PT1086132E - Gene que codifica para um transportador de anião orgânico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "GENE QUE CODIFICA PARA UM TRANSPORTADOR DE ANIÃO ORGÂNICO"

Antecedentes da Invenção

Esta invenção relaciona-se com métodos referentes ao processamento de aniões pelo rim humano. Em particular, relaciona-se com métodos que utilizam ácidos nucleicos e polipéptidos transcritos e expressos nos rins que são responsáveis pela remoção de aniões tóxicos da circulação.

Sweet et ai., descreveram um gene de rato (R0AT1) que codifica para uma proteína de transporte de anião orgânico expressa no rim do rato (Journal of Biological Chemistry 272:30088-30095 [1997]. Sekine et al., também parecem ter descrito essencialmente, o mesmo gene, denominado OAT1 (Journal of Biological Chemistry 272: 18526-18529 [1997]). O seu aparente equivalente murino foi descrito em Lopez-Nieto et al., Journal of Biological Chem. 272: 6471-6478 (1997). E um objectivo desta invenção isolar o ácido nucleico que codifica para um transportador de anião orgânico humano (hOAT). É outro objectivo desta invenção expressar, de forma recombinante, o ácido nucleico que codifica para o hOAT. 2

Outro objectivo é obter o hOAT expresso em produções elevadas em cultura de célula recombinante.

Um objectivo é preparar um polipéptido isolado que codifica para o hOAT.

Um objectivo adicional desta invenção é proporcionar novos polipéptidos hOAT.

Um outro objectivo desta invenção é um ensaio para a avaliação de potenciais interacções fármaco-fármaco devido à interferência de um fármaco ou grupo de fármacos com a excreção activa do rim mediada por hOAT de outro fármaco.

Um outro objectivo desta invenção é um sistema de ensaio para seleccionar compostos candidatos que agonizam ou antagonizam a expressão de hOAT e/ou a actividade biológica do polipéptido hOAT, especialmente a sua actividade de transporte de aniões.

Outro objectivo é proporcionar um sistema de ensaio de selecção de hOAT para identificar as variantes celulares de compostos nefrotóxicos que serão retomados e transportados por hOAT num grau inferior do que é o caso com o composto precursor.

Um outro objectivo é identificar alelos ou isoformas de hOAT que estão associados com a sensibilidade a compostos nefrotóxicos, particularmente fármacos nefrotóxicos. 3

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com um método de selecção compreendendo proporcionar um agonista ou antagonista de hOAT candidato, pôr o candidato em contacto com um polipéptido isolado que seja capaz de transportar aniões orgânicos e que compreende a sequência de hOAT de SEQ ID No: 2 ou uma sequência de aminoácido tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência SEQ ID No: 2, ou pôr o candidato em contacto com uma sequência de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica para o referido polipéptido, determinar o efeito do candidato sobre a transcrição do ácido nucleico ou expressão ou actividade biológica do polipéptido, identificar um agonista ou antagonista de hOAT a partir dos candidatos e, opcionalmente, preparar quantidades adicionais do agonista ou antagonista assim identificado.

De acordo com uma forma de realização em particular, a sequência que codifica para o polipéptido é a sequência que codifica para o hOAT representada na SEQ ID No: 1. A invenção relaciona-se ainda com um método que compreende identificar um ou mais alelos e/ou isoformas da sequência de hOAT em indivíduos humanos e determinar se os tais alelos ou isoformas estão ou não em correlação com a nefrotoxicidade em indivíduos humanos de um fármaco seleccionado, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT da SEQ ID No: 2 ou uma sequência de 4 aminoácidos tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID No: 2; e com um método que compreende identificar variação da sequência nucleica em sequência que codifica para o hOAT, domínios de controlo de expressão de hOAT ou sequências de junção do ARN do hOAT em indivíduos humanos e determinar se tais variações estão ou não em correlação com a nefrotoxicidade de um fármaco seleccionado em indivíduos humanos, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT da SEQ ID No: 2 ou uma sequência de aminoácido tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID No: 2. A invenção relaciona-se ainda com um método que compreende proporcionar uma forma modificada, de maneira covalente, de um análogo de nucleótido fosfonato e determinar se o análogo é ou não transportado por hOAT, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT da SEQ ID No: 2 ou uma sequência de aminoácido tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID No: 2.

De acordo com uma forma de realização em particular, o análogo de nucleótido fosfonato é um derivado de PMEA, de cidofovir ou de PMPA. A invenção relaciona-se ainda com um método que compreende identificar uma interacção fármaco-fármaco pondo em contacto um fármaco candidato com um hOAT e, pelo menos, um segundo fármaco, cujo efeito sobre o transporte mediado 5 por hOAT do fármaco candidato se pretende determinar, e analisar o efeito do segundo ou mais fármacos sobre o transporte mediado por hOAT do fármaco candidato, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT da SEQ ID No:2 ou uma sequência de aminoácido tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID No: 2.

Deste modo, são proporcionados o ácido nucleico isolado que codifica para o hOAT e o péptido hOAT isolado. O hOAT é expresso em células recombinantes, onde encontra utilização na avaliação de compostos para a verificação da nefrotoxicidade ou para a identificação de compostos que têm a capacidade de evitar a nefrotoxicidade. O hOAT é também útil num método para identificar quaisquer alelos e isoformas de hOAT que estejam correlacionados com a sensibilidade do doente a agentes nefrotóxicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 (SEQ ID NOS 1 e 2) representa uma sequência de nucleótidos para o cADN que codifica para o hOAT e a sua sequência traduzida.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO O polipéptido hOAT é definido como uma sequência de polipéptido que tem, pelo menos, 90% e, de preferência, pelo 6 menos, cerca de 95% de identidade com a sequência da Fig. 1 (sequência de referência do hOAT).

Uma etiqueta de sequência expressa (EST) de aproximadamente 200bp tendo alta homologia a um segmento de hOAT é encontrada nos registos de EST do GenBank sob o n° de acesso R25797. "Homologia" é definido como a percentagem de resíduos numa sequência de aminoácidos candidata que é idêntica aos resíduos na sequência de referência do hOAT depois do alinhamento das duas sequências e introduzindo espaços, se necessário, para alcançar o percentual máximo de homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um programa de computador que pode ser utilizado ou adaptado para a finalidade de determinar se uma sequência candidata enquadra-se ou não nesta definição é o "Align 2", de autoria da Genentech, Inc., que foi depositado com documentação de utilizador no United States Copyright Office, Washington, DC 20559, em 10 de Dezembro de 1991. Ácido nucleico de hOAT "isolado" é o que foi separado do seu ambiente como encontrado na natureza, isto é, do genoma no caso do ADN ou do ambiente celular no caso do ARN.

Polipéptido hOAT "isolado" é o que foi separado do seu ambiente celular normal e inclui a proteína hOAT que é homogénea por SDS-PAGE utilizando coloração com prata. 7

Ao calcular-se a homologia da sequência de aminoácido as sequências candidata e de referência são alinhadas de uma maneira que produza o número máximo de resíduos alinhados, com inserções e deleções de resíduos representadas por espaços nas sequências alinhadas. Por exemplo, um polipéptido de 120 resíduos contendo um fragmento de sequência de referência de 100 resíduos fundida no seu terminal N a uma etiqueta de afinidade à poli-histidina de 6 resíduos, mas com uma única substituição no domínio hOAT, é calculado como sendo 99% homólogo à sequência de referência de hOAT, uma vez que a sequência do fragmento corresponde exactamente à sequência de referência de hOAT maximamente alinhada, excepto por uma única substituição de resíduo e a fusão de 6 resíduos ao terminal N. Deste modo, se a comparação de maximização de alinhamento das sequências do candidato e de referência revela uma inserção (ou deleção) de um mais resíduos de aminoácido, então estes resíduos são ignorados com a finalidade de fazer o cálculo da homologia. O requerente reconhece que esta convenção dá origem a uma homologia teórica de 100% entre 2 sequências diferentes, mas escolheu estabelecer a sua própria definição para a finalidade deste depósito. A análise da homologia é baseada em qualquer uma ou mais das sequências atribuídas a partir do ácido nucleico utilizadas para expressar o hOAT, a sequência do produto conforme primeiro produzida in vitro, ou a sequência depois de qualquer modificação pós-translacional. Deste modo, se as sequências de referência e do candidato forem idênticas quando expressas, mas um resíduo de glutamina for mais tarde 8 desaminado em ácido glutâmico, o primeiro candidato é 100% homólogo, mas a sequência desaminada não é.

Para a finalidade deste contexto, "actividade do hOAT" significa qualquer uma ou mais das funções realizadas pelo hOAT no ser humano, incluindo, em particular, o transporte de aniões orgânicos. Não é necessário que um polipéptido tenha actividade de transporte de anião para enquadrar-se na definição de hOAT aqui dada. Por exemplo, em algumas formas de realização os polipéptidos hOAT possuem, pelo menos, um epitopo imune que é capaz de reacção cruzada substancial com um anticorpo criado contra a sequência de referência do hOAT e, deste modo, são úteis em imunoensaios para hOAT, mas podem possuir mutações que tornam o polipéptido incapaz de transporte de anião.

