KR102428383B1 - 중추신경계 및 혈관계에 대한 활성을 가진 벤조디아제핀 생성물 - Google Patents

Abstract

중추신경계 및 혈관계 질환, 특히 인지 악화를 동반한 신경변성 장애, 산화성 스트레스와 관련된 질환, 미토콘드리아 기능장애를 나타내는 질환, 파킨슨병 및 신경병증성 통증은 물론 노화와 관련된 병리학적 과정의 치료를 위한 식 III 화합물, 그것의 생성물 및 이들을 함유하는 제약 조성물이 개시된다.

Description

중추신경계 및 혈관계에 대한 활성을 가진 벤조디아제핀 생성물

본 발명은 노화에 의해 원치않는 산화 또는 병리학적 과정을 동반하는 신경변성 또는 인지 악화와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.

신경변성은 치매, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD) 및 신경병증성 통증(NP)과 같은 신경계 장애의 많은 질환에 공통된 주제이다. 현재 이들 질환은 파괴적이며 관리하는데 돈이 많이 들고 치료도 불충분하다. 게다가 노화와 관련된 이들 질환의 발생이 인구학적 변화로 인해 빠르게 증가하고 있다.

전 세계 인구의 노화 진행은 신경변성 질환 및 노인성 치매의 증가라는 원치않는 결과를 야기한다. 세계적으로 4680만 명의 사람이 치매를 앓고 있는 것으로 추산된다. 이 수는 20년마다 거의 2배씩 증가해서 2030년에 7470만 명, 2050년에는 13150만 명이 될 것이다. 치매는 또한 막대한 경제적 악영향을 미친다. 현재 치매에 대해 추산된 전 세계적 비용은 8180억 달러이고 2018년까지 조 달러로 증가할 것이며, 이로 인해 환자와 가족 구성원 및 간병인의 삶의 질에 엄청난 악영향을 미칠 것이다(Alzheimer's Disease International. World Alzheimer Report 2015 London: Alzheimer's Disease International; 2015).

이들 질환 중에서도 AD는 대략 3500만 명의 사람이 고통받고 있는 질환이며, 고령 인구의 증가로 인해 앞으로 30년 동안 꾸준히 증가할 것으로 추정된다(Reitz, C.; Brayne, C.; Mayeux, R. 알츠하이머병의 역학. Nat. Rev. Neurol., 2011, 7, 137-152)(Reitz, C.; Mayeux, R. 알츠하이머병: 역학, 진단 기준, 위험 요인 및 바이오마커. Biochem. Pharmacol., 2014, 88, 640-651).

AD는 서서히 진행하는 기억 상실 및 인지 기능 상실을 가져오는 뇌의 신경변성 장애이며, 공격 및 우울과 같은 행동 변화가 주로 수반된다(Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M. 알츠하이머병. N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344). 이 질환의 마지막 단계에서 환자는 침대에 누워 지내게 되고 실금하며 간병에 의존하게 되는데, 이는 가족에게 비용상 매우 큰 부담이 된다. AD의 진단 후 사망하기까지 평균 9년이 걸린다(Citron M. (2004). 알츠하이머병에서 질환 변형을 위한 전략. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85). 24시간 간병 체제와 다른 서비스도 필요로 하는 이 질환에 걸린 많은 수의 사람은 의학적, 정신적 및 인적 자원에 중대한 영향을 받을 것이다(Suh Y.H. 및 Checler F. (2002) 아밀로이드 전구체 단백질, 프레세닐린 및 알파-15 시누클레인: 알츠하이머병에서 분자 병인론 및 제약학적 용도. Pharmacol Rev. 54(3):469-525). 따라서, AD에 대한 의학적 관심이 점점 높아지고 있다.

AD는 피질 관련 영역이 포함됨으로 인한, 연하장애(악화된 말하기와 대화 이해를 동반한 언어장애), 행동부전(운동 퇴행이 없을 때 특정 움직임과 의도적 제스처의 협동 및 실행 불능) 및 인지불능(물체, 사람, 소리, 모양 및/또는 냄새를 인지하는 능력 불능)과 함께 기억 상실을 특징으로 하는 전형적인 외피성 치매이다(Crook R. et al. (1998). 프레세닐린 1의 엑손 9의 결실로 인한 강직성 하반신마비 및 플라크를 동반한 알츠하이머병의 변형태. Nat Med. 4(4): 452-5)(Houlden H., Baker M. et al. (2000)). 강직성 하반신마비 및 면화반을 동반한 알츠하이머병의 변형태는 예외적으로 높은 아밀로이드-베타 농도를 초래하는 PS-1 돌연변이에 기인한다(Ann Neurol. 48(5): 806-8)(Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). 조기-개시 알츠하이머병 가계에서 2개의 신규 프레세닐린-1 돌연변이 및 프레세닐린-1 돌연변이와 신규 표현형의 연관성에 대한 예비증거. Neuroreport. 8(6): 1537-42)(Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). 강직성 하반신마비를 동반한 알츠하이머병 변형태: 신경변리학적 표현형. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92)).

이 질환은 다원적이고 이질적이지만 콜린성 뉴런의 대량 손실, 신경섬유원 매듭의 침착 및 베타-아밀로이드 응집물과 같은 특정한 공통 특징을 가진다(Huang, Y.; Mucke, L. 알츠하이머 메커니즘 및 치료 전략. Cell, 2012, 148, 1204-1222).

AD의 화학적 병리현상은 다음과 같이 파킨슨병(PD)과 많은 유사성을 나타낸다: 산화성 스트레스. 미토콘드리아 복합체 I의 감소된 활성, 증가된 지질 과산화. 이들 유사성은 또한 질환의 진행성, 죽은 뉴런 주변에 반응성 미세아교세포의 증식, 산화성 스트레스 및 염증 과정을 포함한다. 제약 산업에 의해 이루어진 많은 투자에도 AD의 유효한 치료는 거의 없는 실정이다.

현재 이 질환을 치료할 수 있는 새로운 약물을 얻고자 상이한 전략들이 조사 중이며, 현재 승인된 약물은 환자에게 그다지 많은 이익을 제공하지는 못하는 걸로 나타냈다. 이들 약물은 질환의 증상 중 일부를 일시적으로 지연시키지만(최선의 경우 1년) 그것의 진행을 방지하지는 못한다.

초기 AD는 콜린성 결함에만 관련되지만, AD에서 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 글루타메이트와 같은 다른 신경전달물질도 감소되거나 조절되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 현재 AD 병리현상에서 가장 많이 연구된 신경전달물질은 콜린계 및 글루타메이트계이다(Palmer, AM; Gershon, S. 콜린 및 글루타메이트가 알츠하이머병의 신경 기반인가? FASEB J 1990, 4, 2745-52). 현재 AD의 치료 옵션은 도네페질, 갈란타민 또는 리바스티그민과 같은 약물에 의한 아세틸콜린에스테라아제의 억제에 기초하거나, 또는 글루타메이트 수용체, NMDA(N-메틸-D-아스파르테이트)에 길항작용할 수 있는 메만틴의 능력에 기초한다. 이들 약물의 낮은 성공률로 인해 새로운 연구들이 개시되었다(Bartus, RT, Dean, RL 3rd; Beer, B; Lippa, AS. 노인성 기억장애의 콜린계 가설. Science 1982, 217, 408-14)(Terry, A.V. Jr.; Buccafusco, J.J. 연령 및 알츠하이머병-관련 인지 결함의 콜린계 가설: 새로운 약물 개발에 대한 최근 난제 및 이들의 관련성. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 821-827)(van Marum, R. J. 알츠하이머병의 현재 및 향후의 치료법. Fundam. Clin. Pharmacol., 2008, 22, 265-274).

AD의 콜린성 가설에 따르면, 중추신경계(CNS)에서 콜린 기능의 상실이 AD와 관련된 인지 장애에 유의하게 기여한다(Bartus, R.; Dean, R.; Beer, B.; Lippa, A. 노인성 기억장애의 콜린성 가설. Science, 1982, 217, 408-414). 또한, 콜린 고갈, 아밀로이드형성 및 Tau 인산화 간의 관계는 복잡하지만, 콜린의 감소가 베타 아밀로이드 생성을 증가시킬 수 있고 Tau 단백질의 인산화를 유도할 수 있는 것으로 추정된다. 한편, AD의 글루타메이트계 가설은 글루타메이트와 관련된 흥분독성 메커니즘이 NMDA 수용체를 연루시켜 변성 및 세포사를 초래한다는 것을 규명하였다(Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Komhuber J. 글루타메이트 및 글루타메이트 수용체 시스템: 약물 작용의 표적. Int. J. Geriatr. Psychiatry 2003, 18, S33-40). NMDA 수용체를 통한 시냅스 자극은 학습 및 기억 기능에 중요하지만, 과잉의 글루타메이트가 흥분독성 및 신경변성을 야기할 수 있다(Michaels RL, Rothman SM. 시험관내 글루타메이트 신경독성: 길항제 약리학 및 세포내 칼슘 농도. J. Neurosci. 1990, 10, 283-92).

이 시나리오에서 치료 전략은 콜린성 긴장을 개선할 수 있는 AChe 효소 억제제와 글루타메이트 유도 신경변성과 상충할 수 있는 NMDA 수용체 길항제의 조합에 의해 양 시스템을 저해해야 한다. 그러나 이 조합 치료법은 일부 단점을 나타낸다. 즉, AD를 앓는 노인 환자와 장년층의 경우 각 약물의 상이한 약동학이 상이하게 영향을 미쳐서 추가적인 문제가 발생할 수 있다. 실제로 병원에서 두 상이한 ADME(투여 분포 대사 배설) 곡선의 조합 치료법을 적용할 수 있다.

두 의약의 조합에 대한 대안적인 접근법은 다중 약물학적 표적에 작용할 수 있는 약물, 즉 다중-표적 약물(MTD)이다.

간단한 화합물을 가지고 둘 이상의 단백질에 동시에 작용시키는 전략은 뛰어난 치료 효과를 제공할 수 있다(Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. 신경변성 질환과 싸우기 위한 다중-표적-지향 리간드. J Med Chem 2008, 51, 347-72)(Zimmerman GR, Lehar J, Keith CT. 다중-표적 치료제; 전체가 부분의 합계를 초과할 때. Drug Discov Today 2007, 12, 34-42)(Morphy R, Ranlovic, Z. 다중 리간드의 단편, 망상 생물학 및 설계. Drug Discov Today 2007, 12, 156-60). 이 효과는 칵테일 또는 다성분 의약을 능가하는 MTD의 사용에 의해 제공되는 잠재적 이익들에 의해 설명될 수 있다. 칵테일을 능가하는 MTD의 이점은 다음과 같이 종합될 수 있다: 1) 간단한 화합물의 약동학을 예측하는 것이 칵테일의 경우보다 훨씬 용이한 경우 임상 개발의 불확실성의 감소, 상이한 생체이용률, 약동학 및 대사과정의 문제점 극복; 2) 약역학적 안전성; 3) 다중 치료 표적을 억제하는 상승작용적 효과로 인한 증가된 효능, 및 4) 약물 칵테일의 부작용(약물-약물 상호작용으로 인하며, 특히 동일한 대사 효소에 대한 상이한 약물의 경쟁이 이들의 독성에 영향을 미치는 경우 약물 대사와 관련됨)을 감소시킴으로 인한 증가된 안전성.

다른 중요한 이점은 순응 확률이 개선된 단순화된 치료 섭생이며, 이것은 특히 노인층 알츠하이머 환자와 이들의 간병인에게 중요하다(Small, G, Dubois B. 알츠하이머병에서 치료 순응성 검토: 경피 패치의 잠재적 이익. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). 이와 관련하여, 중요한 측면은 알츠하이머 환자가 주로 관련될 수 있는 고혈압, 혈관 질환 및 당뇨병을 포함하는 광범위한 의학적 상태(동시이환)에 민감하다는 점이다. 따라서, 노인 집단에서 다중-제약 사용과 관련된 문제는 최근 중요하게 인식되었다. 이들 문제는 주로 약물 상호작용과 관련되는데, 이것은 만성 질병과 장기 부전의 공존으로 인해 노인 집단에서 더 자주 발생한다. 독립적으로는 안전한 두 가지 약물이 특히 노인 집단에서 병용되었을 때도 안전할 수 있다고는 가정할 수 없다. 또한, 어떤 약물 치료에 대해서는 고령의 나이가 예측불가능한 위험 요인이기 때문에 동시에 투여되는 약물의 수는 가능한 많이 감소되어야 한다(Turnheim, K. 약물 요법을 노인이 받을 때: 노인층에서의 약동학 및 약역학. Exp. Geront. 2006, 38, 843-853). MTD는 다목적 약물들 간의 상호작용의 복잡성, 동시이환, 변경된 약역학적 감수성 및 약동학의 변화와 관련하여 노인층에서 조합 치료법보다 매우 선호된다. MTD의 임상 사용은 또한 치료 섭생을 단순화할 수 있다(Youdim, M.B., 및 Buccafusco, JJ (2005) 알츠하이머병 및 파킨슨병의 치료에서 다목적 약물을 위한 CNS 표적. J. Neural Transm 112, 519-537). 처방된 의약 섭생에 대한 순응성은 효과적인 치료를 위해 필수적이다. 비순응은 일반적인 문제이지만, 이것은 알츠하이머 환자와 이들의 간병인에게는 어려운 점이다(Small, G, Dubois B. 알츠하이머병에서 치료 순응성 검토: 경피 패치의 잠재적 이익. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). 결론적으로, 다중 표적에 작용하는 약물을 사용한 단순화된 치료 섭생은 치료에 대한 효과를 증가시킬 수 있다. 모든 앞서 언급된 이점은 약물 칵테일에서는 적용될 수 없다.

