능력이 EP 후의 생존능력보다 10-15% 더 낮아졌다. 그럼에도 불구하고, EP 및 냉동보존으로부터의 해동 후에도, 세포 생존능력이 75%보다 더 높았다.
30분간의 회복 및 형질감염 후 24시간의 회복 이후 냉동보존 후의 세포 형태 및 흡수 활성을 시험하였다. 표 5는 24시간 회복을 갖는 세포 형태 및 흡수 활성이 30분 회복에 비하여 감소된 것을 나타낸다.
샘플 냉동보존 전 회복시간 24시간에서의
세포 컨플루언시		 흡수 활성
(pmole/㎎/min)		 S:N
OATP1B1 24시간 40-50% 0.59 0.44
OATP1B1 30분 70-75% 5.78 4.32
벡터 30분 90-95% 1.34
24-웰 폴리-D-리신 코팅된 Corning BiocoatTM 플레이트에서 웰 당 0.4×106 세포 밀도의 플레이팅 후 다양한 시간 후에 냉동보존으로부터 해동된 형질감염 세포의 세포 형태 및 컨플루언시를 조사하였다. 특히, 도 2는 플레이팅 4시간, 24시간 및 72시간째에 배양된 일시적으로 형질감염된 세포 OATP1B1를 나타낸다. 또한, 이러한 세포들의 플레이팅 24, 48 및 72시간째의 세포 컨플루언시가 하기 표 6에 기록되어 있다.
세포 24시간 48시간 72시간
pOATP1B1를 갖는 FS293 80-90% 90-95% 80-85%
pCMV6 벡터를 갖는 FS293 70-80% 90-95% 90%
pOATP1B1를 갖는 293-F 90-95% 95-100% 80-85%
pCMV6 벡터를 갖는 293-F 90-95% 95-100% 80-85%
바람직하게는, EP 및 냉동보존 후에, 상기 세포는 플레이팅 24시간 후에 80-90% 컨플루언시, 플레이팅 48시간 후에 90%-100% 컨플루언시를 이루며, 폴리-D-리신 코팅된 Corning BiocoatTM 플레이트 상에 단층을 형성한다.
도 4는 각각 MATE1, MATE2K, OATP1B3, OAT1 장쇄, OAT1 단쇄, OAT3, 및 pCMV 벡터로 일시적으로 형질감염된 냉동보존으로부터 해동 된지 24시간 후에 배양된 세포를 나타낸다.
도 5에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포 내의 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein, GFP)의 발현이 DNA의 농도 증가에 따라 증가하였다. 또한, GFP 발현은 24시간의 시점에서보다 48시간의 시점에서 증가하였다. 특히, EP에 의한 GFP 형질감염 효율은 200㎍/㎖ DNA로 24시간에서 100%에 도달했으며, 100㎍/㎖ DNA로 48시간에서는 100% 형광 세포 염색에 도달했다. 따라서, 형질감염된 세포에서 GFP 단백질 발현 수준은 증가된 DNA 농도 및 24시간에 비하여 48시간에서 증가하였다.
OATP1B1 (pOATP1B1) 및 대조구 벡터 (pCMV)로 형질감염된 현탁액 배양된 293 세포의 흡수 활성을 EP 후 다양한 시점에서 분석하였다. 간략히, EP 또는 냉동보존으로부터의 해동 후 형질감염된 세포를 24-웰 폴리-D-리신 코팅된 Corning BiocoatTM 플레이트에 0.4×106 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 프로브 기질, 에스트라디올-17β-글루쿠로니드를 이용하여 하기 표 7에 자세히 나타낸 바와 같이 플레이팅 후 다양한 시점에서 새롭게 (fresh) 플레이팅된 세포 ("새로운") 및 냉동보존된 (cryopreserved) 세포 ("냉동") 모두에서 OATP1B1 흡수 활성 및 흡수율을 결정하였다.
세포/배양 배지,
새로운 또는 냉동		 세포 플레이팅 시점
(시간)		 흡수 활성
(pmol/㎎/min)/ confluence
흡수율
pOATP1B1 pCMV
CD293 내의 293-F, 새로운 48 15.4 (85%) 0.7 (90%) 22.0
CD293 내의 293-F, 냉동 48 15.1 (95-100%) 0.9 (95-100%) 16.8

Excell 내의 FS293, 냉동
 24 36.4 1.9 19.2
48 10.0 0.7 14.3
72 6.6 1.0 6.6

CD293 내의 293-F, 냉동
 24 27.4 1.5 18.3
48 15.1 0.9 16.8
72 9.9 1.0 9.9
주: 괄호 안의 숫자는 분석시간에서의 세포 컨플루언시이다.
