DE102017219981A1

DE102017219981A1 - Transgenes Insekt und dessen Verwendung in Verfahren zur Testung von natürlichen oder synthetischen Substanzen

Info

Publication number: DE102017219981A1
Application number: DE102017219981.4A
Authority: DE
Inventors: Anne Nies; Bernard Moussian; Yiwen Wang; Bernard Spengler; Elke Schaeffeler; Matthias Schwab
Original assignee: Robert Bosch Gesellschaft fuer Medizinische Forschung mbH; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Current assignee: Robert Bosch Gesellschaft fuer Medizinische Forschung mbH; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2019-05-09
Also published as: EP3706560A1; WO2019091966A1; US20200260700A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes Insekt, dessen Genom zumindest eine erste exogene DNA-Sequenz aufweist, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, wobei die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz zu einem funktionalen humanen Membrantransporterprotein in dem transgenen Insekt führt, sowie Verwendungen des transgenen Insekts und Verfahren zur Testung von natürlichen oder synthetischen Substanzen unter Verwendung des transgenen Insekts.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes Insekt, dessen Genom eine exogene DNA-Sequenz aufweist. Ferner betrifft die Erfindung eine Verwendung eines Vektors zur Generierung eines transgenen Insekts, sowie Verfahren zur Testung von natürlichen oder synthetischen Substanzen unter Verwendung des transgenen Insekts.
Stand der Technik
In der Medikamentenentwicklung sind Informationen über klinische Faktoren wie die Blut- und Gewebekonzentration von Arzneimitteln und pharmakologischen Wirkstoffen sowie deren Metaboliten von höchster Wichtigkeit. Dieses Wissen trägt im Wesentlichen dazu bei, die therapeutische Wirksamkeit und das Auftreten von Nebenwirkungen besser verstehen zu können (Giacomini et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010).
Dabei spielen insbesondere Membrantransporterproteine (oder membranständige Transporterproteine) eine wichtige Rolle, da diese in der Lage sind, die Absorption, Distribution und Elimination auch von Wirkstoffen entscheidend zu beeinflussen. Diese Transporterproteine sind integrale Bestandteile der Lipiddoppelschicht von biologischen Membranen. Sie steuern bzw. kontrollieren den Transport zahlreicher Substanzen in die Zellen hinein (Influx) oder aus ihnen heraus (Efflux). Der Substanzaustausch durch diese Membrantransporterproteine kann entweder passiv erleichtert werden oder aktiv erfolgen.
So sind bspw. Membrantransporter wichtige Determinanten der Pharmakokinetik, also der Aufnahme eines Wirkstoffes (Resorption), seiner Verteilung im Körper (Distribution), seiner biochemischen Um- und Abbaus (Metabolisierung) sowie seiner Ausscheidung (Exkretion). Beispielsweise ist bekannt, dass unter den Top 200 der verschreibungspflichtigen Medikamente in den USA, welche über die Niere eliminiert werden, etwa 41% mit Membrantransportern interagieren (Morrissey et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013). Insbesondere sind sekretorische Membrantransporter wichtige Determinanten der Disposition von Fremdstoffen (Xenobiotika), darunter viele verschreibungspflichtige Medikamente.
Aufgrund dessen fordern sowohl die EMA (European Medicines Agency) als auch die FDA (Food and Drug Administration) die Prüfung von derzeit elf relevanten Membrantransportern des Menschen auf mögliche Wechselwirkungen mit neuartigen bzw. neu zuzulassenden Arzneimitteln (Guideline on the investigation of drug interactions, European Medicines Agency, 2012; FDA draft guidance. Drug interaction studies - study design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations, 2012). Diese Tests sind ein wesentlicher und zwingender Teil des präklinischen Arzneimittelentwicklungsprozesses. Beispielsweise lässt sich mit in-vitro Systemen das Wirkstoff-Substratprofil von Membrantransporterproteinen weitestgehend vorhersagen. Für in-vitro Modelle eignen sich bspw. Säugetierzelllinien, die rekombinant human Membrantransporterproteine exprimieren. In Kultur bilden sie eine einzellige Schicht, an der sich die Permeabilität und der Transport von Wirkstoffen untersuchen lassen. Ein weiterer etablierter Test ist das Mausmodell. Hierbei handelt es sich allerdings um ein in-vivo Testsystem.
Die derzeit angewendeten Testsysteme haben jedoch zahlreiche Nachteile. Die Systeme sind zeit- und kostenintensiv. Hierbei ist insbesondere die Bereitstellung des jeweiligen Systems sehr aufwendig. Ferner fallen hohe Betriebs- und Haltungskosten an, bspw. für die große Anzahl von Mäusen, die mit genetisch veränderten Membrantransportern zuvor gezüchtet werden müssen. Nicht zu vernachlässigen sind auch die ethischen Bedenken, die stets bedacht werden müssen, wenn eine Durchführung einer Vielzahl an Mausexperimenten notwendig ist.
Aus diesem Grund besteht ein dringender Bedarf an schnellen und kostengünstigen Testsystemen, um die Auswirkung von Membrantransporterproteinen des Menschen im Arzneimittelentwicklungsprozess präklinisch aufzuklären. Das System sollte dabei die im Stand der Technik vorherrschenden Nachteile überwinden können.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Modell oder Testsystem bereitzustellen, mit welchem die vorstehend genannten Nachteile aus dem Stand der Technik vermindert oder gänzlich vermieden werden können. Erfindungsgemäß werden diese und andere Ziele erreicht durch ein transgenes Insekt, dessen Genom zumindest eine erste exogene DNA-Sequenz aufweist, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, wobei die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz zu einem funktionalen humanen Membrantransporterprotein in dem transgenen Insekt führt.