다중 표적을 위한 리간드 전략은, 특히 신경변성 질환에 연루된 기초적 과정이 원래 다원적이라는 사실에 비추어, 복잡한 신경학적 질환의 치료를 위한 새로운 후보를 개발하기 위한 혁신적인 접근법이 된다(Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. 신경변성 질환과 싸우기 위한 다중-표적-지향 리간드. J Med Chem 2008, 51, 347-72). 이러한 전략은 하나의 단일 화합물이 알츠하이머병 및 다른 신경변성 질환에 내포된 신경변성 과정에서 협동작용하는 다중 표적에 작용할 수 있고, 따라서 상호작용하는 병원성 경로들 간에 원치않는 보완을 예측할 수 있다는 개념에 기초한다. MTD는 약물 조합의 사용에 대한 대안의 실시형태가 될 수 있다. 대부분의 신경변성 메커니즘은 많은 신경 질환에 의해 공유되므로 이들 MTD는 다른 질환을 위한 의약으로도 사용될 수 있다.

허혈성 뇌졸중에 대한 전세계적 부담은 출혈성 뇌졸중의 거의 4배이다. 허혈성 뇌졸중 생존자의 25 내지 30%에서 즉각적인 또는 지연된 혈관성 인지 악화 또는 혈관성 치매가 발생한다. 뇌졸중 손상 후 치매는 모든 종류의 인지 장애를 포함할 수 있다. 뇌졸중 후 사망 위험은 감소했지만 그로 인해 뇌 침범 및 인지 악화를 가진 뇌졸중 생존자 수는 증가했다(R.N. Kalaria et al., 뇌졸중 손상, 인지 손상 및 혈관성 치매. Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis. 2016.01.015).

뇌졸중 후 치매는 뇌졸중 손상 후 발생하는 모든 종류의 치매를 한정하는 임상적 실체로서 간주되며, 혈관성 치매, 신경변성 치매 또는 두 과정의 조합을 포함하는지의 여부와는 무관하다. 뇌졸중 후 치매는 큰 혈관 및 작은 혈관의 질환들뿐만 아니라 신경변성 병리현상의 다양한 조합의 복잡한 병인을 수반한다(R.N. Kalaria et al., 뇌졸중 손상, 인지 손상 및 혈관성 치매. Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016 /j.bbadis. 2016.01.015).

허혈성 뇌졸중 손상의 연쇄반응에 대한 지식으로부터 허혈성 뇌졸중은 매우 이질적인 일련의 복잡한 사건들로 구성된다는 것을 알 수 있다(R. Brouns, P.P. De Deyn, 급성 허혈성 뇌졸중에서 신경생리학적 과정의 복잡성. Clin. Neurol. Neurosurg. 111 (2009) 483-495). 허혈성 뇌졸중은 초기 저관류 사건 후 수 분에서 수 일 및 수 주 동안 진행된다. 주요 사건은 중단된 혈류로 인한 에너지 장애, 흥분독성, 칼슘 과부화, 산화성 스트레스, 혈액 뇌 장벽 기능부전, 미세혈관 손상, 지혈 활성화, 염증 및 면역반응과 관련된 손상 및 신경, 신경교 및 내피 세포 수준의 세포사를 포함한다. 수 일 후에 발생할 수 있는 미세혈관 손상 및 혈액머리태아(hematocephalic) 장벽의 파괴는 혈관성 부종을 초래하고 또한 출혈을 야기할 수 있다. 동시에 조직은 복잡한 손상 범위와 손상을 제한하고 결과를 개선하기 위한 혈관형성을 포함하는 리모델링 반응을 진행한다. 이들 사건은 뇌가 노화되면서 중단되므로, 조직실질이 비가역적으로 손상되어 인지 기능장애를 야기한다(R.N. Kalaria, et al., 뇌졸중 손상, 인지 손상 및 혈관성 치매. Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi. org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).

실험 연구는 허혈성 뇌졸중 손상 후 세포사는 괴사로 인한 것일 수 있음을 시사한다. 그러나 최근에 신경 사멸이 세포자살 및 혼성 메커니즘에 의해 상당히 일어난다는 것이 밝혀졌다(R.N. Kalaria, et al., 뇌졸중 손상, 인지 손상 및 혈관성 치매. Biochim. Biophys. Acta (2016).

신경염증 및 면역저하가 또한 뇌졸중, 노화 및 감염과 관련된다. 이것은 아마 뇌졸중 후 인지 기능에 대한 손상 효과를 야기할 것이다(B.W. McColl, S.M. Allan, N.J. Rothwell, 전신 염증 및 뇌졸중: 병인학, 병리학 및 치료를 위한 표적. Biochem. Soc. Trans. 35(2007) 1163-1165)(C. Meisel, A. Meisel, 뇌졸중 후 면역억제의 억제. N. Engl. J. Med. 365(2011)2134-2136)(W. Swardfager, D.A. Winer, N. Herrmann, S. Winer, K.L. Lanctot, 뇌졸중 후 신경변성에서 인터류킨-17. Neurosci. Biobehav. Rev. 37 (2013) 436-447).

파킨슨병(PD)은 운동 기능장애, 느린 움직임, 강직, 휴식시 진전 및 평형 변화의 증상을 가진 신경변성 질환이다. 이 질환이 진행됨에 따라 많은 환자에서 불안, 우울, 변비 및 치매를 포함하는 비-운동 증상들이 발생한다. 이들 특징은 흑질치밀부에서 도파민 선조체 함량의 상당한 감소 및 도파민성 뉴런의 상실로 인한 것이다(Gauthier, 1982).

PD의 임상 징후는 도파민성 신경 사멸이 70 내지 80%의 역치를 초과하고 선조체 신경 종말의 상실이 50 내지 60%를 초과한 후에 나타난다(Agid, 1991).

PD의 발생 메커니즘에 대한 연구는 흑질치밀부에서 도파민성 뉴런 상실이 미토콘드리아 복합체 I에서의 결함과 관련된다는 것을 밝혀냈다(Jenner 1998).

파킨슨 증상을 완화하는 약물이 있지만 이들 약물의 장기적 사용은 PD의 진행을 방지하는데 효과적이지 않고 소모성 부작용과 관련되었다. 따라서, 퇴행성 진행을 지연시키거나 심지어 중단시키는 신경보호제 치료법을 개발하는데 큰 관심이 있다.

불행히도, 신경보호제 치료법의 개발은 PD와 같은 퇴행성 신경학적 질환의 병리현상에 대한 제한된 시각으로 인해 방해받고 있었다. 파킨슨병의 신경 퇴화를 담당하는 병인 및 병리현상은 아직 불명인 상황이다. 일부 증거는 염증성 과정이 연쇄반응에 연루되어 진행성 뉴런 변성을 초래한다는 미세아교세포의 활성화 이론을 뒷받침한다(Kreutzgber, GW, 1996 Trends Neurosci, 19:312-318). 활성화된 미세아교세포는 파킨슨 환자의 흑질에서 변성된 뉴런 부근에 존재한다(McGeer, PL et al, 1988, Neurology, 38:1285-1291).

고전적인 PD 치료의 과정은 레보도파(L-DOPA) 및 카비도파와 같은 도파민 효현제의 투여이다. 카테콜-O-메틸트랜스페라아제의 억제제 및 아만타딘과 같은 도파민을 대체하거나 그것의 변성을 억제하는 다른 약물 제제가 통상적으로 처방된다(N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781(Dec 1, 2009)).

이러한 약물 제제는 전형적으로 환자의 증상을 개선하지만, 항상 효과적이고 시간 경과시 관용되는 것은 아니며, 부작용으로 운동장애가 있게 된다(A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). 다른 문제는 매일의 치료가 환자에게 부담이 되고 치료 효과가 떨어질 수 있다는 사실이다. 따라서, 미니펌프(예를 들어, 공장내, 피하)를 배치함으로써 도파민 효현제의 연속 주입을 제공할 수 있는 새로운 약물 방출 시스템 및 경피 패치에 의한 피부를 통한 방출을 제시하는 것이 현재 강조된다(A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). 이처럼 약물 및 방출 시스템이 발전하고 있지만 일부 파킨슨 환자는 그럼에도 아직 충분한 완화를 경험하고 있지않다(N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009).

미토콘드리아 질환의 실험 모델은 전형적으로 전자 수송 사슬에 연루된 효소의 억제를 수반한다(1). 또한, 신경변성 질환의 대부분은 미토콘드리아 기능장애와 관련된다는 것이 보고되었다(2-5). 미토콘드리아 호흡 사슬에서 I, II 및 IV 복합체의 결함이 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 및 루게릭병에서 검출되었다(6-9).

일부 증거는 파킨슨병이 자유 라디칼 및 미토콘드리아 기능장애를 수반하는 에너지 생성의 실패를 초래하는 질환임을 나타낸다(10-11). 증가된 산화성 손상, 도파민 고갈, 단백질의 질화, 철의 축적, 단백질의 부가 및 세포자살이 파킨슨병의 특징이다(12-14).

다수의 역학적 연구는 만성 통증이 매우 일반적이며, 개인의 건강과 사회적 건강에 심각한 영향을 미치고 있음을 보여준다(Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. 대부분 신경병증성 기원인 만성 통증의 역학. 일반 모집단 조사로부터의 결과. J Pain 2006; 7:281-289)(Treede RD, Jensen TS, Campbell JN, Cruccu G, Dostrovsky JO, Griffin JW, Hansson P, Hughes R, Nurmikko T, Serra J. 신경병증성 통증의 재정립 및 임상 용도를 위한 등급 시스템: 임상 및 연구 진단 기준에 대한 공통된 합의. Neurology 2008; 70:1630-1635). 신경병증성 만성 통증은 일반 모집단의 대략 7 내지 8%에 영향을 미친다고 추산되며, 이러한 만성 통증에 이용가능한 치료법은 아직 만족스럽지 않다(Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. 대부분 신경병증성 기원인 만성 통증의 역학. 일반 모집단 조사로부터의 결과. J Pain 2006; 7:281-289)(van Hecke O, Austin SK, Khan RA, Smith BH, Torrance N. 일반 모집단에서 신경병증성 통증: 역학 연구의 체계적 검토. Pain 2014; 155:654-62)(Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. 암 환자에서 신경학적 통증의 유병률 및 병인학: 체계적 검토. Pain 2012; 153:359-365). NP는 신경변성의 증상이라고 간주되며, 따라서 NP의 시작을 방지하고 진행을 제어하며 심지어 이 만성 통증 증상을 확립시키는 신경 손상을 회복시키기 위한 전략으로서 신경보호를 생각하는 것은 논리적으로 타당하다(Bordet T 및 Pruss RM. 신경병증성 통증을 예방 및 치료하기 위한 대안의 접근법으로서 신경보호 표적화. Neuro-therapeutics 2009; 6:648-662). 신경보호는 병리학적 스트레스(외상, 독성, 허혈 또는 대사 사건)와 관련하여 신경 생존 및 신경 기능을 유지하는 방법을 포함한다. 따라서, 현재 대부분의 말초 및 중추 NP 신경병증(통증성 당뇨병성 신경병증, 원위 다발성신경병증, HIV 및 항레트로바이러스 치료법에 의한 원위 감각, 화학요법에 의해 유도된 말초신경병증, 대상포진 후 통증, MS 통증 및 뇌졸중 후 통증 등)이 상기 전망과 관련된다(Bordet T 및 Pruss RM. 신경병증성 통증을 예방 및 치료하기 위한 대안의 접근법으로서 신경보호 표적화. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662)(Flatters SJL, Bennett GJ. 파클리탁셀-유도 통증성 말초신경병증에서 말초 감각신경 연구: 미토콘드리아 기능장애에 대한 증거. Pain 2006; 122: 245-257)(Jaggi AS, Singh N. 암-화학요법 약물-유도 말초신경병증에서의 메커니즘. Toxicology 2012; 291:1-9). 이와 관련된 관심은 글루타메이트성 기능장애, 질산화성 스트레스, 미토콘드리아 기능장애, 세포자살, 영양 인자, 신경염증 및 신경변성에 의해 유도된 미손상 섬유의 변화 등에 특히 집중되어있다(Bordet T 및 Pruss RM. 신경병증성 통증을 예방 및 치료하기 위한 대안의 접근법으로서 신경보호 표적화. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662)(DeLeo JA, Sorkin LS, Watkins LR, editors. 통증의 면역 및 신경교 조절. Seattle: IASP Press; 2007)(Park ES, Gao X, Chung JM, Chung K. 래트 신경병증 척수후각 뉴런에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 수준. Neuroscience Letters 2006; 391:108-111). ATP에 의존적인 신경병증에서 전자 수송 사슬의 참여에 기초한 통증에 대한 새로운 치료법의 개발이 제안되었다(Joseph EK, Levine JD. 신경병증 및 염증성 통증 모델에서 미토콘드리아 전자 수송. Pain 2006; 121:105-114)(Joseph EK, Levine JD. 기계적 통각과민증을 매개하는 다수의 PKC-의존적 메커니즘. Pain 2010; 150:17-21). 기계적 통각과민증의 유도에서 신경성장인자(NGF)의 미토콘드리아 의존성이 또한 보고되었다(Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. 신경성장인자-유도 기계적 통각과민증의 미토콘드리아 의존성. Pain 2011; 152:1832-1837).

