JP2002112769A - 臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター - Google Patents
臓器感染用トランスポーター強制発現ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 各種臓器が本来有していない物質輸送機能を
該臓器に付与し、該臓器への薬剤、栄養物質等の有用物
質の取込み輸送を促進したり、あるいは該臓器から排泄
物質等の排出輸送を促進するために用いられる臓器感染
用トランスポーター強制発現ベクターや、かかるベクタ
ーを用いる各種臓器における物質輸送を促進する方法を
提供すること。 【解決手段】 インビトロでヒトやマウスなどの多くの
種の動物に、経口により直接的に遺伝子を生体に発現さ
せることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器におけ
る遺伝子発現が可能で、かつ一過性に発現させることが
できるアデノウイルスベクターを、ＯＡＴ１やＰＥＰＴ
１等のトランスポーター遺伝子の発現用ベクターとして
用い、小腸のモデル細胞を形質転換し、このモデル細胞
を使用して薬剤の輸送について検討したところ、薬剤の
排出輸送能が促進されていた。
該臓器に付与し、該臓器への薬剤、栄養物質等の有用物
質の取込み輸送を促進したり、あるいは該臓器から排泄
物質等の排出輸送を促進するために用いられる臓器感染
用トランスポーター強制発現ベクターや、かかるベクタ
ーを用いる各種臓器における物質輸送を促進する方法を
提供すること。 【解決手段】 インビトロでヒトやマウスなどの多くの
種の動物に、経口により直接的に遺伝子を生体に発現さ
せることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器におけ
る遺伝子発現が可能で、かつ一過性に発現させることが
できるアデノウイルスベクターを、ＯＡＴ１やＰＥＰＴ
１等のトランスポーター遺伝子の発現用ベクターとして
用い、小腸のモデル細胞を形質転換し、このモデル細胞
を使用して薬剤の輸送について検討したところ、薬剤の
排出輸送能が促進されていた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トランスポーター
遺伝子を含む臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ターやその使用、より詳しくは、トランスポーター遺伝
子が本来発現していない臓器に、該トランスポーター遺
伝子を強制発現させるために用いられる臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクターや、かかる臓器感染用ト
ランスポーター強制発現ベクターを用いて臓器における
物質輸送を促進する方法に関する。
遺伝子を含む臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ターやその使用、より詳しくは、トランスポーター遺伝
子が本来発現していない臓器に、該トランスポーター遺
伝子を強制発現させるために用いられる臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクターや、かかる臓器感染用ト
ランスポーター強制発現ベクターを用いて臓器における
物質輸送を促進する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞内外の物質輸送を行う膜タンパク質
等はトランスポーターと呼ばれ、脂質二重膜中に埋め込
まれているトランスポーターに特定の分子が結合する
と、コンフォメーションが変化して物質が取込みあるい
は排出輸送されることが知られている。近年、かかるト
ランスポーター、例えば有機アニオン性物質を輸送する
ＯＡＴ１等の有機アニオントランスポーター、有機カチ
オン性物質を輸送するＯＣＴ１等の有機カチオントラン
スポーター、ペプチド性物質を輸送するＰＥＰＴ１等の
ペプチドトランスポーターなどの遺伝子が相次いで単離
・同定されている。これらトランスポーター遺伝子は、
全身の正常組織・臓器に偏在しているものもあるが、腎
臓、肝臓、脳などといった特定の組織・臓器に局在する
ものも知られている。例えば、生体異物や薬物の代謝お
よび体外排出に関して重要な役割を果たしている肝臓や
腎臓の肝細胞や尿細管細胞に局在するトランスポーター
により、有機アニオン性物質が側底膜を介して肝臓や腎
臓中に取り込まれたり、また細胞内代謝により産生され
た有機アニオン性物質が排出される。表１〜３に、従来
報告されているトランスポーターの種類、名称、遺伝子
バンクにおけるアクセッションナンバー、報告文献名、
組織分布、輸送する基質の一覧表を示す。
等はトランスポーターと呼ばれ、脂質二重膜中に埋め込
まれているトランスポーターに特定の分子が結合する
と、コンフォメーションが変化して物質が取込みあるい
は排出輸送されることが知られている。近年、かかるト
ランスポーター、例えば有機アニオン性物質を輸送する
ＯＡＴ１等の有機アニオントランスポーター、有機カチ
オン性物質を輸送するＯＣＴ１等の有機カチオントラン
スポーター、ペプチド性物質を輸送するＰＥＰＴ１等の
ペプチドトランスポーターなどの遺伝子が相次いで単離
・同定されている。これらトランスポーター遺伝子は、
全身の正常組織・臓器に偏在しているものもあるが、腎
臓、肝臓、脳などといった特定の組織・臓器に局在する
ものも知られている。例えば、生体異物や薬物の代謝お
よび体外排出に関して重要な役割を果たしている肝臓や
腎臓の肝細胞や尿細管細胞に局在するトランスポーター
により、有機アニオン性物質が側底膜を介して肝臓や腎
臓中に取り込まれたり、また細胞内代謝により産生され
た有機アニオン性物質が排出される。表１〜３に、従来
報告されているトランスポーターの種類、名称、遺伝子
バンクにおけるアクセッションナンバー、報告文献名、
組織分布、輸送する基質の一覧表を示す。
【０００３】
【表１】
【表２】
【表３】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】医薬品の投与形態の中
でも、経口投与は簡便さ、苦痛の少なさなどの点から有
用であり、経口で効果の得られる医薬品を開発すること
は重要である。経口で用いられた薬物が効果を発揮する
ためには、小腸での吸収性は大切な因子のうちの１つで
あるが、いくつかの薬物においては小腸から吸収されに
くいものがある。そこで難吸収性の薬物の吸収を改善す
る方法の一つとして、トランスポーターを利用した薬物
のドラッグデリバリーシステムが期待できる。例えば、
β-ラクタム抗生物質のうち経口投与可能な薬剤である
cephradine, cephalexin, cefixime, ceftibuten など
は、小腸の刷子縁膜においてオリゴペプチドの有効な吸
収に関与しているペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１
(Fei et al., Expression cloning of mammalian proto
n-coupled oligopeptide transporter. Nature, 368: 5
63-566 (1994))を介して輸送されることが知られている
(Okano et al., H+ coupled uphill transport of amin
ocephalosporins via the dipeptide transport system
In rabbit Intestinal brush-border membranes. J. B
iol. Chem., 261 : 14130-14134 (1986)、Tsuji et a
l., H+ gradient-dependent and carrier-mediated tra
nsport of cefixime, a new Cephalosporin antibiotic
s, acrossbrush-border membrane vesicles from rat s
mall Intestine. J. Pharmacol.Exp. Ther., 241 : 594
-601 (1987)、Takahashi et al., Interaction of beta
-lactam antibiotics with H+ / peptide cotrasporter
s in rat renal brush-border membranes. J. Phamaco
l. Exp. Ther., 286 : 1037-1042 (1998)、Ganapathy e
t al., differential recognition of beta-lactam ant
ibiotics by intestinal and renal peptide transport
ers, PEPT1 and PEPT2. J. Biol. Chem., 270 : 25672-
25677 (1995))。しかし、一部のβ-ラクタム系抗生物質
は消化管で吸収されにくいため注射剤として投与されて
いる。例えば、これら難吸収性のβ-ラクタム系抗生物
質を経口投与できるようにするため、トランスポーター
を小腸に発現させると、消化管吸収の改善をはかること
が期待できる。また、発現させたトランスポーターの機
能を解析することにより、どの程度吸収過程にトランス
ポーターが寄与しているかを知ることもできる。
でも、経口投与は簡便さ、苦痛の少なさなどの点から有
用であり、経口で効果の得られる医薬品を開発すること
は重要である。経口で用いられた薬物が効果を発揮する
ためには、小腸での吸収性は大切な因子のうちの１つで
あるが、いくつかの薬物においては小腸から吸収されに
くいものがある。そこで難吸収性の薬物の吸収を改善す
る方法の一つとして、トランスポーターを利用した薬物
のドラッグデリバリーシステムが期待できる。例えば、
β-ラクタム抗生物質のうち経口投与可能な薬剤である
cephradine, cephalexin, cefixime, ceftibuten など
は、小腸の刷子縁膜においてオリゴペプチドの有効な吸
収に関与しているペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１
(Fei et al., Expression cloning of mammalian proto
n-coupled oligopeptide transporter. Nature, 368: 5
63-566 (1994))を介して輸送されることが知られている
(Okano et al., H+ coupled uphill transport of amin
ocephalosporins via the dipeptide transport system
In rabbit Intestinal brush-border membranes. J. B
iol. Chem., 261 : 14130-14134 (1986)、Tsuji et a
l., H+ gradient-dependent and carrier-mediated tra
nsport of cefixime, a new Cephalosporin antibiotic
s, acrossbrush-border membrane vesicles from rat s
mall Intestine. J. Pharmacol.Exp. Ther., 241 : 594
-601 (1987)、Takahashi et al., Interaction of beta
-lactam antibiotics with H+ / peptide cotrasporter
s in rat renal brush-border membranes. J. Phamaco
l. Exp. Ther., 286 : 1037-1042 (1998)、Ganapathy e
t al., differential recognition of beta-lactam ant
ibiotics by intestinal and renal peptide transport
ers, PEPT1 and PEPT2. J. Biol. Chem., 270 : 25672-
25677 (1995))。しかし、一部のβ-ラクタム系抗生物質
は消化管で吸収されにくいため注射剤として投与されて
いる。例えば、これら難吸収性のβ-ラクタム系抗生物
質を経口投与できるようにするため、トランスポーター
を小腸に発現させると、消化管吸収の改善をはかること
が期待できる。また、発現させたトランスポーターの機
能を解析することにより、どの程度吸収過程にトランス
ポーターが寄与しているかを知ることもできる。
【０００５】β-ラクタム系抗生物質を輸送する代表的
なトランスポーターとして、腎に発現する有機アニオン
トランスポーター（ＯＡＴ１）が知られている(Tsuji e
t al., In vivo evidence for carrier-mediated uptak
e of beta-lactam antibiotics through organic anion
transport systems In rat kidney and liver. J. Pha
macol. Exp. Ther., 253 : 315-320 (1990)、Jariyawat
et al., The interraction and transport of beta-la
ctam antibiotics with the cloned rat renalorganic
anion transporter 1. J. Phamacol. Exp. Ther., 290
: 672-677 (1999))。ＯＡＴ１は１９９７年、ラット腎
より Sekine らにより単離されている(Sekine et al.,
Expression cloning and characterization of a novel
multispecific Organic Anion Transporter. J. Biol.
Chem., 272 : 18526-18529 (1997))。ＯＡＴ１は外来
性遺伝子発現系であるアフリカツメガエル卵母細胞(Xen
opus laevis oocytes)に発現させるとp-aminohippurat
e, cyclic AMP, cGMP, prostaglandin E2, urate, α-k
etoglutarate, methotrexateなどを輸送し、様々な有機
アニオンにより阻害されることが示されている(Sekine
et al., Expression cloning and characterization of
a novel multispecific Organic Anion Transporter.
J. Biol. Chem., 272 : 18526-18529 (1997))。ＯＡＴ
１は腎において近位尿細管の基底膜側に発現しており、
基質認識性が広く腎からのアニオンの薬物の排出に中心
的役割を果たしていると考えられている(Uwai et al.,
Functional characterization of the rat multispesif
ic organic anion transporter OAT1 mediating basola
teral uptake of anionic drugs in kidney. FEBS Lett
er, 438 : 321-324 (1998)、Tojo et al., Immunohisto
chemical localization ofmultispecific renal organi
c anion transporter 1 In rat kidney. J. Am. Soc. N
ephrol., 10 : 464-471(1999))。そこで、経口投与可能
なβ-ラクタム系抗生物質の輸送が示唆されているＰＥ
ＰＴ１と基質認識性が異なり、本来小腸には発現してい
ない腎トランスポーターＯＡＴ１を小腸に発現させるこ
とにより、難吸収性のβ-ラクタム系抗生物質吸収促進
が期待できる。
なトランスポーターとして、腎に発現する有機アニオン
トランスポーター（ＯＡＴ１）が知られている(Tsuji e
t al., In vivo evidence for carrier-mediated uptak
e of beta-lactam antibiotics through organic anion
transport systems In rat kidney and liver. J. Pha
macol. Exp. Ther., 253 : 315-320 (1990)、Jariyawat
et al., The interraction and transport of beta-la
ctam antibiotics with the cloned rat renalorganic
anion transporter 1. J. Phamacol. Exp. Ther., 290
: 672-677 (1999))。ＯＡＴ１は１９９７年、ラット腎
より Sekine らにより単離されている(Sekine et al.,
Expression cloning and characterization of a novel
multispecific Organic Anion Transporter. J. Biol.