Os polipéptidos de hOAT desta invenção compreendem substituições, deleções ou inserções de qualquer resíduo de aminoácido adjacente a qualquer dos sítios de resíduo de aminoácido da sequência de referência ilustrados na Fig. 1. Os hOATs substitucionais são aqueles em que, pelo menos, um resíduo de aminoácido na sequência de referência foi removido e um aminoácido diferente foi inserido no seu lugar na mesma posição. Um ou mais resíduos são substituídos. A alanina é uma substituição comum para qualquer resíduo e é geralmente utilizada em varredura de alanina para identificar resíduos funcionais, mas encontra-se no âmbito desta invenção substituir outros resíduos na sequência de 9 referência de hOAT. Os resíduos introduzidos, de um modo geral, são aminoácidos que ocorrem naturalmente, geralmente G, Δ, Y, V, L, I, S, T, D, E, Q, C, Μ, N, F, P, W, K, R ou H (utilizando código de uma só letra convencional; documento EP 323.149). Os resíduos adequados também incluem hidroxiprolina, ácido beta-hidroxiaspártico, ácido gama-carboxiglutámico, hidroxilisina ou norleucina, a serem utilizados como alternativas aos seus homónimos.

Estas substituições podem ser conservadoras, isto é, o resíduo de substituição é estrutural ou funcionalmente semelhante ao resíduo substituído. Outras substituições serão menos conservadoras pelo facto de constituírem uma troca entre classes estruturais ou funcionais diferentes de resíduos. Para as finalidades deste contexto, estas classes são como a seguir: 1. Electropositivas: R, K, H; 2. Electronegativas: D, E; 3. Alifáticas: V, L, I, M; 4. Aromáticas :F, Y, W; 5. Pequenas: A, S, T, G, P, C; 6.

Carregadas: R, K, D, E, H; 7. Polares: S, T, Q, N, Y, H, W; e 8. Hidrófilas pequenas: C, S, T. As substituições entre-grupos, de um modo geral, terão maiores efeitos sobre a função da proteína do que as substituições conservadoras (entre-classes). Deste modo, encontra-se, particularmente no âmbito desta invenção introduzir substituições conservadoras no hOAT e, se os resultados não forem satisfatórios, introduzir substituições não conservadoras nos sítios. Tipicamente, no entanto, as substituições ou inserções na sequência com prolina, glicina e cisteina não são favorecidas. Um exemplo de uma variante expressa é uma mudança no codão 498 de AGC para ATC, resultando numa mudança 10 na expressão de isoleucina em vez de serina. Outras variantes são introduzidas no ADN que codifica para o hOAT sem resultar numa mudança na sequência da proteína, por exemplo de ATC para ATT no codão 453 ou de GGG para GGT no codão 491.

As variantes de hOAT são prontamente identificadas por meios de métodos evidentes para o especialista na técnica. Por exemplo, os sítios mostrados pela varredura de alanina para influenciar a actividade biológica seleccionada estão sujeitos à mutagénese de saturação para identificar a modificação óptima para a actividade em questão, por exemplo, a selectividade para o transporte de um anião em particular.

Os hOATs que representam as combinações de variantes de sequência encontram-se no âmbito desta invenção. São introduzidas 2, 3, 4, 5 ou mais substituições, deleções ou inserções no hOAT, conforme aqui definido. Tipicamente, uma deleção de um único resíduo será acompanhada por uma inserção dentro de 1 a cerca de 3 resíduos do sítio de deleção. De um modo geral, as deleções de domínios maiores desnecessários para a actividade de transporte de anião, não necessitam ser acompanhadas por uma inserção. Os resultados de substituições de aminoácidos individuais são, de um modo geral, aditivas, excepto quando os resíduos interagem uns com os outros directa ou indirectamente. Os mesmos são prontamente detectados utilizando os mesmos procedimentos descrito em Sweet et al., ou Sekine et al., (supra), a fim de identificar aqueles que têm as propriedades da sequência de referências do hOAT ou as propriedades modificadas desejadas. 11

Encontram-se incluídos no âmbito desta invenção os hOATs que têm um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido de hOAT em qualquer posição na sequência de referência. Os hOATs insercionais, de um modo geral, terão uma estrutura de polipéptido compreendendo a sequência NH2-PP-A- (X) ni-B-PP-COOH, em que X é(são) o(s) resíduo (s) inserido(s) (que pode ser o mesmo ou diferente), nl é um número inteiro (em geral 1-30, tipicamente 1 ou 2), A ou B são os sítios de resíduo designados para inserção e PP representa o restante do hOAT ou uma ligação no terminal N ou C do hOAT. A invenção inclui fusões de hOAT e sequências de reconhecimento de anticorpo seleccionado (polipéptidos heterólogos) para a purificação por imunoafinidade de hOAT a partir de cultura de célula, fusões de sequências de hOAT com etiquetas de afinidade, tais como FLAG ou poli-histidina, e sequências quiméricas (particularmente fusões de fragmentos de sequência de hOAT com fragmentos de outros receptores da classe de região de transposição de transmembrana 12).

Estão também incluídos no âmbito desta invenção os hOATs em que um sítio de glicosilação é introduzido ou removido da sequência de referência, seja por substituição, inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido. Tais mudanças resultarão na instalação ou remoção da sequência NXS ou NXT, onde X pode ser qualquer resíduo. Deste modo, a asparagina pode ser substituída por qualquer resíduo localizado 2 resíduos no terminal N em serina ou treonina para introduzir um sítio de glicosilação. Alternativamente, a 12 glicosilação simples pode ser omitida substituindo a glicosilação de asp com qualquer resíduo, deletando a serina ou treonina adjacente ao sítio substituindo qualquer resíduo no sítio de glicosilação para perturbar a sequência NXS ou NST.

Estão também incluídos no âmbito desta invenção os hOATs delecionais, isto é, os hOATs em que um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de referência foram removidos num sítio designado, de modo que os resíduos flanqueados são agora unidos por uma ligação de péptido da maneira usual. De um modo geral, não é preferido deletar os resíduos P, C ou G.

Tipicamente, as deleções ou inserções são relativamente pequenas na ordem de 1 a 10 resíduos e, em geral, não mais de 2, embora as deleções ou inserções possam ser bastante grandes se as mesmas não estão em porções críticas da sequência de referência ou a sequência adicional for removida em algum momento durante o processamento pós-tranlacional ou pós-recuperação. O número de resíduos que são deletados ou inseridos dependerá, em parte, se os mesmos são ou não encontrados em componentes estruturas secundários, tais como hélices ou folhas (em consequência do que apenas 1 ou, de preferência, 2 resíduos são inseridos ou deletados), ou estão em domínios menos confinados estruturalmente, tais como loops, onde números maiores de resíduos podem ser deletados ou inseridos sem perturbar indevidamente a estrutura do hOAT. 13

Os hOATs desta invenção podem ser submetidos a modificação covalente pós-translacional, por exemplo, a desaminação da arparagina ou glutamina, ou a oxidação dos resíduos de cisteína. A glicosilação pode ser variante ou ausente dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar a variante. Os hOATs contendo tais modificações estão incluídos no âmbito desta invenção. Se o hOAT for glicosilado em cultura de célula recombinante, o mesmo é, de preferência, glicosilado com hidratos de carbono característicos de células de mamíferos, embora o mesmo também possa ter padrões de glicosilação fúngicos (tal como a levedura). A glicosilação é aceitável, a qual é característica da expressão de hOAT de uma ou mais de fibroblasto, células ou linhas de células do rim, cérebro, pulmão, neuronais, fígado ou medula óssea, ou de qualquer linha de células de mamífero, tais como células CHO ou células embrionárias do rim.

Os alelos humanos que ocorrem naturalmente estão incluídos no âmbito desta invenção. Os mesmos são prontamente identificados pela obtenção de amostras de ácido nucleico de indivíduos numa população, pela sequenciação do hOAT de tais indivíduos e pela determinação dos resíduos nos quais é encontrada a variação. Uma vez que cada variação é identificada, é simples determinar a frequência do suposto alelo em outros indivíduos por meio de PCR utilizando iniciadores específicos para o domínio em questão, ou outros métodos deste tipo conforme são convencionais na técnica para determinar as proporções de alelos em populações humanas. 14

Preparação de Polipéptidos hOAT

Os hOATs desta invenção são prontamente preparados por meio de métodos conhecidos na técnica. De um modo geral, o ácido nucleico que codifica para o hOAT é preparado por PCR, por síntese in vitro (Vasser et al., "N. Ã. R." 18 (aO): 3089 [1990]), por clonagem de uma biblioteca de cADN do genoma humano de rim ou combinações destes. A mutagénese sítio dirigida do ácido nucleico que codifica para o hOAT é utilizada para preparar ácido nucleico que codifica para variantes de sequência. O + (codificação) e - fitas (antisenso) de hOAT estão incluídos no âmbito dos ácidos nucleicos de hOAT, como são o cADN que codifica para o hOAT, o ADN e ARN do genoma. O ADN do hOAT inclui regiões 5' e 3' do gene hOAT que não são transcritas mas servem como domínios de controlo de transcrição e domínios transcritos mas não expressos, tais como intrões (incluindo junções splice), sinais de poliadenilação, domínios de reconhecimento ribossomal e outros. O ácido nucleico de hOAT é expresso em sistemas in vitro ou nas células hospedeiras recombinantes. Um método para a expressão é a síntese à base de ribossoma utilizando tARNs dedicados (Benner, "TIBTECH" 12: 158-163 [1994] e Robertson et al. , "J. Am. Chem. Soc." 113: 2722-2729 [1991]). Normalmente, no entanto, o ácido nucleico que codifica para o hOAT (geralmente o ADN) é inserido num vector de expressão apropriado reconhecido (transcrito e traduzido) pelas células hospedeiras, as células hospedeiras são transfectadas com o vector de expressão, as células hospedeiras recombinantes são 15 desenvolvidas em meio de cultura adequado e, opcionalmente, o hOAT é recuperado da cultura de célula recombinante por método cromatográfico ou outros métodos de purificação. Encontra-se também no âmbito desta invenção sintetizar parcialmente o hOAT em cultura de célula recombinante ou por meio de métodos ín vítro e, depois, ligar os fragmentos do polipéptido por péptido ligase (síntese proteolítica reversa). 0 ácido nucleico para expressão do hOAT pode compreender uma sequência de sinal exógeno. Aqui, o hOAT é expresso como uma proteína de hOAT, de modo que o hOAT seja expresso como um precursor que é processado para amadurecer o hOAT. As pré-sequências adequadas incluem aquelas de (a) proteases microbianas, tais como subtilisina, (b) polipéptidos de mamíferos, (c) citocinas, tais como o interferão gama ou uma interleucina, (d) factores de crescimento, tais como a hormona do crescimento ou TGF-alfa, (e) polipéptidos ou proteínas tendo sequências maduras no terminal N que são homólogas ao hOAT humano, (f) imunoglobulinas, (g) receptores ou (h) outras pré-sequências de proteínas segregadas ou proteínas ligadas a membranas de células. As sequências de sinal, opcionalmente, são derivadas de ou são homólogas à célula hospedeira ou, pelo menos, o ramo filogenético ao qual pertence a célula hospedeira. Por exemplo, normalmente, utilizar-se-ia uma pré-sequência de uma proteína de levedura, tal como um factor conjugativo, num sistema de expressão de levedura, ou de uma bactéria, tal como ST- -II ou beta-lactamase, em sistemas de cultura de células. Uma ampla variedade de sequências de sinal são 16 conhecidas e podem ser utilizadas em métodos para a preparação dos hOATs aqui descritos.