Ferner wird das Ziel erreicht durch die Verwendung eines Vektors zur Generierung transgener Insekten, vorzugsweise transgener Drosophila, wobei der Vektor eine erste DNA-Sequenz aufweist, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere ein Aufnahme-Transporterprotein oder ein Efflux-Transporterprotein ist, insbesondere bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: OCT1 (Gensymbol: SLC22A1), OCT2 (SLC22A2), OATP1B1 (SLCO1B1), OATP1B3 (SLCO1B3), OAT1 (SLC22A6), OAT3 (SLC22A8), MDR1 (ABCB1), BSEP (ABCB11), BCRP (ABCG2), MATE1 (SLC47A1), MATE2 (ALC47A2), oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Vorliegend und allgemein versteht man unter einem „transgenen Insekt“ ein Insekt, dessen Erbanlagen mittels genetischer Methoden gezielt verändert worden ist. Hierbei kann ein Transgen in das Insekt eingeschleust werden. Erfindungsgemäß eignet sich als transgenes Insekt bevorzugt ein Modellorganismus, beispielsweise Drosophila. Um ein solches transgenes Insekt zu erhalten, werden Vektoren, die ein spezifisches Fremdgen enthalten, in eine befruchtete Eizelle eingebracht. Die erhaltenen Nachkommen sind mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit transfiziert und können anschließend nach dem Fremdgen gescreent werden. Das transgene Insekt kann auch durch gezielte Kreuzung erhalten werden. Ferner kann das transgene Insekt auch erhalten werden durch Einschleusung eines Transgens in das Insekt und anschließender Kreuzung mit einem weiteren Insekt, welches u.U. genetisch verändert ist. Erfindungsgemäß kann das transgene Insekt durch sämtliche im Stand der Technik bekannten Methoden, zur Veränderung von Genen in Organismen, erhalten werden.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Fremdgen bzw. Transgen um eine erste exogene DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert.
Bei den „humanen Membrantransporterproteinen“ handelt es sich um solche, die natürlicherweise im menschlichen Genom vorkommen. So sind bspw. für die Absorption von Stoffen im Menschen vor allem die Aufnahmetransporter im Magen-Darm-Trakt bedeutend. Hierzu zählen neben den auf Nährstoffe spezialisierten Aminosäure-, Peptid-, Glukose-, Nukleotid- oder Fettsäuretransportern auch die organischen Anionen-Transporterpolypeptide (OATP) und die organischen Kationen-Transporterproteine (OCT). Effluxtransporter im Epithel des Gastrointestinaltrakts wie die ABC-Proteine (ATP binding cassette proteins) senken dagegen die Absorption und somit die orale Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe, die an die Transporter binden und von diesen aus den Zellen heraustransportiert werden. Für die Elimination durch die Leber entscheidend sind vor allem Membrantransporterproteine wie organische Anionen-Transporterpolypeptide (OATP) organische Kationen-Transporterproteine (OCT) sowie das P-Glykoprotein (MDR1 P-gp), der Gallensalz-Effluxtransporter (BSEP) und das Breast Cancer Resistance Protein (BCRP). Für die Elimination durch die Niere entscheidend sind vor allem Transporterproteine wie organische Anionentransporter (OAT), organische Kationen-Transporterproteine (OCT) sowie Multidrug Resistance and Toxin Extrusion Proteine (MATE). Auch in anderen Zellmembranen, besonders an biologischen Barrieren wie der Blut-Hirn- oder der Blut-Plazenta-Schranke, sind spezielle Transporterproteine vorhanden, um den Stoffaustausch zu regulieren.
Entsprechend ist gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das humane Membrantransporterprotein ein humanes Aufnahme-Transporterprotein oder ein humanes Efflux-Transporterprotein ist, und insbesondere ein Membrantransporterprotein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1 (Gensymbol: SLC22A1), OCT2 (SLC22A2), OATP1B1 (SLCO1B1), OATP1B3 (SLCO1B3), OAT1 (SLC22A6), OAT3 (SCL22A8), MDR1 (ABCB1), BSEP (ABCB11), BCRP (ABCG2), MATE1 (SLC47A1), MATE2 (SLC47A2) oder eine genetische Variante dieser Transporter. Diese Aufnahme- und Efflux-Transporterproteine, werden, wie bereits oben erwähnt, im Rahmen vorklinischer Arzneimitteluntersuchungen auf ihre Wechselwirkung mit den jeweiligen zu untersuchenden Substanzen herangezogen. Bei den Proteinen handelt es sich um organische Kationen-Transporterproteine (OCT), organische Anionen-Transporterpolypeptide (OATP), organische Anionentransporter (OAT), P-Glykoprotein auch bekannt als Multidrug-Resistance-Protein (MDR1), Gallensalz-Effluxtransporter (BSEP), Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) sowie Multidrug und Toxin Extrusion Proteine (MATE). Die Sequenzen dieser und weiterer Membrantransporterprotein-Gene sind bekannt, und bspw. unter www.genenames.org einsehbar.
So ist bspw. gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn ein Membrantransporterprotein eingesetzt wird, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer der Sequenzen aus 5 ausgewählt ist, oder aus einer für diese Sequenzen codierenden DNA-Sequenz. In 5 sind beispielhaft Aminosäuresequenzen von Membrantransporterproteinen gezeigt, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung für die beschriebenen Zwecke und Verfahren geeignet sein können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vorliegend unter einer „DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransportprotein codiert“ jedes doppelsträngige Nukleinsäuremolekül verstanden, das für ein humanes Membrantransportprotein codiert.
Bei einer „genetischen Variante“ eines humanen Membrantransporterproteins handelt es sich erfindungsgemäß und nach dem Wissen und der Erfahrung eines Durchschnittsfachmanns um ein natürliches Protein, das sich in seiner Aminosäuresequenz von der Wildtyp- bzw. Referenzsequenz unterscheidet und bspw. durch den Austausch, die Deletion oder die Insertion von einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren gekennzeichnet ist. Eine genetische Variante eines humanen Membrantransporterprotein weist jedoch bevorzugt weiterhin die gleiche Funktion auf wie das natürlich vorkommende humane Membrantransporterprotein mit der Wildtyp- bzw. Referenzsequenz.
Bei den genetischen Varianten kann es sich um solche Varianten handeln, die natürlich auftreten oder gezielt eingeführt werden. Die Varianten können dabei bereits auf der zu transkribierenden DNA liegen und so zu einer Variante der gelisteten Proteine führen.
Gemäß einer Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das transgene Insekt zumindest 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr exogene DNA-Sequenzen aufweist, die jeweils für ein humanes Membrantransporterprotein kodieren, wobei die Expression der exogenen DNA-Sequenzen zu funktionalen humanen Membrantransporterproteinen in dem transgenen Insekt führt.