Chem., 272 : 18526-18529 (1997))。ＯＡＴ１は外来
性遺伝子発現系であるアフリカツメガエル卵母細胞(Xen
opus laevis oocytes)に発現させるとp-aminohippurat
e, cyclic AMP, cGMP, prostaglandin E2, urate, α-k
etoglutarate, methotrexateなどを輸送し、様々な有機
アニオンにより阻害されることが示されている(Sekine
et al., Expression cloning and characterization of
a novel multispecific Organic Anion Transporter.
J. Biol. Chem., 272 : 18526-18529 (1997))。ＯＡＴ
１は腎において近位尿細管の基底膜側に発現しており、
基質認識性が広く腎からのアニオンの薬物の排出に中心
的役割を果たしていると考えられている(Uwai et al.,
Functional characterization of the rat multispesif
ic organic anion transporter OAT1 mediating basola
teral uptake of anionic drugs in kidney. FEBS Lett
er, 438 : 321-324 (1998)、Tojo et al., Immunohisto
chemical localization ofmultispecific renal organi
c anion transporter 1 In rat kidney. J. Am. Soc. N
ephrol., 10 : 464-471(1999))。そこで、経口投与可能
なβ-ラクタム系抗生物質の輸送が示唆されているＰＥ
ＰＴ１と基質認識性が異なり、本来小腸には発現してい
ない腎トランスポーターＯＡＴ１を小腸に発現させるこ
とにより、難吸収性のβ-ラクタム系抗生物質吸収促進
が期待できる。
【０００６】また、ＯＡＴ１を小腸に発現させた場合で
あっても、取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の
輸送に作用するかが問題となる。トランスポーターが細
胞膜上に発現するときの sorting のメカニズムについ
てはよく分かっていないが、腎においてＯＡＴ１が基底
膜側に発現し有機アニオン性物質の排出方向の輸送を担
っているとすると、小腸においても同様に基底膜側に発
現し管腔側に排出するという取込み方向とは逆の輸送を
行うという可能性もある。しかし、刷子縁膜側でＯＡＴ
１が発現したなら、ＯＡＴ１は有機アニオンとジカルボ
ン酸の交換輸送体であるため、小腸上皮細胞内glutarat
eの濃度が高いと、glutarateとの交換輸送が起こり有機
アニオン性物質が取込み方向に働く可能性も考えられ
る。いずれにしても、ＯＡＴ１遺伝子が本来発現してい
ない小腸にＯＡＴ１を効率よく発現させるＯＡＴ１遺伝
子のデリバリーシステムを利用すると、小腸における有
機アニオン性物質の吸収方向あるいは排出方向の輸送活
性を付与することが期待できる。
あっても、取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の
輸送に作用するかが問題となる。トランスポーターが細
胞膜上に発現するときの sorting のメカニズムについ
てはよく分かっていないが、腎においてＯＡＴ１が基底
膜側に発現し有機アニオン性物質の排出方向の輸送を担
っているとすると、小腸においても同様に基底膜側に発
現し管腔側に排出するという取込み方向とは逆の輸送を
行うという可能性もある。しかし、刷子縁膜側でＯＡＴ
１が発現したなら、ＯＡＴ１は有機アニオンとジカルボ
ン酸の交換輸送体であるため、小腸上皮細胞内glutarat
eの濃度が高いと、glutarateとの交換輸送が起こり有機
アニオン性物質が取込み方向に働く可能性も考えられ
る。いずれにしても、ＯＡＴ１遺伝子が本来発現してい
ない小腸にＯＡＴ１を効率よく発現させるＯＡＴ１遺伝
子のデリバリーシステムを利用すると、小腸における有
機アニオン性物質の吸収方向あるいは排出方向の輸送活
性を付与することが期待できる。
【０００７】脳は血液脳関門を形成する毛細血管内皮細
胞を介して、脳内不要代謝産物の体循環中へ排除・生体
異物の進入遮断を行い脳内と体循環との間の物質交換を
厳密に制御しており、このことが中枢に標的部位を持つ
薬物の脳送達を非常に困難なものとしている。一方で血
液脳関門は、中枢機能の発現／維持に必要な物質を積極
的に体循環系から摂取する機能も同時に併せ持つ。この
ような血液脳関門の物質交換におけるダイナッミックイ
ンターフェース機能は、そこに発現するトランスポータ
ーによって担われていることが近年明らかにされつつあ
る。トランスポーターの中には幅広い基質認識特性を持
つものが存在し、本来生体異物である薬物をも誤認識し
て輸送することが知られていることから、送達したい薬
物のトランスポーターを血液脳関門に発現させることに
より、薬物の脳へのターゲティングが可能となることが
期待できる。
胞を介して、脳内不要代謝産物の体循環中へ排除・生体
異物の進入遮断を行い脳内と体循環との間の物質交換を
厳密に制御しており、このことが中枢に標的部位を持つ
薬物の脳送達を非常に困難なものとしている。一方で血
液脳関門は、中枢機能の発現／維持に必要な物質を積極
的に体循環系から摂取する機能も同時に併せ持つ。この
ような血液脳関門の物質交換におけるダイナッミックイ
ンターフェース機能は、そこに発現するトランスポータ
ーによって担われていることが近年明らかにされつつあ
る。トランスポーターの中には幅広い基質認識特性を持
つものが存在し、本来生体異物である薬物をも誤認識し
て輸送することが知られていることから、送達したい薬
物のトランスポーターを血液脳関門に発現させることに
より、薬物の脳へのターゲティングが可能となることが
期待できる。
【０００８】本発明の課題は、各種臓器が本来有してい
ない物質輸送機能を該臓器に付与し、該臓器への薬剤、
栄養物質等の有用物質の取込み輸送を促進したり、ある
いは該臓器から排泄物質等の排出輸送を促進するために
用いられる臓器感染用トランスポーター強制発現ベクタ
ーや、かかる臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ターを用いる各種臓器における物質輸送を促進する方法
を提供することにある。
ない物質輸送機能を該臓器に付与し、該臓器への薬剤、
栄養物質等の有用物質の取込み輸送を促進したり、ある
いは該臓器から排泄物質等の排出輸送を促進するために
用いられる臓器感染用トランスポーター強制発現ベクタ
ーや、かかる臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ターを用いる各種臓器における物質輸送を促進する方法
を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、目的とするトランスポー
ター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トラン
スポーター遺伝子を強制的に発現させることにより、該
臓器における有用物質の取込み輸送能や排泄物質等の排
出輸送能を促進・付与することができるのではないかと
の知見を得、インビトロでヒトやマウスなどの多くの種
の動物に、経口により細胞株を樹立することなく直接的
に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細
胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能で、かつ一
過性に発現させることができるアデノウイルスベクター
を、トランスポーターＯＡＴ１遺伝子発現用ベクターと
して用い、ヒト大腸癌由来の細胞株を形質転換し、この
大腸細胞株を使用して薬剤の輸送実験を行い、薬剤の排
出輸送能が促進されることを確認し、本発明を完成する
に至った。
を解決するために鋭意研究し、目的とするトランスポー
ター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トラン
スポーター遺伝子を強制的に発現させることにより、該
臓器における有用物質の取込み輸送能や排泄物質等の排
出輸送能を促進・付与することができるのではないかと
の知見を得、インビトロでヒトやマウスなどの多くの種
の動物に、経口により細胞株を樹立することなく直接的
に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細
胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能で、かつ一
過性に発現させることができるアデノウイルスベクター
を、トランスポーターＯＡＴ１遺伝子発現用ベクターと
して用い、ヒト大腸癌由来の細胞株を形質転換し、この
大腸細胞株を使用して薬剤の輸送実験を行い、薬剤の排
出輸送能が促進されることを確認し、本発明を完成する
に至った。
【００１０】すなわち本発明は、目的とするトランスポ
ーター遺伝子を含む発現ベクターであって、該目的トラ
ンスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目
的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用い
られることを特徴とする臓器感染用トランスポーター強
制発現ベクター（請求項１）や、トランスポーター遺伝
子が有機アニオントランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポーター
強制発現ベクター（請求項２）や、トランスポーター遺
伝子が有機カチオントランスポーター遺伝子であること
を特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポータ
ー強制発現ベクター（請求項３）や、トランスポーター
遺伝子がペプチドトランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポーター
強制発現ベクター（請求項４）や、トランスポーター遺
伝子を含む発現ベクターが、トランスポーター遺伝子と
マーカー遺伝子を含む発現ベクターであることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか記載の臓器感染用トランス
ポーター強制発現ベクター（請求項５）や、マーカー遺
伝子が、蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡであるこ
とを特徴とする請求項５記載の臓器感染用トランスポー
ター強制発現ベクター（請求項６）や、発現ベクター
が、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請
求項１〜６のいずれか記載の臓器感染用トランスポータ
ー強制発現ベクター（請求項７）や、トランスポーター
遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特
徴とする請求項１〜７のいずれか記載の臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクター（請求項８）や、トラン
スポーター遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であ
ることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の臓器
感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項９）
や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器
が血液脳関門であることを特徴とする請求項１〜７のい
ずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ター（請求項１０）に関する。
ーター遺伝子を含む発現ベクターであって、該目的トラ
ンスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目
的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用い
られることを特徴とする臓器感染用トランスポーター強
制発現ベクター（請求項１）や、トランスポーター遺伝
子が有機アニオントランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポーター
強制発現ベクター（請求項２）や、トランスポーター遺
伝子が有機カチオントランスポーター遺伝子であること
を特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポータ
ー強制発現ベクター（請求項３）や、トランスポーター
遺伝子がペプチドトランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１記載の臓器感染用トランスポーター
強制発現ベクター（請求項４）や、トランスポーター遺
伝子を含む発現ベクターが、トランスポーター遺伝子と
マーカー遺伝子を含む発現ベクターであることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか記載の臓器感染用トランス
ポーター強制発現ベクター（請求項５）や、マーカー遺
伝子が、蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡであるこ
とを特徴とする請求項５記載の臓器感染用トランスポー
ター強制発現ベクター（請求項６）や、発現ベクター
が、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請
求項１〜６のいずれか記載の臓器感染用トランスポータ
ー強制発現ベクター（請求項７）や、トランスポーター
遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特
徴とする請求項１〜７のいずれか記載の臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクター（請求項８）や、トラン
スポーター遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であ
ることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の臓器
感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項９）
や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器
が血液脳関門であることを特徴とする請求項１〜７のい
ずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベク
ター（請求項１０）に関する。
【００１１】また本発明は、目的とするトランスポータ
ー遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランスポータ
ー遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させるこ
とを特徴とする臓器における物質輸送能を付与・促進す
る方法（請求項１１）や、トランスポーター遺伝子が有
機アニオントランスポーター遺伝子であることを特徴と
する請求項１１記載の臓器における物質輸送能を付与・
促進する方法（請求項１２）や、トランスポーター遺伝
子が有機カチオントランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１１記載の臓器における物質輸送能を
付与・促進する方法（請求項１３）や、トランスポータ
ー遺伝子がペプチドトランスポーター遺伝子であること
を特徴とする請求項１１記載の臓器における物質輸送能
を付与・促進する方法（請求項１４）や、トランスポー
ター遺伝子を含む発現ベクターが、トランスポーター遺
伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターであることを
特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載の臓器にお
ける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１５）
や、マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の臓器に
おける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１６）
や、発現ベクターが、アデノウイルスベクターであるこ
とを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載の臓器
における物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１
７）や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない
臓器が小腸であることを特徴とする請求項１１〜１７の
いずれか記載の臓器における物質輸送能を付与・促進す
る方法（請求項１８）や、トランスポーター遺伝子が本
来発現していない臓器が大腸であることを特徴とする請
求項１１〜１７のいずれか記載の臓器における物質輸送
能を付与・促進する方法（請求項１９）や、トランスポ
ーター遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門で
あることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載
の臓器における物質輸送能を付与・促進する方法（請求
項２０）や、臓器における物質輸送が、該臓器における
物質の取込み制御輸送であることを特徴とする請求項１
１〜２０のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付
与・促進する方法（請求項２１）や、臓器における物質
輸送が、該臓器における物質の排出制御輸送であること
を特徴とする請求項１１〜２０のいずれか記載の臓器に
おける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項２２）
や、請求項１〜１０のいずれか記載の臓器感染用トラン
スポーター強制発現ベクターを用いることにより、物質
輸送能が付与・促進された人工臓器（請求項２３）に関
する。
ー遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランスポータ
ー遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させるこ
とを特徴とする臓器における物質輸送能を付与・促進す
る方法（請求項１１）や、トランスポーター遺伝子が有
機アニオントランスポーター遺伝子であることを特徴と
する請求項１１記載の臓器における物質輸送能を付与・
促進する方法（請求項１２）や、トランスポーター遺伝
子が有機カチオントランスポーター遺伝子であることを
特徴とする請求項１１記載の臓器における物質輸送能を
付与・促進する方法（請求項１３）や、トランスポータ
ー遺伝子がペプチドトランスポーター遺伝子であること
を特徴とする請求項１１記載の臓器における物質輸送能
を付与・促進する方法（請求項１４）や、トランスポー
ター遺伝子を含む発現ベクターが、トランスポーター遺
伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターであることを
特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載の臓器にお
ける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１５）
や、マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の臓器に
おける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１６）
や、発現ベクターが、アデノウイルスベクターであるこ
とを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載の臓器
における物質輸送能を付与・促進する方法（請求項１
７）や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない
臓器が小腸であることを特徴とする請求項１１〜１７の
いずれか記載の臓器における物質輸送能を付与・促進す
る方法（請求項１８）や、トランスポーター遺伝子が本
来発現していない臓器が大腸であることを特徴とする請
求項１１〜１７のいずれか記載の臓器における物質輸送
能を付与・促進する方法（請求項１９）や、トランスポ
ーター遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門で
あることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか記載
の臓器における物質輸送能を付与・促進する方法（請求
項２０）や、臓器における物質輸送が、該臓器における
物質の取込み制御輸送であることを特徴とする請求項１
１〜２０のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付
与・促進する方法（請求項２１）や、臓器における物質
輸送が、該臓器における物質の排出制御輸送であること
を特徴とする請求項１１〜２０のいずれか記載の臓器に
おける物質輸送能を付与・促進する方法（請求項２２）
や、請求項１〜１０のいずれか記載の臓器感染用トラン
スポーター強制発現ベクターを用いることにより、物質
輸送能が付与・促進された人工臓器（請求項２３）に関
する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の臓器感染用トランスポー
ター強制発現ベクターとしては、目的とするトランスポ
ーター遺伝子を含む発現ベクターであって、該目的トラ
ンスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目
的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用い
られるベクターであれば特に制限されるものではなく、
また本発明の臓器における物質輸送能を付与・促進する
方法としては、目的とするトランスポーター遺伝子を含
む発現ベクターを、該目的トランスポーター遺伝子が本
来発現していない臓器に強制発現させる方法であれば特
に制限されるものではなく、ここで臓器とは体内に存す
る脳（血液脳関門および脳実質）、腎臓、肝臓、心臓、
胃、小腸、大腸、肺臓、膵臓、卵巣、子宮、胎盤、骨格
筋、甲状腺等の器官・組織等を意味する。
ター強制発現ベクターとしては、目的とするトランスポ
ーター遺伝子を含む発現ベクターであって、該目的トラ
ンスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目
的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用い
られるベクターであれば特に制限されるものではなく、
また本発明の臓器における物質輸送能を付与・促進する
方法としては、目的とするトランスポーター遺伝子を含
む発現ベクターを、該目的トランスポーター遺伝子が本
来発現していない臓器に強制発現させる方法であれば特
に制限されるものではなく、ここで臓器とは体内に存す
る脳（血液脳関門および脳実質）、腎臓、肝臓、心臓、
胃、小腸、大腸、肺臓、膵臓、卵巣、子宮、胎盤、骨格
筋、甲状腺等の器官・組織等を意味する。
【００１３】本発明において用いられるトランスポータ
ー遺伝子としては、物質輸送能を担うトランスポーター
タンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限される
ものではなく、例えば前記表１に記載されている、ＯＡ
Ｔ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴＰ−Ａ、
ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ
−Ｅ、ＰＧＴ、ＯＡＴ−Ｋ１、Ｎｐｔ１、ＭＣＴ１、Ａ
Ｅ２等をコードする有機アニオントランスポーター遺伝
子や、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、Ｏ
ＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等をコードする有機カチオントラ
ンスポーター遺伝子や、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等をコ
ードするペプチドトランスポーター遺伝子や、アミノ酸
トランスポーター、ＭＤＲ１、ＭＲＰ２等をコードする
ＡＢＣトランスポーター遺伝子を挙げることができる。
これらの中でも、化学構造の異なる多くの有機アニオン
を輸送することのできるトランスポーターであり、種々
のアニオン性薬物の輸送も行っており、その発現が腎特
異的で、腎以外では脳に極めてわずかな発現をみるのみ
であるＯＡＴ１を好適に例示することができる。これら
トランスポーター遺伝子の由来としては特に制限される
ものではなく、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどを挙
げることができる。
ー遺伝子としては、物質輸送能を担うトランスポーター
タンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限される
ものではなく、例えば前記表１に記載されている、ＯＡ
Ｔ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴＰ−Ａ、
ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ
−Ｅ、ＰＧＴ、ＯＡＴ−Ｋ１、Ｎｐｔ１、ＭＣＴ１、Ａ
Ｅ２等をコードする有機アニオントランスポーター遺伝
子や、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、Ｏ
ＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等をコードする有機カチオントラ
ンスポーター遺伝子や、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等をコ
ードするペプチドトランスポーター遺伝子や、アミノ酸
トランスポーター、ＭＤＲ１、ＭＲＰ２等をコードする
ＡＢＣトランスポーター遺伝子を挙げることができる。
これらの中でも、化学構造の異なる多くの有機アニオン
を輸送することのできるトランスポーターであり、種々
のアニオン性薬物の輸送も行っており、その発現が腎特
異的で、腎以外では脳に極めてわずかな発現をみるのみ
であるＯＡＴ１を好適に例示することができる。これら
トランスポーター遺伝子の由来としては特に制限される
ものではなく、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどを挙
げることができる。
【００１４】上記本発明におけるトランスポーター遺伝
子を含む発現ベクターには、トランスポーター遺伝子に
加えてマーカー遺伝子を含ませることができ、トランス
ポーター遺伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターを
用いることにより、各種臓器に本発明の臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクターが感染したことを簡便に
確かめることができる。かかるマーカー遺伝子として
は、各種臓器に上記臓器感染用トランスポーター強制発
現ベクターが感染したことを簡便に確かめることができ
るものであればどのようなものでもよく、例えば、β−
ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素をコード
するＤＮＡや、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡや、
ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパ
ク質をコードするＤＮＡや、ネオマイシン耐性遺伝子、
ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎ
ｅｏRの融合遺伝子（β−ｇｅｏ）等の選択マーカー遺
伝子などを具体的に挙げることができるが、これらの中
でもＧＦＰ遺伝子等の蛍光性タンパク質をコードするＤ
ＮＡが感染確認の容易さからして好ましい。かかるＧＦ
Ｐには、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）、ＥＹＦＰ（Enhanc
ed Yellow Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ(enhanced
CYAN fluorescent protein）（青色）、ＤｓＲｅｄ
（赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラ
ベルを行うこともできる。
子を含む発現ベクターには、トランスポーター遺伝子に
加えてマーカー遺伝子を含ませることができ、トランス
ポーター遺伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターを
用いることにより、各種臓器に本発明の臓器感染用トラ
ンスポーター強制発現ベクターが感染したことを簡便に
確かめることができる。かかるマーカー遺伝子として
は、各種臓器に上記臓器感染用トランスポーター強制発
現ベクターが感染したことを簡便に確かめることができ
るものであればどのようなものでもよく、例えば、β−
ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素をコード
するＤＮＡや、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡや、
ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパ
ク質をコードするＤＮＡや、ネオマイシン耐性遺伝子、
ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎ
ｅｏRの融合遺伝子（β−ｇｅｏ）等の選択マーカー遺
伝子などを具体的に挙げることができるが、これらの中
でもＧＦＰ遺伝子等の蛍光性タンパク質をコードするＤ
ＮＡが感染確認の容易さからして好ましい。かかるＧＦ
Ｐには、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）、ＥＹＦＰ（Enhanc
ed Yellow Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ(enhanced
CYAN fluorescent protein）（青色）、ＤｓＲｅｄ
（赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラ
ベルを行うこともできる。
【００１５】本発明に用いられる発現ベクターとして
は、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以
外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクタ
ー（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での
長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microb
iology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原
性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられる
アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 158, 97-129, 1992）や、リポソーム等を具
体的に挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。これらの中でも、経口により細胞株を樹立す
ることなく直接的に遺伝子を生体に発現させることがで
き、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現
が可能なアデノウイルスベクターが特に好ましい。ま
た、これらの発現ベクターへのトランスポーター遺伝子
の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発
現ベクター中の適当なプロモーターの下流にトランスポ
ーター遺伝子等を挿入することにより発現ベクターを構
築することができる。
は、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以
外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクタ
ー（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での
長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microb
iology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原
性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられる
アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 158, 97-129, 1992）や、リポソーム等を具
体的に挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。これらの中でも、経口により細胞株を樹立す
ることなく直接的に遺伝子を生体に発現させることがで
き、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現
が可能なアデノウイルスベクターが特に好ましい。ま
た、これらの発現ベクターへのトランスポーター遺伝子
の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発
現ベクター中の適当なプロモーターの下流にトランスポ
ーター遺伝子等を挿入することにより発現ベクターを構
築することができる。
【００１６】本発明において、目的とするトランスポー
ター遺伝子が本来発現していない臓器としては特に制限
されるものではなく、例えば、該目的トランスポーター
遺伝子として、ＯＡＴ１等の腎細胞に局在する有機アニ
オントランスポーター遺伝子を用いる場合、小腸、大
腸、直腸等を好適に例示することができる。この場合、
小腸、大腸、直腸等における薬剤、栄養物質等の有用物
質の取込み輸送能の向上や排泄物等の排出輸送能の向上
が期待でき、例えば腎不全患者における小腸、大腸、直
腸等が腎機能の代替を果たすことが期待できる。また、
目的とするトランスポーター遺伝子が本来発現していな
い臓器としては、該目的トランスポーター遺伝子とし
て、ＰＥＰＴ１等の小腸等に局在するペプチドトランス
ポーター遺伝子を用いる場合、血液脳関門（脳毛細血管
内皮細胞）等を好適に例示することができる。この場
合、抗癌剤の脳腫瘍への効率のよい輸送、パーキンソン
病治療薬であるＬ−ドーパのジペプチド誘導体の脳への
効率のよい輸送が期待できる。
ター遺伝子が本来発現していない臓器としては特に制限
されるものではなく、例えば、該目的トランスポーター
遺伝子として、ＯＡＴ１等の腎細胞に局在する有機アニ
オントランスポーター遺伝子を用いる場合、小腸、大
腸、直腸等を好適に例示することができる。この場合、
小腸、大腸、直腸等における薬剤、栄養物質等の有用物
質の取込み輸送能の向上や排泄物等の排出輸送能の向上
が期待でき、例えば腎不全患者における小腸、大腸、直
腸等が腎機能の代替を果たすことが期待できる。また、
目的とするトランスポーター遺伝子が本来発現していな
い臓器としては、該目的トランスポーター遺伝子とし
て、ＰＥＰＴ１等の小腸等に局在するペプチドトランス
ポーター遺伝子を用いる場合、血液脳関門（脳毛細血管
内皮細胞）等を好適に例示することができる。この場
合、抗癌剤の脳腫瘍への効率のよい輸送、パーキンソン
病治療薬であるＬ−ドーパのジペプチド誘導体の脳への
効率のよい輸送が期待できる。
【００１７】また、本発明の臓器における物質輸送能を
付与・促進する方法としては、目的とする前記トランス
ポーター遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランス
ポーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現さ
せることにより、かかる臓器における有用物質の取込み
制御輸送や排泄物質等の排出制御輸送を付与する方法
や、それらの物質輸送能を促進する方法などを具体的に
挙げることができる。また、目的とする前記トランスポ
ーター遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランスポ
ーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させ
る方法としては特に制限されるものではなく、発現ベク
ターを前記特定の臓器に感染させる公知の方法を用いる
ことができ、例えば、発現ベクターが含まれるリポソー
ムを経口投与することにより小腸や大腸に感染させた
り、発現ベクターを含む溶液を浣腸液として用いて大腸
に感染させたり、特定の臓器においてのみ発現するプロ
モーターの制御下にトランスポーター遺伝子を挿入した
発現ベクターを用いることにより感染させることができ
る。
付与・促進する方法としては、目的とする前記トランス
ポーター遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランス
ポーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現さ
せることにより、かかる臓器における有用物質の取込み
制御輸送や排泄物質等の排出制御輸送を付与する方法
や、それらの物質輸送能を促進する方法などを具体的に
挙げることができる。また、目的とする前記トランスポ
ーター遺伝子を含む発現ベクターを、該目的トランスポ
ーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させ
る方法としては特に制限されるものではなく、発現ベク
ターを前記特定の臓器に感染させる公知の方法を用いる
ことができ、例えば、発現ベクターが含まれるリポソー
ムを経口投与することにより小腸や大腸に感染させた
り、発現ベクターを含む溶液を浣腸液として用いて大腸
に感染させたり、特定の臓器においてのみ発現するプロ
モーターの制御下にトランスポーター遺伝子を挿入した
発現ベクターを用いることにより感染させることができ
る。
【００１８】本発明の物質輸送能が付与・促進された人
工臓器としては、上記の臓器感染用トランスポーター強
制発現ベクターを用いることにより得られる臓器であれ
ばその由来や種類は特に制限されるものではなく、例え
ばハイブリッド型人工臓器（病態生理(１９９０)，Ｖｏ
ｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．９２５−９２７）や、ＥＳ細
胞を用いたインビトロで誘導した人工臓器や、ＥＳ細胞
を用いて豚体内で誘導した人工臓器や、本発明の臓器感
染用トランスポーター強制発現ベクターにより物質輸送
能が付与・促進された人工臓器を挙げることができる。
工臓器としては、上記の臓器感染用トランスポーター強
制発現ベクターを用いることにより得られる臓器であれ
ばその由来や種類は特に制限されるものではなく、例え
ばハイブリッド型人工臓器（病態生理(１９９０)，Ｖｏ
ｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．９２５−９２７）や、ＥＳ細
胞を用いたインビトロで誘導した人工臓器や、ＥＳ細胞
を用いて豚体内で誘導した人工臓器や、本発明の臓器感
染用トランスポーター強制発現ベクターにより物質輸送
能が付与・促進された人工臓器を挙げることができる。
【００１９】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ＯＡＴ１遺伝子のアデノウイルスベクターへ
のサブクローニング］ 目的とするトランスポーター遺伝子としてＯＡＴ１遺伝
子を用い、ＯＡＴ１の遺伝子を生体の臓器に発現させる
方法としてアデノウイルスベクターを用いた。用いたア
デノウイルスベクターはHeらによって開発されたもので
(He,T.C. et al., A simplelified system for generat
ing recombinant adenoviruses. Proc.Natl. Acad. Sc
i., 95 : 2509-2514 (1998))、２段階のサブクローニン
グを行うことにより作製することができる（図１及び図
２参照）。このアデノウイルスベクターを用いる方法で
は、大腸菌中で相同組み換えを行い、５．０ｋｂまでの
インサートを高い効率で導入できる。はじめにシャトル
ベクターに目的とするＯＡＴ１遺伝子を組み込み、この
シャトルベクターのアデノウイルスベクターとの相同部
分を利用して、アデノウイルスの大部分の遺伝子を有す
るベクターとの相同組み換えを行い、組み換えアデノウ
イルスベクターを作製した。このシャトルベクターはＧ
ＦＰ(green fluorescent protein)遺伝子を持ち、ＯＡ
Ｔ１遺伝子と別なプロモーターからＧＦＰタンパク質を
発現させることができる。ＧＦＰの利点は生細胞のまま
で簡単に解析できることであり、そのため経時的な観察
が容易であり、トランスフェクションやウイルスの感染
効率の指標とすることができる。
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ＯＡＴ１遺伝子のアデノウイルスベクターへ
のサブクローニング］ 目的とするトランスポーター遺伝子としてＯＡＴ１遺伝
子を用い、ＯＡＴ１の遺伝子を生体の臓器に発現させる
方法としてアデノウイルスベクターを用いた。用いたア
デノウイルスベクターはHeらによって開発されたもので
(He,T.C. et al., A simplelified system for generat
ing recombinant adenoviruses. Proc.Natl. Acad. Sc
i., 95 : 2509-2514 (1998))、２段階のサブクローニン
グを行うことにより作製することができる（図１及び図
２参照）。このアデノウイルスベクターを用いる方法で
は、大腸菌中で相同組み換えを行い、５．０ｋｂまでの
インサートを高い効率で導入できる。はじめにシャトル
ベクターに目的とするＯＡＴ１遺伝子を組み込み、この
シャトルベクターのアデノウイルスベクターとの相同部
分を利用して、アデノウイルスの大部分の遺伝子を有す
るベクターとの相同組み換えを行い、組み換えアデノウ
イルスベクターを作製した。このシャトルベクターはＧ
ＦＰ(green fluorescent protein)遺伝子を持ち、ＯＡ
Ｔ１遺伝子と別なプロモーターからＧＦＰタンパク質を
発現させることができる。ＧＦＰの利点は生細胞のまま
で簡単に解析できることであり、そのため経時的な観察
が容易であり、トランスフェクションやウイルスの感染
効率の指標とすることができる。
【００２０】実施例１−１（pAdTrack-CMV-OAT1の調
製） ラットＯＡＴ１の遺伝子が組み込まれたプラスミド pSP
ORT1-OAT1とシャトルベクター pAdTrack‐CMVを、それ
ぞれ２つの制限酵素 Kpn Iと Hind IIIで３７℃で２時
間インキュベートした（表４）。次いで、電気泳動にか
け、QIAQuick Gel Extraction Kitを用い、アガロース
ゲルからＯＡＴ１の挿入部分とシャトルベクターのＤＮ
Ａを精製し、３０μＬのBuffer PEに抽出した。
製） ラットＯＡＴ１の遺伝子が組み込まれたプラスミド pSP
ORT1-OAT1とシャトルベクター pAdTrack‐CMVを、それ
ぞれ２つの制限酵素 Kpn Iと Hind IIIで３７℃で２時
間インキュベートした（表４）。次いで、電気泳動にか
け、QIAQuick Gel Extraction Kitを用い、アガロース
ゲルからＯＡＴ１の挿入部分とシャトルベクターのＤＮ
Ａを精製し、３０μＬのBuffer PEに抽出した。
【００２１】
【表４】
【００２２】シャトルベクターのクローニングサイトに
ＯＡＴ１を組み込むため、上記精製したＤＮＡのリゲー
ション反応を行い（表５）、得られたベクターpAdTrack
‐CMV-ＯＡＴ１を増幅するためにエレクトロポレーショ
ンにより大腸菌にトランスフォーメーションを行った。
エレクトロポレーションは、サンプル１ｍｍをキュベッ
トに入れ、Genepalser II (BIOLAD社製)を用い、１ｋ
Ｖ、２００Ω、２５μＦで行った。
ＯＡＴ１を組み込むため、上記精製したＤＮＡのリゲー
ション反応を行い（表５）、得られたベクターpAdTrack
‐CMV-ＯＡＴ１を増幅するためにエレクトロポレーショ