냉동보존으로부터의 해동 후 형질감염된 세포에서의 OATP1B1 흡수 활성 및 흡수율은 새롭게 플레이팅된 형질감염된 세포의 경우와 일관된다. 세포 타입 293-F 및 FS293의 모든 경우, 가장 높은 흡수 활성 및 흡수율은 플레이팅 24시간 후에 관찰된다.
냉동보존으로부터의 해동 후 0.4×106 세포/웰 또는 0.2×106 세포/웰의 플레이팅 밀도로 24-웰 폴리-D-리신 코팅된 Corning BiocoatTM 플레이트에 플레이팅 24시간, 48시간 및 72시간 후에 형질감염된 세포 (FS293 또는 293-F)의 형태 및 세포 컨플루언시를 검사하였다. 플레이팅 24시간 후에 세포 컨플루언시가 하기 표 8에 요약되어 있다. 48시간 및 72시간에서의 세포 컨플루언시는 24시간에 달성된 것과 유사하다 (데이터 미표시). 또한, 도 3은 각각, 90-95% 및 60-70%의 컨플루언스로 냉동보존으로부터의 해동 후 플레이팅 24시간 후에 (A) 웰 당 0.4×106 세포 및 (B) 웰 당 0.2×106 세포로 플레이팅된 형질감염된 세포의 이미지를 제공한다.
세포, 배양 배지, 형질감염된 DNA 0.4×106 세포/웰 0.2×106 세포/웰
FS293 Excell 내에서 pOATP1B1로 80-90% 30-50%
FS293 Excell 내에서 pCMV 벡터로 70-80% 50%
293-F CD293 내에서 pOATP1B1로 90-95% 60-70%
293-F CD293 내에서 pCMV6 벡터로 90-95% 80%
최적의 분석 수행을 위하여, 0.2×106의 밀도보다 0.4×106의 밀도로 세포를 플레이팅하는 것이 더 높은 세포 컨플루언시 및 더 높은 흡수 활성을 달성할 수 있는 것과 같이 바람직하다.

세포		 흡수 활성
(pmol/㎎/min)/ 컨플루언스
흡수율
pOATP1B1 pCMV6
FS293 세포, 0.2×106세포/웰 10.5 3.0 3.5
FS293 세포, 0.4××106세포/웰 36.4 1.9 19.2
293-F 세포, 0.2×106세포/웰 20.2 1.5 13.5
293-F 세포, 0.4×106세포/웰 27.4 1.5 18.3
EP 후, 트리판 블루 (trypan blue) 및 혈구계산기 (hemocytometer) 또는 셀로미터 (cellometer)를 이용하여 세포 생존능력을 검사하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포를 사용하는 경우, 세포 EP 후의 생존능력은 EP에 사용된 DNA의 양의 증가에 따라 낮아졌다. 그럼에도 불구하고, pOATP1B1로 형질감염 후의 세포 생존능력은 89% 내지 77%이었으며, 공 벡터로 형질감염 후의 생존능력은 90%였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포를 사용하는 경우, 새롭게 플레이팅된 일시적으로 형질감염된 부착 HEK293 세포 내의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드의 OATP1B1 중재 흡수는 시간-의존적이다. 특히, 흡수 활성 및 흡수율은 EP에 사용된 DNA의 양의 증가에 따라 증가하였다. 그러나, 에스트라디올-17β-글루쿠로니드의 OATP1B1 중재 흡수는 48시간 시점에 비하여 96시간 시점에서 감소하였다. 또한, 도 8에 도시된 바와 같이, 에스트라디올-17β-글루쿠로니드의 노이즈 비율에 대한 신호 (즉, 흡수율)는 EP 48시간 후에 공 벡터에 비하여 OATP1B1로 형질감염된 부착 HEK293 세포에 있어서, DNA의 양 및 분석 배양시간의 증가에 따라 증가하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포를 사용하는 경우, 소규모 EP 장치 및 대규모 EP장치를 이용한 OATP1B1이 일시적으로 발현된 HEK293 세포에서의 에스트라디올-17β-글루쿠로니드 흡수는 흡수 활성 및 노이즈 비율에 대한 신호 (즉, 흡수율) 모두와 일관되었다. 100㎎/㎖ DNA가 실험에 사용되었다.