이들 개념에 따라서, 신경 섬유의 연속성이 중단될 때 일어나는 Wallerian 변성(WD)의 과정에 연루된 다수의 면역 매개인자가 NP의 약물 치료를 위한 새로운 표적으로서 제안되었다(Debovy P. 신경돌기 재생과 신경병증성 통증 유도를 위한 Wallerian 변성 및 말초신경 조건. Annals of Anatomy 2011; 193:267-275)(Lingor P, Koch JC, Tonges L, Bahr M. CNS에서 치료 표적으로서의 신경돌기 변성. Cell Tissue Res 2012; 349:289-311). 신경면역 활성화, 미세아교세포-뉴런 신호화 및 산화성 스트레스도 신경 손상 후 전달을 강화하는데 역할을 한다는 것이 확인되었다(Berger JV, Knaepen L, Janssen SPM, Jaken RJP, Marcus MAE, Joosten EAJ, Deumens R. 메커니즘-기반 치료 접근법을 위한 신경병증-유도 통증 과민반응에 대한 세포 및 분자적 이해. Brain Research Reviews 2011; 67:282-310)(De Leo JA, Tawfik VL, La Croix-Fralish ML. 사면 시냅스: CNS 민감화 및 만성 통증의 경로. Pain 2006; 122:17-21)(Austin PJ, Moalem-Taylor G. 신경병증성 통증에서 신경면역 균형: 염증성 면역세포, 면역-유사 신경교 세포 및 사이토카인 관련성. Journal of Neuroimmunology 2010; 229:26-50)(Salvemini D, Little JW, Doyle T, Neumann WL. 통증에서 반응성 산화 및 질소 종의 역할. Free Radical Biology & Medicine 2011; 51:951-966). 결론적으로, NP 치료를 위한 신경보호 및 특히 신경염증에 관한 혁신적 전략이 현재 연구개발 단계에 있다(Bordet T 및 Pruss RM. 신경병증성 통증을 예방 및 치료하기 위한 대안적 접근법으로서 신경보호 표적화. Neurothera-peutics 2009; 6:648-662)(Stavniichuk R, Drel VR, Shevalye H, Maksimchyk Y, Kuchmerovska TM, Nadler JL, Obrosova IG. 바이칼레인은 산화성-질산화성 스트레스의 억제 및 p38 MAPK 활성화를 통해 당뇨병성 말초신경병증을 완화한다. Experi-mental Neurology 2011; 203:106-113).

노화와 신경학적 및 정신의학적 장애는 신경 세포의 손상을 야기하고 사멸에 이르게 한다. 이와 관련된 빈번한 신경계 병소 중에는 특히 뉴런 변성, 허혈, 염증, 면역 반응, 외상 및 암이 포함된다. 이들의 결과로서, 신경 세포는 수 분 또는 수 시간 내에 죽을 수 있거나, 또는 초기 병소에서 생존하고 이 손상된 상태에서 신경변성을 활성화하며 최종적으로 세포사에 이를 수 있다.

파킨슨병, 알츠하이머병 및 다른 신경변성 질환에서 신경변성은 다원적이고, 따라서 염증, 글루타메이트계 신경독성, 증가된 철 및 산화질소, 내인성 항산화제의 고갈, 영양 인자의 감소된 발현, 유비퀴틴 프로테아솜 시스템의 기능장애 및 전세포자살(proapoptotic) 단백질의 발현을 포함하는 복합적인 독성 반응이 뉴런의 사멸을 초래하는 것으로 추정된다.

기본적인 운동 기술과 감정을 얻는데 신경계의 중요성이 있으므로 신경계를 보호할 수 있는 치료 방법을 발견하는데 관심이 있다.

신경보호는 신경계, 그것의 세포, 구조 및 기능의 보존, 회복, 치유 또는 재생과 관련된다(Vajda et al., 2002, J. Clin. Neurosci. 9:4-8). 신경보호의 한 가지 목표는 신경계에서 원 병소의 효과를 방지 또는 최소화하거나, 또는 신경돌기, 뉴런, 시냅스 및 수상돌기에서 손상을 야기하는 내인성 또는 외인성 유해 과정의 결과를 방지 또는 최소화하는 것이다.

신경보호는 만성 신경변성 질환(알츠하이머, 파킨슨)의 결과인 신경 손상이나 CNS 변성을 보호하기 위해 사용되는 메커니즘 및 전략이다. 신경보호의 목표는 CNS의 손상 후 기능장애/사망을 제한하고 뇌에서 세포 상호작용에 대해 가능한 최대한의 완전성을 유지하여 신경 기능을 방해 없이 유지하도록 시도하는 것이다.

신경보호의 개념은 만성 뇌 질환뿐만 아니라 급성 신경학적 상태에 적용되었는데, 단 CNS를 손상시킨 기본적인 메커니즘의 일부는 이들 상태와 유사해야 한다. 신경변성 장애는 AD, PD, 헌팅턴병 및 근위축성측삭경화증을 포함한다. 신경보호는 이들 상태의 치료에 사용되는 약물 작용 메커니즘으로서 간주된다.

이용가능하며 연구중인 광범위한 신경보호제 제품이 존재하고, 신경 조직에 대한 손상 메커니즘이 많이 유사하다면 이들 중 일부 제품은 둘 이상의 질환에 대해 잠재적으로 사용될 수 있다. 신경보호제 효과를 가진 제품은 다음의 범주로 구분된다: 자유 라디칼 유인제, 항흥분독성제, 세포자살(프로그래밍된 세포사)의 억제제, 항염제, 신경영양 인자, 킬레이트화 금속 이온, 이온 채널 조정제 및 유전자 요법.

산소 자유 라디칼은 신경변성 질환에서 세포막의 지질 과산화를 초래하여 최종적으로 세포사를 가져오는 단백질의 변성, 효소의 비활성화 및 DNA 손상과 관련된다는 것이 증명되었다.

동물 및 인간 모델에서 수행된 연구는 뇌 대사 및 항산화 보호제 메커니즘에 의해 발생된 산화제 종들 간 평형의 상실이 소위 말하는 산화성 스트레스를 야기하고, 이때 상기 방어 시스템의 효능이 감소하여 파괴에 이른다는 것을 보여준다. 이 산화성 스트레스는 나이를 먹어감에 따라 증가하며, 이는 뉴런 미토콘드리아 기능장애와 관련된 AD 병리현상의 주 원인으로 판명되었다(Neurobiol. Aging 2007, 28, 1009-1014). 또한, 항산화 특성을 가진 산물은 피질 뉴런의 배양물에서 아밀로이드 펩타이드에 의해 유도된 세포자살 및 Ca^{2 +} 항상성의 변화를 방지할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Life Sci. 2000, 66, 1879-1892). 결론적으로, 신경 독성에 대해 신경보호제 능력이 있는 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 또는 부티릴콜린에스테라아제(BuChE) 억제제가 상당히 필요성하며, 이들 화합물들은 AD, PD 또는 헌팅턴병과 같은 신경변성 질환의 치료에서 상당한 의학적 중요성을 가질 것이다.

일반적으로 치료 전략은 주로 나타난 병소의 단일 요인의 조정에 기초한다. 이러한 치료는 매우 제한된 동물 모델에서만 유익한 것으로 판명되었으며, 유전적으로 다양한 집단에서 더 가변적인 정도의 병소 중증도를 수반하는 더 복잡한 인간의 장애에서는 유효성을 나타낼 확률이 낮다(Faden 및 Stoica 2007.; Arch Neurol 64:794-800). 산화성 스트레스, 미토콘드리아 기능장애, 부가된 단백질, 세포자살 및 염증과 같은 신경 사멸의 메커니즘이 상당 정도 밝혀졌지만(Youdim, M.B., 및 Buccafusco, J.J. (2005) 알츠하이머병 및 파킨슨병의 치료에서 다목적 약물에 대한 CNS 표적. J. Neural. Transm. 112, 519-537), 이들은 복잡하고 가변적이며, 많은 병소 메커니즘에 대해 다목적 효과를 가진 화합물을 필요로한다.

(발명의 개요)

쿠바특허 CU23879에 개시된 화합물(3-에톡시카보닐-2-메틸-4-(2-니트로페닐))4,11-디하이드로-1H-피리도[2,3-b][1,5]벤조디아제핀)(JM-20)은 심혈관, 뇌혈관 및 중추신경계와 관련된 다른 질환에 대해 효과를 가질 수 있다.

놀랍게도 화합물 JM-20이 바람직하게는 상이한 타입의 치매, 파킨슨병 및 통증과 같은 질환의 치료에서 CNS에 대해 현저한 치료 효과를 가진다는 것을 발견했다.

따라서, 본 발명은 상이한 타입의 치매, 파킨슨병 및 통증과 같은 질환의 치료에서 우선적으로 사용될 수 있는 JM-20 및 그것의 화학적 산물들의 사용에 기초한다.

JM-20은 벤조디아제핀의 산물이며 벤조디아제핀은 치매를 유도하는 것이 널리 보고되었지만(Shash, D., T. Kurth, et al. 2015)(Zhong, G., Y. Wang, et al. 2015)), 예상외로 JM-20이 상이한 치매도 개선한다.

JM-20의 잠재적 유용성이 문헌에 보고되어 있지만, 치매, 파킨슨병 및 신경병증성 통증과 같은 신경변성 질환에서의 치료 약물로서의 가능성은 아직 구체적으로 확립되지 못했다.

본 발명의 추가적 양태로서, 일반식 III의 화합물(JM-20), 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 시험된 프로드러그가 화학적으로 비활성이고 비독성인 적어도 하나의 비히클 제제, 희석제 및/또는 담체와 혼합하여 투여될 수 있으며, 이 혼합 투여되는 물질들은 이후 제안되는 약물 조성물에 포함된 부형제로서 인정된다.