ンにより大腸菌にトランスフォーメーションを行った。
エレクトロポレーションは、サンプル１ｍｍをキュベッ
トに入れ、Genepalser II (BIOLAD社製)を用い、１ｋ
Ｖ、２００Ω、２５μＦで行った。
【００２３】
【表５】
【００２４】次いで、培養チューブに入った５００μＬ
のＬＢ培地（Tryptone 10g, YeastExtract 5g, NaCl 10
g, 5N NaOH 0.2Ml, Add water to 1000mL）に移し、１
時間振とう培養した。ＬＢプレート培地（カナマイシン
入り）に２５０μＬずつまきコロニーを作製した。２ｍ
ＬのＬＢ培地に pAdTrack‐CMV-OAT1 のコロニーを攪拌
させ３７℃で一晩振とう培養し、QIAprep Spin Minipre
p Kitを用いプラスミドを精製し、５０μＬのBuffer EB
で抽出した。得られたプラスミドpAdTrack‐CMV-OAT1の
制限酵素処理 (Hind III, Kpn I)を行い、電気泳動によ
り（表６）大きさを確認した。図４に、pAdTrack‐CMV-
OAT1 構築物の結果を示す。予想される断片のサイズは
９．２及び２．２ｋｂである。
のＬＢ培地（Tryptone 10g, YeastExtract 5g, NaCl 10
g, 5N NaOH 0.2Ml, Add water to 1000mL）に移し、１
時間振とう培養した。ＬＢプレート培地（カナマイシン
入り）に２５０μＬずつまきコロニーを作製した。２ｍ
ＬのＬＢ培地に pAdTrack‐CMV-OAT1 のコロニーを攪拌
させ３７℃で一晩振とう培養し、QIAprep Spin Minipre
p Kitを用いプラスミドを精製し、５０μＬのBuffer EB
で抽出した。得られたプラスミドpAdTrack‐CMV-OAT1の
制限酵素処理 (Hind III, Kpn I)を行い、電気泳動によ
り（表６）大きさを確認した。図４に、pAdTrack‐CMV-
OAT1 構築物の結果を示す。予想される断片のサイズは
９．２及び２．２ｋｂである。
【００２５】
【表６】
【００２６】上記のように、アデノウイルスの遺伝子を
もつベクターにＯＡＴ１のＤＮＡを導入する方法として
２段階のサブクローニングを行った。図３に、大腸菌内
における相同組換えによる組換えアデノウイルスプラス
ミドの産生を示す。用いたＯＡＴ１遺伝子はpSPORT1のS
al I, Not I siteに組み込まれており、このＯＡＴ１遺
伝子の両端にあるKpn I, Hind III siteで切断し、電気
泳動で分離してＯＡＴ１の遺伝子を精製した。同様に制
限酵素Kpn I, Hind IIIで処理したシャトルベクター（p
AdTrack-CMV）にＯＡＴ１遺伝子を組み込み、pAdTrack-
CMV-OAT1を作製した。少量のpAdTrack-CMV-OAT1を再び
制限酵素Kpn I, Hind IIIで切断し、電気泳動で分離し
た（図４参照）。予想されるＤＮＡの分子サイズはＯＡ
Ｔ１のインサート部分の２．２ｋｂと残りの９．２ｋｂ
の２本であり、ＯＡＴ１が組み込まれていることを確認
した。
もつベクターにＯＡＴ１のＤＮＡを導入する方法として
２段階のサブクローニングを行った。図３に、大腸菌内
における相同組換えによる組換えアデノウイルスプラス
ミドの産生を示す。用いたＯＡＴ１遺伝子はpSPORT1のS
al I, Not I siteに組み込まれており、このＯＡＴ１遺
伝子の両端にあるKpn I, Hind III siteで切断し、電気
泳動で分離してＯＡＴ１の遺伝子を精製した。同様に制
限酵素Kpn I, Hind IIIで処理したシャトルベクター（p
AdTrack-CMV）にＯＡＴ１遺伝子を組み込み、pAdTrack-
CMV-OAT1を作製した。少量のpAdTrack-CMV-OAT1を再び
制限酵素Kpn I, Hind IIIで切断し、電気泳動で分離し
た（図４参照）。予想されるＤＮＡの分子サイズはＯＡ
Ｔ１のインサート部分の２．２ｋｂと残りの９．２ｋｂ
の２本であり、ＯＡＴ１が組み込まれていることを確認
した。
【００２７】実施例１−２（相同組み換えによるpAd-OA
T1の調製） 制限酵素処理（表７）により実施例１−１で得られた p
AdTrack‐CMV-OAT1 を制限酵素Pme Iにより一本鎖に
し、電気泳動（100V, 30min, 1.0 %agarose / TAE, Mar
ker :λ／Hind III）により確認した（図５参照）。次
いで、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコ
ール（２５：２５：１）５０μＬを加えvortexし、２分
間遠心し、上層をとりクロロホルム５０μＬを加えvort
exし、２分間遠心した。次いで、エタノール沈殿処理
（５分間放置、３０分間遠心）を行い、ペレットを７５
％エタノールで洗浄後、室温でエタノールを除去し、得
られたペレットを蒸留水１２μＬに溶解した。
T1の調製） 制限酵素処理（表７）により実施例１−１で得られた p
AdTrack‐CMV-OAT1 を制限酵素Pme Iにより一本鎖に
し、電気泳動（100V, 30min, 1.0 %agarose / TAE, Mar
ker :λ／Hind III）により確認した（図５参照）。次
いで、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコ
ール（２５：２５：１）５０μＬを加えvortexし、２分
間遠心し、上層をとりクロロホルム５０μＬを加えvort
exし、２分間遠心した。次いで、エタノール沈殿処理
（５分間放置、３０分間遠心）を行い、ペレットを７５
％エタノールで洗浄後、室温でエタノールを除去し、得
られたペレットを蒸留水１２μＬに溶解した。
【００２８】
【表７】
【００２９】上記Pme I消化物とアデノウイルスベクタ
ー pAdEasy-1 との相同組換えを行った（表８）。サン
プル１ｍｍをキュベットに入れ、Genepalser II(BIOLAD
社製)でエレクトロポレーションを１ｋＶ、２００Ω、
２５μＦで行った。ＬＢ４００μＬを加え１５時間カナ
マイシン含有プレート培地に培養した。QIAprep Spin M
iniprep Kitを用い、プラスミドを精製し、０．８％ア
ガロースゲル上で電気泳動にかけ、エチジウムブロマイ
ドで染色した。結果を図６に示す。移動速度からして、
１〜８、１０及び１１列のクローンは潜在的に有効な組
換え体と考えられた。
ー pAdEasy-1 との相同組換えを行った（表８）。サン
プル１ｍｍをキュベットに入れ、Genepalser II(BIOLAD
社製)でエレクトロポレーションを１ｋＶ、２００Ω、
２５μＦで行った。ＬＢ４００μＬを加え１５時間カナ
マイシン含有プレート培地に培養した。QIAprep Spin M
iniprep Kitを用い、プラスミドを精製し、０．８％ア
ガロースゲル上で電気泳動にかけ、エチジウムブロマイ
ドで染色した。結果を図６に示す。移動速度からして、
１〜８、１０及び１１列のクローンは潜在的に有効な組
換え体と考えられた。
【００３０】
【表８】
【００３１】上記得られた pAd-OAT1の制限酵素処理 (B
amH I,Pac I,Spe I)を行い電気泳動（表９）により大き
さを確認した。図７に、代表的な制限酵素を用いたpAdE
asy-1とpAd-OAT1の電気泳動の結果と予想される断片の
大きさを示す。
amH I,Pac I,Spe I)を行い電気泳動（表９）により大き
さを確認した。図７に、代表的な制限酵素を用いたpAdE
asy-1とpAd-OAT1の電気泳動の結果と予想される断片の
大きさを示す。
【００３２】
【表９】
【００３３】上記のように、閉環状のpAdTrack‐CMV- O
AT1を制限酵素Pme Iで処理し、１カ所だけで切断し直鎖
状にした。この段階で電気泳動で確認したところベクタ
ー全長の１１．４ｋｂのところにシグナルが現れ、直鎖
状になっていることを確認した（図５参照）。pAdTrack
‐CMV-OAT1のPme I消化物とアデノウイルスベクターpAd
Easy-1との相同組換えを行った。相同組み換えはE.coli
（B J5183）にトランスフォーメーションすることで行
なった。B J5183はRec BCD変異体の大腸菌で相同組み換
えが起こりやすい。この大腸菌をカナマイシン含有のＬ
Ｂプレート培地にまき、培養した。pAdTrack-CMVはカナ
マイシン耐性の遺伝子を持っているので、相同組み換え
により閉環状のプラスミドになると耐性を獲得し、カナ
マイシン含有培地中でもコロニーを形成する。カナマイ
シン耐性を持たないpAdEasy-1や、耐性を持っていても
直鎖状のpAdTrack‐CMV-OAT1はコロニーを形成しないの
で、選択的に目的とするpAd-OAT1のコロニーが得られ
た。次いで QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、大腸菌
からプラスミドを精製した。電気泳動でサイズを確認
し、pAdEasy-1より大きなサイズのpAd-OAT1と思われる
ベクターを選択した（図６参照）。コロニーを選択する
とき、より小さいコロニーを選んだ方がpAd-OAT1である
確率が高いということがわかった。これは相同組換えが
起こると全長が３８ｋｂと非常に大きいことから、大変
不安定で成長するのも遅いためと思われる。
AT1を制限酵素Pme Iで処理し、１カ所だけで切断し直鎖
状にした。この段階で電気泳動で確認したところベクタ
ー全長の１１．４ｋｂのところにシグナルが現れ、直鎖
状になっていることを確認した（図５参照）。pAdTrack
‐CMV-OAT1のPme I消化物とアデノウイルスベクターpAd
Easy-1との相同組換えを行った。相同組み換えはE.coli
（B J5183）にトランスフォーメーションすることで行
なった。B J5183はRec BCD変異体の大腸菌で相同組み換
えが起こりやすい。この大腸菌をカナマイシン含有のＬ
Ｂプレート培地にまき、培養した。pAdTrack-CMVはカナ
マイシン耐性の遺伝子を持っているので、相同組み換え
により閉環状のプラスミドになると耐性を獲得し、カナ
マイシン含有培地中でもコロニーを形成する。カナマイ
シン耐性を持たないpAdEasy-1や、耐性を持っていても
直鎖状のpAdTrack‐CMV-OAT1はコロニーを形成しないの
で、選択的に目的とするpAd-OAT1のコロニーが得られ
た。次いで QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、大腸菌
からプラスミドを精製した。電気泳動でサイズを確認
し、pAdEasy-1より大きなサイズのpAd-OAT1と思われる
ベクターを選択した（図６参照）。コロニーを選択する
とき、より小さいコロニーを選んだ方がpAd-OAT1である
確率が高いということがわかった。これは相同組換えが
起こると全長が３８ｋｂと非常に大きいことから、大変
不安定で成長するのも遅いためと思われる。
【００３４】次いで、制限酵素処理により pAd- OAT1の
確認を行った。 pAd- OAT1の制限酵素処理 (BamH I,Pac
I,Spe I)を行い電気泳動により大きさを確認した（図
７参照）。３つの制限酵素でプラスミドを切断すると、
制限酵素サイトから予想される数のバンドが検出され
た。予想される断片のサイズは、BamH Iで切断したと
き、大きさもほぼ予想したサイズになった。
確認を行った。 pAd- OAT1の制限酵素処理 (BamH I,Pac
I,Spe I)を行い電気泳動により大きさを確認した（図
７参照）。３つの制限酵素でプラスミドを切断すると、
制限酵素サイトから予想される数のバンドが検出され
た。予想される断片のサイズは、BamH Iで切断したと
き、大きさもほぼ予想したサイズになった。
【００３５】実施例１−３（ＰＣＲによる各段階でのＯ
ＡＴ１の遺伝子の確認） サブクローニングのそれぞれの段階でＯＡＴ１の遺伝子
が含まれているかをＰＣＲ反応後の電気泳動により確認
した。ＯＡＴ１の全ＤＮＡ配列のうち６４５ｂｐをはさ
むようにプライマーを設計した。図８にアガロースゲル
を用いた上記ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。pAdT
rack‐CMV-OAT1とpAd-OAT1に６４５ｂｐのところにバン
ドが認められた。
ＡＴ１の遺伝子の確認） サブクローニングのそれぞれの段階でＯＡＴ１の遺伝子
が含まれているかをＰＣＲ反応後の電気泳動により確認
した。ＯＡＴ１の全ＤＮＡ配列のうち６４５ｂｐをはさ
むようにプライマーを設計した。図８にアガロースゲル
を用いた上記ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。pAdT
rack‐CMV-OAT1とpAd-OAT1に６４５ｂｐのところにバン
ドが認められた。
【００３６】実施例２［アデノウイルスを用いたＯＡＴ
１の過剰発現系の作製］ 実施例１において用いられているアデノウイルスベクタ
ーは、Ｅ１というアデノウイルスの遺伝子発現に必要な
部分を欠損させた非増殖型のベクターである。Ｅ１はア
デノウイルスの遺伝子発現に必要で、Ｅ１が欠損してい
るとウイルスの蛋白は産生されない。そこでＥ１遺伝子
を持続的に発現する、ヒト胎児腎ＨＥＫ２９３細胞中で
増殖させ、高力価のウイルス液にまで濃縮し、ウイルス
の力価を算出した。また、このウイルス液をＨＥＫ２９
３細胞以外の培養細胞あるいは動物組織に感染させたと
き、感染力によりウイルスのゲノムは高率に核内へ導入
されるが最初に発現すべきＥ１遺伝子が欠損しているた
め、ウイルスは複製されることなく目的遺伝子だけが発
現することになる。そこで、他のパッケージング細胞で
はない細胞においても感染性があるか確認する必要があ
る。そこでブタ腎由来のＬＬＣ−ＰＫ１細胞でＧＦＰが
発現するか調べた。
１の過剰発現系の作製］ 実施例１において用いられているアデノウイルスベクタ
ーは、Ｅ１というアデノウイルスの遺伝子発現に必要な
部分を欠損させた非増殖型のベクターである。Ｅ１はア
デノウイルスの遺伝子発現に必要で、Ｅ１が欠損してい
るとウイルスの蛋白は産生されない。そこでＥ１遺伝子
を持続的に発現する、ヒト胎児腎ＨＥＫ２９３細胞中で
増殖させ、高力価のウイルス液にまで濃縮し、ウイルス
の力価を算出した。また、このウイルス液をＨＥＫ２９
３細胞以外の培養細胞あるいは動物組織に感染させたと
き、感染力によりウイルスのゲノムは高率に核内へ導入
されるが最初に発現すべきＥ１遺伝子が欠損しているた
め、ウイルスは複製されることなく目的遺伝子だけが発
現することになる。そこで、他のパッケージング細胞で
はない細胞においても感染性があるか確認する必要があ
る。そこでブタ腎由来のＬＬＣ−ＰＫ１細胞でＧＦＰが
発現するか調べた。
【００３７】実施例２−１（pAd-OAT1の調製） Endo Free Plasmid Maxi kit によりＨＥＫ２９３にト
ランスフェクションするためのエンドトキシンのないpA
d-OAT1を以下のように大量調製した。まず、５ｍＬのＬ
Ｂ培地にpAd-OAT1で感染した大腸菌のコロニーをとり、
一晩３７℃で振とう培養し、増殖した大腸菌をさらに坂
口フラスコ２本に入れた５００ｍＬのＬＢ培地中に加
え、一晩３７℃で振とう培養した。冷却後、５００ｍＬ
遠心チューブ２本に分け、２５００ｇで１５分間遠心し