도 10에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포를 사용한 경우, OATP1B1 흡수 활성이 전형적인 지질 형질감염 제제 (대조구: 리포펙타민 2000, Invitrogen에서 구입가능)와 STX, MaxCyte Inc., Gaithersburg, MD를 이용한 EP 간에 비교되었다. 특히, EP를 이용하여 형질감염된 세포는 지질 형질감염 제제로 형질감염된 세포들에 비하여 노이즈 비율에 대한 확연히 월등한 신호를 나타내었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 부착 HEK293 세포를 이용하는 경우, 새롭게 플레이팅된 EP 형질감염된 세포 및 냉동보존으로부터의 해동 후 세포에서 OATP1B1 흡수 활성이 검출가능하였다.
OATP1B1*1a, OATP1B1*1b, OATP1B3, OAT1 장쇄, OAT1 단쇄, OAT3, OCT1, OCT2, MATE1, MATE2K 또는 대조구 벡터 (pCMV)로 형질감염된 현탁액 배양된 293 세포의 흡수 활성을 냉동보존으로부터의 행동 후 플레이팅 24시간 후에 분석하였다. 간략히, 형질감염된 세포를 EP 및 냉동보존으로부터의 해동 후에 24-웰 폴리-D-리신 코팅된 Corning BiocoatTM 플레이트에 0.4×106 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. SLC 트랜스포터 흡수 활성 및 흡수율을 하기 표 10에 기술된 바와 같이 플레이팅 24시간 후에 나타난 것과 같이 프로브 기질을 이용하여 결정하였다.

트랜스포터
기질
 흡수 활성
(pmol/㎎/min)/
흡수율
SLC 트랜스포터 pCMV6
OATP1B1*1a 2 μM E17bG 41.0 1.03 40
OATP1B1*1b 2 μM E17bG 32.6 0.88 37
OATP1B3 2 μM CCK-8 28.7 0.2 145
OATP1B3 2 μM CCK-8 77.0 0.79 98
OAT1 장쇄 1 μM PAH 13.1 0.3 39
OAT1 단쇄 1 μM PAH 9.7 0.3 29
OAT1 장쇄 3 μM PAH 15.0 0.71 21
OAT3 1 μM E3S 44.7 1.2 38
OAT3 2 μM E3S 60.9 1.62 38
OCT1 30 μM TEA 127.6 5.63 23
OCT2 30 μM TEA 100.5 5.53 18
MATE1
 10 μM 메트포민 71.4 6.0 12
10 μM TEA 46.3 4.3 11
MATE2K
 10 μM 메트포민 33.5 5.2 6.5
10 μM TEA 46.6 6.1 7.6
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 세포는 각각 10을 넘는 흡수율을 갖는 그들의 특정 원형 기질에 대한 강한 흡수 활성을 나타내었다. 특히, 5를 넘는 흡수율은 성공적인 과정을 나타낸다.
표 11에 나타낸 바와 같이, 재조합 냉동보존 세포에 대한 해동 후 생존능력이 90%를 넘는 것으로 결정되었다.
세포 해동 후 생존능력
OATP1B1*1a 94.2%
OATP1B1*1b 96.1%
OATP1B3 95.5%
OAT1 long 93.5%
OAT3 93.8%
OCT1 95.1%
OCT2 96.1%
대조구 벡터 (pCMV)와 같이 이러한 재조합 세포의 각각을 (냉동보존 후) 플레이팅 24시간 후에 검사하였다. 플레이팅 24시간 후 이러한 세포 각각에 대한 컨플루언시는 하기 표 12에 나타난 바와 같이 85% 이상이었다.
형질감염된 세포 24-시간 컨플루언시
OATP1B1*1a 90%
OATP1B1*1b 95%
OATP1B3 95%
OAT1 long 90%
OAT3 90%
Vector 95%
OCT1 95%
OCT2 85%
도 12에 도시된 바와 같이, 8개의 냉동보존된 재조합 세포 각각은 해동, 폴리-D-리신 플레이트 상에 플레이팅 및 플레이팅 후 24시간 동안 배양후, 합류하는 (confluent) 단층을 형성하였다.