도 1은 IIa 및 IIb의 합성을 도시한다.
도 2는 IIa로부터 화합물 III의 합성을 도시한다.
도 3은 IIb로부터 화합물 III의 합성을 도시한다.
도 4는 JM-10의 이성질체 형태를 도시한다.
도 5는 화합물 III 및 그것의 할로하이드레이트를 얻는 것을 도시한다.
도 6은 JM-20으로부터 푸마레이트 염을 얻는 것을 도시한다(IIIc).
도 7은 JM-20으로부터 포스페이트 염을 얻는 것을 도시한다(IIId).
도 8은 JM-20으로부터 설페이트 염을 얻는 것을 도시한다(IIIf).
도 9는 획득 및 통합 과정에서 단기 및 장기 공간 기억에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 10은 단기 기억 연구의 완료 후 스코폴라민으로 처리된 래트에서 대뇌 조직의 미토콘드리아 기능장애에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 11은 장기 기억 연구의 완료 후 스코폴라민으로 처리된 래트에서 대뇌 조직의 미토콘드리아 기능장애에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 12는 알루미늄에 의해 유도된 상이한 종류의 기억의 상실에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 13은 베타 아밀로이드 25-35 펩타이드 올리고머에 의해 야기된 세포 생육성 손상에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 14는 베타 아밀로이드 25-35 펩타이드 올리고머에 의해 유도된 기억 상실을 JM-20이 회복시키는 것을 도시한다.
도 15는 래트의 총경동맥의 일시적 폐색에 의해 유도된 인지 악화에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 16은 치료 7일 후 수컷 Wistar 래트에서 6-OHDA에 의해 유도된 손상에 대한 JM-20의 신경보호제 효과를 도시한다.
도 17A는 래트의 발바닥 표면에 5% 포르말린을 주사한 후 핥기/물기 행동에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 17B는 래트의 발바닥 표면에 5% 포르말린을 주사한 후 핥기/물기 행동에 대한 JM-20의 시간 경과에 따른 효과를 도시한다.
도 18은 5% 포르말린 테스트의 제II기에 대한 JM-20의 항-초고통각 효과에 대해 플루마제닐로의 예비치료의 영향을 도시한다.
도 19는 수술 14일 후 CCI 래트의 동측성 발에서 기계적 무해자극통증에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 20은 전자 von Frey에 의해 자극되었을 때 발 움츠림 반응을 측정함으로써 결정된 CCI 래트의 동측성 발의 기계적 초고통각의 강도에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 21은 고전적인 Randal Selito 또는 SH Ferreira 테스트의 변형에 따른 발에 대한 일정 압력에 대한 기계적 초고통각에 대한 JM-20(20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다.
도 22는 수술 14일 후 CCI(Wallerian 변성)에 의해 유도된 조직학적 변화에 대한 CCI 후 제7일째에 시작하여 7일 동안 반복 용량으로 JM-20으로 치료된 효과를 도시한다.
도 23은 산화질소 농도의 지표로서 질산염 농도에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.
도 24는 래트에서 카라게닌(500μg/공동)에 의해 유도된 복막 염증 반응에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. A. 백혈구 롤링 및 B. 장간막에서 혈관 내피에 대한 이들의 유착.
도 24는 카라게닌(500μg/공동)에 의해 유도된 복막 염증 반응에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. C. 복강을 향한 백혈구의 이동 및 D. 혈관 투과성.
도 24E는 카라게난 주사 4시간 후 복막액 중 종양괴사인자(TNFα)의 농도에 대한 JM-20의 효과를 도시한다.

약물 조성물은 임의의 액체, 고체 또는 반고체 조성물로 제공하며, 이들은 경구, 볼인두, 설하, 비경구, 예를 들어 근육내, 정맥내, 피내 또는 피하, 국소, 경피, 기관, 기관지, 코, 폐, 직장 또는 다른 적합한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

약물 조성물은 각 제제에 적합한 부형제를 포함한다. 제제는 당업계에 수집된 방법을 사용하여 종래대로 제조된다. 부형제는 투여 방식에 따라서 선택된 약물 형태에 맞게 선택된다.

인간에게 투여하기 위한 일반식 III의 화합물(JM-20), 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 프로드러그는 제약학적으로 허용되는 제형일 수 있으며, 특히 정제(설하정, 코팅정 및 츄어블정을 포함), 경질 및 연질 캡슐(마이크로캡슐, 나노입자 및 펠릿을 포함), 용액(경구 액적, 시럽), 비경구 용액, 경피 패치, 이식물 및 다른 지연 시스템, 연고(크림 및 젤), 코 스프레이, 점막부착제, 좌약, 현탁액, 복원되거나 음식에 첨가되는 분말의 형태일 수 있지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

최신 기술의 공지된 과정을 사용하여, JM-20, 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 프로드러그는 이들을 천연 또는 합성 기원의 유기 및 무기 성질로 이루어진 보조 액체, 고체 또는 반고체 물질과 같은 부형제와 혼합하여 투여에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 충전된 고체, 희석제, 점착제, 용매, 에멀젼, 윤활제, 붕해제, 활제, 향미제, 착색제, 안료, 중합체, 감미제, 가소제, 흡수제, 침투제, 계면활성제, 공-계면활성제, 특수 오일 및/또는 활성 화합물 또는 그것의 생리학적으로 허용되는 염에 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 안정성을 제공하는 버퍼 시스템 등이 이에 포함된다. 일반식 III의 화합물 또는 그것의 산물을 함유하는 제형의 제제에 사용될 수 있는 부형제는 녹말, 락토오스, 셀룰로오스 및 그것의 산물, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨 및 다른 당류, 탈크, 콜로이드 이산화규소, 카보네이트, 산화마그네슘, 인산칼슘, 이산화티타늄, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 젤라틴, 락토프로테인, 시트레이트, 타르트레이트, 알기네이트, 덱스트란, 에틸 셀룰로오스, 시클로덱스트린, 실리콘 엘라스토머, 폴리소르베이트, 아밀로펙틴, 파라벤, 동물성 및 식물성 오일, 프로필렌글리콜, 멸균수, 일가 또는 다가 알코올, 예컨대 글리세롤, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 글리세린 및 폴리에틸렌글리콜 왁스를 포함하며, 이는 다른 보조 물질의 사용에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 일반식 III 또는 그것의 염, 거울상이성질체 형태 및 산화-환원 산물을 함유하는 정제, 미세과립, 나노입자, 펠릿, 복원되는 분말 또는 캡슐과 같은 고체 경구 제형은 즉각 또는 변형된 방출을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따라서 선택된 제형은 일반식 III 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 프로드러그와 같은 활성 제약 성분을 함유하는 정제이다. 미세결정질 셀룰로오스, 옥수수 녹말, 크로스포비돈과 혼합물을 제조하고, 용해된 폴리비닐피롤리돈 및 소듐 라우릴 설페이트를 첨가해서 과립을 형성하는 전 과정 중 유동층에서 건조시키고, 마그네슘 스테아레이트 및 활석과 혼합한 후, 회전 펀치 시스템을 사용하여 정제가 제조되며, 마지막으로 정제가 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 이산화티타늄 및 착색 현탁액으로 코팅된다.

정제를 코팅함으로써 정갈하게 마무리된 모습이 달성되며 불쾌한 맛을 피하게 된다. 이는 메틸아크릴산의 공중합체, 에틸셀룰로오스, 메틸 하이드록시 프로필 셀룰로오스 또는 다른 중합체와 같은 향미차폐제에 의해 달성된다. 정제는 습식 과립화 방법 및 직접 압축 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 직접 압축 방법은 직접 압축을 위한 부형제를 사용하고 정제를 얻기 위한 단계를 감소시키지만, 저 용량의 경우에만 적용된다.

정제는 일반식 III 또는 그것의 산물을 미세과립, 나노입자 또는 매트릭스 시스템에 함유시켜 그것의 방출을 변형시킬 수 있으며, 이 경우 폴리에틸렌 옥사이드, 하이드록시 프로필 셀룰로오스 2910, 마그네슘 스테아레이트, 염화나트륨, 적색 산화제1철, 셀룰로오스 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 Opadry와 같은 부형제를 사용한다.

본 발명의 약물 조성물은 그것의 방출 프로파일을 제어하여 변형된 방출(즉시, 지연 또는 제어) 제형을 얻기 위해 투과성, 생분해성 및 수불용성인 제약학적으로 허용되는 중합체를 함유할 수 있다. 이들 중합체는 펠릿, 정제, 과립 또는 본 발명에서 언급된 임의의 다른 제형에 포함되는 다른 부형제와의 혼합물에 방출 매트릭스로서, 나노입자를 얻는데 있어서 정제, 미세과립, 캡슐을 코팅하는데 사용될 수 있다.

경구 투여용으로 적합한 다른 제약 조성물은 경질 캡슐, 연질 캡슐 및 제약학적 분말이다. 일반식 III의 화합물 또는 그것의 염, 거울상이성질체 형태 및 그것의 생리학적으로 허용되는 산화-환원 산물은, 예를 들어 정제에 대해 설명된 것들과 같은 고체 형태에 통상 사용되는 부형제와 활성 제약 성분의 혼합물을 내부에 함유하는, 경질 젤라틴 또는 셀룰로오스 캡슐의 형태로 투약될 수 있다. 상기 혼합물은 건식 경로, 습식 과립화, 압출, 펠릿화, 미세캡슐화 또는 마이크로-탭 용량화에 의해 얻어질 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 내의 용량화의 경우, 종래의 제조 방법을 사용하며, 이들은 일반식 III의 화합물 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 프로드러그를 식물성 오일, 그리스 또는 이들의 형성에 적합한 다른 유사한 비히클과 혼합하여 제조될 수 있다.

제약학적 분말은 일반식 III(JM-20)의 화합물 또는 그것의 염, 거울상이성질체 형태 및 그것의 생리학적으로 허용되는 프로드러그의 산물과 필러, 현탁제, 감미제, 향미제 및 보존제의 간단한 혼합물에 의해 제조될 수 있다. 본 발명은 또한 분말의 가공시 100℃ 내지 150℃의 반입 온도 및 50℃ 내지 90℃의 반출 온도에서 분무-건조 방법을 사용했다. 용액 상태에서 유기체에 적절히 포함되도록, 또는 쥬스와 같은 식품에 첨가할 수 있도록, 활성 제약 성분들의 용해성을 개선하기 위해 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 4000 및 소듐 라우릴 설페이트와 같은 부형제를 사용한다.

직장 투여용의 일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그는 좌약, 폼 또는 직장 미세관장 용액으로서 투약될 수 있으며, 이들은 활성 화합물과 중성 고체 지방(Witespol 45) 또는 그 제제에 적합한 일부 다른 유사한 비히클, 즉 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 20, 유화제 왁스, 무수 콜로이드 실리콘, 소듐 메타 바이설파이트, 디소듐 에다테이트, 메틸 파라하이드록시벤조에이트, 소듐 포스페이트, Macrogol 300, 글리세린, 물, 프로판, 이소부텐 및 n-부탄의 혼합물을 함유할 수 있다;

액체 경구 투여용의 일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그는 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜, 특히 카복시 메틸 셀룰로오스 또는 다른 증점제의 혼합물과 같은 제약학적으로 허용되는 비히클을 가진 시럽, 엘릭시르, 농축 액적 또는 현탁액으로 제제화될 수 있다. 또한, 착색제, 향미제, 감미제(수크랄로오스, 아스파르탐, 시클라메이트, 스테비아) 및 보존제(파라벤, 벤조에이트)드이 함유될 수 있다. 이들 액체 용량은 사용 전에 분말화된 제약 조성물을 적합한 희석제로 복원하는 것에 기초하여 제조될 수 있다.

비경구 투여용의 일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그는 주사가능한 용액으로 제제화될 수 있다. 이들 용액은 안정제화 성분, 보존 성분 및/또는 버퍼 성분을 함유할 수 있다.

본 발명에서, 활성 제약 성분은 69% 에탄올 용액, 벤조 알코올, 프로필렌 글리콜, 벤조산, 소듐 벤조에이트, 수산화나트륨, 주사용수 중에 들어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 400, 소듐 시트레이트 및 시트르산과 같은 다른 부형제도 또한 사용될 수 있다.

일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그를 함유하는 비경구 투여용의 용액은 또한 만니톨, 폴리소르베이트 80, 염화나트륨 등과 같은 보조 물질을 포함하며, 사용 전에 적합한 희석제로 건조 제약 조성물(동결건조됨)을 복원함으로써 제조될 수 있다.

진피 투여용의 일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그는 실리콘 엘라스토머 및 무수 콜로이드 실리콘과 같은 보조 물질을 사용하여 이식물로서 투약될 수 있고, 펠릿을 제조할 경우에는 다른 제약학적 용도의 중합체가 사용될 수 있다.

경피 투여용의 일반식 III의 화합물(JM-20) 또는 그것의 염, 수화물, 결정질 형태, 거울상이성질체, 이성질체, 대사물질, 생리학적으로 허용되는 프로드러그는 패치로 제제화될 수 있다. 이 경우, 활성 제약 성분은 아크릴 공중합체, 에탄올, 경질 액체 파라핀, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 용액의 지지체와 탈착가능한 시트 안쪽의 실리콘 층에 함유된다(12.75㎠의 표면적에서 방출 속도 15mg/일).

실시예

III 타입의 최종 생성물을 얻기 위해 필요한 합성 중간체인 4-(2'-니트로페닐)-5-카보닐에톡시-2-메틸-3,4-디하이드로-2(1H)피리딘(I) 및 o-클로로포밀-1,4-디하이드로피리딘 유도체(II)를 합성한다.

화합물 II는 건조 디메틸폼아미드에서 옥시염화인을 사용하여 I를 변형시켜 얻어지며, 이 혼합물은 3 내지 9배의 비율로 디클로로메탄 또는 클로로폼에 용해된 I에 첨가되고, 15-20시간 동안 20-60℃의 온도에서 교반된다(도 1).

다음에, 얻어진 생성물에 기본적인 가수분해가 행해진 후, 클로로폼 또는 디클로로메탄으로 추출, 세척에 의한 정제 및 건조가 수행된다.