た。Endo Free Plasmid Maxi kitによりpAd-OAT1を１ｍ
Ｌの Beffer TEに抽出し、そのうち１０μＬを精製水で
１００倍希釈し、波長２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ
260）を測定し、ＯＤ260＝１を５０μｇ／ｍＬとして定
量した。次いで、制限酵素Pac Iを用いる他は実施例１
−２と同様にしてpAd-OAT1を一本鎖状のＤＮＡにした。
ランスフェクションするためのエンドトキシンのないpA
d-OAT1を以下のように大量調製した。まず、５ｍＬのＬ
Ｂ培地にpAd-OAT1で感染した大腸菌のコロニーをとり、
一晩３７℃で振とう培養し、増殖した大腸菌をさらに坂
口フラスコ２本に入れた５００ｍＬのＬＢ培地中に加
え、一晩３７℃で振とう培養した。冷却後、５００ｍＬ
遠心チューブ２本に分け、２５００ｇで１５分間遠心し
た。Endo Free Plasmid Maxi kitによりpAd-OAT1を１ｍ
Ｌの Beffer TEに抽出し、そのうち１０μＬを精製水で
１００倍希釈し、波長２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ
260）を測定し、ＯＤ260＝１を５０μｇ／ｍＬとして定
量した。次いで、制限酵素Pac Iを用いる他は実施例１
−２と同様にしてpAd-OAT1を一本鎖状のＤＮＡにした。
【００３８】実施例２−２（ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９
３細胞の培養） ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞の培養をＤＭＥＭ培地
（１Ｌ当たり、Dulbecco's Modified Eagle Medium１
３．５ｇ、炭酸水素ナトリウム３．７ｇ、ペニシリンＧ
カリウム７０ｍｇ、ストレプトマイシン硫酸塩１３９ｍ
ｇ）で行った。培養後、シャーレ上の培地をアスピレー
ターにより取り除き、ＰＢＳで洗浄後にトリプシン・Ｅ
ＤＴＡ液５ｍＬを加えて５〜１０分間細胞がシャーレか
ら剥がれるまで放置し、細胞が完全に剥がれたら、ＤＭ
ＥＭ培地に懸濁し、遠心後に上清をアスピレーターによ
り除去し、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加えて懸濁し、この
懸濁液中の細胞数を計数板にて計測した。φ１０ｃｍシ
ャーレの場合は１〜２×１０ 6個の割合で、φ１５ｃｍ
シャーレの場合は３〜４×１０6個の割合で細胞を播
き、シャーレを縦横に揺さぶり、細胞がシャーレ上に均
一になるようにした。
３細胞の培養） ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞の培養をＤＭＥＭ培地
（１Ｌ当たり、Dulbecco's Modified Eagle Medium１
３．５ｇ、炭酸水素ナトリウム３．７ｇ、ペニシリンＧ
カリウム７０ｍｇ、ストレプトマイシン硫酸塩１３９ｍ
ｇ）で行った。培養後、シャーレ上の培地をアスピレー
ターにより取り除き、ＰＢＳで洗浄後にトリプシン・Ｅ
ＤＴＡ液５ｍＬを加えて５〜１０分間細胞がシャーレか
ら剥がれるまで放置し、細胞が完全に剥がれたら、ＤＭ
ＥＭ培地に懸濁し、遠心後に上清をアスピレーターによ
り除去し、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加えて懸濁し、この
懸濁液中の細胞数を計数板にて計測した。φ１０ｃｍシ
ャーレの場合は１〜２×１０ 6個の割合で、φ１５ｃｍ
シャーレの場合は３〜４×１０6個の割合で細胞を播
き、シャーレを縦横に揺さぶり、細胞がシャーレ上に均
一になるようにした。
【００３９】実施例２−３（pAd-OAT1のＨＥＫ２９３細
胞へのトランスフェクション；一次ウイルス液の作製) 実験を行う前日にＨＥＫ２９３細胞を２倍に希釈して２
５Ｔフラスコ１本にまき、細胞が５０〜７０％コンフレ
ントに達するまで培養した。組み換えアデノウイルスベ
クター pAd-OAT1 ４μｇ（２０μＬ）とリポフェクタミ
ン２０μＬにそれぞれ無血清培地 (opti-mem-I)５００
μＬを加え、室温で１５〜３０分間放置した。これら２
つの溶液を混ぜ合わせ１５〜４０分間室温で放置し、Ｄ
ＮＡとリポソームの複合体を作製した。ＨＥＫ２９３細
胞の培養液を捨て、４ｍＬのＰＢＳ（−）で細胞を洗っ
た。無血清培地２．５ｍＬを加え３７℃のインキュベー
ターで１０分間放置し、リポソーム溶液を細胞の入った
フラスコに加えて３７℃のインキュベーターで４時間放
置した。培地を捨て、６ｍＬのＤＭＥＭを加え、３７℃
インキュベーターで４日間培養した。
胞へのトランスフェクション；一次ウイルス液の作製) 実験を行う前日にＨＥＫ２９３細胞を２倍に希釈して２
５Ｔフラスコ１本にまき、細胞が５０〜７０％コンフレ
ントに達するまで培養した。組み換えアデノウイルスベ
クター pAd-OAT1 ４μｇ（２０μＬ）とリポフェクタミ
ン２０μＬにそれぞれ無血清培地 (opti-mem-I)５００
μＬを加え、室温で１５〜３０分間放置した。これら２
つの溶液を混ぜ合わせ１５〜４０分間室温で放置し、Ｄ
ＮＡとリポソームの複合体を作製した。ＨＥＫ２９３細
胞の培養液を捨て、４ｍＬのＰＢＳ（−）で細胞を洗っ
た。無血清培地２．５ｍＬを加え３７℃のインキュベー
ターで１０分間放置し、リポソーム溶液を細胞の入った
フラスコに加えて３７℃のインキュベーターで４時間放
置した。培地を捨て、６ｍＬのＤＭＥＭを加え、３７℃
インキュベーターで４日間培養した。
【００４０】実施例２−４（ウイルスの回収） ウイルスを感染させてから９日後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ
の発現の様子を観察し（図９参照）、細胞をラバーポリ
スマン（coster 3010）で剥がし、遠心管に移した後、
１０００ｒｐｍで５分間遠心し、３ｍＬ残して後は捨て
た。遠心管をメタノール／ドライアイスにつけ、細胞を
急速に凍結させ、３７℃水浴で溶解させた。この操作を
３回くり返し、細胞質内からウイルスを放出させた。１
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい遠心管に採
り、一次ウイルス液とした。蛍光のみによる観察結果を
図９Ａに、位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図
９Ｂに示す。
の発現の様子を観察し（図９参照）、細胞をラバーポリ
スマン（coster 3010）で剥がし、遠心管に移した後、
１０００ｒｐｍで５分間遠心し、３ｍＬ残して後は捨て
た。遠心管をメタノール／ドライアイスにつけ、細胞を
急速に凍結させ、３７℃水浴で溶解させた。この操作を
３回くり返し、細胞質内からウイルスを放出させた。１
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい遠心管に採
り、一次ウイルス液とした。蛍光のみによる観察結果を
図９Ａに、位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図
９Ｂに示す。
【００４１】実施例２−５（アデノウイルスのＨＥＫ２
９３細胞への感染；二次ウイルス液の作製） 実験を行う前日にＨＥＫ２９３細胞を２倍に希釈して２
５Ｔフラスコ１本にまき、細胞が５０〜７０％コンフレ
ントに達するまで培養した。ＨＥＫ２９３細胞に一次ウ
イルス液を１ｍＬずつ２５Ｔフラスコ２本に加え、ウイ
ルスを細胞に感染させた。６日後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ
の発現の様子を観察し、同様に細胞をはがし１本の遠心
チューブに集め遠心し、５〜６ｍＬ残して培地を捨て
た。以後、実施例２−４と同様にして二次ウイルス液を
得た。位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図９Ｃ
に示す。
９３細胞への感染；二次ウイルス液の作製） 実験を行う前日にＨＥＫ２９３細胞を２倍に希釈して２
５Ｔフラスコ１本にまき、細胞が５０〜７０％コンフレ
ントに達するまで培養した。ＨＥＫ２９３細胞に一次ウ
イルス液を１ｍＬずつ２５Ｔフラスコ２本に加え、ウイ
ルスを細胞に感染させた。６日後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ
の発現の様子を観察し、同様に細胞をはがし１本の遠心
チューブに集め遠心し、５〜６ｍＬ残して培地を捨て
た。以後、実施例２−４と同様にして二次ウイルス液を
得た。位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図９Ｃ
に示す。
【００４２】実施例２−６（アデノウイルスのＨＥＫ２
９３細胞への感染；三次ウイルス液の作製） ＨＥＫ２９３にウイルス液を１ｍＬずつ２５Ｔフラスコ
４本（７５Ｔ１本、２５Ｔ１本）に加え、二次ウイルス
を細胞に感染させた。２日後、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発
現の様子を観察した。結果を図９Ｄに示す。実施例２−
４と同じように細胞をはがし遠心し、培地を捨てた。１
２ｍＬのopti-nen Iを加え、以後、実施例２−４と同様
にして三次ウイルス液を得た。図９Ｄは位相差像と蛍光
両方をあわせたものであり、図９Ｄからほぼ１００％感
染するまでにウイルス液を濃縮できたことがわかった。
９３細胞への感染；三次ウイルス液の作製） ＨＥＫ２９３にウイルス液を１ｍＬずつ２５Ｔフラスコ
４本（７５Ｔ１本、２５Ｔ１本）に加え、二次ウイルス
を細胞に感染させた。２日後、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発
現の様子を観察した。結果を図９Ｄに示す。実施例２−
４と同じように細胞をはがし遠心し、培地を捨てた。１
２ｍＬのopti-nen Iを加え、以後、実施例２−４と同様
にして三次ウイルス液を得た。図９Ｄは位相差像と蛍光
両方をあわせたものであり、図９Ｄからほぼ１００％感
染するまでにウイルス液を濃縮できたことがわかった。
【００４３】実施例２−７（三次ウイルスの力価の測
定） ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルのディッシュ２枚にまい
た。細胞がコンフルエントになった段階で三次ウイルス
を段階希釈して細胞にかけた。２日後、培地を交換し、
ウイルス液を取り除いた。２日後と５日後に蛍光顕微鏡
でＧＦＰの発現を確認し、単位面積当たりの蛍光を発し
ている細胞数の割合を求め、三次ウイルスの力価を次の
計算により求めた。三次ウイルスをＨＥＫ２９３細胞に
感染させたときの感染した細胞の割合を、ＧＦＰの蛍光
がみえる細胞の数をもとに計算した。１μＬ／９．５ｃ
ｍ2でインフェクションしたときコンフルエントになっ
たＨＥＫ２９３の細胞数を１．２×１０7cells／７５ｃ
ｍ2と仮定すると、全細胞に占めるＧＦＰの発現細胞の
割合は７．５％であった。ＨＥＫ２９３細胞での三次ウ
イルスの力価を、１．１×１０8ＰＦＵ（Plaque-formin
g unit per cell）／ｍＬと見積もった。
定） ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルのディッシュ２枚にまい
た。細胞がコンフルエントになった段階で三次ウイルス
を段階希釈して細胞にかけた。２日後、培地を交換し、
ウイルス液を取り除いた。２日後と５日後に蛍光顕微鏡
でＧＦＰの発現を確認し、単位面積当たりの蛍光を発し
ている細胞数の割合を求め、三次ウイルスの力価を次の
計算により求めた。三次ウイルスをＨＥＫ２９３細胞に
感染させたときの感染した細胞の割合を、ＧＦＰの蛍光
がみえる細胞の数をもとに計算した。１μＬ／９．５ｃ
ｍ2でインフェクションしたときコンフルエントになっ
たＨＥＫ２９３の細胞数を１．２×１０7cells／７５ｃ
ｍ2と仮定すると、全細胞に占めるＧＦＰの発現細胞の
割合は７．５％であった。ＨＥＫ２９３細胞での三次ウ
イルスの力価を、１．１×１０8ＰＦＵ（Plaque-formin
g unit per cell）／ｍＬと見積もった。
【００４４】実施例３［ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞
における物質輸送］ 小腸のモデル細胞であるＣａｃｏ−２細胞に組換えアデ
ノウイルスを感染させ、ＯＡＴ１の輸送機能、すなわち
ＯＡＴ１が取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の
輸送に作用するかを調べた。かかるヒト大腸癌由来のＣ
ａｃｏ−２細胞を用いて発現させたＯＡＴ１の機能や輸
送活性を調べるため、まず、実際に組み換えアデノウイ
ルスがＣａｃｏ−２に感染しＯＡＴ１を発現するかどう
かを調べた。本実施例で用いたアデノウイルスベクター
はＧＦＰ遺伝子を持っているため、トランスフェクショ
ンや感染の効率の指標となることから、Ｃａｃｏ−２に
組み換えアデノウイルスを感染させ、ＧＦＰの発現効率
を調べた結果、ＧＦＰの発現からＯＡＴ１の発現がほぼ
予測することができた。次いで、ディッシュ法によりＯ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3Ｈ］パラアミ
ノ馬尿酸（ＰＡＨ）の取込みについて調べた。次に、カ
ップ法によりＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における物
質輸送の方向、すなわち管腔側（ＡＰ）から側底膜側
（ＢＰ）方向か、あるいは側底膜側（ＢＰ）から管腔側
（ＡＰ）方向かを、［3Ｈ］ＰＡＨの透過量により調べ
た。これらの実験により、本発明の臓器感染用トランス
ポーター強制発現ベクターの有効性を確認した。
における物質輸送］ 小腸のモデル細胞であるＣａｃｏ−２細胞に組換えアデ
ノウイルスを感染させ、ＯＡＴ１の輸送機能、すなわち
ＯＡＴ１が取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の
輸送に作用するかを調べた。かかるヒト大腸癌由来のＣ
ａｃｏ−２細胞を用いて発現させたＯＡＴ１の機能や輸
送活性を調べるため、まず、実際に組み換えアデノウイ
ルスがＣａｃｏ−２に感染しＯＡＴ１を発現するかどう
かを調べた。本実施例で用いたアデノウイルスベクター
はＧＦＰ遺伝子を持っているため、トランスフェクショ
ンや感染の効率の指標となることから、Ｃａｃｏ−２に
組み換えアデノウイルスを感染させ、ＧＦＰの発現効率
を調べた結果、ＧＦＰの発現からＯＡＴ１の発現がほぼ
予測することができた。次いで、ディッシュ法によりＯ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3Ｈ］パラアミ
ノ馬尿酸（ＰＡＨ）の取込みについて調べた。次に、カ
ップ法によりＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における物
質輸送の方向、すなわち管腔側（ＡＰ）から側底膜側
（ＢＰ）方向か、あるいは側底膜側（ＢＰ）から管腔側
（ＡＰ）方向かを、［3Ｈ］ＰＡＨの透過量により調べ
た。これらの実験により、本発明の臓器感染用トランス
ポーター強制発現ベクターの有効性を確認した。
【００４５】実施例３−１（ヒト大腸癌由来Ｃａｃｏ−