도 13-19 및 표 13-14에 나타난 바와 같이, 트랜스포터 단백질을 발현하는 냉동보존된 재조합 세포에서 동역학적 및 억제 프로파일을 보고된 값으로 검사하였다. 특히, 도 13a-13c에 기술된 바와 같이, OAT1를 발현하는 재조합 세포에 의한 PAH 흡수의 동역학 및 그의 프로베네시드의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 14a-14c에 도시된 바와 같이, OAT3을 발현하는 재조합 세포에 의한 E3S 흡수의 동역학 및 그의 프로베네시드의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 15a-15f에 도시된 바와 같이, OAT1을 발현하는 재조합 세포에 의한 TEA 및 메트포민 흡수의 동역학 및 그의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 16a-16e에 도시된 바와 같이, OAT2를 발현하는 재조합 세포에 의한 TEA 및 메트포민 흡수의 동역학 및 그의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 17a-17f에 도시된 바와 같이, OATP1B1*1a를 발현하는 재조합 세포에 의한 E17βG, E3S 및 로수바스타틴 흡수의 동역학 및 시클로스포린 A에 의한 E17βG 흡수의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 18a-18e에 도시된 바와 같이, OATP1B1*1b를 발현하는 재조합 세포에 의한 E17βG, E3S 및 로수바스타틴 흡수의 동역학 및 시클로스포린 A에 의한 E17βG 흡수의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다. 도 19a-19e에 도시된 바와 같이, OATP1B3를 발현하는 재조합 세포에 의한 CCK-8, E17βG, 및 로수바스타틴 흡수의 동역학 및 시클로스포린 A에 의한 CCK-8 흡수의 억제 프로파일이 보고된 값과 일치한다.
SLC 트랜스포터 세포 문헌보고
트랜스포터 기질 Km (μM) Km (μM) 테스트 시스템 문헌
OATP1B1*1a E17βG 6.2 6.3 HEK293 세포 P. Sharma, et al. Xenobiotica 40:24. 2010
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OAT1 PAH 87.3 28 HEK293 세포 Ueo H, et al., Biochem Pharmacol., 2005
OAT3 E3S 4.0 6.3 HEK293 세포 Ueo H, et al., Biochem Pharmacol., 2005
Corning® SLC TransportoCellsTM 문헌보고
트랜스포터 기질 억제제 IC50
(μM)		 IC50
(μM)		 테스트 시스템 문헌
OATP1B1*1a E17βG 시클로스포린 A 0.8 0.7 HEK293 세포 MG Soars, et al., Drug Metab Dispos, 2012
OATP1B3 CCK-8 시클로스포린 A 0.7 0.6 HEK293 세포 Bednarczyk D. Anal Biochem. 2010
OAT1 PAH 프로베네시드 7.2 6.5 CHO Ho ES, et al., J Am Soc Nephrol., 2001
OAT3 E3S 프로베네시드 8.8 9 S2 Takeda M, et al., Eur J Pharmacol., 2001
OCT1 메트포민 시메티딘 230 104 HEK293 세포 Sumito I, et al., JPET, 2011
OCT2 메트포민 시메티딘 195 124 HEK293 세포 Sumito I, et al., JPET, 2011
통상의 기술자에게 본 발명의 넓은 발명적 개념을 벗어나지 않은 채 전술된 구현 예에 다양한 변경이 가해질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현 예에 한정되지 않으며, 하기 특허청구범위에 한정된 바와 같은 본 발명의 요지 및 범위에 포함되는 변경을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

Claims (6)

  1. 약물 트랜스포터 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 일시적으로 과발현된 유전자를 포함하는 냉동보존(cryopreserved) 재조합 세포로서, 여기서 약물 트랜스포터 단백질의 활성은 냉동보존으로부터의 해동 후의 냉동보존된 재조합 세포의 집단에서 검출가능하고, 냉동보존된 재조합 세포는 전기천공법 (electroporation)을 포함하는 방법에 의해 하나 이상의 유전자로 일시적으로 형질감염되고, 및 상기 하나 이상의 유전자는 OATP1B3이고, 상기 세포는 HEK293인, 냉동보존 재조합 세포.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자는 인간; 또는 생쥐(mouse), 래트, 기니피그, 개, 및 원숭이로부터 선택되는 동물 종으로부터 개별적으로 유래되는, 냉동보존 재조합 세포.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 단백질의 활성이 냉동보존으로부터의 해동 후의 플레이팅 24시간 후에 상기 세포의 집단에서 검출가능한, 냉동보존 재조합 세포.
  4. 약물 트랜스포터 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자로 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계; 및 형질감염의 48시간 이내에 일시적으로 형질감염된 재조합 세포를 냉동보존하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 일시적 형질감염 단계는 전기천공법을 포함하며, 상기 하나 이상의 유전자는 OATP1B3이고, 상기 세포는 HEK293인, 약물 트랜스포터 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 일시적으로 과발현하는 일시적으로 형질감염된 재조합 세포의 제조방법.
  5. 청구항 4에서,
    일시적으로 형질감염된 재조합 세포는 형질감염 후 30분 내지 24시간 이내에 냉동보존되는, 일시적으로 형질감염된 재조합 세포의 제조방법.
  6. 청구항 4 또는 5의 제조방법에 따라 제조되는 냉동보존된 일시적으로 형질감염된 재조합 세포.
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