화합물 I은 단일 단계에서의 다-성분 반응에 의해 얻어지며, 용매로서 아세트산에서 2-니트로벤젠 알데하이드, 멜드럼 산, 에틸 아세토아세테이트 및 암모늄 아세테이트의 등몰 양을 혼합하고 7-10시간 동안 환류 반응을 행한다. 이후, 혼합물을 물에 붓고 얻어진 침전물은 에탄올 재결정화에 의해 정제한다.

화합물 III의 합성

얻어진 화합물 IIa 또는 IIb에 무수 에탄올 중에서 오쏘페닐렌디아민과의 반응을 행하여 화합물 III(JM-20)을 얻었으며, 이 화합물은 사용된 시약의 조건에 따라 상이한 염을 형성하도록 제조될 수 있다.

IIa로부터 화합물 III의 획득

화합물 III(JM-20)을 얻기 위해, 화합물 IIa의 에탄올 용액에, 용매로서 무수 에탄올 중 오쏘페닐렌디아민의 등몰 양을 첨가하고 교반했다. 등몰 양 이상의(1-2 당량) 트리에틸아민을 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 유지하거나(도 2, 방법 A) 또는 충분한 양의(1-1.5 당량) 수산화나트륨 용액을 제어 적하 첨가하고 반응 혼합물을 계속 교반하였다(도 2, 방법 B).

IIb로부터 화합물 III의 획득

화합물 III(JM-20)을 얻기 위해, 화합물 IIb의 에탄올 용액에, 용매로서 무수 에탄올 중에서 오쏘페닐렌디아민의 등몰 양을 첨가하고 교반했다. 등몰 양 이상의(1-2 당량) 트리에틸아민을 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 유지하거나(도 3, 방법 A) 또는 충분한 양의(1-1.5 당량) 수산화나트륨 용액을 제어 적하 첨가하고 반응 혼합물을 계속 교반한다(도 3, 방법 B).

화합물 JM-20의 이성질체 구조가 도 4에 도시된다.

할로하이드레이트 -타입 염으로서 화합물 III의 획득

촉매의 사용하에 또는 부재하에 IIa 또는 IIb로부터 III의 상응하는 염산염 또는 브롬화수소산염(JM-20의 할로하이드레이트)이 얻어진다. 상응하는 수소산이 적합한 촉매량(5-25% mol)으로 첨가되었을 때 촉매 과정이 일어나므로, 반응 시간이 감소되며 반응 수율도 약간 증가된다(도 5).

JM-20(IIIa) 염산염은 IIa로부터 적절히 얻어지며, HCl의 적합한 양이 첨가되었을 때 촉매 반응이 일어난다. JM-20 화합물은 IIb로부터 브롬화수소산염(IIIb)으로서 또한 얻어질 수 있으며, 브롬화물의 경우 염화물보다 분자내 친핵성 치환 반응이 용이해지므로, 빠르고 효과적인 반응이 일어나 브롬화수소산염으로서 JM-20이 얻어진다.

푸마레이트 염으로서 화합물 III의 획득

IIIa 또는 IIIb 용액에 모노소듐 푸마레이트를 첨가하고 2-5시간 자기 교반하면 III의 염산염 또는 브롬화수소산염으로부터 JM-20(IIIc) 푸마레이트 염이 얻어지며(도 6), 이어서 에탄올을 적합한 양으로 첨가하여 침전시킨다.

IIIc 푸마레이트에 상응하는 침전물을 적합하게 여과 및 세척, 정제한 후, 감압하에 온도-제어 건조기에 넣는다.

포스페이트 염 형태로 화합물 III의 획득

반응을 시작할 때 등몰 양의 인산을 첨가하거나 또는 에탄올 용액 중의 IIIa 또는 IIIb에 인산을 첨가하고 교반함으로써 IIa 또는 IIb로부터 최종 생성물을 얻는 것과 유사한 과정에 의해 JM-20(IIId) 포스페이트 염이 얻어질 수 있다(도 7).

설페이트 염 형태로 화합물 III의 획득

도 8에 도시된 대로, IIa 또는 IIb 또는 IIIa 또는 IIIb 할로하이드레이트에 기초하여 JM-20(IIIf)가 얻어질 수 있다.

정제 형태 제제의 획득

각 120.00mg 정제는 아래의 성분을 함유한다:

제조 과정의 간단한 설명:

1. 20메시를 통해 주 활성 성분, 옥수수 녹말 및 락토오스를 체질한다.

2. 배합식에 확립된 양에 따라서 제제의 모든 성분을 칭량한다.

3. 물과 C 등급 에틸알코올의 혼합물을 스팀 재킷이 있는 금속 용기에 붓고 폴리비닐피롤리돈을 첨가하고 흔들어서 완전히 용해시켜서 응집소 용액을 얻는다.

4. 주 활성 성분, 옥수수 녹말 및 락토오스(내부 상의 성분)를 혼합기를 넣고 15분 동안 혼합한다.

5. 연동 펌프를 사용하여 응집소 용액을 서서히 첨가하고, 필요에 따라 물과 C 등급 에틸알코올(1:1)을 사용하여 필요한 습윤 정도를 완성한다. 저속 밀에서 분쇄한다.

6. 유동층에서 과립을 건조시킨다. 10분 후 과립의 샘플을 취하고 탈과립화하고 잔류 습도를 측정한다. 상기 습도는 0.8 내지 1.2%가 유지되어야 한다.

7. 건조된 과립과 윤활제를 10분간 혼합한다.

8. 고속 회전 기계에서 평평하고 기울어지고 홈이 있는 6.4mm 직경 다이를 사용해서 혼합물을 압축하여 아래의 파라미터를 가진 정제를 얻는다.

질량: 120.0mg ± 10%

높이: 2.6 ± 0.10mm

경도: 4.0 ± 1 KgF

취약성: 1% 미만

경구용 액적 형태 제제의 획득

모든 액적(20 mL)은 아래의 성분을 함유한다:

제조 과정의 간단한 설명:

1. 정제수의 pH와 전도도를 측정한다.

2. 프로필렌글리콜을 반응기에 붓는다.

3. 적절한 용량의 보조 스테인리스 스틸 용기에서 정제수에 소듐 사카린을 용해시킨다.

4. Kollidon 25를 첨가하여 점차적으로 분산되면 적어도 30분간 교반하여 완전히 분산시킨다.

5. 생성물을 교반하고 열을 가하여 30분간 40-50℃의 온도를 유지한다.

6. 얻어진 생성물에 주 활성 성분을 조금씩 첨가하고 30분간 일정한 교반을 유지한다.

7. 열을 제거하고 실온(30±2℃)이 될 때까지 기다린다.

8. 적절한 용량의 보조 유리 또는 스테인리스 스틸 용기에서 메틸 파라벤과 프로필렌 글리콜을 C 등급 에틸알코올에 용해하고 계속 교반해서 완전히 용해시킨다.

9. 얻어진 생성물에 가용성 액체 딸기향미제를 첨가하고 완전히 균질해질 때까지 교반한다.

10. 얻어진 생성물을 반응기 탱크에 서서히 첨가한 후, 일정하고 강하게 교반한다.

11. 적절한 용량의 유리 또는 스테인리스 스틸 용기에서 시트르산과 무수 소듐 시트레이트를 용해하고, 매 첨가 후 교반해서 완전히 용해시킨다.

12. 얻어진 생성물을 반응기 탱크에 서서히 첨가한 후, 일정하고 강하게 교반한다.

13. 적절한 용량의 유리 또는 스테인리스 스틸 용기에서 정제수에 Ponceau S. 산 레드를 용해시킨후, 교반해서 완전히 용해시키고 상기 생성물과 혼합시킨다.

14. 물로 정해진 부피를 만들고 균질해질 때까지 교반한다.

15. pH가 4.0 - 6.0로 유지되는지 확인한다.

16. 최종 여과를 수행한다.

17. 최종 생성물을 호박색 유리병(x 15mL, 15.0±1.0mL 용액)에 넣고, 오일상 생성물에 대한 드립 리듀서를 가진 마개를 사용하여 적절히 밀봉한다.

주사가능한 제제의 획득:

JM-20의 모든 벌브(2mL)는 아래의 성분을 함유한다:

1. 멸균 후 반응기가 완전히 건조되었는지 점검한다. 그렇지 않다면 반응기를 무수 알코올로 헹군다.

2. 1N 염산 용액을 제조하여 pH를 조정한다.

3. Cremofor ELP의 일부분과 무수 알코올을 반응기에 첨가하고 420rpm에서 혼합한다.

4. 칭량한 주 활성 성분을 함유하는 비이커에 무수 알코올의 일부분을 첨가한다. 반응기에 첨가하고 유리 교반기로 분산시킨다. 이 작업을 모든 주 활성 성분이 없어지고 모든 무수 알코올이 사용될 때까지 반복한다.

5. 주 활성 성분이 완전히 용해될 때까지 420rpm에서 60분간 반응기 내의 교반을 유지한다.

6. Cremofor ELP의 나머지 부분을 첨가하고 무수 알코올로 씻어담고 420rpm에서 10분간 교반한다.

7. 1N 염산으로 용액의 pH를 5.0 - 6.0으로 조정한다.

8. 무수 알코올을 첨가하여 용액의 부피를 완성하고 420rpm에서 5분간 교반한다.

9. 과정 제어를 위해 용액 10mL를 취해서 실험실로 보낸다(평가 및 pH).

10. 충전 및 질화 시스템의 정확한 셋팅을 점검한다.

11. 무수 알코올로 기공도가 (0.45+0.2㎛)인 Sartobran P MidiCaps 필터의 완전성 테스트를 수행한다.

12. 일단 과정 제어가 완료되면, 질소를 사용하여 반응기를 가압해서 기공도가 0.45㎛ + 0.2㎛인 Sartobran P 필터 카트릿지를 통해 용액을 강제로 내보낸다. 벌브를 충전하고 밀봉해서 용액 2.2mL의 용량을 제조한다.

치매 모델에서의 기억 연구

시약

모든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. Faculty of Chemistry of the University of Havana에 소재한 유기 합성 실험실에 의해 제안된 연구를 위해 JM-20을 충분한 양으로 투여했다.

상이한 연구를 위해 JM-20을 카복시메틸 셀룰로오스(CMC) 0.05%에 현탁하고 경구 투여했다. 스코폴라민 브로마이드를 0.9% 식염수 용액에 용해하고 복강내 투여했다(1mg/kg, 4mL/Kg 체중). 염화알루미늄을 실험 대상을 위한 일반적인 식수에 용해하고 500mg/Kg 용량으로 1개월 동안 장기 형태로 경구 투여하면서 행동 연구를 수행했다. 베타 아밀로이드 펩타이드(25-35)를 올리고머화하고 제조자의 지시에 따라 가용성으로 만들고 5uL 중에 100pmol의 용량으로 두개내 경로를 통해 오른쪽 대뇌 반구에 투여했다.

실험 동물 ; 윤리적 고려사항

스코폴라민과 알루미늄 모델에 해당하는 생체내 실험은 Wistar 래트(수컷 230-260g)를 사용했고, 베타 아밀로이드 모델에 해당하는 생체내 실험은 OF-1 마우스(수컷 25-30g)를 사용했다. National Laboratory Animal Production Center(CENPALAB, Mayabeque, Cuba)에서 얻은 모든 동물은 도착한 후 7일 동안 실험실 조건에 적응시켰다. 12시간 사이클로 명암이 교대하는 제어된 온도(22±2℃), 45-55% 상대습도 조건에 유지했고 요구에 따라 물과 사료를 자유롭게 제공했다. 모든 행동 연구는 빛과 소음 수준이 제어되는 조건에서 09:00에서 17:00 사이에 수행되었다. 이 연구에서 보고된 동물을 사용한 모든 과정은 실험실 동물 관리에 대한 국제 협회에 의해 승인된 기준 및 동물 실험에 대해 확립된 국내 규정에 따라서 행해졌다.

실험 설계

프로토콜 1: 스코폴라민에 의해 유도된 기억 상실에 대한 JM -20 효과의 평가

스코폴라민의 급성 복강내 투여에 의해 영향을 받는, 단기 기억과 장기 기억의 획득 및 통합 과정에 대한 3개 용량의 JM-20(2, 4 및 8 mg/kg)의 보호제 효과를 조사했다. 이 목적을 위해, 4건의 독립적인 테스트에서 단기 및 장기 기억의 획득 및 통합 과정 전에 JM-20을 투여했다.