２細胞の培養） 液体窒素タンクから取り出したＣａｃｏ−２細胞を、３
７℃で解凍し、改変ＤＭＥＭ培地（１Ｌ当たり、Dulbec
co's Modified Eagle Medium２７ｇ、炭酸水素ナトリウ
ム４４ｍＭ、ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍＬ、ス
トレプトマイシン硫酸塩１００μｇ／ｍＬ、Ｌ−グルタ
ミン２ｍＭ、Neaa １ｍＭ、ＦＢＳ１０％）で懸濁し遠
心する洗浄操作を２回行った後、５％炭酸ガス下３７℃
で４〜７日間培養した。培養後に培地を捨て０．２５％
ＨＢＳＳ（Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリー）で細胞単層を２回洗
浄し、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離処理を行
い、細胞懸濁液を調製し、細胞計数板で細胞数を計測
し、ディッシュには rat tail collagenでコーティング
した上に１．２６×１０5cells／ｍＬ（１．０ｍＬ／ウ
ェル）、カップには１．２６×１０5cells／ｍＬ（０．
５ｍＬ／カップ）の細胞を用いた。培養４日目から培地
を交換し、以後１日おきに交換して培養した。
２細胞の培養） 液体窒素タンクから取り出したＣａｃｏ−２細胞を、３
７℃で解凍し、改変ＤＭＥＭ培地（１Ｌ当たり、Dulbec
co's Modified Eagle Medium２７ｇ、炭酸水素ナトリウ
ム４４ｍＭ、ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍＬ、ス
トレプトマイシン硫酸塩１００μｇ／ｍＬ、Ｌ−グルタ
ミン２ｍＭ、Neaa １ｍＭ、ＦＢＳ１０％）で懸濁し遠
心する洗浄操作を２回行った後、５％炭酸ガス下３７℃
で４〜７日間培養した。培養後に培地を捨て０．２５％
ＨＢＳＳ（Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリー）で細胞単層を２回洗
浄し、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離処理を行
い、細胞懸濁液を調製し、細胞計数板で細胞数を計測
し、ディッシュには rat tail collagenでコーティング
した上に１．２６×１０5cells／ｍＬ（１．０ｍＬ／ウ
ェル）、カップには１．２６×１０5cells／ｍＬ（０．
５ｍＬ／カップ）の細胞を用いた。培養４日目から培地
を交換し、以後１日おきに交換して培養した。
【００４６】実施例３−２（Ｃａｃｏ−２におけるＧＦ
Ｐの発現） Ｃａｃｏ−２細胞へのウイルスの感染を次のようにして
調べた。Ｃａｃｏ−２細胞を４ウェルのディッシュ２枚
にまいた。ディッシュはあらかじめコラーゲンコートし
たものを使用した。細胞がコンフルエントになった段階
で、三次ウイルスをMOI (multiplicity of Infection)
７５，１５，４に段階希釈した。コンフルエントなＣａ
ｃｏ−２細胞の密度を１×１０7cells／７５ｃｍ2と仮
定して、表１０に示す量の三次ウイルスを細胞にかけて
感染させた。感染２日後に培地を除去し、ウイルスを取
り除いた。２日後と５日後に蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現
を観察した。図１０はＧＦＰ発現の様子を示す図であ
る。MOI ７５では十分な発現が見られたが、MOI １５、
４とウイルス量が少なくなるに従ってＧＦＰの発現も減
少した。２日目と５日目では感染効率はほとんど変わら
ず、ＧＦＰの発現は少なくとも５日持続することがわか
った。十分な感染を得るためにはMOI ７５の濃度のウイ
ルスを使う必要があることがわかった。
Ｐの発現） Ｃａｃｏ−２細胞へのウイルスの感染を次のようにして
調べた。Ｃａｃｏ−２細胞を４ウェルのディッシュ２枚
にまいた。ディッシュはあらかじめコラーゲンコートし
たものを使用した。細胞がコンフルエントになった段階
で、三次ウイルスをMOI (multiplicity of Infection)
７５，１５，４に段階希釈した。コンフルエントなＣａ
ｃｏ−２細胞の密度を１×１０7cells／７５ｃｍ2と仮
定して、表１０に示す量の三次ウイルスを細胞にかけて
感染させた。感染２日後に培地を除去し、ウイルスを取
り除いた。２日後と５日後に蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現
を観察した。図１０はＧＦＰ発現の様子を示す図であ
る。MOI ７５では十分な発現が見られたが、MOI １５、
４とウイルス量が少なくなるに従ってＧＦＰの発現も減
少した。２日目と５日目では感染効率はほとんど変わら
ず、ＧＦＰの発現は少なくとも５日持続することがわか
った。十分な感染を得るためにはMOI ７５の濃度のウイ
ルスを使う必要があることがわかった。
【００４７】
【表１０】
【００４８】実施例３−３（ディッシュ法によるＯＡＴ
１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3Ｈ］ＰＡＨの取込
み） 実施例３−１で調製したディッシュ内のウェル中の培養
液を真空ポンプで吸引し、細胞を傷つけないようにし
て、細胞表面を３７℃に温めた培地１ｍｌで３回洗い、
最後に加えた培地をできるだけきれいに取り除いた。Ｏ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞（AdOAT1）の対照として正
常Ｃａｃｏ−２細胞（Normal）も同様にディッシュ内に
調製した。各細胞をそれぞれ２組用意し、一方のグルー
プは予め１ｍＭのグルタール酸溶液で３７℃、３０分プ
レインキュベートした。ディッシュ内を３７℃とし、ウ
ェル内に０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液２１０μＬ
を加え、インキュベートし、経時的にサンプリングし
た。細胞を可溶化するために、５ＮのＮａＯＨ５００μ
Ｌを加え振とうし、５ＮのＨＣｌ５００μＬで中和し、
その溶液を液体シンチレーションカウンターで測定し
た。結果を図１１に示す。図１１に示されるように、Ｏ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞（AdOAT1）においては、対
照の正常Ｃａｃｏ−２細胞（Normal）に比べ、有意に［
3Ｈ］ＰＡＨの取込み量が増加していた。また、グルタ
ール酸溶液で予めプレインキュベートした場合は取り込
みの促進がみられた。このように、ＯＡＴ１を発現させ
たＣａｃｏ−２細胞で［3Ｈ］ＰＡＨの取込み量が増加
したことから、管腔側でＯＡＴ１が機能的に発現してい
ると考えられる。
１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3Ｈ］ＰＡＨの取込
み） 実施例３−１で調製したディッシュ内のウェル中の培養
液を真空ポンプで吸引し、細胞を傷つけないようにし
て、細胞表面を３７℃に温めた培地１ｍｌで３回洗い、
最後に加えた培地をできるだけきれいに取り除いた。Ｏ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞（AdOAT1）の対照として正
常Ｃａｃｏ−２細胞（Normal）も同様にディッシュ内に
調製した。各細胞をそれぞれ２組用意し、一方のグルー
プは予め１ｍＭのグルタール酸溶液で３７℃、３０分プ
レインキュベートした。ディッシュ内を３７℃とし、ウ
ェル内に０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液２１０μＬ
を加え、インキュベートし、経時的にサンプリングし
た。細胞を可溶化するために、５ＮのＮａＯＨ５００μ
Ｌを加え振とうし、５ＮのＨＣｌ５００μＬで中和し、
その溶液を液体シンチレーションカウンターで測定し
た。結果を図１１に示す。図１１に示されるように、Ｏ
ＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞（AdOAT1）においては、対
照の正常Ｃａｃｏ−２細胞（Normal）に比べ、有意に［
3Ｈ］ＰＡＨの取込み量が増加していた。また、グルタ
ール酸溶液で予めプレインキュベートした場合は取り込
みの促進がみられた。このように、ＯＡＴ１を発現させ
たＣａｃｏ−２細胞で［3Ｈ］ＰＡＨの取込み量が増加
したことから、管腔側でＯＡＴ１が機能的に発現してい
ると考えられる。
【００４９】実施例３−４（カップ法によるＯＡＴ１発
現Ｃａｃｏ−２細胞における物質輸送方向） （ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における管腔側から側
底膜側への透過実験）実施例３−１で調製したカップ内
の培養液を捨てた後、培養液で３回洗浄し、最後に加え
た培地をできるだけきれいに取り除いた。ＯＡＴ１発現
Ｃａｃｏ−２細胞（Caco-2/AdOAT1）の対照として正常
Ｃａｃｏ−２細胞（Caco-2/Normal）も同様に調製し
た。カップ内を３７℃とし、側底膜側（basolateral si
de）に培地１．５ｍＬを加え、直ちに、管腔側（Apical
side）に０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液５１０μＬ
を加え、インキュベートし、経時的に側底膜側からサン
プリングした。各サンプリング時に５００μＬをサンプ
リングし、新たに５００μＬの培地を側底膜側に加え
た。各サンプルは、実施例３−３と同様にして液体シン
チレーションカウンターで測定した。
現Ｃａｃｏ−２細胞における物質輸送方向） （ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における管腔側から側
底膜側への透過実験）実施例３−１で調製したカップ内
の培養液を捨てた後、培養液で３回洗浄し、最後に加え
た培地をできるだけきれいに取り除いた。ＯＡＴ１発現
Ｃａｃｏ−２細胞（Caco-2/AdOAT1）の対照として正常
Ｃａｃｏ−２細胞（Caco-2/Normal）も同様に調製し
た。カップ内を３７℃とし、側底膜側（basolateral si
de）に培地１．５ｍＬを加え、直ちに、管腔側（Apical
side）に０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液５１０μＬ
を加え、インキュベートし、経時的に側底膜側からサン
プリングした。各サンプリング時に５００μＬをサンプ
リングし、新たに５００μＬの培地を側底膜側に加え
た。各サンプルは、実施例３−３と同様にして液体シン
チレーションカウンターで測定した。
【００５０】（ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における
側底膜側から管腔側への透過実験）上記と同様に調製し
たカップ内の側底膜側（basolateral side）に０．１６
μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液１．５ｍＬを加え、直ちに、
管腔側（Apical side）に培地５００μＬを加え、イン
キュベートし、経時的に管腔側からサンプリングした。
各サンプリング時に２００μＬをサンプリングし、新た
に２００μＬの培地を管腔側に加えた。各サンプルは、
実施例３−３と同様にして液体シンチレーションカウン
ターで測定した。
側底膜側から管腔側への透過実験）上記と同様に調製し
たカップ内の側底膜側（basolateral side）に０．１６
μＭの［3Ｈ］ＰＡＨ溶液１．５ｍＬを加え、直ちに、
管腔側（Apical side）に培地５００μＬを加え、イン
キュベートし、経時的に管腔側からサンプリングした。
各サンプリング時に２００μＬをサンプリングし、新た
に２００μＬの培地を管腔側に加えた。各サンプルは、
実施例３−３と同様にして液体シンチレーションカウン
ターで測定した。
【００５１】これら透過実験の結果を図１２に示す。図
１２に示されるように、カップ法によりＯＡＴ１を発現
させたＣａｃｏ−２細胞における側底膜側（ＢＬ）から
管腔側（ＡＰ）方向への［3Ｈ］ＰＡＨの透過量が有意
に増加し、その比は約１．６倍となった。また、その速
度も細胞間隙マーカーであるマンニトールの透過速度よ
り４．５倍速いものであった。これらの結果から、ＯＡ
Ｔ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における輸送方向は、管腔側
（ＡＰ）から側底膜側（ＢＬ）方向ではなく、側底膜側
（ＢＬ）から管腔側（ＡＰ）方向であり、ＯＡＴ１は排
出方向に輸送作用を有することがわかった。ＯＡＴ１発
現Ｃａｃｏ−２細胞における輸送方向が側底膜側（Ｂ
Ｌ）から管腔側（ＡＰ）方向であることを確認するため
に、上記透過実験における０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡ
Ｈ溶液に代えて、１０ｍＭのペニシリンＧ（ＰＣＧ）含
有０．１６μＭ［3Ｈ］ＰＡＨ溶液を用いて同様な透過
実験を行った。結果を図１３に示す。図１３に示される
ように、阻害剤ＰＣＧによってＯＡＴ１を発現させたＣ
ａｃｏ−２細胞における側底膜側（ＢＬ）から管腔側
（ＡＰ）方向への［3Ｈ］ＰＡＨの透過量が、マンニト
ールレベルまで下がったことから、ＯＡＴ１の発現によ
る分泌指向性を確認することができた。
１２に示されるように、カップ法によりＯＡＴ１を発現
させたＣａｃｏ−２細胞における側底膜側（ＢＬ）から
管腔側（ＡＰ）方向への［3Ｈ］ＰＡＨの透過量が有意
に増加し、その比は約１．６倍となった。また、その速
度も細胞間隙マーカーであるマンニトールの透過速度よ
り４．５倍速いものであった。これらの結果から、ＯＡ
Ｔ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における輸送方向は、管腔側
（ＡＰ）から側底膜側（ＢＬ）方向ではなく、側底膜側
（ＢＬ）から管腔側（ＡＰ）方向であり、ＯＡＴ１は排
出方向に輸送作用を有することがわかった。ＯＡＴ１発
現Ｃａｃｏ−２細胞における輸送方向が側底膜側（Ｂ
Ｌ）から管腔側（ＡＰ）方向であることを確認するため
に、上記透過実験における０．１６μＭの［3Ｈ］ＰＡ
Ｈ溶液に代えて、１０ｍＭのペニシリンＧ（ＰＣＧ）含
有０．１６μＭ［3Ｈ］ＰＡＨ溶液を用いて同様な透過
実験を行った。結果を図１３に示す。図１３に示される
ように、阻害剤ＰＣＧによってＯＡＴ１を発現させたＣ
ａｃｏ−２細胞における側底膜側（ＢＬ）から管腔側
（ＡＰ）方向への［3Ｈ］ＰＡＨの透過量が、マンニト
ールレベルまで下がったことから、ＯＡＴ１の発現によ
る分泌指向性を確認することができた。
【００５２】実施例４［ＰＥＰＴ１発現ＲＢＥＣ１細胞
における［3Ｈ］ジペプチドの取込み］ 上記実施例１と同様にして、トランスポータＰＥＰＴ１
遺伝子を組み込んだ発現アデノウイルスベクター（AdhP
EPT1-EYFP）を構築し、培養株化ラット脳毛細血管内皮
細胞（ＲＢＥＣ１）に感染させた。次に、上記実施例３
−３に準じて、ディッシュ法によるＰＥＰＴ１発現ＲＢ
ＥＣ１細胞における［3Ｈ］ＧｌｙＳａｒの取込みにつ
いて調べた。結果を図１４に示す。図１４に示されるよ
うに、発現ベクター（AdhPEPT1-EYFP）で感染されたＰ
ＥＰＴ１発現ＲＢＥＣ１細胞は、対照である感染されて
いないＲＢＥＣ１細胞に比べ、ジペプチドの取込み量が