Unter einer „exogenen DNA-Sequenz“ wird dabei jede DNA-Sequenz verstanden, die in dem betreffenden Insekt nicht natürlich, d.h. ohne genetische Modifizierung des Insekts vorkommt, und die aus einem anderen Organismus, hier dem Menschen, in das Genom des Insekts transferiert und dort stabil eingebaut wird. Entsprechend bedeutet „eine exogene DNA-Sequenz aufweisen“, dass die DNA-Sequenz eines anderen Organismus (hier: des Menschen) in dem Insekt, d.h. in dem Genom des Insekts, zu dessen Expression eingebaut wurde und dort stabil integriert vorliegt.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz des humanen Membrantransporterproteins in dem Insekt gewebespezifisch, insbesondere Speicheldrüsengewebe-spezifisch, Darmsystemgewebe-spezifisch, Tracheengewebe-spezifisch oder Malpighigewebe-spezifisch.
Erfindungsgemäß ist die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz des humanen Membrantransporterproteins in den transgenen Insekten gewebespezifisch. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung der humanen Membrantransporter. Sofern die Expression nur in einem Gewebe erfolgt, kann dieses Gewebe separat untersucht werden, sodass Störfaktoren wie die Überexpression im gesamten Insekt vermieden werden können.
Ferner bietet diese Ausgestaltung den Vorteil, dass das exprimierte humane Membrantransporterprotein gewebespezifisch untersucht werden kann. Dies ermöglicht beispielsweise die Untersuchung von Membrantransporterproteinen in der Speicheldrüse, im Darm, in den Tracheen oder im Malpighigewebe. Weitere beliebige Kombinationen, welche gewebeunspezifisch sind, sind auch möglich.
Insbesondere die Speicheldrüsengewebe-Spezifität ist vorteilhaft, da das Zielgewebe der Speicheldrüse bei embryonalen und frühen Larvenstadien nicht essentiell ist, sodass eine Gewebemanipulation, einschließlich der Expression von menschlichen Proteinen und deren Funktionsanalysen, ohne die Beeinflussung der Fitness und Lebensfähigkeit der Embryonen einhergehen kann. Darüberhinaus sind die Epithelzellen der Speicheldrüse polar und ähneln daher den menschlichen Leber- oder Nierenzellen, die hauptsächlich klinisch relevante menschliche Membrantransporter exprimieren, zum Beispiel OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3 und MDR1.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das transgene Insekt eine Taufliege, insbesondere eine, die zur Gattung Drosophila gehört.
Drosophila ist eine Gattung aus der Familie der Taufliegen (Drosophilidae). Zu dieser Gattung gehört auch die Taufliege Drosophila melanogaster, die als gängiger Modellorganismus in der Genetik bekannt ist. Besonders vorteilhaft an diesem Modellsystem ist, dass diese Fliegenart sehr einfach und billig zu züchten ist. In der Genforschung wird Drosophila bevorzugt als Forschungsobjekt verwendet, weil sie eine kurze Generationsfolge von nur etwa 9 bis 14 Tagen aufweist, aus einer Generation bis zu 400 Nachkommen entspringen, jedes Individuum nur vier Chromosomenpaare besitzt und weil die Art viele leicht erkennbare Genmutationen zeigt. Im Vergleich dazu sind Modellsysteme, welche auf einem Säugetier beruhen, deutlich teurer und aufwendiger.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, unter Kontrolle eines gewebespezifischen GAL4/UAS-Expressionssystems, insbesondere unter Kontrolle eines Speicheldrüsengewebe-spezifischen, Darmsystemgewebe-spezifischen, Tracheengewebe-spezifischen oder Malpighigewebe-spezifischen GAL4/UAS-Expressionssystems Desweiteren ist es auch möglich, die erste exogene DNA-Sequenz mithilfe des Q-Systems (Potter et al., Cell 2010) zu exprimieren.
Mit dem GAL4/UAS-System steht ein genetisches Werkzeug zur Verfügung, welches die Expression von Fremdgenen in spezifisch ausgewählten Zellen bzw. Geweben erlaubt. Dafür werden zwei Module verwendet. Zum einen wird der GAL4-Genaktivator der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) unter die Kontrolle spezifischer regulatorischer Elemente kloniert. GAL4 kodiert für einen hefespezifischen Transkriptionsfaktor, desse Expression unter der Kontrolle eines zell- oder gewebespezifischen Promotors aus der Fliege steht. Das andere Modul enthält das Gen, welches für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, und steht unter der Kontrolle von UAS-Elementen (upstream activating sequences), den Zielsequenzen des GAL4-Genregulators. Die spezifische Bindung des GAL4 an die so genannte UAS sorgt für die Aktivierung des downstream gelegenen Zielgens, das für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert. Durch die Kreuzung von GAL4-Linien und solchen Linien, die das Zielgen tragen, können derartige Systeme hergestellt werden.
Das GAL4/UAS-System ist vorteilhafterweise anwendbar in Insekten, insbesondere in Drosophila. Erfindungsgemäß können GAL4-Linien, welche gewebespezifisch exprimieren, zur Gewinnung eines transgenen Insekts gemäß dieser Ausgestaltung eingesetzt werden. Dabei wird das GAL4 nur in den spezifischen Geweben exprimiert. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das Genom des transgenen Insekts zumindest eine zweite exogene DNA-Sequenz auf, die für ein fluoreszierendes Protein kodiert, insbesondere für ein fluoreszierendes Protein, das ausgewählt ist aus GFP, CFP, YFP, mCherry, dsRed oder Varianten dieser.
Gemäß dieser Ausführungsform ist es vorteilhafterweise möglich durch die Fluoreszenz der jeweiligen Proteine, die in den jeweiligen Geweben spezifisch exprimiert werden können, die räumliche und zeitliche Verteilung in lebenden Organismen direkt beobachten zu können. Beispielsweise kann das fluoreszierende Protein als Marker für ein Protein, bspw. des humanen Membrantransporterproteins, genutzt werden oder um das Gewebe, in dem das humane Membrantransporterprotein exprimiert wird, sichtbar zu machen. Hierbei kann die erste exogene DNA-Sequenz mit der zweiten exogenen DNA-Sequenz verbunden sein. Die Proteine und damit die biologischen Prozesse können in-vivo somit sichtbar gemacht werden bspw. mittels Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserrastermikroskopie.