As construções de ácido nucleico que codificam para o hOAT, de um modo geral, são unidas em vectores de expressão onde estarão sob o controlo de sequências que controlam a transcrição, traslacção e estabilidade do ARN. Estas sequências incluem sequências promotoras, operadoras, intensificadoras e de poliadenilação e, em geral, são conhecidas na técnica. A construção de vectores de expressão adequados para os hOATs desta invenção é uma questão de rotina para os especialistas na técnica, e será conseguida utilizando os instrumentos convencionais da biologia molecular, incluindo a sintese do ácido nucleico in vitro, PCR, adaptadores, ligases, enzimas de restrição, plasmídeos de expressão e condutores, auxiliares de transfecção e outros, todos os quais estão publicamente disponíveis (e, na sua maioria comercialmente disponíveis).

As células hospedeiras adequadas para a transfecção com o ácido nucleico que codifica o hOAT são bem conhecidas. Algumas estão mencionadas acima, enquanto outras estão descritas no documento WO 93/13208 na página 12, linha 21 -página 19, linha 5, e no documento EP 319.312 Bl, página 16, linhas 10-18 e na Tabela II do mesmo. Pode ser ideal utilizar células hospedeiras que são capazes de glicosilar o hOAT, tipicamente, incluindo células de mamíferos, tais como células embrionárias 293 de rim, células COS, CHO, células BHK-21 e outras. Xenopus oocytes são adequados para a expressão do ARN do hOAT. Além disso, são adequadas as 17 células hospedeiras utilizadas até aqui para expressar polipéptidos transportadores de anião em cultura de células recombinantes. 0 sistema hospedeiro-vector deve produzir um hOAT substancialmente homogéneo, de modo a evitar a necessidade de purificar os vários alelos, isoformas ou produtos de clivagem do hOAT uns dos outros. Se a célula hospedeira for capaz de glicosilação, essencialmente, todas as moléculas do hOAT devem ser glicosiladas. Além disso, as células hospedeiras, idealmente, não irão proteolisar o hOAT. Pode-se seleccionar células que não contêm protease, por exemplo, no periplasma que irá clivar o hOAT. Por exemplo, E. coli e outras estirpes microbianas são conhecidas por possuírem pouca ou nenhuma actividade proteolitica extracelular ou periplasmática (que não sejam as peptidases de sinal). A ausência de proteases nocivas ajuda a assegurar que o produto não é tornado micro-heterogéneo no que se refere ao comprimento da cadeia por proteases endógenas ao hospedeiro que actuam sobre o produto da expressão do hOAT. Além disso, ou alternativamente, os resíduos básicos do hOAT que definem sítios para a clivagem proteolitica são substituídos por resíduos que não sejam K ou R.

As células recombinantes de hOAT são cultivadas sob condições convencionais utilizando os meios de cultura convencionais utilizados até aqui com as células em questão. Estas condições e meios são amplamente conhecidos. As células transfectadas de fresco podem expressar os hOATs apenas de forma transitória, mas transformantes estáveis são prontamente obtidos de acordo com a prática convencional 18 utilizando co-transformação com um gene de selecção, tal como DHFR ou glutamina sintetase e cultura em série na presença de um agente de selecção, tal como o metotrexato ou a metionina sulfoximina, respectivamente. As quantidades de hOATs podem diferir substancialmente apesar de diferenças minimas no carácter dos substituintes ou inserções. Nestes casos, é desejável seleccionar um sistema de expressão que produza uma quantidade de hOAT que seja, pelo menos, cerca de 75% daquela obtida com o hOAT de referência no mesmo sistema de expressão. O hOAT pode ser expresso em bactérias na forma de corpos retrácteis, em cuja base o hOAT insolúvel é recuperado e redobrado utilizando métodos conhecidos, por exemplo, a dissolução num desnaturante, tal como o cloridrato de guanidínio seguido pela gradual remoção do desnaturante. Os hOATs directamente expressos desta invenção podem ter uma metionina adicional no terminal N ou resíduo de metionina bloqueado, embora possam ser utilizadas células hospedeiras que irão eliminar por clivagem tais resíduos de metionina no terminal N se as mesmas são estranhas às proteínas como encontradas na natureza. A fim de evitar dificuldades com produtos de expressão insolúveis, é preferível expressar o hOAT em células eucarióticas, mais preferencialmente, células de mamíferos. 0 hOAT é isolado ou purificado de cultura de célula recombinante por meio de métodos utilizados até aqui para outras proteínas, por exemplo, electroforese em gel SDS/nativa ou redutora, focagem isoeléctrica, electroforese 19 gradiente de pH imobilizado, precipitação de sal, fraccionamento de solvente (utilizando, por exemplo, etanol) e cromatografia, tal como filtração em gel, troca iónica (catiónica ou aniónica), afinidade de ligando (cibacrom blue F3GA ou p-aminobenzamidina), imunoafinidade, cromatofocagem, cromatografia de interacção de fase reversa ou hidrófoba. Tipicamente, o hOAT será isolado de modo a ser >95% puro em peso de proteína e, de preferência, superior a 99% puro. No entanto, o termo "isolado", conforme utilizado com referência à proteína ou ácido nucleico de hOAT, refere-se à ausência de um ou mais dos polipéptidos ou ácidos nucleicos humanos normais encontrados em associação com o hOAT no seu ambiente natural e não implica, necessariamente, que o hOAT é purificado em qualquer grau livre de proteínas não-hOAT. Uma vez que o hOAT é normalmente encontrado na membrana celular, é preferível recuperar o hOAT recombinante com uma preparação de membrana; caso contrário, a função do hOAT pode ser perturbada. De qualquer modo, muitas utilidades do hOAT não necessitam, de modo algum, da purificação da proteína; os ensaios de detecção para agonistas ou antagonistas são melhor conduzidos em células hospedeiras intactas.

Opcionalmente, os polipéptidos hOAT ou os seus fragmentos são preparados ín vitro, especialmente, se os mesmos são relativamente pequenos, por exemplo, na ordem de cerca de 30 resíduos ou menos. Por exemplo, os hOATs são preparados por síntese utilizando procedimentos de síntese de péptido de fase sólida padrão, conforme descrito por Merrifield "J. Am. Chem. Soc." 85: 2149 (1963). Estes são, então, ligados uns aos outros pela utilização de péptido 20 ligase (proteólise reversa). Os métodos in vitro de síntese de proteína são também utilizados para preparar hOATs sem a necessidade de cultura de célula recombinante. Tais métodos são úteis para preparações em pequena escala e têm a vantagem de reduzir o possível efeito nas produções de protease das células hospedeiras. A síntese da proteína hOAT in vitro tem uma vantagem adicional, bastante substancial, em que permite a introdução específica de sítio dentro do hOAT de um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente. Em concordância, quando o termo "resíduo de aminoácido" é aqui utilizado (em relação com a modificação de hOAT por substituição ou inserção, especialmente por um único aminoácido) será entendido que o aminoácido não está limitado aos resíduos que ocorrem naturalmente associados com os tARNs nativos. O aminoacil tARN é preparado de forma eficiente utilizando uma variedade de resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente ("que não ocorrem naturalmente" significa não encontrado naturalmente nas proteínas, embora o aminoácido possa ser encontrado noutra parte na natureza). Uma vez que o tARN é seleccionado para ser incorporado num codão não reconhecido por qualquer dos tARNs normalmente envolvidos na síntese de proteína, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente seleccionado é incorporado apenas no sítio específico na sequência de hOAT escolhido para o codão único. Deste modo, nestes casos, o hOAT é codificado por um ácido nucleico tendo um codão nonsense, por exemplo, UAG, no sítio de inserção ou substituição desejado, único.

Os aminoácidos adequados que não ocorrem naturalmente estão descritos, por exemplo, em Greenstein et al., 21 "Chemistry of the Amino Acids", Vols. 1-3, 1986. De um modo geral, utilizar-se-ia L-aminoácidos farmaceuticamente inócuos que são encontrados na natureza, mas normalmente não incorporados nas proteínas. Tais aminoácidos, tipicamente, estarão estruturalmente relacionados a um resíduo que ocorre naturalmente que produz o efeito desejado a um dado sítio e será utilizado para melhor resolver e optimizar a propriedade desejada do hOAT.

Os hOATs desta invenção também incluem os hOATs que foram substituídos por uma unidade não-peptitilo, seja com a finalidade de, para começar, preparar o hOAT, seja como uma modificação subsequente do hOAT preparado por substituição, inserção ou deleção de aminoácido conforme aqui descrito em outra parte. A modificação covalente pode conseguir, essencialmente, o mesmo objectivo que um mutante sítio-dirigido na mesma localização utilizando um resíduo que ocorre naturalmente. 0 triptofano é um aminoácido relativamente raro em hOAT. Em concordância, este resíduo é um sítio atraente para a modificação covalente pós-translacional pelo facto de se esperar que a substituição em outros sítios seja menor do que talvez seja o caso com resíduos mais comuns. A reacção do trp com um oxidante, tal como um dador de halogéneo, por exemplo, o bromo, produzirá a estrutura de cadeia lateral 22

Esta reacção deve ser conduzida em solvente aquoso e em baixas concentrações de halogéneo.

Outras modificações covalentes de hOATs ficarão evidentes ao especialista. Cadeias laterais sensíveis são protegidas mascarando as mesmas com anticorpos dirigidos contra um epítopo que inclui o resíduo a ser protegido. Os reagentes para conseguir tais modificações são bem conhecidos e têm sido utilizados amplamente nos campos do diagnóstico e preparativo. Ver T. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, 1983.

Os hOATs formam ligações cruzadas com uma matriz insolúvel em água ou são incorporados a um veículo lipídico, tal como um lipossoma, em geral um ULV. A ligação cruzada é conseguida fazendo reagir o hOAT e a matriz com um agente bifuncional. Exemplos de agentes bifuncionais adequados incluem 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres disuccinimidílicos tais como 3,3'-detiobis (succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivação, tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato produzem 23 intermediários fotoactiváveis que são capazes de formar ligações cruzadas na presença de luz. Alternativamente, o hOAT é imobilizado em matrizes reactivas insolúveis em água, tais como hidratos de carbono activados por brometo de cianogeno e os substratos reactivos descritos nos documentos U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440.

Os hOATs são também modificados de forma covalente pela ligação do hOAT a vários polímeros não-proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol ou polioxialcilenos, da maneira apresentado, por exemplo nos documentos U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. O PEG é um polímero não imunogénico, linear, não carregado com três moléculas de água por unidade de óxido de etileno. Ver Maxfield, et al., "Polymer" 16: 505-509 (1975); Bailey, F. E. et al., em "Nonionic Surfactants", Schick, M. J., ed, pp. 794-821 (1967). Várias enzimas terapêuticas foram conjugadas ao PEG para aumentar a sua meia-vida in vivo (Abuchowski, A., et al., "J. Biol. Chem." 252: 3582-3586 (1977); Abuchowski, A. et al., "Câncer Biochem. Biophys." 7: 175-186 (1984). Foi relatado que um conjugado de IL-2 (interlucina-2)-PEG aumentou a vida circulatória e a potência (Katre, N. V. et al., "Proc. Natl. Acad. Sei." 84: 1487-1491 (1987); Goodson, R. et al., "Bio/Technology" 8: 343-346 (1990)). Ver também Abuchowski, A. et al., "J. Biol. Chem." 252: 3578-3581 (1977). Qualquer um dos métodos para a conjugação de PEG utilizado nestas citações é aceitável para utilização com os hOATs desta invenção. 24

Utilizações para os hOATs desta Invenção

Os hOATs desta invenção são utilizados em métodos terapêuticos, diagnósticos e preparatórios. A sua utilização irá depender das propriedades que os mesmos possuem, conforme ficará evidente para um especialista. Na sua maioria, todos os hOATs reterão epitopos imunes ao hOAT, de modo que os mesmos são úteis em vez de hOAT em ensaios de hOAT quer possuam ou não qualquer actividade de transporte de anião.

Os hOATs desta invenção são úteis na identificação de substâncias que se ligam ao hOAT (parceiros de ligação do hOAT, ou "TBP"). De particular interesse são as substâncias que são capazes de se ligar ao hOAT para substancialmente inibir a actividade de transporte de anião do hOAT ou, de preferência, introduzir selectividade favorável na actividade de transporte, de tal modo que fármacos nefrotóxicos, tais como a anfotericina ou cidofovir não sejam absorvidos tão avidamente quanto na ausência da substância. A capacidade do TBP de ligar-se ao hOAT é também útil em métodos para recuperar o hOAT de misturas contaminadas, tais como os sobrenadantes de culturas celulares de células que expressam hOAT recombinante (incluindo os hOATs da sequência de aminoácido de hOAT aqui apresentada). Tipicamente, os hOATs podem ser utilizados em vez do hOAT padrão em imunoensaios para hOAT se os mesmos possuírem, pelo menos, um epítopo reconhecido pelo anticorpo utilizado no imunoensaio de hOAT em questão, enquanto os TBPs são utilizados em vez dos anticorpos para hOAT. Os hOATs são também úteis, conforme 25 apropriado, em ensaios funcionais para certas propriedades individuais de hOAT.

Os péptidos TBPs são obtidos pela utilização de métodos evolucionários dirigidos ín vitro, tais como aqueles que utilizam fagos filamentosos para apresentar sequências candidatas (também conhecidos como phage dísplay) e métodos semelhantes conhecidos per se que dependem da geração sistemática e detecção de péptidos para verificar a actividade. Estas são, tipicamente, moléculas bastante pequenas, contendo na ordem de cerca de 5 a 20 residuos.

Os anticorpos para TBPs são imunoglobulinas, normalmente anticorpos monoclonais, os quais (em formas de realização preferidas) são capazes de inibir, de forma específica, a função de transporte do hOAT. Os anticorpos são criados, de modo convencional, imunizando o animal com um conjugado imunogénico de hOAT, por exemplo, hOAT de ligação cruzada com a hemocianina do molusco keyhole limpet. O termo "anticorpo monoclonal", conforme aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são essencialmente idênticos em especificidade e afinidade. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos híbridos e recombinantes (por exemplo, anticorpos "humanizados") independentemente da espécie de origem ou designação de classe ou subclasse da imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv). Deste modo, os 26 anticorpos "monoclonais" são produzidos por meio de qualquer método em particular que produza uma população substancialmente homogénea. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos utilizando os métodos descritos por Kohler & Milstein, "Nature" 256: 495 (1975), Goding,

Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp 59-103 (1986), Kozbor, "J. Immunol." 133: 3001 (1984) ou Brodeur et ai., Monoclonal Antibody Prodution Techniques and

Applications, pp. 51-63 (1987) ou podem ser feitos por meio de métodos de ADN recombinante. Cabilli et al., Patente U.S. N° 4.816.567.

Numa forma de realização preferida da invenção, o anticorpo monoclonal terá uma afinidade pela sequência de referência do hOAT e, pelo menos, cerca de 109 moles/litro, conforme determinado, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson & Pollard, "Anal. Biochem." 107: 202 (1980). Além disso, tipicamente, o anticorpo monoclonal inibirá a actividade de transporte do hOAT (utilizando um anião orgânico padrão, tal como o para-amino-hipurato) em, pelo menos, cerca de 50%, de preferência superior a 80% e mais preferencialmente, superior a 90%, conforme determinado por meio de métodos convencionais. O ADN que codifica para o anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que são capazes de ligar especificamente a genes que codificam para as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como 27 uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são, então, transfectados para células hospedeiras, tais como células COS simias, células do ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, caso contrário, não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.

Opcionalmente, o ADN pode ser modificado com a finalidade de mudar o carácter da imunoglobulina produzida pela sua expressão. Por exemplo, as formas humanizadas de anticorpos murinos são produzidas substituindo uma região determinante de complementaridade (CDR) do domínio variável do anticorpo murino para a região correspondente de um anticorpo humano. Nalgumas formas de realização, resíduos de aminoácido da região de estrutura seleccionada (FR) do anticorpo murino são também substituídos pelos resíduos de aminoácido correspondente no anticorpo humano. As formas humanizadas de anticorpos murinos também podem ser produzidas substituindo a sequência de codificação para os domínios de cadeia constante pesada e leve humana em vez das sequências murinas homólogas. Morrison, et al., "PNAS" 81: 6851 (1984). 0 TBP também inclui sequências de ácido nucleico que se ligam ao hOAT. Os métodos de selecção evolucionária para oligonucelótidos que se ligam a proteínas alvo são bem conhecidos (documento WO 92/14843; Ellington et al., "Nature" 355: 850 (1992); Bock et al., "Nature" 355: 564 (1992); Ellington et al., "Nature" 346: 818 (1990) ; Tuerk et al., "Science " 249: 505 (1990) . Estes oligonucleótidos, 28 vulgarmente conhecidos como aptêmeros, de um modo geral, contêm as bases usuais A, T, G, C ou U ou derivados destas, e compreendem sequências que se ligam a um sitio predeterminado na proteína alvo. Um método de selecção para TBPs que inibe o transporte da função do hOAT compreende (a) preparar um conjunto de candidatos (oligonucleótidos, péptidos, extractos, proteínas, etc.), (b) pôr os candidatos em contacto com o hOAT que tem actividade de transporte de anião (tipicamente, as sequência de referência de hOAT), (c) isolar do hOAT aqueles candidatos que são capazes de se ligarem ao hOAT, (d) pôr os candidatos do passo c) em contacto com um hOAT em que a função de transporte do hOAT foi substancialmente submetida a mutação para fora do hOAT e (e) recuperar aqueles candidatos que não se ligam à forma que sofreu mutação.

Para as aplicações de diagnóstico, os hOATs desta invenção, opcionalmente, são marcados com uma unidade detectável, seja in vivo, seja in vitro. A unidade detectável pode ser qualquer substituinte que seja capaz de produzir, seja directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a unidade detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I, um composto fluorescente ou luminescente, tal como o isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; um marcador radioactivo isotópico, 125 32 i 4 q tal como I, P, C ou H, ou uma enzima, tal como a fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase do rábano silvestre. 29

Qualquer método conhecido na técnica per ser pode ser utilizado para conjugar o hOAT à unidade detectável. Ver os métodos descritos supra e Hunter, et al., "Nature" 144: 945 (1962); David, et al., "Biochemistry" 13: 1014 (1974); Pain, et al., "J. Immunol. Meth." 40: 219 (1981); e Nygren, J. "Histochem. and Cytochem." 30: 407 (1982). Os oligonucleótidos TBPs são marcados da maneira convencional até agora utilizada na técnica de sonda de diagnóstico.

Os TBPs ou hOATs da presente invenção são utilizados, opcionalmente, em técnicas de imunoensaios conhecidos, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche directos e indirectos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (1987) .

Os ensaios de ligação competitiva dependem da capacidade de um padrão marcado (que pode ser o hOAT, ou uma porção deste imunologicamente reactiva, tal como um hOAT marcado desta invenção) para competir com a amostra de teste de hOAT para ligar-se com uma quantidade limitada de TBP. A quantidade de hOAT na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada ao TBP. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, o TBP, de um modo geral, é insolubilizado antes ou depois da competição, de modo que o padrão e o analito que estão ligados ao TBP são convenientemente separados do padrão e analito que permanecem não ligados. 30

Os ensaios sanduíche envolvem a utilização de dois TBPs, cada um capaz de ligar-se a uma porção diferente do alvo, ou epítopo, de hOAT. Num ensaio sanduíche, o analito amostra de teste é ligado por um primeiro TBP que é imobilizado num suporte sólido, e, depois, um segundo TBP liga-se ao analito, formando, deste modo, um complexo insolúvel de três partes. David & Greene, Patente U.S. N° 4.376.110. O segundo anticorpo pode ser ele próprio marcado com uma unidade detectável (ensaios sanduíche directos) ou podem ser medidos utilizando um anticorpo anti-TBP que é marcado com uma unidade detectável (ensaio sanduíche indirecto). Por exemplo, um tipo de ensaio sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a unidade detectável é uma enzima.

Os TBPs desta invenção são também úteis para a formação de imagem in vivo, em que um TBP marcado com uma unidade detectável é administrado a um hospedeiro, de preferência na corrente sanguínea, e é testada a presença e localização do TBP marcado no hospedeiro.

Os ácidos nucleicos de hOAT ou TBP também podem ser utilizados num método para identificar isoformas ou alelos de ácidos nucleicos ou polipéptidos de hOAT que põem um doente num risco específico de nefrotoxicidade. Tais variantes, alelos ou isoformas exibirão uma selectividade diferente em relação à absorção de certos aniões. Se estes aniões forem fármacos nefrotóxicos ou metabolitos de fármaco, então, um doente pode estar em risco específico de lesão. O doente pode ser testado (por exemplo, ampliando o ADN que codifica para o hOAT genómico a partir de uma amostra sanguínea) para 31 determinar se a variante, isoforma ou alelo em-risco está presente. Se estiver, então a dosagem do fármaco pode ser reduzida ou um fármaco alternativo pode ser utilizado. Este método compreende identificar uma ou mais variações da sequência que ocorre naturalmente na população humana e determinar a selectividade de tais variações para o transporte de uma substância nefrotóxica seleccionada. Em seguida, um doente é testado para verificação da variação associada com o transporte relativamente selectivo da substância nefrotóxica.

Do mesmo modo, a variação alélica das regiões de controlo transcripcional do gene de hOAT pode ser analisada verificar para correlação com a susceptibilidade da absorção e transporte de fármacos nefrotóxicos seleccionados; aqui, a correlação será com a quantidade de expressão do hOAT, em relação à selectividade da proteína hOAT. Este método compreende identificar uma ou mais variações de sequência que ocorrem naturalmente no domínio do controlo da expressão de hOAT na população humana e determinar os níveis de expressão de hOAT em células contendo tal variante. Os doentes que têm níveis relativamente altos de expressão de hOAT podem não ser considerados adequados para o tratamento com fármacos nefrotóxicos, ou a dosagem de tais fármacos pode ser reduzida. 0 hOAT também pode ser útil em métodos de detecção para compostos que podem actuar para suprimir ou intensificar a absorção e transporte de anião por hOAT. A supressão da actividade do hOAT (antagonismo) é útil na redução da 32 nefrotoxicidade de fármacos, isto é, para servir como agentes nefroprotectores, enquanto o aumento da actividade do hOAT (agonismo) é útil no tratamento das disfunções renais. Os métodos de detecção compreendem proporcionar um agonista ou antagonista de hOAT candidato, pôr o candidato em contacto com o ácido nucleico ou polipéptido do hOAT, determinar o efeito do candidato na transcrição do ácido nucleico de hOAT (ou a expressão ou actividade biológica do polipéptido de hOAT), identificar um agonista ou antagonista de hOAT e, opcionalmente, preparar quantidades adicionais do agonista ou antagonista que é assim identificado. A actividade biológica de hOAT é testada utilizando as linhas de células estáveis do Exemplo 1, conforme apresentado no Exemplo 2. 0 hOAT é útil em ensaios de detecção para formas modificadas dos fármacos até aqui nefrotóxicos, ou como parte de um programa de detecção toxicológico para determinar a nefrotoxicidade potencial de novos compostos terapêuticos. A acumulação do candidato nos transformantes de hOAT em relação às células de controlo são indícios de potencial nefrotoxicidade. Determinar os valores CC50S utilizando os transformantes de hOAT produziria uma medida directa da nefrotoxicidade potencial. Uma forma candidata de um composto suspeito ou um fármaco nefrotóxico conhecido, por exemplo, um profármaco, é posta em contacto com o hOAT e é determinado o seu efeito sobre o transporte por hOAT de um anião referência. 0 transporte do composto de teste propriamente dito (em geral, numa forma marcada isotopicamente) também pode ser determinado. Alternativamente, pode-se testar o transporte do composto na presença de probenecid. Se o 33 composto já não for transportado, ou o transporte do anião referência não for afectado pelo composto, ou o probenecid não tem influência sobre se o composto é ou não transportado, então, o candidato é adequado para estudos adicionais em animais como um potencial fármaco não-nefrotóxico, por exemplo, no caso de um profármaco como uma forma não-nefrotóxica do fármaco precursor. Os profármacos de nucleótido análogos de fosfanato, tais como cidofovir, PMEA ou PMPA adequados para teste incluem mono e diésteres e amidatos do grupo fosfonilo.

Exemplo 1 - Geração de uma linha celular transformada, de forma estável, com o gene hOATl

Uma linha de células que, de forma estável, expressa hOATl foi preparada e caracterizada para, em última instância, provar que o cADN isolado codifica para a proteína hOAT funcional. A construção de expressão contendo o gene hOATl foi preparada como a seguir. A sequência que codifica o hOATl foi ampliada por PCR de plasmídeo isolado de biblioteca de cADN de rim humano. A reacção de PCR foi realizada sob condições padrão utilizando o sistema Expand High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim). Foram utilizados os oligonucleótidos 5'-ACCGTCTAGAATTCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACGTCCACCA TGGCCTTTAATGACCTCCTGCAGCAGG-3' (SEQ. ID NO. 3) e 5'-TACTCACGTGGATCCTGATCAGACGTCTGTAGGACCTTCCCTCCCTTT AGG-3' (SEQ. ID NO. 4) como um iniciador senso e antisenso para introduzir 34 o sítio de restrição EcoRI e BamHI, respectivamente. Além disso, o iniciar senso continha a sequência truncada não traduzida em 5' do vírus do mosaico da alfafa (sublinhada) e a sequência consenso de Kozak favorável (CCACCATGG) (SEQ. ID NO. 5) para maximizar a iniciação da translação. 0 produto de PCR foi digerido com EcoRI/BamHI e clonado no vector de expressão pIRESneo (CLONTECH, Paio Alto, CA) utilizando os sítios de restrição correspondentes para dar o plasmídeo pIRES-hOAT. Depois da clonagem, foi verificada a sequência de nucleótido correcta de todo o fragmento gerado por PCR. 0 plasmídeo pIRES-hOAT foi transfectado em células CHO-K1 (ATCC CCL61) desenvolvendo em mistura nutriente F-12 suplementada com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. 24 horas antes da transfecção, aproximadamente 6 x 10° células CH0-K1 foram semeadas em placas Petri de 100 mm. No momento da transfecção, os meios foram aspirados e foram adicionados às células 6 mL de meios frescos contendo 12 pg de pIRES-hOAT e 60 pg de lípido catiónico Cytofectin GSV (Glen Research, Sterling, VA) . A seguir à incubação de um dia para o outro, teve início a selecção de transformantes estáveis em mistura de nutriente F-12 livre de vermelho de fenol contendo soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina como acima, mais 1 mg/mL de G418 (CLONTECH). As colónias viáveis foram isoladas depois de 2 semanas de selecção e testadas para verificação da absorção de ácido p-amino-hipúrico (PAH, um substrato protótipo de sistemas de transporte de anião orgânico) na presença e ausência de probenecid (inibidor de transporte de anião orgânico). Para o ensaio de absorção de PAH, as células 35 foram semeadas em placas de 12 poços numa densidade de 2 x 105 células/poço. Depois de 48 horas, o meio de crescimento foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). 0 ensaio de absorção foi realizado em tampão de transporte (NaCl 135 mM, KC15 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 1,2 mM, MgSCb 0,8 mM, glucose 28 mM e HEPES 13 mM, pH 7,2) contendo [3H] ΡΔΗ 5 M (New England Nuclear, actividade espec. 1,2 Ci/mmol) ± 1 μΜ de probenecid. Depois de 90 minutos de incubação a 37°C no tampão de transporte, as células foram lavadas 3 vezes com PBS gelado (2 mL/poço) e lisadas directamente na placa na presença de 0,3% de Triton X-100 (0,5 mL/poço) durante 20 min à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com 0,5 mL/poço de Triton X-100 adicionais, o lisado e o lavado foram combinados, adicionou-se fluido de cintilação e a radioactividade foi contada. Como resultado deste ensaio, foi identificado um clone transformado com aumento de 30 vezes na absorção de PAH em comparação com as células CHO-K1 precursoras e denominado CHO-hOAT.

Exemplo 2 - Caracterização funcional de hOATl A cinética da absorção de PAH mediado por hOATl foi caracterizada utilizando células CHO-hOAT. O ensaio de absorção foi realizado conforme descrito acima com várias concentrações de [3H] PAH variando de 5 a 160 μΜ. Para ter acesso a absorção líquida específica de hOATl, a absorção de fundo medida nas células CHO-Kl precursoras em cada concentração de substrato foi subtraída daquela determinada 36 em células CHO-hOAT. As constantes cinéticas foram calculadas utilizando programas de computador de Cinética de Enzima (Chem SW, Fairfield, CA) . Conforme esperado, a absorção de PAH em células CHO-hOAT era saturável com células Km = 13 μΜ e Vmax = 42 pmol/106. Ao contrário da absorção de fundo de PAH em células CH0-K1, a absorção em células CO-hOAT foi extremamente sensivel ao probenecid com IC50 = 6,2 μΜ quando medida a uma concentração de PAH igual ao seu Km. Além disso, a acumulação de PAH em CHO-hOAT foi estimulada aproximadamente 2,5 vezes pré-carregando as células com glutarato 10 mM indicando que a proteina hOAT funciona como um permutador de anião orgânico/dicarboxilato.

Exemplo 3 - Distribuição de tecido de hOATl

Foi utilizado um tecido múltiplo humano de imunotransferência Northern (CLONTECH) para a localização da expressão de hOATl em tecidos humanos. Uma sonda marcada com Q O ✓ iii [ P]dATP especifica para hOAT foi gerada por iniciação aleatória do fragmento de ADN BsrGI/Bsu361 correspondente aos nucleótidos 420-854 da sequência que codifica para o hOATl. A membrana foi hibridizada durante 1 hora a 68°C em tampão de hibridização ExpressHyb (CLONTECH) e depois lavada duas vezes em 2 x SSC com 0,05% de SDS durante 30 minutos à temperatura ambiente seguida por uma única lavagem com 0,1% de SDS a 50 °C. Foi detectado um forte sinal no rim correspondendo a 2,5 kb de transcrito de hOATl. Não foi encontrado sinal positivo nos outros tecidos testados (cérebro, coração, 37 músculo esquelético, cólon, timo, baço, intestino delgado, placenta, pulmão ou leucócitos do sangue periférico).

Além disso, a expressão de hOATl em vários tecidos humanos foi examinada por ampliação RT-PCR mais sensível. Para esta finalidade foram utilizados kits I e II de cADN Multiple Choice contendo tecidos específicos de cADNs (Origene Technologies, Rockville, MD) e dois conjuntos de iniciadores para hOAT para a detecção por PCR da expressão de hOATl. Os oligonucleótidos 5'-CCCGCTGGCACTCCTCCTCCGGGAG-3' (SEQ. ID NO. 6) (senso) e 5'-GTAGAGCTCGGCAGTCATGCTCACCA-3' (SEQ. ID NO. 7) (antisenso), foram utilizados para ampliar um fragmento 606-bp da região que codifica para o hOATl (nucleótidos 815-1420). No conjunto independente de reacções PCT, um fragmento 295bp de hOATl (compreendido dos últimos 175 nucleótidos codificantes e 120 nucleótidos do 3'-UTR) foi ampliado utilizando os nucleótidos, 5'-CCAGCGCTGTCACTGTCCTCCTGC-3' (SEQ. IDNO. 8) (senso), e 5'-AACCCCCACACTTGGGTCACCATTTCCTC-3' (SEQ. ID NO. 9) (antisenso). As reacções PCR foram levadas a cabo utilizando o Sistema Expand High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim) num volume total de 25 pL contendo 1 pg de cADN específico do tecido. Foram realizados trinta e cinco ciclos de ampliação (95° C durante 40 s, 58° C durante 1 min, e 72° C durante 45 s) . Foram identificados tecidos positivos depois da separação das reacções PCR num gel de agarose a 1%. Conforme esperado, um forte sinal positivo 38 foi detectado, de forma consistente, no rim. Em contraste com a análise de imunotransferência Northern, o cérebro e o músculo esquelético também tiveram resultado positivo para a expressão de hOAT embora num grau inferior em comparação com o rim. A presença da proteína hOAT no tecido do rim humano foi verificada por uma análise de imunotranferência com anticorpo policlonal de coelho anti-hOATl em AnaSpec (San Jose, CA) , utilizando técnicas imunológicas padrão. Em resumo, um péptido imunogénico, NH2-TVQDLESRKGKQTR-COOH (SEQ. ID NO. 10), correspondente aos aminoácidos 515-528 de hOATl foi conjugado a uma hemocianina do molusco keyhole limpet através de um resíduo de cisteína adicionado ao terminal C do péptido. O soro do animal foi colhido depois de 4 imunizações na presença de adjuvante de Freund completo e foi purificado por afinidade contra o péptido imunogénico imobilizado numa resina de Sefarose. Para a análise de imunotranferência, foi extraído o córtex de rim humano com um tampão contendo Tri-HC1 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,5% de deoxicolato e 0,1% de SDS. Depois da homogeneização na presença do cocktail inibidor de proteinase completo (Boehringer Mannheim) o extracto foi clarificado por centrifugação a alta velocidade, separado por electroforese num gel de 8% SDS-poliacrilamida e por electro-imunotransferência numa membrana de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA) . A membrana foi bloqueada em PBS/5% de leite seco (PBS-M) durante 1 hora, lavada 3 vezes em PBS/0,05% de Tween 20 (PBS-T) e incubada de um dia para o outro com o anticorpo anti-hOAT. A seguir a lavagem com PBS-T, a membrana foi incubada em PBS-M com 39 anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase do rábano selvagem (Zymed, South San Francisco, CA) . Depois de uma lavagem adicional e incubação com um substrato quimioluminescente (Amersham, Arligton Heights, IL) , a imunotransferência foi exposta a uma película de raio-X. 0 anticorpo reconheceu um produto heterogéneo com um peso molecular aparente de 80 a 90 kDA. Isto foi significativamente maior do que o peso molecular previsto da sequência de aminoácido de hOATl (60,3 kDa). No entanto, quando o extracto de córtex foi tratado com péptido: N-glicosidase F, que especificamente cliva as cadeias de oligossacáridos ligadas em N, foi detectado na imunotransferência um produto homogéneo de 60 kDA.

Exemplo 4 - Determinação do Potencial Nefrotóxico por Ensaio de Cultura Celular utilizando Transformantes de hOAT O Adefovir (ADV) é um nucleótido anti-HIV análogo com um perfil de resistência único actualmente sendo submetido à avaliação clínica de Fase III. A toxicidade clínica mais importante do ADV é a nefrotoxicidade associada com alterações das funções renais em marcadores de laboratório. O ADV é um substrato para o transportador 1 de anião orgânico renal humano (hOAT) localizado na membrana basolateral dos túbulos convolutos proximais. Neste exemplo, foi investigado o papel do hOAT no mecanismo da nefrotoxicidade do ADV. Células de ovário de hamster chinês (CHO), que exibem baixa sensibilidade à citoxicidade do ADV devido à sua 40 absorção limitada, foram transformadas, de forma estável, com cADN de hOAT para gerar células CHO-hOAT, conforme descrito acima. Foram comparadas a absorção e a citotoxicidade do ADV nas duas linhas de células.

As células CHO-hOAT acumularam ADV em níveis >300 vezes superiores em comparação com as células CHO. A absorção de ADV por CHO-hOAT era saturável (Km = 23 uM, Vmax = 390 pmol/106 células) e sensível ao inibidor de hOAT probenecid (PBC; IC50 = 6,5 mM) . É importante observar que o ADV era -500 vezes mais citotóxico em CHO-hOAT em comparação com as células CHO. No entanto, na presença de PBC 1 mM, as células CHO-hOAT eram apenas 3 vezes mais susceptíveis ao ADV do que as células CHO. Outro nucleótido antiviral, o cidofovir (CDV), mas não o seu produto cíclico (cCDV), também se acumulou, de forma eficaz, em CHO-hOAT (Km = 70 uM, Vmax = 1,110 pmol/106 células). Em concordância, 0 CDV foi >400 vezes mais citotóxico em CHO-hOAT em comparação com CHO. Em contraste, a citotoxicidade de cCDV foi aumentada até um grau muito menor em células CHO-hOAT em correspondência com a falta de nefrotoxicidade do cCDV. Semelhante ao ADV, a citotoxicidade do CDV foi também reduzida, de forma significativa, por PBC. A expressão de hOAT aumenta a citotoxicidade de ADV. Uma vez que altos níveis de expressão de hOAT é especifico dos túbulos renais, o hOAT desempenha um papel crucial no mecanismo da nefrotoxicidade do ADV. Deste modo, os inibidores de hOAT (por exemplo, o PBC) podem ser úteis para superar a nefrotoxicidade do ADV. Observações com CDV e cCDV correlacionam com o seu potencial nefrotóxico e proporcionam 41 um suporte adicional para o envolvimento do hOAT neste processo. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> GILEAD SCIENCES, INC., et ai.