有意に増加した。
における［3Ｈ］ジペプチドの取込み］ 上記実施例１と同様にして、トランスポータＰＥＰＴ１
遺伝子を組み込んだ発現アデノウイルスベクター（AdhP
EPT1-EYFP）を構築し、培養株化ラット脳毛細血管内皮
細胞（ＲＢＥＣ１）に感染させた。次に、上記実施例３
−３に準じて、ディッシュ法によるＰＥＰＴ１発現ＲＢ
ＥＣ１細胞における［3Ｈ］ＧｌｙＳａｒの取込みにつ
いて調べた。結果を図１４に示す。図１４に示されるよ
うに、発現ベクター（AdhPEPT1-EYFP）で感染されたＰ
ＥＰＴ１発現ＲＢＥＣ１細胞は、対照である感染されて
いないＲＢＥＣ１細胞に比べ、ジペプチドの取込み量が
有意に増加した。
【００５３】
【発明の効果】本発明の臓器感染用トランスポーター強
制発現ベクターを用いると、各種臓器が本来有していな
い物質輸送機能を特定の臓器に付与し、該臓器への薬
剤、栄養物質等の有用物質の取込み輸送を促進したり、
あるいは該臓器から排泄物質等の排出輸送を促進するこ
とができる。
制発現ベクターを用いると、各種臓器が本来有していな
い物質輸送機能を特定の臓器に付与し、該臓器への薬
剤、栄養物質等の有用物質の取込み輸送を促進したり、
あるいは該臓器から排泄物質等の排出輸送を促進するこ
とができる。
【図１】本発明における組換えアデノウイルスの構築シ
ステムを示す図である。
ステムを示す図である。
【図２】本発明におけるシャトルベクター及びアデノウ
イルスのバックボーンベクターを示す図である。
イルスのバックボーンベクターを示す図である。
【図３】大腸菌での相同組換えによる本発明の組換えア
デノウイルスプラスミドの構築を示す図である。
デノウイルスプラスミドの構築を示す図である。
【図４】本発明の発現ベクター構築の相同組換えに用い
る pAdTrack-CMV-OAT1 の電気泳動の結果を示す図であ
る。
る pAdTrack-CMV-OAT1 の電気泳動の結果を示す図であ
る。
【図５】本発明の発現ベクター構築の相同組換えに用い
る pAdTrack-CMV-OAT1 の直鎖化ＤＮＡの電気泳動の結
果を示す図である。
る pAdTrack-CMV-OAT1 の直鎖化ＤＮＡの電気泳動の結
果を示す図である。
【図６】ラットＯＡＴ１の pAdEasy-1 ベクターへの相
同組換えの結果を示す図である。
同組換えの結果を示す図である。
【図７】本発明の発現ベクター pAd-OAT1の電気泳動の
結果を示す図である。
結果を示す図である。
【図８】ラットＯＡＴ１特異的プライマーを用いたＰＣ
Ｒの結果を示す図である。
Ｒの結果を示す図である。
【図９】本発明の発現ベクター pAd-OAT1をＨＥＫ２９
３細胞へトランスフェクションした結果を示す図であ
る。
３細胞へトランスフェクションした結果を示す図であ
る。
【図１０】本発明の発現ベクター pAd-OAT1をＣａｃｏ
−２細胞へトランスフェクションした結果を示す図であ
る。
−２細胞へトランスフェクションした結果を示す図であ
る。
【図１１】ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3
Ｈ］ＰＡＨの取込み結果を示す図である。
Ｈ］ＰＡＨの取込み結果を示す図である。
【図１２】ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞における［3
Ｈ］ＰＡＨの透過性の結果を示す図である。
Ｈ］ＰＡＨの透過性の結果を示す図である。
【図１３】ＯＡＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞におけるペニ
シリンＧ存在下における［3Ｈ］ＰＡＨの透過性の結果
を示す図である。
シリンＧ存在下における［3Ｈ］ＰＡＨの透過性の結果
を示す図である。
【図１４】ＰＥＰＴ１発現ＲＢＥＣ１細胞における［3
Ｈ］ジペプチドの取込み結果を示す図である。
Ｈ］ジペプチドの取込み結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 DA06 EA02 EA04 FA01 FA10 GA14 GA19 HA01 HA17 4B065 AA90X AA91Y AA95X AB01 AC14 BA01 BA03 CA24 CA44 CA46
Claims (23)
- 【請求項１】 目的とするトランスポーター遺伝子を含
む発現ベクターであって、該目的トランスポーター遺伝
子が本来発現していない臓器に、該目的トランスポータ
ー遺伝子を強制発現させるために用いられることを特徴
とする臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。 - 【請求項２】 トランスポーター遺伝子が有機アニオン
トランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項
１記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクタ
ー。 - 【請求項３】 トランスポーター遺伝子が有機カチオン
トランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項
１記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクタ
ー。 - 【請求項４】 トランスポーター遺伝子がペプチドトラ
ンスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項１記
載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。 - 【請求項５】 トランスポーター遺伝子を含む発現ベク
ターが、トランスポーター遺伝子とマーカー遺伝子を含
む発現ベクターであることを特徴とする請求項１〜４の
いずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベ
クター。 - 【請求項６】 マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質を
コードするＤＮＡであることを特徴とする請求項５記載
の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。 - 【請求項７】 発現ベクターが、アデノウイルスベクタ
ーであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載
の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。 - 【請求項８】 トランスポーター遺伝子が本来発現して
いない臓器が小腸であることを特徴とする請求項１〜７
のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現
ベクター。 - 【請求項９】 トランスポーター遺伝子が本来発現して
いない臓器が大腸であることを特徴とする請求項１〜７
のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現
ベクター。 - 【請求項１０】 トランスポーター遺伝子が本来発現し
ていない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求
項１〜７のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター
強制発現ベクター。 - 【請求項１１】 目的とするトランスポーター遺伝子を
含む発現ベクターを、該目的トランスポーター遺伝子が
本来発現していない臓器に強制発現させることを特徴と
する臓器における物質輸送能を付与・促進する方法。 - 【請求項１２】 トランスポーター遺伝子が有機アニオ
ントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求
項１１記載の臓器における物質輸送能を付与・促進する
方法。 - 【請求項１３】 トランスポーター遺伝子が有機カチオ
ントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求
項１１記載の臓器における物質輸送能を付与・促進する
方法。 - 【請求項１４】 トランスポーター遺伝子がペプチドト
ランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項１
１記載の臓器における物質輸送能を付与・促進する方
法。 - 【請求項１５】 トランスポーター遺伝子を含む発現ベ
クターが、トランスポーター遺伝子とマーカー遺伝子を
含む発現ベクターであることを特徴とする請求項１１〜
１４のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与・
促進する方法。 - 【請求項１６】 マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質
をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１５
記載の臓器における物質輸送能を付与・促進する方法。 - 【請求項１７】 発現ベクターが、アデノウイルスベク
ターであることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれ
か記載の臓器における物質輸送能を付与・促進する方
法。 - 【請求項１８】 トランスポーター遺伝子が本来発現し
ていない臓器が小腸であることを特徴とする請求項１１
〜１７のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与
・促進する方法。 - 【請求項１９】 トランスポーター遺伝子が本来発現し
ていない臓器が大腸であることを特徴とする請求項１１
〜１７のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与
・促進する方法。 - 【請求項２０】 トランスポーター遺伝子が本来発現し
ていない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求
項１１〜１７のいずれか記載の臓器における物質輸送能
を付与・促進する方法。 - 【請求項２１】 臓器における物質輸送が、該臓器にお
ける物質の取込み制御輸送であることを特徴とする請求
項１１〜２０のいずれか記載の臓器における物質輸送能
を付与・促進する方法。 - 【請求項２２】 臓器における物質輸送が、該臓器にお
ける物質の排出制御輸送であることを特徴とする請求項
１１〜２０のいずれか記載の臓器における物質輸送能を
付与・促進する方法。 - 【請求項２３】 請求項１〜１０のいずれか記載の臓器
感染用トランスポーター強制発現ベクターを用いること
により、物質輸送能が付与・促進された人工臓器。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000308880A JP2002112769A (ja) | 2000-10-10 | 2000-10-10 | 臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター |
| PCT/JP2001/008894 WO2002031139A1 (fr) | 2000-10-10 | 2001-10-10 | Vecteur d'expression de transporteur compulsif pour infection organique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000308880A JP2002112769A (ja) | 2000-10-10 | 2000-10-10 | 臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002112769A true JP2002112769A (ja) | 2002-04-16 |
Family
ID=18789129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000308880A Pending JP2002112769A (ja) | 2000-10-10 | 2000-10-10 | 臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002112769A (ja) |
| WO (1) | WO2002031139A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150043555A (ko) * | 2012-09-11 | 2015-04-22 | 코닝 인코포레이티드 | 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 |
| CN114736871A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-07-12 | 中山康晟生物技术有限公司 | 一种腺病毒包装wayne293 lvpro动物细胞培养方法 |
-
2000
- 2000-10-10 JP JP2000308880A patent/JP2002112769A/ja active Pending
-
2001
- 2001-10-10 WO PCT/JP2001/008894 patent/WO2002031139A1/ja active Search and Examination
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150043555A (ko) * | 2012-09-11 | 2015-04-22 | 코닝 인코포레이티드 | 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 |
| KR102113239B1 (ko) | 2012-09-11 | 2020-05-21 | 코닝 인코포레이티드 | 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 |
| KR20200057096A (ko) * | 2012-09-11 | 2020-05-25 | 코닝 인코포레이티드 | 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 |
| KR102211189B1 (ko) | 2012-09-11 | 2021-02-03 | 코닝 인코포레이티드 | 약물 트랜스포터 단백질(들) 및/또는 약물대사 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 일시적으로 과발현하는 소모성 냉동보존 세포 |
| CN114736871A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-07-12 | 中山康晟生物技术有限公司 | 一种腺病毒包装wayne293 lvpro动物细胞培养方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002031139A1 (fr) | 2002-04-18 |
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