Als fluoreszierende Proteine eignen sich unter anderem folgende UV-Proteine wie bspw. Sirius, Sandercyanin, shBFP-N158S/L173l; blaue Proteine wie bspw. Azurite, EBFP2, mKalama1, mTagBFP2, TagBFP, shBFP; Cyan Proteine wie bspw. ECFP, Cerulean, mCerulean3, SCFP3A, CyPet, mTurquoise, mTurquoise2, TagCFP, mTFP1, monomeric Midoriishi-Cyan, Aquamarine; grüne Proteine wie bspw. TurboGFP, TagGFP2, mUKG, Superfolder GFP, Emerald, EGFP, Monomeric Azami Green, mWasabi, Clover, mNeonGreen, NowGFP, mClover3; gelbe Proteine wie bspw. TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, SYFP2, Citrine, Ypet, lanRFP-AS83, mPapaya1, mCyRFP1; orangene Proteine wie bspw. Monomeric Kusabira-Orange, mOrange, mOrange2, mKO_K, mKO2; rote Proteine wie bspw. TagRFP, TagRFP-T, mRuby, mRuby2, mRuby3, mTangerine, mApple, mStrawberry, FusionRed, mCherry, mNectarine, mScarlet, mScarlet-l; dunkelrote Proteine wie bspw. mKate2, HcRed-Tandem, mPlum, mRaspberry, mNeptune, NirFP, TagRFP657, TagRFP675, mCardinal, mStable, mMaroon1, mGarnet2; nahe IR Proteine wie bspw. iFP1.4, iRFP713 (iRFP), iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP720, iFP2.0, mlFP, TDsmURFP, miRFP670; Saphire-typ Proteine wie bspw. Sapphire, T-Sapphire, mAmetrine; oder lange Stoke-Shift Proteine wie bspw. mKeima, mBeRFP, LSS-mKate1, LSS-mKate2, LSSmOrange, CyOFP1, Sandercyanin.
Varianten des fluoreszierenden Proteins können beispielsweise die Redox-sensitiven Varianten des GFP sein; zu nennen wären hierbei RoGFP, rxYFP oder HyPer. Ferner sind spannungsabhängige GFP-Varianten wie das PROPS oder die VSFP bekannt. Als Variante des fluoreszierenden Proteins werden erfindungsgemäß auch solche Proteine verstanden, die natürlichen Ursprungs sind, aber auf Grund von Mutationen verändert vorliegen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Generierung eines transgenen Insekts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

a) Subklonieren einer ersten exogenen DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, in einen Expressionsvektor zum Erhalt eines die erste exogene DNA-Sequenz aufweisenden Vektors;
b) Einbringen des in Schritt a) gewonnen Vektors in ein Insekt, zum Erhalt eines stabilen Stammes eines transgenen Vorläuferinsekts; und
c) Kreuzung des transgenen Vorläuferinsekts mit einem Insekt, das ein an den Expressionsvektor angepasstes Expressionssystem aufweist, zum Erhalt des transgenen Insekts.

Gemäß dieser Ausgestaltung der Erfindung lässt sich schnell und sicher ein transgenes Insekt herstellen. Bei dem Subklonieren wird die erste exogene DNA-Sequenz in eine andere DNA-Sequenz, den Expressionsvektor, eingebracht. Hierfür können die exogene DNA-Sequenz sowie der Expressionsvektor mit Hilfe von Restriktionsenzymen spezifisch geschnitten werden, um so genannte komplementäre „sticky-Ends“ oder „glatte“ „blunt-Ends“ zu erhalten, welche anschließend miteinander ligiert werden können, sodass der gewünschte Expressionsvektor erhalten wird. Die Ligation kann dabei mit Hilfe von DNA-Ligasen durchgeführt werden. Das Einbringen der ersten exogenen DNA-Sequenz in den Expressionsvektor kann auch durch andere Verfahren, bspw. das In-Fusion Cloning System (Takara Bio USA Inc.), erfolgen.
Erfindungsgemäß können als Expressionsvektoren Plasmide, Cosmide oder YACs und modifizierte Viren eingesetzt werden; bevorzugt wird ein Plasmidvektor verwendet.
Beispielsweise kann ein UAS-geeigneter Vektor verwendet werden. Dies ermöglicht die Anwendung des GAL4/UAS-Systems bei der Generierung eines transgenen Insekts. Ferner kann der Vektor eine Gensequenz aufweisen, die für einen bestimmten Phänotypen kodiert. Hierdurch kann vorteilhafterweise eine spätere Selektion von transgenen Vorläuferinsekten anhand des Phänotypen durchgeführt werden. Der ausgeprägte Phänotyp dient dabei als Selektionsmarker. Mutationen, die zu einem veränderten Phänotypen führen können, betreffen bspw. die Augenfarbe, die Körperfarbe, die Morphologie des Auges, die Morphologie von Extremitäten, einschließlich der Flügel, der Körperborsten, der Körperfarben etc.
In einer bevorzugten Ausgestaltung kann das humane Membrantransportergen in die attP Attachement-Site im Expressionsvektor eingeführt werden, sodass beispielsweise ein pUASTattB-Expressionsvektor erhalten wird.
Im nächsten Schritt, dem Schritt b), erfolgt das Einbringen des hergestellten Vektors in ein Insekt. Dabei kann der Vektor in ein Insektenembryonen mikroinjiziert werden. Der stabile Stamm eines transgenen Vorläuferinsekts kann anschließend mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit erhalten werden. Sofern der Expressionsvektor einen Selektionsmarker aufweist, können die transgenen Vorläuferinsekten anhand dessen identifiziert werden und entsprechend aussortiert werden. Als Selektionsmarker können bspw. die Augenfarbe oder die Körperfarbe herangezogen werden.
Im letzten Schritt des Verfahrens zur Generierung eines transgenen Insekts wird das Vorläuferinsekt mit einem weiteren Insekt gekreuzt. Die beiden Insekten unterscheiden sich in ihrem Genom. Während das Vorläuferinsekt bereits das Gen des humanen Membrantransporterproteins enthält, weist das andere Insekt dieses Gen nicht auf. Bevorzugt handelt es sich bei dem letztgenannten Insekt um eine gewebespezifische Linie, dessen Expressionssystem an das des Vorläuferinsekts angepasst ist.