각 테스트에서 무작위로 선택된 대상의 6개 실험 그룹을 다음과 같이 형성했다(그룹당 n=10): 건강한 대조군(CMC 및 식염수); JM-20 미손상 그룹(JM-20 8mg/kg); 스코폴라민 그룹(CMC 및 스코폴라민 1mg/kg); JM-20 스코폴라민 그룹((JM-20 2mg/kg 및 스코폴라민 1mg/kg), (JM-20 4mg/kg 및 스코폴라민 1mg/kg) 및 (JM-20 8mg/kg 및 스코폴라민 1mg/kg)).

단기 기억과 장기 기억을 획득하고 통합하는 과정의 독립적인 연구에 적합한 실험 설계를 사용하여, 새로운 물체를 인식하는 테스트 및 강제된 교대 Y-미로 테스트에 의해 기억에 대한 효과를 평가했다.

행동 연구의 마지막에, 대뇌 조직에 기반한 상이한 생체내 연구를 수행했다. 상이한 산화성 스트레스 마커, 미토콘드리아 기능, 아세틸콜린에스테라아제 AchE 효소의 활성 수준, 및 기억 및 학습 과정에 밀접히 연루되는 대뇌 영역에서 뉴런 및 신경돌기 생육성의 조직학적 변수에 대한 JM-20의 효과를 연구했다.

프로토콜 2: 염화알루미늄에 의해 유도된 기억 상실에 대한 JM-20 효과의 평가

스코폴라민의 급성 복강내 투여에 의해 영향을 받는 상이한 타입의 기억에 대해 2개 용량의 JM-20(2 및 8mg/kg)의 보호제 효과를 조사했다. 이 목적을 위해, 염화알루미늄(500mg/kg)을 투여하기 시작한 후 15일 뒤부터 행동 연구가 끝날 때까지 JM-20을 투여했다. 다음과 같은 3가지 타입의 기억에 대한 JM-20 및 염화알루미늄의 효과를 평가했다: Morris Water 미로 테스트 및 T-미로 테스트에 의한 공간 기억; 새로운 물체 인식 테스트에 의한 신규성 인식; 및 수동적 회피 테스트에 의한 감정-관련 기억.

무작위로 선택된 대상의 5개 실험 그룹을 다음과 같이 형성했다(그룹당 n=10): 건강한 대조군(CMC 및 물); JM-20 미손상 그룹(JM-20 8mg/kg 및 물); 알루미늄 그룹(CMC 및 염화알루미늄 500mg/kg); JM-20 알루미늄 그룹((JM-20 2mg/kg 및 알루미늄 500mg/kg), 및 (JM-20 8mg/kg 및 알루미늄 500mg/kg)).

행동 연구의 결론에서, 대뇌 조직에 대해 상이한 생체내 연구를 수행했다. 상이한 산화성 스트레스 마커, 미토콘드리아 기능 및 아세틸콜린에스테라아제 AchE 효소의 활성 수준을 연구했다.

프로토콜 3: 베타 아밀로이드 25-35 펩타이드 올리고머에 의해 유도된 손상에 대한 JM -20 효과의 평가

베타 아밀로이드 25-25 펩타이드 올리고머의 1uM 농도에 노출된 PC12 셀라인의 세포 생육성에 대한 JM-20의 효과를 평가했다. 이 시험관내 테스트에서는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 가용성으로 된 3개 농도의 JM-20(3.125, 6.25 및 12.5uM)의 효과가 평가되었다. 다음과 같은 6개 실험 그룹을 형성했다: 미치료 대조군(NT); 비히클 그룹(DMSO); 베타 아밀로이드 그룹(Aβ 1μM); JM-20 베타 아밀로이드 그룹((JM-20 3.125uM + Aβ 1μM), (JM-20 6.25uM + Aβ 1μM) 및 (JM-20 12.5uM + Aβ 1μM)).

계속해서, OF-1 마우스에 대한 생체내 연구를 수행했다. 10 및 30mg/kg 체중 용량으로 경구 경로로, 10일 동안 Aβ(100pmol)의 두개내 투여 후 7일 뒤에 베타 아밀로이드 올리고머의 투여에 의해 유도된 기억에 대한 JM-20의 효과를 평가했다. 다음과 같이 5개 실험 그룹을 형성했다: 건강한 대조군(Sham); 미손상 JM-20 그룹(Sham + JM-20 30mg/kg); 베타 아밀로이드 그룹(Aβ 100pmol + CMC); JM-20 베타 아밀로이드 그룹((JM-20 10mg/kg + Aβ 100pmol) 및 (JM-20 30mg/kg + Aβ 100pmol)).

행동 연구

Y-미로. 자발적 변경

Y-미로 강제 교대 테스트에 의해 공간 기억에 대한 JM-20의 효과를 평가했다(20). 플라스틱으로 중앙 플랫폼에서 120도 각도로 3개의 줄기(55 x 20 x 20cm)을 가진 미로를 제조했다. 테스트는 두 세션으로 수행했다. 첫 번째 학습 단계에서 훈련 단계를 시작했으며, 이때는 각 래트를 중앙 플랫폼에 두고 세 번째 줄기(B)는 닫은 상태에서 미로의 다른 줄기(A 및 C)를 10분간 자유롭게 탐색하도록 했다. 줄기 중 어느 하나의 안쪽에 사지를 들여놓는 것을 각 줄기로의 진입으로 간주했다. 10분간 줄기로의 진입 순서를 추후 분석을 위해 비디오로 기록했다. 평가 단계에서는 래트가 앞서 닫혀 있었던 줄기를 포함해서 Y-미로 줄기를 5분간 자유롭게 탐색하도록 했다. 줄기로의 진입 순서는 추후 분석을 위해 5분간 비디오 테이프에 기록했다. 이 테스트는 새로운 줄기(B)로의 진입 횟수를 평가했고, 이 줄기로의 진입 퍼센트는 연구중인 동물의 더 좋은 기억과 정비례했다. 줄기(B)로의 정확한 진입 퍼센트를, 아래 식에 나타낸 대로, 가능한 총 교대로부터 수행된 교대 비율에 기초하여 계산했다: 정확한 진입 % = (B로의 진입 횟수)/(3개 줄기로의 진입 총 횟수) x 100. 각 테스트 후, 미로를 40% 에탄올 용액으로 청소하여 후각적 단서의 존재를 감소시켰다.

물체 인식

인식된 새로운 물체의 기억에 대한 JM-20의 효과를 물체 인식 테스트에 의해 평가했다. 이 테스트는 연속 2일 동안 개방된 현장에서 수행되었다. 첫 날에 동물은 현장에 적응되었고, 2개 구역에서 상자를 3분간 탐색하도록 내버려 두었다. 두번째 날에는 각각 5분씩 두 단계에 의해 학습 평가와 함께 훈련을 수행했으며, 이하 이를 각각 훈련(E) 및 테스트 단계(P)라고 언급한다. E 단계 동안 래트에게 2개의 동일한 물체를 제시했고 이것은 익숙한 물체(F)로 칭했다. 30분 후 P 단계를 시작했고 래트는 익숙한 물체(F)와 새로운 물체(N)에 노출되었다. 물체의 탐색을 분석하기 위해 테스트를 기록했고, 그 결과는 각 물체에 대해 각 동물에 의해 취해진 탐색 시간에 의존한다. 물체 F와 N의 구별 비율을 ID = (N-F)/(N+F)에 따라 계산했다.

Morris Water 미로

약간 변형하여 Vorhees y Williams(21)에 의해 설명된 대로 Morris Water 미로 테스트를 원형 탱크(직경 1.52m, 깊이 0.60m)에서 행했다. 매일 4개 구역씩 5일의 훈련을 수행했고 6일째에 학습 평가를 행했다. 동물은 모든 훈련 구역에서 변하지 않는 위치에 고정된, 침수된 플랫폼의 위치를 학습할 수 있었다. 전체 실험 동안 몇 가지 외부 단서가 고정된 위치에 위치되고 유지되었다. 각 훈련 세션에서 동물은 4개의 탈출 장소 중 하나에서 탱크의 벽과 마주하여 물에 넣어졌고, 1분의 최대 시간 내에 플랫폼을 발견했다. 평가일에는 플랫폼을 제거했다. 훈련 시험에서, 탈출(동물이 플랫폼을 발견하는데 걸린 시간) 지연, 학습 평가를 위한 테스트 동안 플랫폼의 사분면에 동물이 남은 시간 및 플랫폼 장소가 발견될 때까지 점유된 거리를 평가했다.

수동적 회피

Kohara와 동료들(22)에 의해 설명된 방법에서 약간 변형하여 수동적 회피 테스트를 수행했다. 2개 챔버로 구성된 수동적 회피 장비(UGO Basile)를 사용했으며, 하나의 챔버에는 조명을 비추었고(30 x 30 x 30cm) 나머지 하나는 어둡게하였으며(10　x　20　x 12cm), 이 두 챔버는 길로틴 형태의 접근 문에 의해 연결된다. 어두운 챔버에는 전기 회로가 장착되었다. 이 테스트는 연속 2일 동안 두 단계로 수행되었다. 첫 날에는 각 래트를 밝은 챔버에 10초간 넣은 후 챔버들 사이의 문을 열고 래트가 최대 90초 동안 자유롭게 탐색하도록 했다. 일단 래트가 어두운 챔버로 들어가면 접근 문을 닫았고, 래트는 5초간 1mA의 전기 전하를 받았다. 둘째 날에는 어두운 챔버로의 진입 지연을 300초의 최대 시간 내에 평가했다.

미토콘드리아 기능성 연구

대뇌 미토콘트리아 분리

원심분리에 의해 미토콘드리아를 분리했다. 목을 베서 동물을 죽이고 뇌를 즉시 제거하고 수크로오스 75mmol/L, EGTA 1mmol//L, 만니톨 225mmol/L, BSA 0.1% 및 HEPES-KOH 10mmol/L, pH 7.2를 함유하는 50mL 분리 버퍼에서 4℃에서 절단하고 Potter-Elvehjen에서 균질화했다. 이렇게 얻어진 현탁액을 3분간 2000g에서 원심분리하고, 부유 물질을 8분간 12000g에서 원심분리했다. 침전물을 20uL 디기토닌 10%를 함유하는 분리 버퍼 10mL에 재현탁한 후, 10분간 12000g에서 원심분리했다. 미토콘드리아 침전물을 EGTA가 없는 분리 버퍼에 현탁한 후, 10분간 12000g에서 원심분리하고, 부유 물질을 버리고, EGTA가 없는 분리 버퍼로 부드럽게 세척했다. microLowry 방법에 의해 표준 패턴으로 소 혈청 알부민을 사용하여 단백질의 농도를 측정했다(Mirandola et al., 2010).

미토콘드리아를 KCl 130mmol/L, MgCl₂ 1mmol/L 및 HEPES-KOH, 포스페이트 2mmol/L, pH 7.4의 배지에서 인큐베이션했다. 5mmol/L 로테논 및 2.5μmol/L 포타슘 석시네이트로 미토콘드리아(1mg 단백질/mL)에 에너지를 제공했다.

미토콘드리아 막 전위

POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 사프라닌(10μM)의 형광 마커를 사용하여 495/586nm(여기/방출)에서 미토콘드리아 막 전위를 측정했다.

미토콘드리아 팽창

POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계를 사용하여 Ca^{2 +} 200μmol/L 존재하에 표준 배지 중에서 인큐베이션된 미토콘드리아 현탁액의 540nm에서 겉보기 흡광도의 감소에 의해 미토콘드리아 팽창을 모니터링했다.

반응성 산소 종의 생성

형광 마커로서 Amplex 레드(Molecular Probes, OR, Eugene)와 양고추냉이 퍼옥시다아제 1UI/mL를 사용하여 분광형광계에 의해 563/587nm(여기/방출)에서 반응성 산소 종(ROS)을 확인했다.

효소 및 레독스 상태 테스트를 위한 뇌 조직의 준비

목을 베어서 래트를 죽인 후, 뇌를 제거하고 재빨리 절개해서 해마와 양쪽 대뇌 반구의 전두엽 피질의 2개의 영역으로 분리했다(23). 이들 영역을 소듐 포스페이트(0.1 mM, pH 7.4: NaCl 0.13 M, KCl 0.0027 M, KH₂PO₄ 136.04 M, Na₂HPO₄ 0.0016 M) 버퍼 용액에서 1:10(p:v)의 비율로 균질화한 후, 에펜드로프 원심분리기(Germany, 5424R)에서 20분간 6,000g에서 원심분리했다. 뇌 구조물의 균질화물의 일부를 -80℃에서 보존한 후 사용했다. 기준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하여 POLARstar Omega(Germany)에서 Lowry 방법(24)에 의해 단백질 농도를 측정했다.

아세틸콜린에스테라아제(AChE) 활성

추출된 해마 및 전두엽 피질의 균질물에 존재하는 AChE 효소의 활성을 약간 변형된 Ellman(25)에 의해 설명된 방법을 사용하여 분광광도적으로 측정했다(26). 이 테스트는 200μL의 최종 부피에서 96-웰 시트에서 수행되었다. 140μL의 Ellman 시약, 50μL의 균질물 및 10μL의 20mM 아이오데이트 아세틸티오콜린(AcSCh) 용액을 함유한 반응 배지를 37℃에서 1분간 인큐베이션했다. POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 1분 간격으로 20분간 405nm에서 흡광도를 판독했다. 효소 활성을 계산하고 단백질 mg당 1분 내에 가수분해된 (AcSCh)의 μmol로서 표시했다.

레독스 상태 및 산화성 손상 변수의 연구

수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 활성

SOD 효소 활성을 피로갈롤 산화 방법을 사용하여 확인했다(27). 시약 혼합물은 2.8mL Tris 0.2M - HCl 0.2M(pH 8.2)의 용액, 0.05mL EDTA 60mM, 0.1mL 균질물 및 0.05mL 피로갈롤 용액 7.37mM로 이루어졌다. POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 1분 동안 420nm에서 흡광도를 판독했다. 결과는 단백질 mg당 효소 활성 유닛으로 표시했고, 효소 활성 1 유닛은 1분 내에 기질 1μmol을 전환을 촉매하는 효소의 양으로서 간주된다.

카탈라아제(CAT) 활성

과산화수소(H₂O₂)의 분해에 기초하여 CAT 효소 활성을 확인했다(28). 시약 혼합물은 0.9mL 포스페이트 버퍼(pH 7.0), 0.1mL 뇌 조직 균질물 및 0.5mL H₂O₂(50mM)로 이루어졌다. POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 10초 및 70초에 240nm에서 흡광도를 판독했다. 결과는 단백질 mg당 1분당 분해된 H₂O₂의 μmol로서 표시했다.

환원된 글루타티온(GSH) 수준

일부 변형된 Ellan(29)에 의해 설명된 방법에 따라서 GSH 수준을 추산했다. 트레이에 0.375mL의 포스페이트 버퍼(50mM, pH 8.0), 0.1mL의 균질물 및 0.025mL의 5,5'-디티오-비스-니트로벤조산(DTNB)/아세톤(0.6mM) 용액을 첨가했다. POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 412nm에서 흡광도를 판독했다. 형성된 크로모포의 몰 소멸 계수를 사용하여 결과를 얻었다(1.36Х10⁴ mol/L^-1cm^-1). 결과는 단백질 mg당 GSH의 μmol로서 표시했다.

지질 과산화 수준

티오바르비투르산과의 반응으로부터 형성된 말론디알데하이드(MDA)를 검출함으로써 지질 과산화 수준을 정량했다(30). 시약 배지는 350μL의 트리클로로아세트산:티오바르비투르산:염산의 혼합물, 100μL의 뇌 조직 균질물 및 50μL의 디-ter-부틸하이드록시톨루엔(BHT)으로 형성되었다. 이 혼합물을 TALBOYS(USA) 진동교반장치에서 균질화하고 100℃에서 Grant OLS200(USA) 써모스탓 수조에 5분간 넣어두었다. 이어서 에펜드로프 원심분리기(Germany, 5424R)에서 10분간 3,000rpm에서 원심분리했다. 뇌 조직에서 지질 과산화의 산물로서 형성된 MDA는 티오바르비투르산과 반응하여 착색된 화합물을 형성하며, 이를 POLARstar Omega(Germany) 형광 분광광도계에서 535nm에서 분광광도법에 의해 확인했다. 형성된 착색된 화합물의 몰 소멸 계수(1.56 x 10⁵ M^{- 1} cm^{- 1})를 이용하여 아래 식에 따라 MDA 농도를 계산했다:

여기서 C는 결정될 MDA 농도이고, D.O는 검출된 흡광도이다. 결과는 단백질 mg당 MDA 나노몰로서 표시했다.

조직학적 연구

스코폴라민의 급성 복강내 투여에 의해 야기된 병소의 조직학적 평가를 해마 및 전두엽 피질의 영역에서 수행했다. Paxinos and Watson Atlas(31)를 래트 뇌의 해부학적 상태와 함께 사용하여 각 뇌 영역을 확정했고, 뇌의 각 영역에서 항상 처음 세 번 절단되는 4μm 두께 크라운 구역에 헤마톡실린과 에오신(HE)의 팅크로 처리했다. 양쪽 반구를 Leica(Microsystems, Germany) 광학 현미경으로 관찰했다. CA1, CA2, CA3 구역에서 신경 손상을 확인했으며, 해마 치상회 및 위축, 핵 농축증, 어두운 세포질 색 또는 뉴런의 부재가 변성 마커로서 고려되었다. 이에 더하여, 부분적으로 또는 완전히 탈수초화된 신경돌기의 출현 및 신경돌기 위축에 기초하여 구체적으로 신경돌기 손상을 확인했고, 그 결과는 연구된 각 슬라이드 또는 각 영역에 존재하는 총 신경돌기의 퍼센트로서 표시했다. 전두엽 피질의 수준에서 조직학적 손상의 분석을 수행하여 각 대뇌 반구의 세 가지 고정된 영역에서 침범된 뉴런 및 신경돌기의 평균 숫자를 카운팅했고, 그 결과는 각 영역에서의 총계와 비교하여 손상된 뉴런/신경돌기의 퍼센트로서 표시했다.

통계적 분석

얻어진 결과의 통계 처리 및 분석에 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc., USA.) 프로그램을 사용했다. 데이터는 평균±EEM(표준 평균 오차)로 표시되었고 그것의 정규성과 등분산성을 점검했다. 간단한 분류 변량 분석(ANOVA)을 수행한 다음 상이한 실험 그룹 간 다중 비교를 위해 Tukey 테스트를 수행했다. p<0.05의 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과는 도 9 내지 14에 도시된다.

도 9는 특히 획득 및 통합 과정에서 단기 및 장기 공간 기억에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. 데이터는 자발적 변경의 퍼센트의 평균±DE(그룹당 n=7)로서 표시된다. 통계적 분석을 위해 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 수행했다. 상이한 문자는 p<0.05에서 이들 사이를 구별한다.

도 10은 단기 기억 연구 완료 후 스코폴라민으로 처리된 래트에서 대뇌 조직의 미토콘드리아 기능장애에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. 상이한 용량의 JM-20을 스코폴라민을 투여하기 1시간 전에 경구 투여했다. 스코폴라민 투여 1시간 후에 뇌 미토콘드리아를 분리하고 막 전위(A), H₂O₂ 생성(B), 미토콘드리아 팽창(C) 및 미토콘드리아로의 칼슘 유입(D)을 평가했다. 막대는 평균±EEM(n=10)으로 표시했다. 상이한 문자는 그룹간 차이를 나타낸다: ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, p<0.05. ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, 비히클/스코폴라민 1mg/Kg 그룹에 비해 (A): ***, p=0.0009, (B): **, p=0.0034.

도 11은 장기 기억 연구 완료 후 스코폴라민으로 처리된 래트에서 대뇌 조직의 미토콘드리아 기능장애에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. 상이한 용량의 JM-20을 스코폴라민을 투여하기 1시간 전에 경구 투여했다. 스코폴라민 투여 24시간 후에 뇌 미토콘드리아를 분리하고 막 전위(A), H₂O₂ 생성(B) 및 미토콘드리아 팽창(C)을 평가했다. 막대는 평균±EEM(n=10)으로 표시했다. ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, 비히클/스코폴라민 1mg/Kg 그룹에 비해 ***, p<0.001; **, p<0.01 y *, p<0.05.

도 12는 알루미늄에 의해 유도된 상이한 타입의 기억의 상실에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. A) 새로운 물체 인식 테스트, 새로운 물체 인식 기억; B) 수동적 회피 테스트, 감정-관련 기억; C) Y-미로 테스트, 공간작업 기억; D) Morris Water 미로 공간 기준 기억. 막대는 평균±EEM으로 표시했다. 상이한 문자는 그룹간 차이를 나타낸다: ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, p<0.05. ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, 알루미늄 500mg/Kg으로 처리된 그룹에 비해 ***, p<0.001; **, p<0.01 y *, p<0.05.

도 14는 베타 아밀로이드 25-35 펩타이드 올리고머에 의해 유도된 기억 상실이 JM-20에 의해 어떻게 회복되는지를 도시한다. JM-20은 베타 아밀로이드 투여 7일 후에 투여되었다. 막대는 평균±EEM으로 표시했다: ANOVA 및 사후 Tukey에 의해, 베타 아밀로이드로 처리된 그룹에 비해 ***, p<0.001; **, p<0.01 y *, p<0.05.

혈관성 치매

혈관성 치매 모델 동물(Swiss 수컷 알비노 마우스)에 20분 동안 총경동맥의 일시적 폐색을 행하고 인지 악화를 Morris Water 미로 테스트에 의해 평가했다.

결과는 도 15에 도시된다.

도 15는 래트의 총경동맥의 일시적 폐색에 의해 유도된 인지 악화에 대한 JM-20의 효과를 도시한다. 동물은 재관류 후 4mg/Kg의 경구 용량이 투여되었다. 데이터는 평균±DE로서 표시된다(그룹당 n=8). 통계적 분석을 위해 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 수행했다, * p<0.01은 치료받지 않은 허혈 동물에 비해 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

6- 하이드록시도파민 주사에 의한 흑질치밀부의 일방적 병소

재료 및 방법

실험 동물

National Laboratory Animal Production Center(CENPALAB)(Havana, Cuba)에서 보내온 200 내지 250g 중량의 수컷 성체 Wistar 래트를 실험에 사용했다. Center for the Research and Development of Medicines(CIDEM)에서 보내온 동물은 평균 온도 23℃(22±2℃)에서 반투명 플라스틱 상자에 유지되었고 사료와 물은 마음대로 공급되었으며 12시간 주기의 명암이 적용되었다.

윤리적 고려사항

이 연구에서는 동물을 사용한 실험에 대한 윤리강령에 확립된 규정을 준수했다. 인정된 사육 센터에서 동물을 획득함으로써 동물의 유전적 정통성을 보증했다. 이 과정은 유전적으로 오염된 동물의 사용을 방지한다. 생물학적 관점에서 연구를 위한 유전적 자질의 중요성은 실험 결과가 실험이 반복될 수 있는 어떤 다른 장소에서도 재현될 수 있다는 사실에 있으며, 윤리적 관점에서는 최소한의 동물이 사용되어야 한다. 연구 동안 동물은 가능한 최상의 사육 조건에서 유지되었다. 동물의 사육은 23℃의 온도에서 유지되었으며, 이는 열대지역의 쾌적한 범위에 해당한다(22±2℃). 높은 온도는 동물에게 스트레스를 유발하고 38℃가 넘는 온도는 사망을 일으킬 수 있다는 사실을 염두하면 온도 제어가 중요하다. 광주기성은 생물학적 주기, 생화학 및 호르몬 리듬을 직접 및/또는 간접적으로 제어하므로 동물이 노출되는 명암의 기간은 12시간씩 유지되었다.

화합물의 투여

JM-20은 손상을 유도하고 24시간 후에 7일 동안 매일 3개의 상이한 용량 10, 20 및 40mg/Kg으로 투여되었다. 이 화합물은 0.05%로 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 중에 제조되어 캐뉼라로 위내 경로로 투여되었다. 다음과 같이 5개 실험 그룹을 만들었다: 그룹 I(비히클/아스코르브산 식염수, n=6), 그룹 II(6-OHDA로 처리된 동물, n=8), 그룹 III(6-OHDA로 처리되고 10mg/Kg JM-20으로 병용치료된 동물, n=8), 그룹 IV(6-OHDA로 처리되고 20mg/Kg JM-20으로 병용치료된 동물, n=8) 및 그룹 V(6-OHDA로 처리되고 40mg/Kg JM-20으로 병용치료된 동물, n=8). 모든 행동 연구는 제7일째에 행해졌다.

데이터 가공

통계적 분석은 GraphPad Prism Version(5.01.2007) 패키지를 사용하여 행했다. 결과는 미치료 대조군 세포와 비교하여 활력 퍼센트의 평균±SEM으로 표시된다. 모든 경우, 변량 분석(OneWay ANOVA)을 행한 후 Dunet 테스트(GraphPad Prism 5)를 수행하여 실험에 사용된 대조군에 비해 p<0.05(*), p<0.01(**) y p<0.001 (***)의 유의성 수준에 따라 유의한 차이를 결정했다. 실험에서 얻어진 모든 값을 다양한 대조군과 그리고 서로에 대해 비교하기 위해, Tukey 테스트(GraphPad Prism 5)를 행했으며, 유의성 수준은 p<0.05(*), p<0.01(**) y p<0.001(***)였다.

래트에 대해 설계된 실험 모델에서 병소

래트에서 6-하이드록시도파민 주사에 의한 흑질치밀부의 일방적 병소

선조체(오른쪽 반구)의 일방적 도파민성 탈신경을 진행시킬 목적으로 래트를 클로랄 하이드레이트(0.4g/kg 중량, i.p., Merck(Darmstadt, Germany))로 마취하고 정위적 수술을 위해 설계된 프레임에 배치하고(Stoelting Instruments, USA.), 오른쪽 흑질치밀부에 식염수 용액 신경독소 6-OHDA-HBr(8μg/3μL, 항산화제로서 아스코르브산 0.2mg/mL를 함유)을 주사했다(Pavon Fuentes, Nancy (2007) Efecto de la inactivacion de los receptores dopaminergicos D2 y de la mani-pulacion del nucleo subtalamico sobre la conducta motora en modelos de hemiparkinsonismo en roedores. Doctor en Ciencias de una Especialidad, Unive-rsidad de Ciencias Medicas de La Habana). Paxinos and Watson Atlas(Paxinos, G. and Watson, C. 입체 좌표에서의 래트 뇌. 2nd the Academic Press. New York, 1986)에 따라서 브레그마를 기준점으로서 해서 좌표를 계산했고, 이는 표 1에 제시된다.

좌표
AP	-4.4 mm
ML	1.2 mm
DV	7.8 mm
기준 막대	-2.4 mm 양이간 라인 밑

브레그마에 대해 mm 단위로 표시된 정위 좌표(DV는 경막면을 말한다)

신경독소를 Manilton 주사기(3μl)를 사용하여 1μl/min의 유속으로 서서히 주사하고 주사 완료 후 5분간 유지한다.

IV. 행동 테스트

A. 원통 테스트

이 테스트에서는 원통의 가장자리에 닿을 수 없도록 래트를 직경 20cm 높이 30cm의 투명한 아크릴 원통에 넣었다. 원통 모양은 미지의 장소에 래트를 넣었을 때 뒷발로 벽을 수직 탐색하는 선천적 행동에 적합하다(Chan, H., Paur, H., Vernon, A.C., Zabarsky, V., Datla, K.P., Croucher, M.J., Dexter,D.T., 2010 파킨슨 병의 설치류 모델에서 mGluR2/3 수용체의 선택적 활성화 후 감소된 미세아교세포 활성화와 관련된 신경보호 및 기능 회복. Parkinsons Dis. pii, 190450). 동물의 배치 후, 오른쪽이나 왼쪽 양쪽 앞발로 동물에 의해 이루어진 터치의 횟수가 원통의 벽에 대해 동물당 최대 총 20회 터치로 정량된다.

6-OHDA에 의해 일방적 영향을 받은 동물은 영향을 받은 반대쪽의 발, 즉 왼쪽 발을 더 적게 사용하는 경향을 나타냈다. 각 동물에 의해 나타난 비대칭성의 퍼센트가 아래의 식으로 정량된다(Roof, R.L., Schielke, G.P., Ren, X., Hall E.D. (2001) 래트에서 2건의 중대뇌동맥 폐색 모델 후 장기 기능 성과의 비교. Stroke 32: 2648-2657).

(동측 터치 %) - (반대측 터치 %) = (비대칭 %)

탐색 활동

동물의 수직 탐색 활동을 평가하기 위해, 탐색 활동 테스트를 수행했다. 동물을 투명한 Plexiglas의 작은 방(41 x 41 x 33(h)cm)(UGO BASILE, Multiple Activity Cage Cat. No. 47420)에 넣었다. 데이터 출력은 52050-04 데이터 획득 소프트웨어 패키지(Windows® 기반)로 관리했다. 작은 방은 스틸 홈이 있는 4개의 수직 스틸 막대를 가진 검은색 Plexiglas로 제조된 견고한 베이스 상에 지지됨으로, 수평/수직 검출 시스템이 정확히 고정된다. 센서는 수직 탐색에 의한 동물의 움직임을 확인할 수 있는 IR 발광 시스템이다. 데이터는 컴퓨터로 모니터링된다. 동물을 상자에 넣고 상자를 탐색하도록 한다. 상자는 환경 소음으로부터 격리되고 빛이 적은 방에 5분 동안 둔다. 상자 안의 센서의 광선이 중단되는 때인 동물이 상자의 벽을 수직으로 탐색한 횟수를 기록한다(Cools, A.R., R. Brachten, D. Heeren, A. Willemen, 및 B. Ellenbroek, 1990. Wistar 래트의 개별-특이적 특징의 신경생물학적 프로파일 후의 조사. Brain Res. Bull. 24: 49-69).

결과는 도 16에 제시된다.

도 16은 치료 7일 후에 수컷 Wistar 래트에서 6-OHDA에 의해 유도된 손상에 대한 JM-20의 신경보호제 효과를 도시한다. (A) 비대칭 %의 감소(원통 테스트), JM-20으로 치료된 동물은 치료받지 않은 손상된 동물과 비교하여 감소된 운동 손상을 나타냈다. (B) 손상에 대한 반대쪽 발의 증가된 사용을 나타냈다. (C) 손상된 동물 및 2개 용량의 JM-20(40 및 20mg/Kg)으로 치료된 동물에서 동측성 발의 사용의 정상적인 값(~50%)을 나타냈다. (D) JM-20으로 치료된 동물은 수직 탐색이 증가했으며, 치료되지 않은 손상된 동물과 비교하여 40mg/Kg의 용량에서 통계적으로 유의했다.

긴장성 통증

래트의 긴장성 통증 모델(5% 포르말린 테스트)에서 통증과 관련된 행동에 대한 JM-20(10, 20, 40mg/Kg, p.o)의 효과를 연구했다(Dubuisson D., Dennis, S.G. 포르말린 테스트: 래트 및 고양이에서 모르핀, 메페리딘 및 뇌간 자극의 진통 효과에 대한 정량적 연구. Pain 1977;4:161-174).

결과는 도 17A, 17B 및 18에 제시된다.

도 17A는 래트의 발바닥 표면에 5% 포르말린을 주사한 후 핥기/물기 행동에 대한 JM-20(10-40mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.), 디아제팜 10mg/Kg 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 데이터는 제I기(0-5분), 지연기(5-15분) 및 제II기(15-45분) 동안 핥기/물기 시간의 누적 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7). ^*** p<0.001은 비히클로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다(하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Dunnett의 귀납법 적용).

도 17B는 래트의 발바닥 표면에 5% 포르말린을 주사한 후 핥기/물기 행동에 대한 JM-20(10-40mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.), 디아제팜 10mg/Kg 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 시간에 따라 도시한다. 데이터는 45분 동안 핥기/물기 시간의 평균(5min/sec)±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7).

도 18은 5% 포르말린 테스트의 제II기에 대한 JM-20의 항-초고통각 효과에 대해 플루마제닐(10mg/Kg, i.p)로 동물을 예비치료한 것의 영향을 도시한다. 각 칼럼은 평균±EEM으로서 그룹당 6-10마리 동물의 반응 시간을 나타낸다. ^* P<0.05, ^*** P <0.001은 치료 그룹과 대조군(비히클 단독)의 통계적 차이를 나타내고, ^**** P<0.05는 플루마제닐의 존재 또는 부재하에 디아제팜으로 치료된 그룹들의 통계적 차이를 나타내고, ^≠ P<0.05는 플루마제닐의 존재 또는 부재하에 JM-20으로 치료된 그룹들의 통계적 차이를 나타낸다.

신경병증성 통증

NP 모델인 좌골 신경 모델(CCI)의 만성 속박감에 대한 JM-20의 효과를 연구했다(Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. 암 환자에서 신경병증성 통증의 유병률 및 병인론: 체계적 검토. Pain 2012; 153: 359-365)

결과는 도 19-23에 제시된다.

도 19는 von Frey 필라멘트 자극에 의한 발 움츠림 반응을 측정함으로써 결정된, 수술 14시간 후에 CCI 래트의 동측 발에서 기계적 무해자극통증에 대한 JM-20(20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 데이터는 반응 역치의 50%의 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7). 상이한 문자는 그룹 간 유의한 차이를 나타낸다(하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Bonferronni의 귀납법 적용).

도 20은 전자 von Frey에 의해 자극되었을 때 발 움츠림 반응을 측정함으로써 결정된, CCI 래트의 동측 발의 기계적 초고통각의 강도에 대한 JM-20(20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 데이터는 초기 3회 측정의 평균으로부터 상이한 시간에서의 3회 측정의 평균을 차감한 값에 기초하여 계산된 g 단위의 감소에 대한 역치 차이(Δ)의 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7). ^** p<0.01은 비히클로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, ^# p<0.05는 Sham CCI 그룹과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다(하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Bonferronni의 귀납법 적용).

도 21은 고전적인 Randal Selito 또는 SH Ferreira 테스트의 변형에 따른 발에 대한 일정 압력에 대한 기계적 초고통각에 대한 JM-20(20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 데이터는 초기 측정값으로부터 상이한 시간에서의 측정값을 차감함으로써 계산된 반응 시간의 차이(Δ)의 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7). ^* p<0.05는 비히클로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, ^## p<0.01은 Sham CCI 그룹과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다(하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Bonferronni의 귀납법 적용).

도 22는 수술 14일 후에 CCI(Wallerian 변성)에 의해 유도된 조직학적 변화에 대한 CCI 후 제7일에 시작한 7일 동안의 반복 용량의 JM-20(20mg/Kg, p.o)에 의한 치료의 효과를 도시한다. A, B 및 C는 CCI Sham 래트, JM-20으로 치료된 CCI 및 비히클로 치료된 CCI에서 병소에 대해 원위 5mm에 있는 좌골 신경의 길이방향 구획을 도시한다(H/E 착색). sham-CCI와 비교하여 Schawann 세포의 증식과 대식세포 침윤 및 미엘린 피막과 관련된 질서있는 배열의 상실의 결과로서 위약 치료된 동물과 비교하여 CCI 동물에서 상대적으로 세포질의 증가를 관찰할 수 있었다. 화살표는 타원형 미엘린(타원의 적색 덩어리)을 함유하는 Schawann 세포의 많은 소화방 중 하나를 나타낸다. D, E 및 F는 동일한 동물로부터의 구획을 나타내며, 미엘린 착색을 위한 특수 기술인 룩솔 패스트 블루(LFB) 기술에 의해 착색된다. B 및 E: CCI에 의해 유도된 신경 섬유의 감소된 탈조직화 및 JM-20으로 치료된 동물에서 세포의 증가된 수 및 미엘린 피막의 변성이 나타나며, 특히 피막 변성 효과는 E에서 구체화된다.

도 23은 산화질소 농도의 지표로서 질산염 농도에 대한 JM-20(20 mg/Kg, 10mL/Kg, p.o) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=7). ^*** p<0.001은 비히클로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, ^### p<0.001은 Sham CCI 그룹과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다(하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Bonferronni의 귀납법 적용).

카라게닌 -유도 복막염

계속해서, 이들 조건에서 JM-20의 항염증 활성을 조사하기 위해 설치류의 CA 유도 복막염 모델에서 상이한 실험을 설계했다.

결과는 도 24A-E에 도시된다.

도 24는 래트에서 카라게닌(500μg/공동)에 의해 유도된 복막 염증 반응에 대한 JM-20(20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) 또는 비히클(CMC, 0.05%)의 효과를 도시한다. 장간막에서 혈관 내피에 대한 백혈구 롤링(A) 및 이들의 유착(B)이 염증 유도 4시간 후에 생체내 현미경에 의해 확인되었다. 복강을 향한 백혈구의 이동(C) 및 혈관 투과성(μg/mL)(D)이 CA 후 4시간 뒤에 확인되었다. 카라게닌 주사 4시간 후에 복막액에서 종양괴사인자(TNFα)의 농도에 대한 효과(E)가 확인되었다. 데이터는 평균±EEM으로 표시된다(그룹당 n=6). ^* p< 0.05, ^** p <0.01은 비히클로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, ^### p<0.001, ^## p<0.01은 복강내 식염수 용액으로 치료된 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다(각 사례에서 하나의 경로에 대해 ANOVA 후 Newman-Keuls 또는 Bonferronni의 귀납법 적용).

Claims (13)

1. 하기 식 III의 화합물을 포함하는 치매, 또는 파킨슨병 또는 통증의 치료용 제약학적 조성물.
   

   

   
   
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12. 제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병 또는 혈관성 치매인 것을 특징으로 하는 치매, 또는 파킨슨병 또는 통증의 치료용 제약학적 조성물.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증인 것을 특징으로 하는 치매, 또는 파킨슨병 또는 통증의 치료용 제약학적 조성물.
    

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