<12 0> NOVO TRANSPORTADOR DE ANIÃO ORGÂNICO CODIFICADOR DE GENE

<130> 240.1FPCT <140> PCT/US 99/ 13172 <141> 10-Out-1999 <150> 60/088.864 <151> ll-Jun-1998 <150> 60/132.267 <151> 03-Maio-1999 <16 0 > 10 <170> Patentln Ver. 2.0 <210 > 1 <211> 2123 <212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > 42 <223> Descrição de Organismos Desconhecidos: Esta informação não se encontra disponível <2 2 0 >

<221> CDS <222> (263)..(1912) < 4 0 0 > 1 43 368 43 368 Ile Gin Vai Thr 20 aac acc ctg cag Asn Thr Leu Gin 35 ccg cct gcc gat Pro Pro Ala Asp ctg ccc cgg gac Leu Pro Arg Asp 70 tcc ccg cag tgg Ser Pro Gin Trp 85 aca ggg gcc aca Thr Gly Ala Thr 100 acc ttc cca tet Thr Phe Pro Ser 115 agg gcc cta ege Arg Ala Leu Arg etc gga gcc atg Leu Gly Ala Met 150 aag gta ctc ate Lys Vai Leu Ile 165 gea gcc ttc gea Ala Ala Phe Ala 180

Gly Gly Vai Gly ccc ctg ctc ctg Pro Leu Leu Leu 30 gcc ate cct acc Ala Ile Pro Thr 45 aag aac ggg ggg Lys Asn Gly Gly 60 cct gag tcc tgc Pro Glu Ser Cys 75 ctc aat ggc aca Leu Asn Gly Thr gat ggc tgg ate Asp Gly Trp Ile 110 gag tgg gac ctt Glu Trp Asp Leu 125 tcc ttg tac atg Ser Leu Tyr Met 140 ctt gea gac agg Leu Ala Asp Arg 155 cag aca gct gtg Gin Thr Ala Vai

Arg Phe Gin Gin 15 atg gct tet cac Met Ala Ser His cac cac tgc ege

His His Cys Arg 50 ctg gag gtc tgg

Leu Glu Vai Trp 65 ctc ege ttc acc

Leu Arg Phe Thr 80 gaa gcc aat ggc

Glu Ala Asn Gly 95 tat gac aac age Tyr Asp Asn Ser gtg tgc tet cac

Vai Cys Ser His 130 gtg ggg gtg ctg

Vai Gly Vai Leu 145 cta ggc ege cgg

Leu Gly Arg Arg 160 tea ggg acc tgc

Ser Gly Thr Cys 175

Leu Vai vai Leu 25 aac ttc act gct

Asn Phe Thr Ala 40 gcc aac ctc age

Ala Asn Leu Ser 55 agg cag ggg cag Arg Gin Gly Gin gga ctg ccc ttt

Gly Leu Pro Phe 90 gag ccc tgc acc

Glu Pro Cys Thr 105 acc ate gtg act

Thr Ile Vai Thr 120 cag ctg gcc cag

Gin Leu Ala Gin 135 gtg ttc ggc tac Vai Phe Gly Tyr ttg aac tac ctg

Leu Asn Tyr Leu 170 ccc aac ttc ccc

Pro Asn Phe Pro 185 436 484 532 580 628 676 724 772 820 44 ate tac tgc gee Ile Tyr Cys Ala 190 tcc etc aac tgc Ser Leu Asn Cys 205 cgg gee tgc gtg Arg Ala Cys Vai 220 ttc etc ctg gct Phe Leu Leu Ala 235 cag cta ctg gtc Gin Leu Leu Vai ttc ttc att gag Phe Phe Ile Glu 270 etc acc ctg agg Leu Thr Leu Arg 285 gaa gaa gga gee Glu Glu Gly Ala 300 aag gag ctg acc Lys Glu Leu Thr 315 ege tgc ccc acc Arg Cys Pro Thr ttc cgg etc etc Phe Arg Leu Leu atg aca ctg aat Met Thr Leu Asn 210 ggc acc ttg att Gly Thr Leu Ile 225 ggt gtg gee tac Gly Vai Ala Tyr 240 tet gcg cct ttt Ser Ala Pro Phe 255 teg gee ege tgg Ser Ala Arg Trp gee ctg cag aga Ala Leu Gin Arg 290 aaa ttg agt atg Lys Leu Ser Met 305 atg ggc aaa ggc Met Gly Lys Gly 320 etc ege cac etc Leu Arg His Leu 335 teg ggc atg gct Ser Gly Met Ala 195 gtg gag tgg atg Vai Glu Trp Met ggc tat gtc tac Gly Tyr Vai Tyr 230 gct gtg ccc cac Ala Vai Pro His 245 ttt gee ttc ttc Phe Ala Phe Phe 260 cac tcc tcc tcc His Ser Ser Ser 275 gtc gee cgg ate Vai Ala Arg Ile gag gta etc cgg Glu Vai Leu Arg 310 cag gea teg gee Gin Ala Ser Ala 325 ttc etc tgc etc Phe Leu Cys Leu 340 ctg gct ggc ate Leu Ala Gly Ile 200 ccc att cac aca Pro Ile His Thr 215 age ctg ggc cag Ser Leu Gly Gin tgg ege cac ctg Trp Arg His Leu 250 ate tac tcc tgg Ile Tyr Ser Trp 265 ggg agg ctg gac Gly Arg Leu Asp 280 aat ggg aag cgg Asn Gly Lys Arg 295 gee agt ctg cag Ala Ser Leu Gin atg gag ctg ctg Met Glu Leu Leu 330 tcc atg ctg tgg Ser Met Leu Trp 345 868 916 964 1012 1060 1108 1156 1204 1252 1300 ttt gee act age ttt gea tac tat ggg ctg gtc atg gac ctg cag ggc 1348 45 45 Phe Ala Tyr Tyr ate tac cta ate Ile Tyr Leu Ile 370 ctt gtg ggc ttc Leu Vai Gly Phe 385 atg gct gea ctg Met Ala Ala Leu 400 ata ccc cag gac Ile Pro Gin Asp 415 aag ggt tgt ctg Lys Gly Cys Leu gaa ctg tat ccc Glu Leu Tyr Pro 450 acc atg gee cga Thr Met Ala Arg 465 gee gag etc tac Ala Glu Leu Tyr 480 gtg gee gee age Vai Ala Ala Ser 495 cca ctg cca gac Pro Leu Pro Asp

Asp Leu Gin Gly 360 ggt gct gtg gac Gly Ala Vai Asp 375 tcc ctg ggt ege Ser Leu Gly Arg ate tgc ate ctg Ile Cys Ile Leu 410 cga acc tet ctt Arg Thr Ser Leu 425 aac tgc ate ttc Asn Cys Ile Phe 440 cag aca ggc atg Gin Thr Gly Met 455 gtg age cca ctg Vai Ser Pro Leu etc ttc ate tac Leu Phe Ile Tyr 490 etc ctg cca gag Leu Leu Pro Glu 505 ctg gag age agg Leu Glu Ser Arg 520

Phe Ala Thr Ser 350 ttt gga gtc age

Phe Gly Vai Ser 365 ctg cct gee aag

Leu Pro Ala Lys 380 cgg cct gee cag

Arg Pro Ala Gin 395 etc aat ggg gtg Leu Asn Gly Vai gct gtg ctg ggg

Ala Vai Leu Gly 430 ctg tat act ggg

Leu Tyr Thr Gly 445 gga atg ggc age

Gly Met Gly Ser 460 gtg age atg act

Vai Ser Met Thr 475 ggt gct gtt cct Gly Ala Vai Pro acc ctg ggc cag

Thr Leu Gly Gin 510

Gly Leu Vai Met 355 cag gtg ate ttt Gin Vai Ile Phe ctt gtc ate aac

Leu Vai Ile Asn 390 ctg ctg gea ggc

Leu Leu Ala Gly 405 cag tcc att gtc

Gin Ser Ile Vai 420 gct gee tcc ttc

Ala Ala Ser Phe 435 aca atg ate cgg Thr Met Ile Arg gtg ggc age ate

Vai Gly Ser Ile 470 ccc tcc atg cct

Pro Ser Met Pro 485 gct gtc act gtc

Ala Vai Thr Vai 500 acg gtg cag gac

Thr Vai Gin Asp 515 1396 1444 1492 1540 1588 1636 1684 1732 1780 1828 46 aaa ggg aaa cag acg cga cag caa caa gag cac cag aag tat atg gtc 1876

Lys Gly Lys Gin Thr Arg Gin Gin Gin Glu His Gin Lys Tyr Met Vai 525 530 535 cca ctg cag gcc tca gca caa gag aag aat gga ctc tgaggactga 1922

Pro Leu Gin Ala Ser Ala Gin Glu Lys Asn Gly Leu 540 545 550 gaaggggcct tacagaaccc taaagggagg gaaggtccca caggtctccg gccacccaca 1982 caaggaggag gaagaggaaa tggtgaccca agtgtggggg ttgtggttca ggaaagcatc 2042 ttcccagggg tccacctccc tttataaacc ccaccagaac cacatcatta aaaggtttga 2102 ctgcgaaaaa aaaaaaaaaa a 2123

<210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Desconhecido < 4 0 0 > 2

Met Ala Phe Asn Asp Leu Leu Gin Gin Vai Gly Gly Vai Gly Arg Phe 1 5 10 15 Gin Gin Ile Gin Vai Thr Leu Vai Vai Leu Pro Leu Leu Leu Met Ala 20 25 30 Ser His Asn Thr Leu Gin Asn Phe Thr Ala Ala Ile Pro Thr His His 35 40 45 Cys Arg Pro Pro Ala Asp Ala Asn Leu Ser Lys Asn Gly Gly Leu Glu 50 55 60 Vai Trp Leu Pro Arg Asp Arg Gin Gly Gin Pro Glu Ser Cys Leu Arg 65 70 75 80 Phe Thr Ser Pro Gin Trp Gly Leu Pro Phe Leu Asn Gly Thr Glu Ala 85 90 95 Asn Gly Thr Gly Ala Thr Glu Pro Cys Thr Asp Gly Trp Ile Tyr Asp 100 105 110 Asn Ser Thr Phe Pro Ser Thr Ile Vai Thr Glu Trp Asp Leu Vai Cys 115 120 125 47 47 Ser His Arg Ala Leu Arg Gin Leu Ala Gin Ser Leu Tyr Met Vai Gly 130 135 Vai Leu Leu Gly Ala Met Vai Phe 145 150 Arg Arg Lys Vai Leu Ile Leu Asn 165 Thr Cys Ala Ala Phe Ala Pro Asn 180 Leu Leu Ser Gly Met Ala Leu Ala 195 200 Leu Asn Vai Glu Trp Met Pro Ile 210 215 Leu Ile Gly Tyr Vai Tyr Ser Leu 225 230 Ala Tyr Ala Vai Pro His Trp Arg 245 Pro Phe Phe Ala Phe Phe Ile Tyr 260 Arg Trp His Ser Ser Ser Gly Arg 275 280 Gin Arg Vai Ala Arg Ile Asn Gly 290 295 Ser Met Glu Vai Leu Arg Ala Ser 305 310 Lys Gly Gin Ala Ser Ala Met Glu 325 His Leu Phe Leu Cys Leu Ser Met 340 Tyr Tyr Gly Leu Vai Met Asp Leu 355 360 Leu Ile Gin Vai Ile Phe Gly Ala 370 375 Gly Phe Leu Vai Ile Asn Ser Leu 385 390 140

Gly Tyr Leu Ala Asp Arg Leu Gly 155 160

Tyr Leu Gin Thr Ala Vai Ser Gly 170 175

Phe Pro Ile Tyr Cys Ala Phe Arg 185 190

Gly Ile Ser Leu Asn Cys Met Thr 205

His Thr Arg Ala Cys Vai Gly Thr 220

Gly Gin Phe Leu Leu Ala Gly Vai 235 240

His Leu Gin Leu Leu Vai Ser Ala 250 255

Ser Trp Phe Phe Ile Glu Ser Ala 265 270

Leu Asp Leu Thr Leu Arg Ala Leu 285

Lys Arg Glu Glu Gly Ala Lys Leu 300

Leu Gin Lys Glu Leu Thr Met Gly 315 320

Leu Leu Arg Cys Pro Thr Leu Arg 330 335

Leu Trp Phe Ala Thr Ser Phe Ala 345 350

Gin Gly Phe Gly Vai Ser Ile Tyr 365

Vai Asp Leu Pro Ala Lys Leu Vai 380

Gly Arg Arg Pro Ala Gin Met Ala 395 400

Ala Leu Leu Leu Ala Gly Ile Cys Ile Leu Leu Asn Gly Vai Ile Pro 48 405 410 415

Gin Asp Gin Ser Ile Vai Arg Thr Ser Leu Ala Vai Leu Gly Lys Gly 420 425 430

Cys Leu Ala Ala Ser Phe Asn Cys Ile Phe Leu Tyr Thr Gly Glu Leu 435 440 445

Tyr Pro Thr Met Ile Arg Gin Thr Gly Met Gly Met Gly Ser Thr Met 450 455 460

Ala Arg Vai Gly Ser Ile Vai Ser Pro Leu Vai Ser Met Thr Ala Glu 465 470 475 480

Leu Tyr Pro Ser Met Pro Leu Phe Ile Tyr Gly Ala Vai Pro Vai Ala 485 490 495

Ala Ser Ala Vai Thr Vai Leu Leu Pro Glu Thr Leu Gly Gin Pro Leu 500 505 510

Pro Asp Thr Vai Gin Asp Leu Glu Ser Arg Lys Gly Lys Gin Thr Arg 515 520 525

Gin Gin Gin Glu His Gin Lys Tyr Met Vai Pro Leu Gin Ala Ser Ala 530 535 540

Gin Glu Lys Asn Gly Leu 545 550 <210> 3 <211> 77

<212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta informação não se encontra disponível <400> 3 accgtctaga attcttttta tttttaattt tctttcaaat acgtccacca tggcctttaa 60 77 tgacctcctg cagcagg 49 <210> 4 <211> 51

<212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta informação não se encontra disponível < 4 0 0 > 4 tactcacgtg gatcctgatc agacgtctgt aggaccttcc ctccctttag g 51 <210> 5 <211> 9

<212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta informação não se encontra disponível < 4 0 0 > 5 ccaccatgg 9 <210> 6 <211> 25

<212> ADN 50 <213> Desconhecido <2 2 0 > informação <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta não se encontra disponível < 4 0 0 > 6 cccgctggca ctcctcctcc gggag 25 <210> 7 <211> 26

<212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > informação <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta não se encontra disponível < 4 0 0 > 7 gtagagctcg gcagtcatgc tcacca 26 <210> 8 <211> 24

<212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > informação <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta não se encontra disponível 51 < 4 Ο Ο > 8 ccagcgctgt cactgtcctc ctgc 24 <210> 9 <211> 29

<212> ADN <213> Desconhecido <2 2 0 > <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta informação não se encontra disponível <400> 9 aacccccaca cttgggtcac catttcctc 29

<210 > 10 <211> 14 <212> PRT <213> Desconhecido <2 2 0 > <223> Descrição de organismo desconhecido: Esta informação não se encontra disponível < 4 0 0 > 10

Thr Vai Gin Asp Leu Glu Ser Arg Lys Gly Lys Gin Thr Arg 15 10 52

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência dos leitores. Não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora se tenha tomado muito cuidado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição: EP323149 A [0030] U54301144 A [0056] WO 9313208 A [0045] U54670417 A [0056] EP319312 BI [0045] U54791192 A [0056] U53969287 A [0055] U54179337 A [0056] US 369[016 A [0055] US 4816567 A, Cabilly [0061] U54195128 A [0055] WO 9214843 A [0065] US 4247642 A [0055] US 4376110 A, David & Greene [0070] U54229537 A [0055] US 9913172 W [0087] US 4330440 A [0055] WO 60088864 A [0087] US 4640835 A [0056] WO 60132267 A [0087] US 4496689 A [0056]

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Lisboa, 13/12/2007

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de detecção compreendendo proporcionar um agonista ou antagonista de hOAT candidato, pôr o candidato em contacto com um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e que compreende a sequência de hOAT com a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2, ou pôr o candidato em contacto com uma sequência de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica para o referido polipéptido, determinar o efeito do candidato sobre a transcrição do ácido nucleico ou a expressão ou a actividade biológica do polipéptido, identificar um agonista ou antagonista de hOAT a partir dos candidatos e, opcionalmente, preparar quantidades adicionais do agonista ou antagonista assim identificado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência que codifica para o polipéptido é a sequência de codificação de hOAT representada na SEQ ID NO: 1.

3. Método que compreende a identificação de um ou mais alelos e/ou isoformas da sequência de hOAT em indivíduos humanos e determinar se tais alelos ou isoformas estão ou não em correlação com a nefrotoxicidade de um fármaco seleccionado em indivíduos humanos, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT de SEQ ID NO: 2 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2.

4. Método que compreende a identificação de uma variação de sequência nucleica na sequência de codificação de hOAT, domínios de controlo de expressão de hOAT ou sequência de splicing de ARN de hOAT em indivíduos humanos e determinar se tal variação está ou não em correlação com a nefrotoxicidade de um fármaco seleccionado em indivíduos humanos, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2.

5. Método que compreende proporcionar uma forma modificada de maneira covalente de um análogo de nucleótido fosfonato e determinar se o análogo é ou não transportado por hOAT, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2.

6. Método de acordo com a Reivindicação 5, em que o análogo de nucleótido fosfonato é um derivado de PMEA, de cidofovir ou de PMPA.

7. Método que compreende a identificação de uma interacção de fármaco-fármaco pondo em contacto um fármaco 3 candidato com hOAT e, pelo menos, um segundo fármaco, cujo efeito sobre o transporte mediado por hOAT do fármaco candidato se pretende determinar, e analisar o efeito do segundo ou mais fármacos sobre o transporte mediado por hOAT do fármaco candidato, em que o hOAT é um polipéptido isolado que é capaz de transportar aniões orgânicos e compreende a sequência de hOAT de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2. Lisboa, 13/12/2007