Die korrekt abgelaufene Kreuzung kann durch die Expression in den Nachkommen durch Reverse Transkriptase PCR bestätigt werden. Die Membranlokalisierung der humanen Transporterproteinen in den spezifischen Geweben kann durch Standardimmunfärbungstechniken mit validierten primären Antikörpern verifiziert werden. Beispielsweise können Immunfluoreszenzbilder durch konfokale Laserscanningmikroskopie erhalten werden.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens ist das Expressionssystem GAL4/UAS.
Vorteilhafterweise ist der Expressionsvektor, in welchem die erste exogene DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, subkloniert wird, geeignet zur Verwendung in einem GAL4/UAS-Expressionssystems. Bevorzugt weist der Expressionsvektor eine UAS auf. Durch die Kreuzung des Vorläuferinsekts, welches den Expressionsvektor mit der UAS aufweist, mit einer GAL4-Linie, welche zudem gewebespezifisch ist, kann die Expression der humanen Membrantransporterproteine einfach und sicher gesteuert werden.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens ist das transgene Insekt eine Drosophila und das in Schritt c) eingesetzte Insekt, das ein an den Expressionsvektor angepasstes Expressionssystem aufweist, ist eine GAL4 Drosophila-Linie.
Diese Ausführungsform ist bevorzugt, da bereits zahlreiche GAL4 Drosophila-Linien bekannt sind und sich eignen zur Kreuzung innerhalb eines UAS-Systems. Als GAL4-Linien können beispielsweise P(fkh-Gal4), P(GawB)34B oder P(GawB)C-765 eingesetzt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese eine Verwendung eines transgenen Insekts zur Testung von synthetischen oder natürlichen Verbindungen, insbesondere von Medikamenten und pharmakologischen Wirkstoffen.
Mit dieser Ausgestaltung kann durch das transgene Insekt ein neuartiges und kostengünstiges in-situ Assay-System bereitgestellt werden, das es ermöglicht, Wechselwirkung zwischen humanen Membrantransporterproteinen und synthetischen oder natürlichen Verbindungen, insbesondere Medikamenten und pharmakologische Wirkstoffe, zu untersuchen. So können die transgenen Insekten für pharmakologische Screenings eingesetzt werden. Die Wechselwirkung kann dabei durch verschiedene bildgebende Techniken untersucht werden, bspw. mittels Fluoreszenzspektroskopie.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung kann die Wechselwirkung mittels transporterspezifischen fluoreszierenden Tracersubstraten untersucht werden. Diese können in Embryonen der transgenen Insekten, die transparent sind und das humane Membrantransporterprotein exprimieren, injiziert werden. Anschließend kann die Aufnahme des fluoreszierenden Tracersubstrats in die Zellen oder Gewebe, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, beispielsweise durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Dabei kann verglichen werden, wie sich die jeweiligen fluoreszierenden Tracersubstrate in Abwesenheit bzw. Gegenwart der jeweiligen Untersuchungssubstanzen verhalten.
In diesem Zusammenhang können Substanzen, die mit einem Aufnahmetransporter interagieren, zu einer reduzierten Ansammlung des fluoreszierenden Tracers führen und damit zu einer reduzierten Fluoreszenz innerhalb der Zelle. Auf der anderen Seite können Substanzen, die mit einem Effluxtransporter wechselwirken, zu einer erhöhten Fluoreszenz in den jeweiligen Gewebezellen und einem reduzierten Fluoreszenzsignal im Gewebelumen führen.
Besonders vorteilhaft ist an diesem System, dass innerhalb von 30 Minuten bis zu 100 Fliegenembryos injiziert und gescreent werden können. Ferner ist besonders vorteilhaft, dass es sich bei dem Modellsystem um ein sehr kleines Insektenembryo handelt (0,5 mm), sodass sich dieses System zur automatisierten Analyse der Wirkstoffwechselwirkung mit den Membrantransporterproteinen eignet.
Das neue Assay-System, basierend auf den transgenen Insekten, kann in der Lage sein bereits bestehende Mausmodelle zu ersetzen, wodurch ein Modell geschaffen wird, welches ethisch unbedenklich ist.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Verwendung wird die Verbindung auf deren Wechselwirkung mit humanen Membrantransporterproteinen getestet, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante Transporter.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese eine Verwendung eines transgenen Insekts zur Testung der Funktion von humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Es versteht sich, dass die obigen Ausführungen, die im Hinblick auf die Membrantransporterproteine und das transgene Insekt getroffen wurden, auch für deren/dessen hier vorliegende beschriebene Verwendung sowie für Verfahren gelten, die erfindungsgemäß und wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden.
Neben der Wechselwirkung mit humanen Membrantransporterproteinen kann im gleichen Modellsystem auch die Funktion von humanen Membrantransporterproteinen untersucht werden. Die Funktion von humanen Membrantransporterproteinen wird bevorzugt in-situ untersucht. Dabei werden die jeweiligen zu untersuchenden Substanzen bevorzugt in die Insektenembryonen injiziert, wobei diese beispielsweise in Gelatine eingebracht sind. Anschließend werden optional in einem Kryostaten dünne Schnitte (typischerweise 20 µm dick) des jeweiligen Insekts in einem Kryostaten hergestellt. Anschließend wird eine Matrixsubstanz durch pneumatisches Spritzen auf die Embryonen oder deren Schnitte aufgebracht. Diese Matrix besteht aus kleinen organischen Molekülen, welche die eingebrachte Laserenergie absorbieren und für die Desorption und Ionisierung der Analyten sorgen. Die jeweiligen zu untersuchenden Substanzen können räumlich aufgelöst im Gewebe der Embryonen direkt durch die Verwendung einer Atmosphärendruck Scanning Microprobe Matrix-Assisted Laser Desorption lonization (SMALDI) lonenquelle gekoppelt mit beispielsweise einem Orbitalfallen-Massenspektrometer gemessen werden. Die erhaltenen Bilder und Daten können dazu verwendet werden, die räumliche Verteilung und Menge der zu untersuchenden Substanzen in den jeweiligen Geweben zu bestimmen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Testung einer zu untersuchenden synthetischen oder natürlichen Verbindung im Hinblick auf deren Wechselwirkung mit humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter, wobei das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen von Embryonen eines transgenen Insekts;
b) Einbringen einer ersten Tracersubstanz in die Embryonen und Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird; und/oder Messen der Akkumulation der Tracersubstanz im gewebespezifischen Lumen der Embryonen;
c) Einbringen einer zu untersuchenden synthetischen oder natürlichen Verbindung in die Embryonen durch Injektion in die Embryonen oder Inkubation der Embryonen in der gelösten Verbindung;
d) Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird; und/oder Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den gewebespezifischen Lumen der Embryonen; und
e) Bestimmung, anhand einer verminderten Akkumulation der Tracersubstanz oder einer unveränderten Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, ob die Verbindung mit einem Aufnahme-Membrantransporterprotein interagiert oder nicht; und/oder Bestimmung, anhand einer verminderten Akkumulation der Tracersubstanz oder einer unveränderten Akkumulation der Tracersubstanz in den gewebespezifischen Lumen der Embryonen, ob die Verbindung mit einem Efflux-Membrantransporterprotein interagiert oder nicht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist das gewebespezifische Lumen der Embryonen ausgewählt aus dem Speicheldrüsen-Lumen, Darm-Lumen, dem Lumen der Malpighi-Gefäßen, und dem Tracheenlumen der Embryonen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Messen der Akkumulation der Tracersubstanz im gewebespezifischen Lumen der Embryonen und/oder die Bestimmung, anhand einer verminderten Akkumulation der Tracersubstanz oder einer unveränderten Akkumulation der Tracersubstanz in den gewebespezifischen Lumen der Embryonen, ob die Verbindung mit einem Efflux-Membrantransporterprotein interagiert oder nicht, mithilfe der hoch-ortsauflösenden-bildgebenden Massenspektrometrie oder mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt das Einbringen der zu untersuchenden Verbindung in Schritt b) in einem Zeitraum von ca. 5 min bis 4 h, vorzugsweise ca. 60 min nach dem gleichzeitigen Einbringen der Tracersubstanz und einer zu untersuchenden Verbindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur direkten Testung der Funktion von humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter, wobei das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen von Embryonen eines transgenen Insekts;
b) Einbringen einer synthetischen oder natürlichen Verbindung in die Embryonen durch Injektion in die Embryonen oder Inkubation der Embryonen in der gelösten Verbindung; und
c) Messen des Vorliegens und/oder der Menge der in Schritt b) eingebrachten Verbindung in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird.

Dabei erfolgt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens das Messen der Akkumulation einer synthetischen oder natürlichen Verbindung in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, insbesondere in den Zellen der Speicheldrüsen oder anderer Zelltypen der Embryonen; und/oder das Messen der Akkumulation der synthetischen oder natürlichen Verbindung in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, insbesondere dem Speicheldrüsen-Lumen oder im Lumen von Darm, Malpighi-Gefäßen, Tracheen der Embryonen, mithilfe einer hoch-ortsauflösenden und/oder hochauflösend-bildgebenden Massenspektrometrie oder mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie.
Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist in ihrer Anwendung nicht auf die Details der Erstellung und Anordnung der Komponenten, die in der Beschreibung dargestellt oder in den Zeichnungen veranschaulicht sind, beschränkt. Die Erfindung ermöglicht andere Ausbildungsformen und kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Auch dient die hier verwendete Ausdrucksweise und Terminologie Beschreibungszwecken und ist nicht als einschränkend zu betrachten. Die Verwendung von „einschließlich“, „umfassend“ oder „aufweisend“, „enthaltend“, „beinhaltend“ und Variationen davon soll im vorliegenden Text das danach Aufgezählte sowie Äquivalente davon und Zusätzliches mit umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die keinesfalls als weiter einschränkend aufzufassen sind, weiter veranschaulicht. Der gesamte Inhalt aller in der vorliegenden Anmeldung zitierten Angaben (einschließlich Literaturstellen, ausgegebener Patente, veröffentlichter Patentanmeldungen und mitanhängiger Patentanmeldungen) wird hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich beliebiger Definitionen hierin, vorrangig.
Es folgt die Beschreibung der Figuren.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines Insektenembryos mit der ebenfalls schematisch dargestellten Speicheldrüse als beispielhaftes spezifisches Gewebe eines Insektenembryos (oben), sowie schematische Darstellungen beispielhafter Ausführungsformen des Einsatzes eines transgenen Insekts gemäß der vorliegenden Erfindung (unten), einmal mit einem Aufnahme-Membrantransporterprotein (A, B), und einmal mit einem Efflux-Membrantransporterprotein (C, D).
2 zeigt Immunfluoreszenzaufnahmen von Speicheldrüsen transgener Drosophila-Embryonen, die entweder die Referenzsequenz des humanen SLC22A1/OCT1-Proteins (SLC22A1 ref) oder verschiedene, im Menschen vorkommende genetische Varianten (z.B. SLC22A1 L160F; SLC22A1 G465R) exprimieren.
3A zeigt die Analyse der Aufnahme von fluoreszierendem Ethidiumbromid, einem Transportsubstrat von OCT1, in die Speicheldrüse von transgenen Drosophila-Embryonen, die entweder die Referenzsequenz des humanen SLC22A1/OCT1-Proteins (SLC22A1 ref) oder verschiedene, im Menschen vorkommende genetische Varianten (z.B. SLC22A1 L160F; SLC22A1 G465R), exprimieren.
3B zeigt die Ethidiumbromidaufnahme der Epidermis und der Speicheldrüse.
4A zeigt die Ethidiumbromidaufnahme in die Speicheldrüsen von transgenen Drosophila-Embryonen, die die Referenzsequenz des humanen SLC22A1/OCT1-Proteins exprimieren.
4B zeigt die Inhibierung der Ethidiumbromidaufnahme mit zunehmender Konzentration von Cimetidin.
5 zeigt Aminosäuresequenzen von beispielhaften Membrantransporterproteinen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, wobei hier die folgenden gezeigt sind OCT1 (SLC22A1) (A) (SEQ ID Nr. 1), OCT2 (SLC22A2) (B) (SEQ ID Nr. 2), OATP1B1 (SLCO1B1) (C) (SEQ ID Nr. 3), OATP1B3 (SLCO1B3) (D) (SEQ ID Nr. 4), OAT1 (SLC22A6) (E) (SEQ ID Nr. 5), OAT3 (SLC22A8) (F) (SEQ ID Nr. 6), MDR1 (ABCB1) (G) (SEQ ID Nr. 7), BSEP (ABCB11) (H) (SEQ ID Nr. 8), BCRP (ABCG2) (I) (SEQ ID Nr. 9), MATE1 (SLC47A1) (J) SEQ ID Nr. 10), MATE2 (SLC47A2) (K) (SEQ ID Nr. 11),

Ausführungsformen der Erfindung
In 1 ist im oberen Abschnitt ein Insektenembryo 10 (Drosophila) dargestellt, wobei anterior links und posterior rechts dargestellt ist. Ferner ist die Speicheldrüse 12 (salivary gland) des Insektenembryos schematisch eingezeichnet. Die Speicheldrüse im Insektenembryo besteht aus einem Epithelzellen-Monolayer, die ein Lumen bilden. An deren Basalseite kommen diese Zellen mit Blut (Hämolymphe) in Kontakt, und auf der Apikalseite sekretieren die Zellen Glycoproteine, die für die Substratadhäsion des Tieres erst während der Verpuppung benötigt werden, nicht jedoch im Embryo oder frühen Larvenstadien.
Im unteren Abschnitt von 1 sind vergrößerte Darstellungen von Speicheldrüsen als beispielhaftes spezifisches Gewebe zweier verschiedener Ausführungsformen von transgenen Insekten gezeigt: In A und B wird in dem transgegen Insekt ein humanes Aufnahme-Membrantransporterprotein exprimiert, und zwar gewebespezifisch, wohingegen in C und D ein Efflux-Membrantransporterprotein gewebespezifisch exprimiert wird.
In den 1 A, B ist gezeigt, dass das Aufnahme-Membrantransporterprotein in der Basalmembran exprimiert wird; das Membrantransportprotein nimmt den Tracer, der mittels Injektion zugeführt wird, auf (A). Eine simultane Zuführung (bspw. Injektion) eines fluoreszierenden Tracers und einer zu testenden Substanz, bspw. eines Arzneimittels, inhibiert die Akkumulierung des fluoreszierenden Tracers in der Speicheldrüse (B), wenn die zu untersuchende Substanz mit dem Aufnahme-Membrantransporterprotein interagiert.
In den 1C, D ist gezeigt, dass das Efflux-Membrantransporterprotein in der Apikalmembran exprimiert wird; dieses Membrantransportprotein transportiert den Tracer, der zunächst in die Speicheldrüsenzellen aufgenommen werden muss, in das Lumen der Speicheldrüse (C). Eine simultane Zuführung (bspw. Injektion) eines fluoreszierenden Tracers und einer zu testenden Substanz, bspw. eines Arzneimittels, inhibiert die Akkumulierung des fluoreszierenden Tracers in dem Lumen der Speicheldrüse und führt zu einer erhöhten Fluoreszenz der Speicheldrüsenzellen (D), wenn die zu untersuchende Substanz mit dem Efflux-Membrantransporterprotein interagiert.
In 2 ist gezeigt, dass mithilfe des GAL4/UAS Expressionssytems die Membrantransporterproteine OCT1/SLC22A1 Referenzsequenz und dessen Varianten L160F und G465R in den Speicheldrüsen von Drosophila melanogaster-Embryonen exprimiert werden. Die Embryonen wurden standardmäßig für 20 min in 4% Formaldehyd, bei Raumtemperatur und anschließendem mehrfachen Waschen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert. Mit Hilfe eines OCT1/SLC22A1-spezifischen Antikörpers und eines sekundären Antikörpers (Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse IgG, Invitrogen) wurden in Standardverfahren die OCT1-Proteine in den Embryonen detektiert. OCT1/SLC22A1 Referenzsequenz und die Variante L160F lokalisieren in der basalen und lateralen Zellmembran, wohingegen die Variante G465R im Zytoplasma zu finden ist. Im Wesentlichen zeigt dieser Versuch, dass humane Membrantransporterproteine in Fliegenembryonen so lokalisiert sind wie in humanen Zellen.
In 3 ist gezeigt, dass mithilfe des GAL4/UAS Expressionssytems die Membrantransporterproteine OCT1/SLC22A1 Referenzsequenz und dessen Varianten L160F und G465R in den Speicheldrüsen exprimiert von Drosophila melanogaster-Embryonen exprimiert werden. Die Speicheldrüsen sind zudem durch die gewebespezifische Expression von GFP gekennzeichnet. Diese lebenden Embryonen wurden mit 0.5 µM Ethidiumbromid injiziert. Die Akkumulation von Ethidiumbromid in den Speicheldrüsen wurde durch konfokale Laserraster-Mikroskopie sichtbar gemacht. Das Verhältnis des Signals in den Speicheldrüsenzellen und in den Epidermiszellen, die Ethidiumbromid natürlicherweise aufnehmen und damit den Hintergrund darstellen, dient dazu, die Effizienz der Aufnahme in die Speicheldrüsenzellen zu bestimmen. Unterschiede in der Aufnahme von Ethidiumbromid durch die Varianten bspw. von OCT1 Referenzsequenz lassen sich so feststellen.
In 4 ist gezeigt, dass mithilfe des GAL4/UAS Expressionssytems das Membrantransporterprotein OCT1/SLC22A1 Referenzsequenz in den Speicheldrüsen von Drosophila melanogaster-Embryonen exprimiert wird. Die Speicheldrüsen sind zudem durch die gewebespezifische Expression von GFP gekennzeichnet. Ethidiumbromid und Cimetidin wurden gleichzeitig in die ventrale Seite der Embryonen injiziert. Die Inhibition der Ethidiumbromidaufnahme durch Cimetidin ist konzentrationsabhängig. Die Wirkung von Cimetidin ist in Insekten die gleiche wie in humanen Zellen.
In 5 sind, wie oben bereits erwähnt, Aminosäuresequenzen von beispielhaften Membrantransportproteinen gezeigt, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Beispielhaft sind hier die Aminosäuresequenzen der folgenden Membrantransportproteine gezeigt: OCT1 (SLC22A1) (A), OCT2 (SLC22A2) (B), OATP1B1 (SLCO1B1) (C), OATP1B3 (SLCO1B3) (D), OAT1 (SLC22A6) (E), OAT3 (SLC22A8) (F), MDR1 (ABCB1) (G), BSEP (ABCB11) (H), BCRP (ABCG2) (I), MATE1 (SLC47A1) (J), MATE2 (SLC47A2) (K).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Giacomini et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010 [0002]
Morrissey et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013 [0004]

Claims

Transgenes Insekt, dessen Genom zumindest eine erste exogene DNA-Sequenz aufweist, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, wobei die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz zu einem funktionalen humanen Membrantransporterprotein in dem transgenen Insekt führt.
Transgenes Insekt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz des humanen Membrantransporterproteins in dem Insekt gewebespezifisch ist, insbesondere Speicheldrüsengewebe-spezifisch, Darmsystemgewebe-spezifisch, Tracheengewebe-spezifisch oder Malpighigewebe-spezifisch ist.
Transgenes Insekt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das transgene Insekt eine Taufliege ist, insbesondere eine, die zur Gattung Drosophila gehört.
Transgenes Insekt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das humane Membrantransporterprotein ein humanes Aufnahme-Transporterprotein oder ein humanes Efflux-Transporterprotein ist, insbesondere ein humanes Membrantransporterprotein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Transgenes Insekt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ersten exogenen DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, unter Kontrolle eines gewebespezifischen GAL4/UAS-Expressionssystems liegt, insbesondere unter Kontrolle eines Speicheldrüsengewebe-spezifischen, Darmsystemgewebe-spezifischen, Tracheengewebe-spezifischen oder Malpighigewebe-spezifischen GAL4/UAS-Expressionssystem.
Transgenes Insekt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Genom zumindest eine zweite exogene DNA-Sequenz aufweist, die für ein fluoreszierendes Protein kodiert, insbesondere für ein fluoreszierendes Protein, das ausgewählt ist aus GFP, CFP, YFP, mCherry, dsRed oder Varianten dieser.
Verwendung eines Vektors zur Generierung transgener Insekten, vorzugsweise transgener Drosophila, wobei der Vektor eine erste DNA-Sequenz aufweist, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere ein Aufnahme-Transporterprotein oder ein Efflux-Transporterprotein ist, insbesondere bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Verfahren zur Generierung eines transgenen Insekts nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Subklonieren einer ersten exogenen DNA-Sequenz, die für ein humanes Membrantransporterprotein kodiert, in einen Expressionsvektor zum Erhalt eines die erste exogene DNA-Sequenz aufweisenden Vektors; b) Einbringen des in Schritt a) gewonnenen Vektors in ein Insekt, zum Erhalt eines stabilen Stammes eines transgenen Vorläuferinsekts; und c) Kreuzung des transgenen Vorläuferinsekts mit einem Insekt, das ein an den Expressionsvektor angepasstes Expressionssystem aufweist, zum Erhalt des transgenen Insekts.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet dass das Expressionssystem GAL4/UAS ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das transgene Insekt eine Drosophila ist, und das in Schritt c) eingesetzte Insekt, das ein an den Expressionsvektor angepasstes Expressionssystem aufweist, eine GAL 4-Drosophila Linie ist.
Verwendung eines transgenen Insekts nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Testung von synthetischen oder natürlichen Verbindungen, insbesondere von Medikamenten und pharmakologischen Wirkstoffen.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung auf deren Wechselwirkung mit humanen Membrantransporterproteinen getestet wird, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Verwendung eines transgenen Insekts nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Testung der Funktion von humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter.
Verfahren zur Testung einer zu untersuchenden synthetischen oder natürlichen Verbindung im Hinblick auf deren Wechselwirkung mit humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter, wobei das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen von Embryonen eines transgenen Insekts; b) Einbringen einer ersten Tracersubstanz in die Embryonen und Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird; und/oder Messen der Akkumulation der Tracersubstanz im gewebespezifischen Lumen der Embryonen; c) Einbringen einer zu untersuchenden synthetischen oder natürlichen Verbindung in die Embryonen durch Injektion in die Embryonen oder Inkubation der Embryonen in der gelösten Verbindung; d) Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird; und/oder Messen der Akkumulation der Tracersubstanz in den gewebespezifischen Lumen der Embryonen, mithilfe einer hoch-ortsauflösenden, bildgebenden Massenspektrometrie oder mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie; und e) Bestimmung, anhand einer verminderten Akkumulation der Tracersubstanz oder einer unveränderten Akkumulation der Tracersubstanz in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, ob die Verbindung mit einem Aufnahme-Membrantransporterprotein interagiert oder nicht; und/oder Bestimmung, anhand einer verminderten Akkumulation der Tracersubstanz oder einer unveränderten Akkumulation der Tracersubstanz in den gewebespezifischen Lumen der Embryonen, ob die Verbindung mit einem Efflux-Membrantransporterprotein interagiert oder nicht, mithilfe einer hoch-ortsauflösenden, bildgebenden Massenspektrometrie oder mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Einbringen der zu untersuchenden Verbindung in Schritt b) in einem Zeitraum von ca. 5 min bis 4 h, vorzugsweise ca. 60 min, nach dem Einbringen der ersten Tracer-Substanz und einer zu untersuchenden Verbindung erfolgt.
Verfahren zur Testung der Funktion von humanen Membrantransporterproteinen, wobei das humane Membrantransporterprotein insbesondere bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OCT1, OCT2, OATP1 B1, OATP1 B3, OAT1, OAT3, MDR1, BSEP, BCRP, MATE1, MATE2 oder eine genetische Variante dieser Transporter, wobei das Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen von Embryonen eines transgenen Insekts nach einem der Ansprüche 1 bis 6;F b) Einbringen einer synthetischen oder natürlichen Verbindung in die Embryonen durch Injektion in die Embryonen oder Inkubation der Embryonen in der gelösten Verbindung; und c) Messen des Vorliegens und/oder der Menge der in Schritt b) eingebrachten Verbindung in den Zellen oder Geweben der Embryonen, in denen das humane Membrantransporterprotein spezifisch exprimiert wird, mithilfe einer hoch-ortsauflösenden, bildgebenden Massenspektrometrie oder mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie..