ES2902992T3 - Derivado de benzodiazepina con actividad sobre los sistemas vascular y nervioso central - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula (III), sus derivados y composiciones farmacéuticas que los contienen para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central y vascular, especialmente trastornos neurodegenerativos, con deterioro cognitivo, enfermedades asociadas al estrés oxidativo, enfermedades que cursan con disfunción mitocondrial, enfermedad de Parkinson y dolor neuropático, así como procesos patológicos asociados con el envejecimiento.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivado de benzodiazepina con actividad sobre los sistemas vascular y nervioso central

Campo de invención:

Esta invención se refiere a la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o enfermedades asociadas al deterioro cognitivo, con oxidación no deseada o procedimientos patológicos asociados al envejecimiento.

La neurodegeneración es un tema común a muchas enfermedades de los trastornos del sistema nervioso, tales como las demencias, la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD) y el dolor neuropático (NP). Estas enfermedades son devastadoras y su manejo es costoso y los tratamientos actuales son inadecuados. A la urgencia de este problema se suma el hecho de que la incidencia de estas enfermedades relacionadas con el envejecimiento está creciendo rápidamente debido a los cambios demográficos que se están produciendo.

El progresivo envejecimiento de la población mundial trae consigo la consecuencia no deseada del aumento de enfermedades neurodegenerativas y demencias seniles. En todo el mundo, se estima que 46.8 millones de personas viven con demencia. Se estima que este número crecerá casi al doble cada 20 años; a 74.7 millones en 2030 y 131.5 millones para 2050. La demencia también tiene un impacto económico enorme. Hoy en día, el coste mundial estimado de la demencia es de 818 mil millones de dólares y se convertirá en una enfermedad de un billón de dólares para 2018, con un tremendo impacto en la calidad de vida tanto de los pacientes como de sus familiares y cuidadores (Alzheimer's Disease International. World Alzheimer Report 2015. London: Alzheimer's Disease International; 2015).

De todos ellos, la AD es la más prevalente con aproximadamente 35 millones de personas que padecen la enfermedad y se estima que su incidencia crecerá significativamente en las próximas tres décadas, manteniendo el ritmo de la edad promedio de la población (Reitz, C.; Brayne, C.; Mayeux, R. Epidemiology of Alzheimer's disease. Nat. Rev. Neurol., 2011, 7, 137-152) (Reitz, C.; Mayeux, R. Alzheimer's disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem. Pharmacol., 2014, 88, 640-651). La AD es un trastorno neurodegenerativo del cerebro que conduce a la pérdida de memoria y a la pérdida de funciones cognitivas que progresa a un ritmo lento, a menudo acompañada de cambios de comportamiento tal como agresión y depresión (Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M. Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344). En su última etapa, los pacientes están postrados en cama, incontinentes y dependientes de cuidados, algo que resulta muy caro para las familias. En promedio, la muerte ocurre 9 años después del diagnóstico (Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85). La gran cantidad de personas que padecen esta enfermedad, que requieren atención las 24 horas del día y otros servicios, afectará gravemente a los recursos médicos, monetarios y humanos (Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3):469-525). Por lo tanto, esta es una preocupación médica creciente.

La AD es una demencia cortical prototípica caracterizada por pérdida de memoria junto con disfagia (trastorno del lenguaje con deterioro de la comprensión del habla y la conversación), dispraxia (discapacidad en la coordinación y ejecución de ciertos movimientos y gestos intencionales en ausencia de deterioro motor) y agnosia (la capacidad de reconocer objetos, personas, sonidos, formas u olores) atribuidos a la participación de áreas de asociación cortical (Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5) (Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic 5 paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloidbeta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8) (Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Dos mutaciones novedosas de presenilina-1 en las genealogías de la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano y evidencia preliminar de la asociación de mutaciones de presenilina-1 con un fenotipo novedoso. Neuroreport. 8(6): 1537-42) (Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92).

Aunque la enfermedad es multifactorial y heterogénea, tiene ciertas características comunes tales como pérdidas masivas de neuronas colinérgicas, depósito de ovillos neurofibrilares y agregados beta-amiloides (Huang, Y.; Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell, 2012, 148, 1204-1222). La patología química de la AD muestra muchas similitudes con la enfermedad de Parkinson (PD): estrés oxidativo, actividad reducida del complejo mitocondrial I, aumento de la peroxidación lipídica. Estas similitudes también incluyen la naturaleza progresiva de la enfermedad, la proliferación de microglia reactiva alrededor de las neuronas moribundas, el estrés oxidativo y los procedimientos inflamatorios.

A pesar de las grandes inversiones realizadas por la industria farmacéutica, existen pocos tratamientos eficaces para la AD, de hecho, no existen.

Hoy en día se están siguiendo diferentes estrategias para la obtención de nuevos fármacos para tratar la enfermedad, dado que hemos visto que los fármacos actualmente aprobados aportan pocos beneficios a los pacientes. Estos fármacos retrasan temporalmente (un año en el mejor de los casos) algunos de los síntomas de la enfermedad pero no evitan su evolución. Aunque inicialmente la AD se asoció solo con una deficiencia colinérgica, se ha demostrado que otros neurotransmisores tal como la dopamina, la noradrenalina, la serotonina y el glutamato están reducidos o no regulados en la AD. Actualmente los neurotransmisores más estudiados en la patogenia de la AD son colinérgicos y glutamatérgicos (Palmer, AM; Gershon, S. Is the neuronal basis of Alzheimer's disease cholinergic or glutamatergic? FASEB J 1990, 4, 2745-52).

Las opciones terapéuticas actuales para la AD se basan en la inhibición de la acetilcolinesterasa con fármacos tales como donepezil, galantamina o rivastigmina o en la capacidad de la memantina para antagonizar el receptor de glutamato, NMDA (N-metil-D-aspartato. Debido al bajo índice de éxito de estos fármacos, se han abierto nuevas líneas de investigación. (Bartus, RT, Dean, RL 3rd; Beer, B; Lippa, AS The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science 1982, 217, 408-14) (Terry, A.V. Jr.; Buccafusco, J.J. The cholinergic hypothesis of age and Alzheimer's disease-related cognitive deficits: recent challenges and their implications for novel drug development. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 821-827) (van Marum, R. J. Current and future therapy in Alzheimer's disease. Fundam. Clin. Pharmacol., 2008, 22, 265-274)

De acuerdo con la hipótesis colinérgica de la AD, la pérdida de funciones colinérgicas en el sistema nervioso central (CNS) contribuye significativamente a la disfunción cognitiva asociada a la AD (Bartus, R.; Dean, R.; Beer, B.; Lippa, A. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science, 1982, 217, 408-414). Además, aunque la relación entre el agotamiento colinérgico, la amiloidogénesis y la fosforilación de Tau es compleja, parece que la reducción del colinérgico puede aumentar la producción de amiloide B y puede inducir la fosforilación de la proteína Tau. Por otro lado, la hipótesis glutamatérgica de AD establece que los mecanismos excitotóxicos relacionados con el glutamato implican al receptor NMDA que conduce a la degeneración y muerte celular (Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Komhuber J. Glutamate and the glutamate receptor system: a target for drug action. Int J Geriatr Psiquiatría 2003, 18, S33-40). La estimulación sináptica a través de los receptores NMDA es importante para las funciones del aprendizaje y la memoria, pero un exceso de glutamato puede causar excitotoxicidad y neurodegeneración (Michaels RL, Rothman SM. Glutamate neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. J Neurosci 1990 10, 283-92).

En este escenario, las estrategias de tratamiento deberían ejercer impedimentos para ambos sistemas mediante una combinación de un inhibidor de la enzima AChe capaz de mejorar el tono colinérgico con un antagonista del receptor NMDA capaz de contrastar con la neurodegeneración inducida por glutamato. Sin embargo, esta combinación de terapias presenta algunas desventajas. Además de afrontar la administración de fármacos separados, algo que crea un problema adicional para los pacientes ancianos que padecen AD y para las personas que los cuidan, las diferentes farmacocinéticas de los respectivos fármacos pueden incidir en diferentes farmacodinámicas. En la práctica, las clínicas se enfrentarían a la administración de una terapia combinada de dos curvas ADME (administración, distribución, metabolismo, excreción) diferentes.

Un enfoque alternativo e innovador para la combinación de dos medicamentos es el de los fármacos que pueden actuar sobre múltiples dianas farmacológicas, los denominados fármacos de dianas múltiples (MTD).

La estrategia de actuar sobre dos o más proteínas al mismo tiempo con un compuesto simple puede proporcionar efectos terapéuticos superiores (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72) (Zimmerman GR, Lehar J, Keith CT. Multi-target therapeutics, whenthewhole is greaterthan the sum o fthe parts. Drug Discov Today 2007, 12, 34-42) (Morphy R, Ranlovic, Z. Fragments, network biology and designing multiple ligands. Drug Discov Today 2007, 12, 156-60). Esto se puede explicar por el número de beneficios potenciales que brinda el uso de los MTD en lugar de los cócteles o medicamentos de varios componentes. Las ventajas de los MTD sobre los cócteles se pueden resumir en: 1) reducir la incertidumbre en el desarrollo clínico, dado que predecir la farmacocinética de un compuesto simple es mucho más fácil que la de un cóctel, superando el problema de las diferentes biodisponibilidades, farmacocinéticas y metabolismos; 2) seguridad farmacodinámica; 3) mayor eficacia debido al efecto sinérgico de inhibir múltiples dianas terapéuticas, y 4) mayor seguridad al disminuir los efectos secundarios de consumir cócteles de fármacos (riesgos reducidos debido a interacciones fármaco-fármaco); esto es particularmente relevante para el metabolismo de fármacos donde la competencia de diferentes fármacos por la misma enzima metabólica afecta su toxicidad.

Otra ventaja importante es un régimen terapéutico simplificado con mejores posibilidades de cumplimiento y esto es especialmente importante para los pacientes ancianos con Alzheimer y sus cuidadores (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). Con respecto a esto, un aspecto importante es que los pacientes con Alzheimer son susceptibles a una amplia gama de condiciones médicas (comorbilidad) que incluyen hipertensión, enfermedades vasculares y diabetes que a menudo pueden estar asociadas. Por lo tanto, los problemas asociados con el uso de multifarmaceútico en la población geriátrica se han reconocido como críticos en los últimos años. Estos problemas consisten principalmente en interacciones de fármacos, algo que ocurre con mayor frecuencia en esta población debido a la coexistencia de enfermedades crónicas y fallas orgánicas. No se puede suponer que dos fármacos que por sí mismos son seguros también lo sean cuando se combinan, especialmente en la población geriátrica. Además, el número de fármacos administrados al mismo tiempo se debe reducir tanto como sea posible, ya que la edad avanzada es un factor de riesgo impredecible para cualquier tratamiento farmacológico (Turnheim, K. When drug therapy gets old: pharmacokinetics and pharmacodynamics in the elderly. Exp. Geront. 2006, 38, 843-853). Dado que los MTD se ven fuertemente favorecidos sobre las terapias combinadas en lo que respecta a la complejidad de las interacciones entre los fármacos multifuncionales, las comorbilidades, las sensibilidades farmacodinámicas alteradas y los cambios en la farmacocinética en los ancianos. El uso clínico de MTD también puede simplificar el régimen terapéutico (Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinson's diseases J. Neural Transm 112, 519-537). El cumplimiento de los regímenes de medicación prescritos es esencial para un tratamiento eficaz. El incumplimiento representa un problema general, pero es un desafío para los pacientes de Alzheimer y sus cuidadores (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med ResOpin 2007, 23, 2705-13). En consecuencia, un régimen de tratamiento simplificado con fármacos que actúen sobre múltiples dianas podría aumentar la adherencia al tratamiento. Todas las ventajas anteriores mencionadas no están disponibles para cócteles de fármacos.

La estrategia del ligando 1 para dianas múltiples es un enfoque innovador para el desarrollo de nuevos candidatos para el tratamiento de enfermedades neurológicas complejas, especialmente teniendo en cuenta que los procedimientos básicos implicados en las enfermedades neurodegenerativas son por naturaleza multifactoriales (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerativo diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72). Dicha estrategia se basa en el concepto de que un solo compuesto puede actuar sobre múltiples dianas que cooperan en el procedimiento neurodegenerativo implícito en el Alzheimer y en otras enfermedades neurodegenerativas y que, por lo tanto, prevería la compensación no deseada entre las rutas patógenas que interactúan. Pero los MTD se pueden representar una práctica alternativa al uso de combinaciones de fármacos. Dado que la mayoría de los mecanismos neurodegenerativos son compartidos por muchas enfermedades neuronales, estas m Td también se pueden usar como medicación para otras enfermedades. La carga global del accidente cerebrovascular isquémico es casi 4 veces mayor que la del accidente cerebrovascular hemorrágico. Las pruebas actuales sugieren que entre el 25 y el 30 % de los supervivientes de un accidente cerebrovascular isquémico desarrollan un deterioro cognitivo vascular inmediato o retardado o demencia vascular. La demencia después de una lesión por accidente cerebrovascular puede incluir todo tipo de trastornos cognitivos. Dado que el riesgo de muerte después de un accidente cerebrovascular ha disminuido, ha aumentado el número de supervivientes de un accidente cerebrovascular que tienen afectación cerebral y deterioro cognitivo (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.10167j.bbadis.2016.01.015).

La demencia después del accidente cerebrovascular se considera una entidad clínica que define todos los tipos de demencia que ocurren después de una lesión por accidente cerebrovascular, además de si incluye procedimientos vasculares, neurodegenerativos o una combinación de los dos. Eso conlleva una etiología compleja con combinaciones variables de enfermedades de los vasos grandes y pequeños así como patologías neurodegenerativas_(R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.10167j.bbadis.2016.01.015).

Por el conocimiento que se tiene sobre la cascada de lesiones isquémicas, se sabe que se trata de una serie de eventos complejos que son altamente heterogéneos_(R. Brouns, P.P. De Deyn, The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke, Clin. Neurol. Neurosurg. 111 (2009) 483-495) evolucionan de minutos a días y semanas después del evento de hipoperfusión inicial. Los principales eventos incluyen fallas de energía debido a la interrupción del flujo sanguíneo, excitotoxicidad, sobrecarga de calcio, estrés oxidativo, disfunción de la barrera hematoencefálica, daño microvascular, activación hemostática, lesiones relacionadas con respuestas inflamatorias e inmunes y muerte celular a nivel neuronal, células gliales y endoteliales. Las lesiones microvasculares y la ruptura de la barrera hematoencefálica que pueden ocurrir días después, provocan edema vasogénico y también pueden causar hemorragias. Al mismo tiempo, los tejidos pueden sufrir una compleja gama de respuestas de reparación y remodelación que incluyen angiogénesis para limitar el daño y mejorar las consecuencias. Estos eventos se truncan en los cerebros que envejecen, por lo que el parénquima se lesiona de manera irreversible, lo que contribuye a la disfunción cognitiva (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015),

Los estudios experimentales sugieren que la muerte celular después de un deterioro isquémico es altamente atribuible a la necrosis. Sin embargo, los desarrollos recientes indican que la muerte neuronal ocurre significativamente por apoptosis así como por mecanismos híbridos (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016),

La neuroinflamación y la inmunodepresión también se asocian con accidentes cerebrovasculares, envejecimiento e infecciones. Esto probablemente tenga un efecto perjudicial sobre la función cognitiva después de un accidente cerebrovascular (B.W. McColl, S.M. Allan, N.J. Rothwell, Systemic inflammation and stroke: aetiology, pathology and targets for therapy, Biochem. Soc. Trans. 35 (2007) 1163-1165) (C. Meisel, A. Meisel, Suppressing immunosuppression after stroke, N. Engl. J. Med. 365 (2011) 2134-2136) (W. Swardfager, D.A. Winer, N. Herrmann, S. Winer, K.L. Lanctot, Interleukin-17 in post-stroke neurodegeneration, Neurosci. Biobehav. Rev. 37 (2013) 436-447). La enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa con síntomas de disfunción motora, movimientos lentos, rigidez, temblores en reposo y alteraciones del equilibrio. A medida que avanza la enfermedad, muchos pacientes desarrollan síntomas no motores que incluyen ansiedad, depresión, estreñimiento y demencia. Estas características se atribuyen a la gran reducción del contenido de dopamina estriatal y la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la materia negra pars compacta (Gauthier, 1982).

Los signos clínicos de la PD aparecen después de que la muerte neuronal dopaminérgica excede un umbral del 70 al 80 % y una pérdida de terminaciones nerviosas estriadas que excede del 50 al 60 % (Agid, 1991).

La investigación sobre los mecanismos de desarrollo de la PD ha indicado que la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la materia negra pars compacta se refiere a la deficiencia en el complejo mitocondrial I (Jenner 1998).

Aunque existen fármacos que alivian los síntomas de Parkinson, el uso crónico de estos fármacos no es eficaz para prevenir la progresión de la PD y se ha asociado con efectos secundarios debilitantes. Por lo tanto, es de gran interés desarrollar terapias neuroprotectoras que retrasen o incluso detengan la progresión degenerativa.

Desafortunadamente, el desarrollo de terapias neuroprotectoras se ha visto obstaculizado por el conocimiento limitado de la patogénesis de enfermedades neurológicas degenerativas tales como la PD. Aún se desconoce la etiología y patogenia responsables del deterioro neural del Parkinson. Algunas líneas de prueba apoyan la teoría de la activación de la microglía y los procedimientos inflamatorios están implicados en la cascada de eventos que conducen a la degeneración neuronal progresiva (Kreutzgber, GW, 1996 Trends Neurosci, 19:312-318). La microglía activada está presente en la vecindad de las neuronas en degeneración en la materia negra de los pacientes de Parkinson (McGeer, PL et al, 1988, Neurology, 38:1285-1291).

El curso del tratamiento clásico de la PD es la administración de agonistas dopaminérgicos tales como levodopa (L-DOPA) y carbidopa. Se prescriben comúnmente otros agentes farmacéuticos con el objetivo expreso de reemplazar la dopamina o inhibir su degradación, tales como los inhibidores de la catecol-O-metiltransferasa y la amantadina (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1,2009).

Si bien tales agentes farmacéuticos mejoran por lo general los síntomas del paciente, no siempre son efectivos y/o tolerados con el tiempo, siendo la discinesia un efecto secundario (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Otra complicación es el hecho de que los tratamientos diarios pueden ser onerosos y disminuir la adherencia del paciente a la medicación. Por lo tanto, hoy en día se está poniendo énfasis en nuevos sistemas de liberación de fármacos que sean capaces de proporcionar infusiones continuas de agonistas de la dopamina mediante la colocación de minibombas (por ejemplo, intrayeyunal, subcutánea) y para la liberación a través de la piel mediante parches dérmicos (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Incluso con la evolución de dichos fármacos y sus sistemas de liberación, algunos pacientes de Parkinson todavía no reciben suficiente alivio (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1,2009).

Los modelos experimentales de enfermedades mitocondriales por lo general implican la inhibición de enzimas implicadas en la cadena de transporte de electrones (1). También se ha informado que muchas de las enfermedades neurodegenerativas están asociadas con disfunción mitocondrial (2-5). Se han detectado defectos en los complejos I, II y IV de la cadena respiratoria mitocondrial en las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington y Lou Gehrig (6-9).

Algunas líneas de prueba implican que el Parkinson es una enfermedad que implica radicales libres y una disfunción mitocondrial que conduce a la falla en la producción de energía (10-11). El aumento del daño oxidativo, el agotamiento de la dopamina, la nitración de proteínas, la acumulación de hierro, la adición de proteínas y la apoptosis son características de la enfermedad de Parkinson (12-14).

Múltiples estudios epidemiológicos muestran que el dolor crónico tiene una alta prevalencia con un impacto grave en la salud de las personas, la salud y los servicios sociales (Torrance N, Smith BH. Bennett Ml, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (Treede RD, Jensen TS, Campbell JN, Cruccu G, Dostrovsky JO, Griffin JW, Hansson P, Hughes R, Nurmikko T, Serra J. Redefinition of neuropathic pain and a grading system for clinical use: consensus statement on clinical and research diagnostic criteria. Neurology 2008; 70:1630-1635). Particularmente se ha estimado que el dolor crónico con contenido neuropático afecta aproximadamente del 7 al 8 % de la población general y las terapias disponibles para su tratamiento son aún insatisfactorias (Torrance N, Smith BH. Bennett Ml, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289)_(van Hecke O, Austin SK, Khan RA, Smith BH, Torrance N. Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies. Pain 2014; 155:654-62) (Bennett M i, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365). El NP es considerado un síntoma de neurodegeneración, entonces es lógico considerar la neuroprotección como una estrategia para prevenir su inicio, controlar su progresión e incluso revertir las lesiones neurales que conducen al establecimiento de estos síntomas de dolor crónico (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662). La neuroprotección incluye métodos que mantienen la supervivencia de las neuronas o su función en el contexto de estrés patológico (eventos traumáticos, tóxicos, isquémicos o metabólicos). Por consiguiente hoy en día el tratamiento de la mayoría de las neuropatías periféricas y centrales del NP (neuropatía diabética dolorosa, polineuropatía distal, sensorial distal por HIV y terapias antirretrovirales, neuropatías periféricas inducidas por quimioterapia, neuralgia posherpética, dolor de Ms y dolor después del accidente cardiovascular, etc.) sea ser dirigido hacia esa perspectiva (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Flatters SJL, Bennett GJ. Studies of peripheral sensory nerves in paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy: Evidence for mitochondrial dysfunction. Pain 2006; 122: 245-257) (Jaggi AS, Singh N. Mechanisms in cancer-chemotherapeutic fármacos-induced peripheral neuropathy. Toxicology 2012; 291:1-9). Se hace especial hincapié en la disfunción glutamatérgica, el estrés nitro-oxidativo, la disfunción mitocondrial, la apoptosis, los factores tróficos, la neuroinflamación y los cambios en las fibras no lesionadas inducidas por la neurodegeneración (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (DeLeo JA, Sorkin LS, Watkins LR, editors. Immune and glial regulation of pain. Seattle: IASp Press; 2007) (Park ES, Gao X, Chung JM, Chung K. Levels of mitochondrial reactive oxygen species increase in rat neuropathic spinal dorsal horn neurons. Neuroscience Letters 2006; 391:108-111). Se ha sugerido una aproximación bióloga en el desarrollo de nuevas terapias para el dolor en base a la participación de la cadena de transporte de electrones en neuropatías dependientes de ATP (Joseph EK, Levine JD. Mitochondrial electron transport in models of neuropathic and inflammatory pain. Pain 2006; 121:105-114) (Joseph EK, Levine JD. Multiple PKCedependent mechanisms mediating mechanical hyperalgesia. Pain 2010; 150:17-21). También se ha informado la dependencia mitocondrial del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la inducción de hiperalgesia mecánica (Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. Mitochondrial dependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia. Pain 2011; 152:1832-1837).

De acuerdo con estas ideas, múltiples mediadores inmunes implicados en el procedimiento de degeneración walleriana (WD) que ocurre cuando se interrumpe la continuidad de la fibra nerviosa se han propuesto como nuevas dianas para el tratamiento farmacológica del NP (Debovy P. Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction. Annals of Anatomy 2011; 193: 267-275) (Lingor P, Koch JC, Tonges L, Bahr M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res 2012; 349:289-311). También se ha reconocido el papel de la activación neuroinmune, la señalización de la microglía-neurona y el estrés oxidativo en el refuerzo de la transmisión después de lesiones nerviosas (Berger JV, Knaepen L, Janssen SPM, Jaken RJP, Marcus MAE, Joosten EAJ, Deumens R. Cellular and molecular insights into neuropathy-induced pain hypersensitivity for mechanism-based treatment approaches. Brain Research Reviews 2011; 67: 282-310) (De Leo J.A, Tawfik VL, La Croix-Fralish ML. The tetrapartite synapse: Path to CNS sensitization and chronic pain. Pain 2006;122:17-21) (Austin PJ, Moalem-Taylor G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: Involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines Journal of Neuroimmunology 2010; 229:26-50) (Salvemini D, Little JW, Doyle T, Neumann WL. Roles of reactive oxygen and nitrogen species in pain. Free Radical Biology &Medicine 2011;51:951-966). En consecuencia, estrategias innovadoras dirigidas a la neuroprotección y particularmente a la neuroinflamación para el tratamiento de NP se encuentran hoy en la etapa de investigacióndesarrollo (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Stavniichuk R, Drel VR, Shevalye H, Maksimchyk Y, Kuchmerovska TM, NadlerJL, Obrosova IG. Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation. Experimental Neurology 2011; 203:106-113).

El envejecimiento y los trastornos neurológicos y psiquiátricos causan lesiones y la muerte de las células nerviosas. Entre las lesiones frecuentes y relevantes del sistema nervioso se incluyen, entre otras, la degeneración neuronal, la isquemia, la inflamación, las respuestas inmunitarias, los traumatismos y el cáncer. Como resultado de esto, las células nerviosas pueden morir en minutos u horas o pueden sobrevivir a la lesión inicial en un estado lesionado que activa la neurodegeneración y finalmente también termina en la muerte celular.

La neurodegeneración en el Parkinson, el Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas parece ser multifactorial, por lo que una gama compleja de reacciones tóxicas que incluyen inflamación, neurotoxicidad glutamatérgica, aumento de hierro y óxido nítrico, agotamiento de antioxidantes endógenos, expresión reducida de factores tróficos, disfunción del sistema proteasómico de ubiquitina. y la expresión de proteínas proapoptóticas conduce a la muerte de neuronas.

Dada la importancia del sistema nervioso para posibilitar la motricidad y la sensibilidad básicas, existe interés en encontrar armas terapéuticas para proteger el sistema nervioso.

La neuroprotección está dirigida a la conservación, recuperación, curación o regeneración del sistema nervioso, sus células, estructura y función (Vajda et al 2002, J Clin Neurosci 9:4-8). Uno de los objetivos de la neuroprotección es prevenir o minimizar los efectos de una lesión original en el sistema nervioso, o prevenir o minimizar las consecuencias de procedimientos dañinos endógenos o exógenos que provocan lesiones en los axones, neuronas, sinapsis y dendritas.

La neuroprotección es el mecanismo y la estrategia usados para proteger contra la lesión neuronal o la degeneración del CNS como resultado de enfermedades neurodegenerativas crónicas (Alzheimer, Parkinson). El objetivo de la neuroprotección es limitar la disfunción/muerte después de una lesión en el CNS y tratar de mantener la mayor integridad posible para las interacciones celulares en el cerebro, lo que resulta en una función neuronal inalterada. El concepto de neuroprotección se aplicó tanto a las enfermedades crónicas del cerebro como a las afecciones neurológicas agudas, dado que algunos de los mecanismos básicos que lesionan el CNS son similares a estas afecciones. Los trastornos neurodegenerativos incluyen AD, PD, enfermedad de Huntington y esclerosis amiotrófica lateral. Se ha considerado que la neuroprotección es el mecanismo de acción del fármaco usado para el tratamiento de estas afecciones.

Existe una amplia gama de productos neuroprotectores disponibles o en investigación y algunos productos pueden potencialmente usarse para más de una enfermedad, dado que muchos de los mecanismos para las lesiones de los tejidos neurales son similares. Los productos con efectos neuroprotectores se agrupan en las siguientes categorías: secuestradores de radicales libres, agentes antiexcitotóxicos, inhibidores de la apoptosis (muerte celular programada), agentes antiinflamatorios, factores neurotróficos, iones metálicos quelantes, moduladores de canales iónicos y terapia génica.

Se ha demostrado que los radicales libres de oxígeno están asociados con la desnaturalización de proteínas, la inactivación de enzimas y el daño del ADN que resulta en la peroxidación lipídica de las membranas celulares y finalmente la muerte celular en enfermedades neurodegenerativas.

Estudios realizados tanto en modelos animales como humanos muestran que la pérdida de equilibrio entre especies oxidantes generada por el metabolismo cerebral y los mecanismos protectores antioxidantes producen el llamado estrés oxidativo cuando dichos sistemas de defensa disminuyen su eficacia y son vulnerados. Este estrés oxidativo aumenta con la edad y se encuentra entre las principales causas de patogénesis de la AD (Neurobiol. Aging 2007, 28, 1009-1014) posiblemente asociado con disfunciones neuronales mitocondriales. También se sabe que los productos con propiedades antioxidantes son capaces de prevenir la apoptosis inducida por el péptido amiloide así como los cambios en homeostasis del Ca2 en cultivos de neuronas corticales (Life Sci. 2000, 66, 1879-1892). 66, 1879-1892). En consecuencia, existe una gran necesidad de inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE) o butirilcolinesterasa (BuChE), y con capacidad neuroprotectora para agresiones tóxicas tales como los radicales libres oxigenados, dichos compuestos tendrían gran importancia médica en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la AD, la PD o de Huntington.

En general, las estrategias de tratamiento se basan frecuentemente en la modulación de un solo factor de la lesión propuesta. Aunque podemos observar que dichos tratamientos son beneficiosos en animales muy limitados; modelos, es menos probable que se muestren eficaces en trastornos humanos más complejos que implican grados más variables de gravedad de la lesión en una población genéticamente diversa (Faden and Stoica 2007.; Arch Neurol 64:794-800). En gran medida, dados los presuntos mecanismos de muerte neuronal tales como el estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, proteínas agregadas, apoptosis e inflamación (Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinson's diseases J. Neural Transm 112, 519­ 537), son tan complejos como variados, se quieren compuestos únicos que tengan efectos polivalentes sobre los múltiples mecanismos de las lesiones.

El compuesto (3-etoxicarbonil-2-metil-4-(2-nitrofeenil)-4,11-dihidro-1H-pirido [2,3-b][1,5] benzodiacepina) (JM-20) que se describe en el documento de Patente Cubana CU23879 por su estructura química puede tener efectos sobre enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y otras asociadas al sistema nervioso central.

Sorprendentemente, los investigadores han descubierto que el compuesto JM-20 tiene marcados efectos terapéuticos en el CNS, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades tales como diferentes tipos de demencia, Parkinson y dolor. Por lo tanto, la esencia de esta invención se basa en el uso de JM-20 y sus productos químicos para ser usados preferentemente en el tratamiento de enfermedades tales como los diferentes tipos de demencia, Parkinson y dolor.

JM-20 es un producto de la benzodiacepina y se ha informado ampliamente que las benzodiacepinas inducen demencias (Huber-Geismann, F, 1994) (Rosenberg, P. B. 2015). (Shash, D., T. Kurth, et al. 2015) (Zhong, G., Y. Wang, et al. 2015)), pero inesperadamente JM-20 mejora diferentes tipos de demencias. A pesar de que se ha descrito en la literatura la potencial utilidad de JM-20, no se ha establecido su potencial como fármaco terapéutico en enfermedades neurodegenerativas tales como demencias, Parkinson y dolor neuropático.

El documento CU 23 879 B1 revela JM-20 y su uso previsto para el tratamiento de ansiedad, isquemia, epilepsia, hipertensión arterial y otros trastornos cardiovasculares, cerebrovasculares, neurodegenerativos, neuropsiquiátricos y neurológicos.

El documento WO 2009/137462 revela métodos de tratamiento de trastornos o déficits cognitivos que comprenden la administración de compuestos muy generales.

Como aspecto adicional a esta invención, el compuesto de fórmula general III (JM-20), sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros, se pueden administrar mezclados con al menos un agente vehículo, diluyente y/o portador, químicamente inerte, no tóxico, reconocidos en lo que sigue como excipientes incluidos en las composiciones de fármacos que se proponen.

Las composiciones farmacéuticas proporcionan cualquier composición líquida, sólida o semisólida, se pueden administrar por vía oral, bucofaríngea, sublingual, parental, por ejemplo: intramuscular, intravenosa, intradérmica o subcutánea, tópica, transdérmica, traqueal, bronquial, nasal, pulmonar, rectal u otra vía de administración apropiada.

Las composiciones farmacéuticas descritas incluirán excipientes apropiados para cada fórmula. Las formulaciones se preparan convencionalmente usando métodos recogidos en el estado de la técnica. Los excipientes se seleccionan por su forma de fármaco de elección según la forma en que se administrarán.

El compuesto de fórmula general III (JM-20), sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros para su administración a humanos pueden estar contenidos en formas de dosis farmacéuticamente aceptables entre las que se encuentran pero no se limitan a estas formas de presentación: comprimidos (incluyendo sublinguales, recubiertos y masticables), cápsulas duras y blandas (incluyendo microcápsulas, nanopartículas y pellas), soluciones (gotas orales, jarabes), soluciones parenterales, parches transdérmicos, implantes y otros sistemas retardantes, ungüentos (cremas y geles), pulverizadores nasales, mucosas-adhesivos, supositorios, suspensiones, polvos para reconstituir o para agregar a los alimentos, entre otras formas de dosis incluidas en esta invención.

Usando procedimientos tecnológicos conocidos en el estado de la técnica, JM-20, sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden formular en formas de dosis adaptadas a su administración, mezclándolos con excipientes tales como auxiliares líquidos, sólidos o semisólidos. Sustancias, compuestas de naturalezas orgánicas e inorgánicas, de origen natural o sintético. Algunos de los incluidos son: sólidos rellenos, diluyentes, aglutinantes, disolventes, emulsiones, lubricantes, desintegrantes, deslizantes, aromatizantes, colorantes, pigmentos, polímeros, edulcorantes, plastificantes, potencial de absorción, potencial de penetración, surfactantes, cosurfactantes, aceites especializados y/o sistemas reguladores que dan a los compuestos activos o sus sales fisiológicamente aceptables estabilidad física, química y/o biológica.

Algunos excipientes usados en la formulación de las formas de dosis que contienen el compuesto de fórmula general III o sus productos, sin limitarse al uso de otras sustancias auxiliares, son: almidones, lactosa, celulosa y sus productos, sacarosa, sorbitol, manitol y otros azúcares, talco, dióxido de silicio coloidal, carbonatos, óxidos de magnesio, fosfatos de calcio, dióxido de titanio, polivinil pirrolidona, povidona, gelatina, lactoproteínas, citratos, tartratos, alginatos, dextrano, etilcelulosa, ciclodextrinas, elastómeros de silicona, polisorbatos, amilopectina, parabenos, aceites animales y vegetales, propilenglicol, agua esterilizada, alcoholes mono o poli hidroxílicos tales como glicerol, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearilfumarato de sodio, lauril sulfato de sodio, glicerina y ceras de polietilenglicol entre otros.

Formas orales sólidas de dosis tales como comprimidos, microgránulos, nanopartículas, pellas, polvos para reconstituir o cápsulas que contienen la fórmula general III o sus sales, formas enantiómeras y productos de oxidación-reducción según esta invención se pueden usar para liberación inmediata o modificada.

Una forma farmacéutica de elección, según esta invención, son comprimidos que contienen como ingrediente farmacéutico activo la fórmula general III o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros preparados en una mezcla con celulosa microcristalina, almidón de maíz, crospovidona, agregando polivinilpirrolidona disuelta y lauril sulfato de sodio para formar un granulado el cual se seca en un procedimiento completo en un lecho fluidizado y se mezcla con estearato de magnesio y talco, posteriormente se elaboran los comprimidos mediante un sistema de punzones rotativos para su fabricación, finalmente los comprimidos se recubren con un hidroxilpropil celulosa, polietilenglicol 4000, dióxido de titanio y suspensión colorante.

Al recubrir los comprimidos logramos un acabado elegante y evitamos el sabor desagradable; esto se logra con un agente que enmascara el sabor tal como copolímero de ácido metil acrílico, etil celulosas, metil hidroxil propil celulosa u otros polímeros. Los comprimidos se pueden obtener tanto por el método de granulación en húmedo explicado anteriormente como por el método de compresión directa usando excipientes para la compresión directa y las etapas decrecientes en la fase de obtención de comprimidos, siempre que se trabaje con dosis bajas. Los comprimidos pueden ser de liberación modificada y pueden contener la fórmula general III o sus productos en microgránulos, nanopartículas o sistemas matriciales, usando excipientes tales como: óxido de polietileno, hidroxilpropilcelulosa 2910, estearato de magnesio, cloruro de sodio, óxido ferroso rojo, acetato de celulosa, polietilenglicol 3350 y opadry.

Según esta invención, las composiciones farmacéuticas pueden contener polímeros farmacéuticamente aceptables, permeables, biodegradables e insolubles en agua, para controlar su perfil de liberación obteniendo así formas de dosis de liberación modificada (inmediata, retardada o controlada). Estos polímeros se pueden usar para recubrir los comprimidos, microgránulos, cápsulas en la obtención de nanopartículas, como matrices de liberación en pellas, comprimidos, gránulos o mezclas con otros excipientes incluidos en cualquier otra forma de dosis mencionada en esta invención.

Para administración oral, otras composiciones farmacéuticas apropiadas son cápsulas duras, cápsulas blandas y polvos farmacéuticos, el compuesto de fórmula general III o sus sales, formas enantiómeras y productos de su oxidación-reducción fisiológicamente aceptables se pueden dosificar en forma de cápsulas de gelatina dura o celulosa. por ejemplo, que contiene en su interior una mezcla del ingrediente farmacéutico activo con excipientes comúnmente usados en formas sólidas tales como las descritas para comprimidos; dicha mezcla se puede obtener por vía seca, granulación húmeda, extrusión, peletización, microcapsulación o dosis de microcomprimidos. Para dosis en cápsulas de gelatina blanda se usan métodos de fabricación convencionales y se pueden preparar mezclando el compuesto de fórmula general III o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros con aceites vegetales, grasas u otros vehículos similares apropiados para su formación.

En el caso de los polvos farmacéuticos, estos se pueden fabricar mediante mezclas simples del compuesto de fórmula general III (JM-20) o sus sales, formas enantiómeras y productos de sus profármacos fisiológicamente aceptables con cargas, agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y conservantes. Aunque esta invención también usó el método de atomización-secado a temperaturas de entrada entre 100 °C -150 °C y temperaturas de salida entre 50 °C - 90 °C en la elaboración de polvos, usando excipientes tales como el dextrano, polietilenglicol 4000 y lauril sulfato de sodio, entre otros, para mejorar la solubilidad del principio activo farmacéutico para su correcta incorporación al organismo en soluciones, o para agregarlo a alimentos tales como jugos.

Para administración rectal, el compuesto de fórmula general III (JM-20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden dosificar como supositorios, espumas o soluciones de microenemas rectales que pueden contener una mezcla de compuestos activos con una base de grasa sólida neutra. (Witespol 45) o algún otro vehículo similar apropiado para su formulación; monooleato de sorbitán, polisorbato 20, cera emulsionante, silicona coloidal anhidra, metabisulfito de sodio, edatato de disodio, parahidroxilbenzoato de metilo, fosfatos de sodio, macrogol 300, glicerina, agua, propano, isobuteno y n-butano.

Para la administración oral líquida, el compuesto de fórmula general III (JM-20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden formular como jarabes, elixires, gotas concentradas o suspensiones que tienen un vehículo farmacéuticamente aceptable tales como una mezcla de etanol, glicerol, propilenglicol y/o polietilenglicol, entre otros, carboxilmetilcelulosa u otros agentes espesantes; puede contener colorantes, aromatizantes, edulcorantes (sucralosa, aspartamo, ciclamato, Stevia) y conservantes (parabenos, benzoatos). Estas dosis líquidas se pueden preparar sobre la base de la reconstitución de composiciones farmacéuticas en polvo con un diluyente apropiado antes de su uso.

Para la administración parenteral, el compuesto de fórmula general III (JM-20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden formular como soluciones inyectables. Estas soluciones pueden contener ingredientes estabilizantes, conservantes y/o agentes reguladores.

En esta invención, el ingrediente farmacéutico activo está en una solución de etanol al 69 %, alcohol benzoico, propilenglicol, ácido benzoico, benzoato de sodio, hidróxido de sodio, agua para inyección; también se pueden usar otros excipientes tales como polietilenglicol 400, citrato de sodio y ácido cítrico.

Las soluciones para administración parenteral que contienen el compuesto de fórmula general III (JM 20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros también se pueden preparar mediante la reconstitución de una composición farmacéutica seca (liofilizada) con un diluyente apropiado antes de su uso, incluido el uso de sustancias auxiliares tales como manitol, polisorbato 80, cloruro de sodio y otros.

Para la administración subdérmica, el compuesto de fórmula general III (JM 20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden dosificar como implantes usando sustancias auxiliares tales como elastómeros de silicona y silicona coloidal anhidra aunque para la preparación de las pellas se pueden usar otros polímeros de uso farmacéutico.

Para la administración transdérmica, el compuesto de fórmula general III (JM 20) o sus sales, hidratos, formas cristalinas, enantiómeros se pueden formular como parches; en este caso el ingrediente farmacéutico activo está contenido en un soporte de copolímero acrílico, etanol, parafina líquida ligera, palmitato de isopropilo, tereftalato de polietileno, solución de etileno acetato de vinilo y una capa de silicona en el interior de la hoja desprendible (con una tasa de liberación nominal de 15 mg/día, en una superficie de 12.75 cm2).

Ejemplos de realización

Obtención del intermediario sintético, derivado de 5-formilato de 1,4-dihidropiridina.

El compuesto II se obtiene sobre la base de la transformación de I vía oxicloruro de fósforo, en dimetilformamida seca, cuya mezcla se agrega posteriormente en la proporción de 3 a 9 veces a una disolución de I en diclorometano o cloroformo y se agita a una temperatura entre 20- 60 °C, durante 15-20 horas (Figura 1, que muestra el diagrama de obtención de IIa y IIb).

A continuación, el producto resultante se somete a hidrólisis básica, con posterior extracción con cloroformo o diclorometano, purificación mediante lavado y secado.

El compuesto I se obtiene mediante una reacción multicomponente en una única etapa, donde se mezclan en cantidades equimolares aldehído 2-nitrobenceno, ácido de Meldrum, acetoacetato de etilo y acetato de amonio, en ácido acético como disolvente y sometiéndolos a una reacción de reflujo durante 7 a 10 horas. Pasado ese tiempo, la mezcla se vierte sobre agua y el precipitado resultante se purifica mediante recristalización en etanol.

Obtención del compuesto III.

El compuesto IIa o IIb obtenido previamente se somete a una reacción con ortofenilendiamina en etanol absoluto para obtener el Compuesto III (JM-20) que se pueden preparar formando diferentes sales, dependiendo de las condiciones de los reactivos usados.

Obtención del compuesto III de IIa

Para obtener el compuesto III (JM-20) se parte de una solución etanólica del compuesto IIa y se agregan cantidades equimolares de ortofenilendiamina, en etanol absoluto como disolvente, con agitación. Se agregan cantidades equimolares o mayores (1-2 equivalentes) de trietilamina (Figura 2, método A) a la mezcla de reacción, manteniendo la agitación o agregando cantidades suficientes (1 - 1.5 equivalentes) de disolución de hidróxido de sodio por goteo controlado y agitando continuamente el mezcla de reacción (Figura 2, método B).

Obtención del compuesto III a partir de IIb

Para obtener el compuesto III (JM-20), se inicia con el compuesto IIb en disolución de etanol y se agregan cantidades equimolares de ortofenilendiamina, en etanol absoluto como disolvente, con agitación. Se agregan cantidades equimolares o mayores (1-2 equivalentes) de trietilamina (Figura 3, método A) a la mezcla de reacción, manteniendo la agitación o agregando cantidades suficientes (1 - 1.5 equivalentes) de una disolución de hidróxido de sodio por goteo controlado y agitando continuamente la mezcla de reacción (Figura 3, método B).

Obtención del compuesto III como sales de tipo halohidrato

Las correspondientes sales de clorhidrato o bromohidrato de III (halohidratos de JM-20) se obtienen de IIa o IIb respectivamente con o sin el uso de un catalizador. Cuando se agrega el correspondiente hidrácido en cantidades catalíticas apropiadas (5-25 % mol), se produce un procedimiento de catálisis que disminuye el tiempo de reacción y aumenta ligeramente el rendimiento de la reacción (Figura 5, que muestra un diagrama para la obtención del compuesto III y sus halohidratos).

El clorhidrato de JM20 (IIIa) se obtiene adecuadamente de IIa, y cuando se agregan cantidades apropiadas de HCl, se produce la catálisis de reacción. El compuesto JM-20 también se puede obtener como bromohidrato (IIIb) a partir de IIb (Figura 5) con la característica de que el bromuro es un grupo mejor saliente que el cloruro, se facilita la reacción de sustitución nucleofílica intramolecular, lo que resulta en una reacción rápida y eficiente para obtener JM-20 como bromohidrato.

Obtención del compuesto III como sal fumarato

La sal fumarato de JM-20 (lllc) se obtiene a partir del clorhidrato o bromohidrato de III al agregar fumarato monosódico a una disolución de IIIa o IIIb, con agitación magnética durante 2-5 horas (Figura 6) y su posterior precipitación al agregar etanol en cantidades apropiadas.

El precipitado correspondiente al fumarato de IIIc se filtra y lava, purifica y posteriormente se coloca en un secador de temperatura controlada a presión reducida. La figura 6 muestra un diagrama para obtener la sal fumarato de JM-20 (IIIc).

Obtención del compuesto III en forma de sal fosfato

La sal de fosfato de JM-20 (IIId) se puede obtener mediante un procedimiento similar al anterior, a partir de IIa o IIb, agregando cantidades equimolares de ácido fosfórico al inicio de la reacción o agregando ácido fosfórico a IIIa o IIIb en solución de etanol, con agitación (Figura 7, que muestra la obtención de sal fosfato a partir de JM-20 (llld)).

Obtención del compuesto III en forma de sal sulfato

Sulfato de JM-20 (IIIf) se puede obtener de IIa o IIb o sobre la base de halohidratos de IIIa o IIIb, como se muestra en la figura 8.

Obtención de una formulación en forma de comprimido

Cada comprimido de 120.00 mg contiene:

Breve descripción del procedimiento tecnológico:

1. Tamizar el principio activo, el almidón de maíz y la lactosa a través de una malla 20.

2. Pesar todos los componentes de la formulación según las cantidades establecidas en la fórmula.

3. Para la solución de aglutininas, verter la mezcla de agua y alcohol etílico de clase C en un recipiente de metal con camisa de vapor, agregar la polivinilpirrolidona y agitar hasta que se disuelva por completo.

4. Cargar la batidora con el principio activo, almidón de maíz y lactosa (componentes de la fase interna). Mezclar durante 15 min.

5. Agregar la solución de aglutininas lentamente usando la bomba peristáltica, completando el grado de humedad requerido usando agua y alcohol etílico clase C (1:1) si es necesario. Triturar en un molino a baja velocidad.

6. Secar el granulado en lecho fluidizado. Después de 10 minutos tomar una muestra representativa de granulado, desgranular y probar su humedad residual; dicha humedad debe registrar entre 0.8 y 1.2 %.

7. Mezclar el granulado seco con lubricantes durante 10 min.

8. En una máquina rotativa de alta velocidad, comprimir la mezcla usando matrices planas, biseladas y ranuradas de 6.4 mm de diámetro (1/4 PBR) para obtener comprimidos con los siguientes parámetros:

Masa: 120.0 mg ± 10 %

Altura: 2.6 ± 0.10 milímetro

Dureza: 4.0 ± 1 kgF

Friabilidad: menos del 1 %

Obtención de formulación para forma de gota oral.

Cada mL (20 gotas) contiene:

Breve descripción del procedimiento tecnológico:

1. Medir el pH y la conductividad del agua depurada al momento de fabricar el producto.

2. Verter propilenglicol en el reactor.

3. Disolver la sacarina de sodio en agua purificada en un recipiente auxiliar de acero inoxidable con la capacidad apropiada.

4. Incorporar Kollidon 25, esparciendo poco a poco, agitando durante al menos 30 minutos hasta su total dispersión.

5. Agitar y aplicar calor a la preparación, manteniendo la temperatura entre 40 - 50 °C, durante 30 minutos.

6. Incorporar el principio activo a los resultados de la etapa anterior en pequeñas porciones, manteniendo una agitación constante durante 30 minutos.

7. Retirar el calor y esperar a que la preparación alcance la temperatura ambiente: 30 ± 2 °C.

8. Disolver el metil parabeno y el propilenglicol en alcohol etílico clase C en un recipiente auxiliar de vidrio o acero inoxidable con la capacidad apropiada, agitando constantemente hasta su total disolución.

9. A los resultados de la etapa anterior, agregar sabor fresa líquido soluble y agitar hasta que esté completamente homogéneo.

10. Incorporar los resultados de la etapa anterior lentamente en el tanque del reactor, agitándolo constante y fuertemente.

11. Disolver el ácido cítrico y el citrato de sodio deshidratado en un recipiente de vidrio o de acero inoxidable, con la capacidad apropiada, agitando después de cada adición hasta su completa disolución.

12. Incorporar lentamente los resultados de la etapa anterior al tanque del reactor, agitándolo constante y fuertemente.

13. Disolver rojo ácido Ponceau S. en agua purificada en un recipiente de vidrio o acero inoxidable que tenga la capacidad apropiada, agitando hasta su total disolución e incorporando la preparación.

14. Desnatar el volumen preestablecido con agua. Agitar hasta que esté uniforme.

15. Probar que el pH se mantenga en el intervalo de 4.0 - 6.0.

16. Hacer un filtrado final; probar las características organolépticas.

17. Embotellar la preparación final en frascos de vidrio ámbar * 15 mL, con 15.0 ± 1.0 mL de la solución, debidamente tapados, usando tapas con reductores de goteo para productos aceitosos.

Obtención de formulación inyectable:

Cada bulbo (2 mL) de JM-20 contiene:

1. Verificar que el reactor esté completamente seco después de ser esterilizado; si no, enjuagarlo con alcohol deshidratado.

2. Preparar una solución de ácido clorhídrico 1 N para ajustar el pH.

3. Agregar una parte de Cremofor ELP y alcohol deshidratado al reactor. Mezclar a 420 rpm.

4. Pesar el principio activo y agregar porciones de alcohol deshidratado al vaso de precipitados que lo contiene; dispersar con el agitador de vidrio y agregar al reactor; repetir esta operación hasta que se haya eliminado todo el principio activo y se haya agotado todo el alcohol deshidratado.

5. Mantener la agitación en el reactor durante 60 minutos a 420 rpm hasta que el principio activo esté totalmente disuelto.

6. Agregar el resto del Cremofor ELP, barriendo el resto con alcohol deshidratado, agitando durante 10 minutos a 420 rpm.

7. Determinar el pH de la solución y ajustarlo con ácido clorhídrico 1N, entre 5.0 y 6.0.

8. Completar el volumen de la solución agregando alcohol deshidratado. Agitar durante 5 minutos a 420 rpm.

9. Tomar 10 mL de la solución y enviarlos al laboratorio para el control del procedimiento (evaluación y pH).

10. Verificar la correcta configuración de los sistemas de llenado y nitrógeno.

11. Ejecutar la prueba de integridad del filtro Sartobran P MidiCaps, (0.45 0.2 pm) de porosidad con alcohol deshidratado.

12. Una vez finalizado el control del procedimiento, presurizar el reactor con nitrógeno (0.7-1.0 bar) para impulsar la solución a través del cartucho de filtro Sartobran P de 0.45 pm y 0.2 pm de porosidad. Llenar y sellar los bulbos, haciendo dosis de 2.2 mL de la solución.

Estudios de memoria en modelos de demencia

Reactivos

Todos los reactivos se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se administró JM-20 en cantidades suficientes para los estudios propuestos por el laboratorio de síntesis orgánica de la Facultad de Química de la Universidad de La Habana.

Para los diferentes estudios, JM-20 se suspendió en carboximetilcelulosa (CMC) al 0.05 % y se administró por vía oral. Se disolvió bromuro de escopolamina en la solución salina al 0.9 % y se administró por vía intraperitoneal (1 mg/kg, 4 mL/kg de peso). Se disolvió cloruro de aluminio en agua de bebida común para los sujetos experimentales y se administró por vía oral en una dosis de 500 mg/kg de peso, en forma crónica durante un mes y mientras se realizaban estudios de comportamiento. Los péptidos beta amiloides (25-35) se oligomerizaron y se hicieron solubles según las normas del fabricante y se administraron por vía intracerebroventricular a 100 pmol en 5 uL, en el hemisferio cerebral derecho.

Animales de experimentación. Consideraciones éticas.

Experimentos in vivo correspondientes al modelo de escopolamina y aluminio usaron ratas Wistar (machos, 230-260 g), mientras que los experimentos in vivo correspondientes al modelo de beta amiloide usaron ratones OF-1 (machos, 25-30 g). Todos los animales provenían del National Laboratory Animal Production Center (CENPALAB, Mayabeque, Cuba) y luego de su llegada fueron sometidos a adaptación a las condiciones de laboratorio durante 7 días. Se mantuvieron en ciclos alternos de 12 horas de luz y oscuridad, a temperaturas controladas (22 ± 2 °C), 45-55 % de humedad relativa y se les suministró agua y comida libremente a pedido. Todos los estudios de comportamiento se realizaron entre las 09:00 y las 17:00 en condiciones controladas de niveles de luz y ruido. Todos los procedimientos con animales reportados en este estudio se realizaron según criterios aprobados por comités internacionales para el cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con las regulaciones nacionales establecidas para experimentos con animales.

Diseño del experimento

Protocolo 1: Evaluación del efecto de JM-20 sobre la pérdida de memoria inducida por escopolamina

Se investiga el efecto protector de tres dosis de JM-20 (2, 4 y 8 mg/kg) sobre los procedimientos de adquisición y consolidación de la memoria a corto y largo plazo, afectados por la administración intraperitoneal aguda de escopolamina. Para ello, se administró JM-20 previo a la afectación o al procedimiento de adquisición y consolidación de la memoria, tanto a corto como a largo plazo, en cuatro pruebas independientes.

En cada prueba formamos 6 grupos experimentales de sujetos elegidos al azar (n = 10, por grupo): grupo control sano (CMC y solución salina); grupo JM-20 no dañado (JM-20 8 mg/kg); grupo escopolamina (CMC y escopolamina 1 mg/kg); grupos JM-20-escopolamina (JM-20 2 mg/kg y escopolamina 1 mg/kg), (JM-20 4 mg/kg y escopolamina 1 mg/kg) y (JM-208 mg/kg y escopolamina 1 mg/kg).

El efecto sobre la memoria se evaluó mediante la prueba de reconocimiento de objetos nuevos y la prueba de laberinto en Y de alternancia forzada, usando diseños experimentales apropiados para el estudio independiente del procedimiento de adquisición y consolidación de la memoria a corto y largo plazo.

Al final de los estudios de comportamiento, se realizaron diferentes estudios in vivo sobre la base de tejido cerebral. Se estudió el efecto de JM-20 sobre diferentes marcadores de estrés oxidativo, función mitocondrial, niveles de actividad de la enzima de acetilcolinesterasa AchE y los parámetros histológicos de viabilidad neuronal y axonal en regiones cerebrales muy implicadas en los procedimientos de memoria y aprendizaje.

Protocolo 2: Evaluación del efecto de JM-20 sobre la pérdida de memoria inducida por cloruro de aluminio

Se investiga el efecto protector de dos dosis de JM-20 (2 y 8 mg/kg) sobre diferentes tipos de memoria afectados por la administración intraperitoneal aguda de escopolamina. Para ello se administró JM-20 desde los 15 días siguientes al inicio de la administración de cloruro de aluminio (500 mg/kg) hasta el final de los estudios de comportamiento. Se evalúo el efecto de JM-20 y cloruro de aluminio en tres tipos de memoria: memoria espacial mediante la prueba del laberinto de agua de Morris y la prueba del laberinto en T; reconocimiento de la novedad mediante la prueba de reconocimiento de objetos novedosos; y memoria emocional-asociativa mediante la prueba de evitación pasiva.

Se formaron 5 grupos experimentales de sujetos seleccionados al azar (n = 10, por grupo): grupo control sano (CMC y agua); grupo JM-20- no dañado (JM-20 8 mg/kg y agua); grupo aluminio (CMC y cloruro de aluminio 500 mg/kg); grupos JM-20-aluminio (JM-202 mg/kg y aluminio 500 mg/kg) y (JM-208 mg/kg y aluminio 500 mg/kg).

Tras la conclusión de los estudios de comportamiento, se llevaron a cabo diferentes estudios in vivo sobre tejido cerebral. Se estudió el efecto de JM-20 sobre diferentes marcadores de estrés oxidativo, la funcionalidad mitocondrial y los niveles de actividad de la enzima acetilcolinesterasa AchE.

Protocolo 3: Evaluación del efecto de JM-20 sobre el daño inducido por oligómeros peptídicos beta amiloide 25-35 Inicialmente se evalúo el efecto de JM-20 sobre la viabilidad celular de una línea de células PC12 sometidas a una concentración de 1 pM de oligómeros peptídicos beta amiloide 25-25. Esta prueba in vitro evaluó el efecto de 3 concentraciones de JM-20 (3.125, 6.25 y 12.5 uM) preparadas solubles en dimetilsulfóxido (DMSO). Se formaron 6 grupos de experimentos: grupo de control no tratado (NT); grupo de vehículo (DMSO); grupo beta amiloide (Ap 1 pM); grupos JM-20-beta amiloide (JM-203.125 Ap 1 pM), (JM-206.25 Ap 1 pM) y (JM-20 12.5 Ap 1 pM).

Posteriormente se realizaron estudios in vivo en ratones OF-1. Se evaluó el efecto de JM-20 sobre la pérdida de memoria inducida por oligómeros beta amiloides administrados 7 días después de la administración intracerebroventricular de Ap (100 pmol) durante 10 días, por vía oral en dosis de 10 y 30 mg/kg de peso. Se formaron 5 grupos de experimentos: grupo de control sano (Simulado); grupo JM-20 sin daños (Simulado JM-20 30 mg/kg); grupo beta amiloide (Ap 100 pmol CMC); grupos JM-20-beta amiloide (JM-20 10 mg/kg Ap 100 pmol) y (JM-2030 mg/kg Ap 100 pmol).

Estudios de comportamiento

Laberinto Y. Alternancia espontánea

El efecto de JM-20 sobre la memoria espacial se evaluó mediante la prueba de alternancia forzada del laberinto en Y (20). El laberinto fue construido de plástico con tres brazos (55 * 20 * 20 cm) en un ángulo de 120° sobre una plataforma central. La prueba se realizó en dos sesiones. En una primera fase de aprendizaje se llevó a cabo la fase de entrenamiento durante la cual se colocó a cada rata en la plataforma central y se le permitió explorar libremente los brazos (A y C) del laberinto durante 10 minutos mientras se mantenía cerrado el tercer brazo (B). Las entradas en cada brazo se consideraron entradas en las cuatro extremidades dentro de cualquiera de los brazos. La secuencia de entradas a los brazos durante 10 minutos fue videograbada para ser analizada posteriormente. La fase de evaluación consistió en permitir a las ratas explorar libremente los brazos del laberinto en Y durante 5 minutos, incluido el que había sido cerrado previamente. La secuencia de entradas en los brazos se grabó durante 5 minutos para su posterior análisis. Esta prueba evaluó el número de entradas en el nuevo brazo (B), donde el porcentaje de entradas en este brazo es directamente proporcional a una mejor memoria en los animales estudiados. El porcentaje de entradas correctas en el brazo B se calculó sobre la base de la proporción de alternancias realizadas a partir del total de alternancias posibles, como se muestra en la siguiente ecuación: % de entradas correctas = (número de entradas en B)/(total de entradas en los tres brazos) * 100. Después de cada prueba, se limpió el laberinto con una solución de etanol al 40 % para reducir la existencia de pistas olfativas.

Reconocimiento de objetos

El efecto de JM-20 en la memoria de objetos novedosos reconocidos se evaluó mediante la prueba de reconocimiento de objetos. Esta prueba se llevó a cabo en campo abierto durante 2 días consecutivos. El primer día los animales se adaptaron al campo, dejándoles explorar la caja durante 3 minutos, en 2 secciones. En el segundo día se realizó el entrenamiento con evaluación del aprendizaje por 2 etapas de 5 minutos cada una, en adelante tratadas como entrenamiento (E) y fase de prueba (P), respectivamente. Durante la etapa E, a las ratas se les presentaron 2 objetos idénticos, llamados objetos familiares (F). Después de 30 minutos, comenzó la etapa P y las ratas se expusieron al objeto familiar F y un objeto nuevo (N). Se registraron pruebas para analizar la exploración de los objetos, definida por el tiempo de exploración que toma cada animal para cada objeto. Las tasas de discriminación entre los objetos F y N se calcularon como ID = (N-F)/(N F).

Laberinto de agua de Morris

El Laberinto de agua de Morris se realizó según lo descrito por Vorhees y Williams (21) con algunas modificaciones, en un tanque circular (1.52 m de diámetro, 0.60 m de profundidad). Se llevaron a cabo 5 días de entrenamiento, 4 secciones por día y el día 6 fue para la evaluación del aprendizaje. Los animales debían aprender a ubicar una plataforma sumergida, fija en una posición inmutable, durante todas las secciones de entrenamiento. Se colocaron varias pistas externas y se mantuvieron en una posición fija durante todo el experimento. En cada sesión de entrenamiento, los animales se colocaron en el agua, de cara a la pared del tanque, en uno de los 4 sitios de salida, hasta que encontraron la plataforma en un tiempo máximo de 1 minuto. El día de la evaluación, se retiró la plataforma. Se cuantificaron la latencia de escape (el tiempo que el animal tardó en encontrar la plataforma) en las pruebas de entrenamiento, el tiempo que el animal permaneció en el cuadrante de la plataforma durante la prueba para la evaluación del aprendizaje y la distancia recorrida hasta que se encontró el sitio de la plataforma.

Evitación pasiva

La prueba de evitación pasiva se realizó en base a la metodología descrita por Kohara y colaboradores (22) con algunas modificaciones. Se usó un equipo de evitación pasiva (UGO Basile) compuesto por 2 cámaras, una iluminada (30 * 30 * 30 cm) y otra oscura (10 * 20 * 12 cm), unidas por una puerta de acceso en forma de guillotina. La cámara oscura estaba equipada con un circuito eléctrico.

La prueba se realizó en 2 etapas durante 2 días consecutivos. El primer día, cada rata se colocó en la cámara iluminada durante 10 segundos, luego se abrió la puerta entre las cámaras y se permitió que la rata explorara libremente durante un tiempo máximo de 90 segundos. Una vez que la rata había entrado en la cámara oscura, la puerta de acceso se cerró y la rata recibió una carga eléctrica de 1 mA durante 5 segundos. El segundo día se midió la latencia de entrada a la cámara oscura en un tiempo máximo de 300 segundos.

Estudios de funcionalidad mitocondrial

Aislamiento de las mitocondrias cerebrales

Las mitocondrias se aislaron mediante centrifugación diferencial. Los animales se sacrificaron por decapitación y sus cerebros se extrajeron inmediatamente, se cortaron en 50 mL de agente regulador de aislamiento que contenía sacarosa 75 mmol/L, EGTA 1 mmol//L, manitol 225 mmol/L, BSA 0.1 % y HEPES-KOH 10 mmol/L, pH 7,2, a 4 °C, y homogeneizado en un Potter-Elvehjen. La suspensión así obtenida se centrifugó a 2000 g durante 3 minutos y la materia flotante se centrifugó a 12000 g durante 8 minutos. El sedimento se volvió a suspender en 10 mL de agente regulador de aislamiento que también contenía 20 uL de digitonina al 10 % y este se centrifugó a 12000 g durante 10 minutos. El sedimento mitocondrial se suspendió en agente regulador de aislamiento sin EGTA, se centrifugó a 12000 g durante 10 minutos, se desechó la materia flotante y se lavó suavemente con agente regulador de aislamiento sin EGTA. Se usó el método microLowry para determinar la concentración de proteínas usando albúmina de suero bovino como patrón estándar (Mirandola et al., 2010). Las mitocondrias se incubaron en un medio de KCl 130 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L y HEPES-KOH, fosfato 2 mmol/L, pH 7.4. Las mitocondrias (1 mg de proteína/mL) se energizaron con 5 mmol/L y rotenona 2.5 pmol/L de succinato de potasio.

Potencial de membrana mitocondrial

El potencial de membrana mitocondrial se determinó usando un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania) y usando el marcador fluorescente de safranina O (10 j M) en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania) a 495/586 nm (excitación/emisión).

Inflamación mitocondrial

El hinchamiento mitocondrial se controló por la disminución de la absorbancia aparente a 540 nm de la suspensión de mitocondrias incubadas en un medio estándar, en presencia de Ca2+ 200 jmol/L y usando un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania).

Producción de especies reactivas de oxígeno

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se determinaron mediante espectrofluorometría usando rojo Amplex (Molecular Probes, OR, Eugene) como marcador fluorescente y 1 ul/ml de peroxidasa de rábano picante a 563/587 nm (excitación/emisión).

Preparación de tejido cerebral para pruebas de estado enzimático y redox.

Las ratas se sacrificaron por decapitación; sus cerebros fueron extraídos y disecados rápidamente para separar 2 regiones, el hipocampo y la corteza prefrontal de ambos hemisferios cerebrales (23). Estas regiones se homogeneizaron en solución de agente regulador de fosfato de sodio (0.1 mM, pH 7.4: NaCl 0.13 M, KCI 0.0027 M, KH²PO⁴ 136.04 M, Na²HPO⁴0.0016 M) en una proporción de 1:10 (p: v), y se centrifugaron a 6,000 g durante 20 minutos en una centrífuga Eppendorf (Alemania, 5424R). Las proporciones del homogeneizado de las estructuras cerebrales se conservaron a -80 °C hasta su uso. Su concentración de proteínas se determinó por el método Lowry (24) en un POLARstar Omega (Alemania), usando como referencia albúmina de suero bovino.

Actividad de la acetilcolinesterasa (AChE)

La actividad de la enzima AChE presente en el homogeneizado del hipocampo extraído y las cortezas prefrontales se midió espectrofotométricamente usando el método descrito por Ellman (25) con ligeras modificaciones (26). La prueba se llevó a cabo en una hoja de 96 pocillos con un volumen final de 200 j L. El medio de reacción contenía 140 j L de reactivo de Ellman, 50 j L de homogeneizado y 10 j L de solución de yodato acetiltiocolina (AcSCh) 20 mM y se incubó durante 1 minuto a 37 °C. La absorbancia se leyó a 405 nm durante 20 minutos con intervalos de 1 minuto en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania). La actividad enzimática se calculó y expresó como jmoles de (AcSCh) hidrolizado en un minuto por mg de proteína.

Estudio del estado redox y parámetros de daño oxidativo

Actividad de superóxido dismutasa (SOD)

La actividad de la enzima SOD se determinó mediante el método de oxidación de pirogalol (27). La mezcla de reactivos estaba compuesta por una solución de 2.8 mL de Tris 0.2 M - HCl 0.2 M (pH 8.2), 0.05 mL de EDTA 60 mM, 0.1 mL de homogeneizado y 0.05 mL de solución de pirogalol 7.37 mM. La absorbancia se leyó en 420 nm durante 1 minuto en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania). Los resultados se expresaron como unidades de actividad enzimática por mg de proteína, considerando 1 unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 jm ol de sustrato en un minuto.

Actividad de catalasa (CAT)

La actividad de la enzima CAT se determinó sobre la base de la descomposición del peróxido de hidrógeno (H²O²) (28). La mezcla de reactivos estaba compuesta por 0.9 mL de agente regulador de fosfato (pH 7.0), 0.1 mL de homogeneizado de tejido cerebral y 0.5 mL de H2O2(50 mM). La absorbancia se leyó a 240 nm, a los 10 y 70 segundos, en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania). Los resultados se expresaron como jmoles de H²O² descompuesto por minuto por mg de proteína.

Niveles de glutación reducida (GSH)

Los niveles de GSH se estimaron siguiendo la metodología descrita por Ellman (29), con algunas modificaciones. En una bandeja agregamos 0.375 mL de agente regulador de fosfato (50 mM, pH 8.0), 0.1 mL de homogeneizado y 0.025 mL de una solución de ácido 5.5'-ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB)/acetona (0.6 mM). La absorbancia se leyó en 412 nm, en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania). Los resultados se calcularon usando el coeficiente de extinción molar del cromofor formado (1.36 * 104 (mol/L)'1cirr1. Los resultados se expresaron como GSH nmol por mg de proteína.

Niveles de peroxidación lipídica

Los niveles de peroxidación lipídica se cuantificaron detectando malondialdehído (MDA) formado a partir de la reacción con ácido tiobarbitúrico (30). El medio reactivo se formó con 350 j L de una mezcla de ácido tricloroacético: ácido úrico tiobarbitúrico: ácido clorhídrico, 100 j L de homogeneizado de tejido cerebral y 50 j L de di-ter-butilhidroxitolueno (BHT). La mezcla se homogeneizó en un vibro-agitador TALBOYS (EE. UU.) y se colocó durante 5 minutos en un baño de agua con termostato Grant OLS200 (EE. UU.) A 100 °C. Posteriormente se centrifugó a 3,000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Eppendorf (Alemania, 5424R). El MDA formado como producto de la peroxidación lipídica en el tejido cerebral reacciona con el ácido úrico tiobarbitúrico y produce un compuesto coloreado que se determinó por espectrofotometría a 535 nm en un espectrofotómetro de fluorescencia POLARstar Omega (Alemania). La concentración de MDA se calculó teniendo en cuenta el coeficiente de extinción molar del compuesto coloreado formado (1.56 * 105 M-1 cm-1) y dependiendo de la siguiente ecuación:

C= D.0 x104nM

1.56

donde C es la concentración de MDA que se va a determinar y D.O es la absorbancia detectada. Los resultados se expresaron como nanomol de MDA por mg de proteína.

Estudio histológico

La evaluación histológica de las lesiones causadas por la administración intraperitoneal aguda de escopolamina se realizó en regiones del hipocampo y corteza prefrontal. Se usó el Atlas de Paxinos y Watson (31) con la descripción anatómica del cerebro de rata para identificar cada región cerebral y se procesaron para tintura de hematoxilina y eosina (HE) en cortes de corona de 4pm de espesor, tomando siempre los primeros tres cortes de cada región. Ambos hemisferios se observaron en un microscopio óptico Leica (Microsystems, Alemania). Se evaluó el daño neuronal en las zonas CA1, CA2, CA3 y se consideraron marcadores de degeneración la circunvolución dentada del hipocampo y la atrofia, la picnosis nuclear, la coloración oscura del citoplasma o la ausencia de neuronas. Además, se calculó el daño axonal específicamente en base a la aparición de axones parcial o totalmente desmielinizados, así como la atrofia axonal y se expresó como un porcentaje del total de axones presentes en cada portaobjetos o en cada región estudiada. Realizando el análisis de daño histológico a nivel de la corteza prefrontal, se contó el número promedio de neuronas y axones afectados en las tres áreas fijas de cada hemisferio cerebral y se expresó como porcentaje de neuronas/axones dañados respecto al total en cada área.

Análisis estadístico

Para el procesamiento estadístico y el análisis de los resultados obtenidos se usó el programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., EE. UU.). Los datos se expresaron como la media ± EEM (error medio estándar) y se verificó su normalidad y homocedasticidad. Se realizó análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA), seguido del Test de Tukey para comparaciones múltiples para realizar comparaciones entre los diferentes grupos experimentales. Un valor de p <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Los resultados se muestran en las figuras 9 a 14.

La figura 9 muestra los efectos de JM-20 sobre la memoria espacial a corto y largo plazo, particularmente en los procedimientos de adquisición y consolidación. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 7, por grupo) del porcentaje de alternancia espontánea. Para el análisis estadístico se realizaron ANOVA y pruebas de comparación múltiple de Tukey. Letras diferentes se diferencian entre sí para p <0.05.

La figura 10 muestra los efectos de JM-20 sobre la disfunción mitocondrial del tejido cerebral en ratas tratadas con escopolamina, después de completar los estudios de memoria a corto plazo. Las diferentes dosis de JM-20 se administraron por vía oral 1 hora antes de la administración de la escopolamina. Se aislaron mitocondrias cerebrales 1 hora después de la administración de la escopolamina y se evaluó el potencial de membrana (A), generación de H²O² (B), hinchazón mitocondrial (C) y entrada de calcio a las mitocondrias (D). Las barras representan la media ± EEM (n = 10). Letras diferentes muestran las diferencias entre grupos: p <0.05, por ANOVA y Tukey post hoc. (A): ***, p = 0.0009, (B): **, p = 0.0034 con respecto al grupo vehículo/escopolamina 1 mg/kg, por ANOVA y grupo de Tukey post hoc.

La figura 11 muestra el efecto de JM-20 sobre la disfunción mitocondrial del tejido cerebral en ratas tratadas con escopolamina después de completar los estudios de memoria a largo plazo. Las diferentes dosis de JM-20 se administraron por vía oral 1 hora antes de la administración de la escopolamina. Las mitocondrias cerebrales se aislaron 24 horas después de la administración de la escopolamina y se evaluó el potencial de membrana (A), generación de H²O² (B) e hinchazón mitocondrial (C). Las barras representan la media ± EEM (n = 10). ***, p <0.001; **, p <0.01 y *, p <0.05 con respecto al grupo vehículo/escopolamina 1mg/Kg, por ANOVA y Tukey post hoc.

La figura 12 muestra el efecto de JM-20 sobre la pérdida de diferentes tipos de memoria inducida por el aluminio. A) Prueba de reconocimiento de objetos nuevos, memoria de reconocimiento de objetos nuevos; B) Prueba de evitación pasiva, memoria emocional-asociativa; C) Prueba de laberinto en Y, memoria de trabajo espacial; D) Memoria de referencia espacial de laberinto de agua de Morris. Las barras representan la media ± EEM. Letras diferentes muestran diferencias entre grupos: p <0.05, por ANOVA y Tukey post hoc. ***, p <0.001; **, p <0.01 y *, p <0.05 comparación con respecto al grupo tratado con aluminio 500mg/Kg, por ANOVA y grupo de Tukey post hoc.

La figura 13 muestra el efecto de JM-20 sobre el daño a la viabilidad celular producido por oligómeros peptídicos beta amiloide 25-35.

La figura 14 muestra cómo JM-20 revierte la pérdida de memoria inducida por oligómeros peptídicos beta amiloide 25­ 35. Se administró JM-20 7 días después de la administración del beta amiloide. Las barras representan la media ± EEM; la comparación se realiza en el grupo tratado con beta amiloide ***, p <0.001; **, p <0.01 y *, p <0.05 por ANOVA y grupo de Tukey post hoc.

Demencia vascular

Como modelo de demencia vascular, los animales (ratones albinos machos suizos) se sometieron a oclusión transitoria de las arterias carótidas comunes durante 20 minutos y se evaluó el deterioro cognitivo mediante la prueba del laberinto de agua de Morris.

Los resultados se muestran en la figura 15.

La figura 15 muestra los efectos de JM-20 sobre el deterioro cognitivo inducido por la oclusión transitoria de las arterias carótidas comunes de ratas. A los animales se les administraron dosis orales de 4 mg/kg, 1 después de la reperfusión. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 8, por grupo). Para el análisis estadístico se realizó ANOVA y pruebas de comparación múltiple de Tukey, *p<0.01, representa diferencias significativas con respecto a los animales isquémicos sin tratamiento n.

Lesiones unilaterales de la sustancia negra pars compacta por inyección de 6-hidroxidopamina Materiales y métodos

Animales de experimentación

Se usaron ratas Wistar macho adultas, con un peso entre 200 y 250 gramos al inicio del experimento, provenientes del National Laboratory Animal Production Center (CENPALAB), La Habana, Cuba. Los animales se mantuvieron en el Center for the Research and Development of Medicines (CIDEM) en cajas plásticas translúcidas a una temperatura promedio de 23 °C (22 ± 2 °C), con suministro adlibitum de agua y alimentos y períodos de 12 horas de luz y oscuridad.

Consideraciones éticas

En este estudio se respetaron las normas establecidas en el código de ética para experimentos con animales. Se garantizó la autenticidad genética de los animales adquiriéndolos en centros de cría reconocidos. Este procedimiento evita el uso de animales contaminados genéticamente. Desde un punto de vista biológico, la importancia de la calidad genética para la investigación radica en el hecho de que los resultados del experimento se pueden reproducir en cualquier otro lugar donde puedan repetirse y desde el punto de vista ético asegura que se necesite usar el menor número de animales.

Durante la investigación, los animales se mantuvieron en las mejores condiciones de alojamiento posibles. Se mantuvieron a temperaturas de 23 °C, por lo que se encuentran dentro del intervalo de compromiso establecido para las zonas tropicales (22 ± 2C). El control de la temperatura es importante si se tiene en cuenta que las altas temperaturas provocan estrés en los animales y temperaturas superiores a los 38 °C pueden provocar su muerte. Los períodos de luz y oscuridad a los que estuvieron expuestos duraron 12 horas ya que la fotoperiodicidad controla directa y/o indirectamente los ritmos circadianos, bioquímicos y hormonales.

Administración del compuesto

JM-20 se administró en 3 dosis diferentes: 10, 20 y 40 mg/Kg, 24 horas después de inducir el daño y diariamente durante 7 días. El compuesto se preparó en carboximetilcelulosa (CMC) al 0.05 %, por vía intragástrica con una cánula. Había 5 grupos de experimentación: Grupo I (vehículo/solución salina con ácido ascórbico, n = 6), Grupo II (animales afectados con 6-OHDA, n = 8), Grupo III (animales afectados con 6-OHDA y cotratados con 10 mg/kg de JM-20, n = 8), Grupo IV (animales afectados con 6-OHDA y cotratados con 20 mg/kg de JM-20, n = 8) y Grupo V (animales afectados con 6-OHDA y cotratados con 40 mg/kg de JM-20 n = 8). Todos los estudios de comportamiento se realizaron a los 7 días.

Procesamiento de datos

Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete GraphPadPrism Version.5.01.2007. Los resultados indican la media ± SEM del porcentaje de vitalidad en comparación con las células de control no tratadas. En todos los casos se realizó análisis de varianza (ANOVA de un factor) seguido de la prueba de Dunet (GraphPadPrism 5) para determinar diferencias significativas con un nivel de significación de p <0.05 (*), p <0.01 (**) y p <0.001 (* **) con respecto a un control usado en el experimento. Para comparar todos los valores obtenidos en el experimento con varios controles y entre sí, se realizaron la prueba de Tukey (GraphPadPrism 5), con un nivel de significación de p <0.05 (*), p <0.01 (**) y p <0.001 (***).

Métodos de lesión en modelos experimentales diseñados para ratas

Lesiones unilaterales de la sustancia negra pars compacta por inyección de 6-hidroxidopamina en ratas

Con el fin de proceder a la denervación dopaminérgica unilateral del cuerpo estriado (hemisferio derecho), las ratas se anestesiaron con hidrato de cloral [0.4 g/kg de peso, i.p., Merck (Darmstadt, Alemania)] y se colocaron en un marco diseñado para cirugía estereotáctica (Stoelting Instruments, EE. UU.), donde se inyectaron en el lado derecho sustancia negra pars compacta con solución salina neurotoxina 6-OHDA-HBr (8|jg/3|jL, que también contiene 0,2 mg/ml de ácido ascórbico como antioxidante) (Pavón Fuentes, Nancy (2007) Efecto de la inactivación de los receptores dopaminérgicos D2 y de la manipulación del núcleo subtalámico sobre la conducta motora en modelos de hemiparkinsonismo en roedores. Doctor en Ciencias de una Especialidad, Universidad de Ciencias Médicas de La Habana). Las coordenadas se calcularon tomando Bregma como punto de referencia de acuerdo con el Paxinos and Watson Atlas [Paxinos,G. and Watson,C., The rat brain in stereotaxic coordenates.2nd the Academic Press. New York, 1986], mencionado en la tabla 1.

Tabla 1. Coordenadas estereotáxicas expresadas en mm con respecto a Bregma (excepto el DV que se refiere a la superficie dural)

Una vez en su lugar, la neurotoxina se inyectó lentamente a una velocidad de flujo de 1 jl/min, con una jeringa Manilton (3 jl), permaneciendo in situ durante 5 min. una vez finalizada la inyección.

IV. Pruebas de comportamiento

A. Prueba de cilindros

En esta prueba se colocaron ratas dentro de un cilindro acrílico transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de alto que no permitía que el animal alcanzara el borde. La forma cilindrica favorece el comportamiento innato de exploración vertical de la pared con sus extremidades posteriores cuando las ratas fueron colocadas en un sitio que no conocían.

(Chan, H.,Paur,H.,Vernon,A.C.,Zabarsky,V.,Datla,K.P.,Croucher,M.J.,Dexter,D.T., 2010. Neuroprotection and functional recovery associated with decreased microglial activation following selective activation of mGluR2/3 receptors in a rodent model of Parkinson's disease. ParkinsonsDis.pii,190450). Después de la colocación del animal, se cuantifica el número de toques realizados por el animal con ambas patas delanteras, la derecha o la izquierda, hasta un total de 20 toques por animal en la pared del receptor.

Los animales afectados unilateralmente con 6-OHDA tienden a usar en menor medida la pata contralateral a la afectación, en este caso la pata izquierda. El porcentaje de asimetría que presenta cada animal se cuantifica mediante la siguiente fórmula (Roof Rl , Schielke GP, Ren X, Hall ED (2001) A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats. Stroke 32: 2648-2657).

Actividad exploratoria

Para evaluar la actividad exploratoria vertical de los animales se usa la prueba de actividad exploratoria; el animal se coloca en un cubículo de plexiglás transparente, 41 * 41 * 33 (h) cm, (UGO BASILE, MultipleActivityCage Cat. No.

47420. Data output is managed by 52050-04 Data Acquisition Software Package (Windows® based). El cubículo se apoya sobre una base robusta fabricada en plexiglás negro que cuenta con 4 barras verticales de acero con ranuras de acero para que los sistemas de detección horizontal/vertical estén correctamente fijados. Los sensores son sistemas de emisión de luz IR capaces de registrar los movimientos de los animales por formas, o más bien por exploración vertical. Los datos se controlan en un ordenador. Los animales se colocan en el centro de la caja para que puedan explorarla. La caja se coloca en una habitación aislada del investigador y del ruido ambiental y con poca iluminación, por un período de 5 minutos. El investigador toma la cantidad de veces que el animal explora verticalmente las paredes de la caja, cuando los rayos de luz del sensor en la caja se interrumpen (Cools, A. R., R. Brachten, D. Heeren, A. Willemen, and B. Ellenbroek, 1990. Search after neurobiological profile of individual-specific features of Wistar rats. Brain Res. Bull. 24: 49-69).

Los resultados se presentan en la figura 16.

La figura 16 muestra el efecto neuroprotector de JM-20 sobre el daño inducido por 6-OHDA en ratas Wistar macho después de 7 días de tratamiento. (A) reducción del % de asimetría (prueba del cilindro), los animales tratados con JM-20 mostraron una disminución del daño motor en comparación con los animales dañados sin tratamiento. (B) mayor uso de la pata contralateral al daño y (C) valores normales del uso de la pata ipsilateral (50 % ~), en animales dañados y tratados con ambas dosis de JM-20 (40 y 20 mg/Kg). (D) Los animales tratados con JM-20 aumentaron su exploración vertical, siendo estadísticamente diferente a la dosis de 40 mg/kg en lo que respecta a los animales dañados no tratados.

Dolor tónico

Se estudió el efecto de JM-20 (10, 20, 40 mg/kg, p.o.) sobre los comportamientos relacionados con el dolor en un modelo de dolor tónico (prueba de formalina al 5 %) en ratas. (Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine and brain-stem stimulation in rats and cats. Pain 1977;4:161-174).

Los resultados se presentan en las figuras 17A, 17B y 18.

La figura 17A muestra los efectos de JM-20 (10-40 mg/kg, 10 mL/kg, p.o.), diazepam 10 mg/kg o vehículo (CMC, 0.05 %) sobre el comportamiento de lamer/morder después de inyectar formalina al 5 % en la superficie plantar de la pata de rata. Los datos se presentan como la media acumulativa del tiempo de lamer/morder ± Ee M durante la Fase I (0-5min), Latencia (5-15min) y Fase II (15-45min) o la prueba de formalina, n=7 por grupo, *** p<0.001 representa diferencias significativas con respecto al grupo de control tratado con el vehículo (ANOVA para una ruta seguida por Dunnett a posteriori).

La figura 17B muestra la evolución temporal del efecto de JM-20 (10-40 mg/kg, 10 mL/kg, p.o.), diazepam 10 mg/kg o vehículo (CMC, 0.05 %) sobre el comportamiento de lamer/morder después de la inyección de formalina al 5 %. en la superficie plantar de la pata de la rata. Los datos se presentan como la media del tiempo de lamer/morder (/ 5 min/seg) ± EEM durante los 45 minutos de la prueba, n=7 por grupo.

La figura 18 muestra la influencia del tratamiento previo de los animales con flumazenil (10 mg/kg, i.p.) sobre el efecto antihipernociceptivo de JM-20 en la Fase II del ensayo de formalina al 5 %. Cada columna representa el tiempo de reacción de 6-10 animales por grupo como la media ± EEM, * P <0.05, *** P <0.001 representa las diferencias estadísticas entre los grupos tratados y de control (solo vehículo), ■■■■P <0.05 representa diferencias estadísticas entre los grupos tratados con diazepam en presencia o ausencia de flumazenil, t P <0.05 representa diferencias estadísticas entre los grupos tratados con JM-20 en presencia o ausencia de flumazenil.

Dolor neuropático

Se estudió el efecto de JM-20 sobre la constricción crónica del modelo del nervio ciático (CCI), un modelo NP (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365)

Los resultados se presentan en la figura 19-23.

La figura 19 muestra los efectos de JM-20 (20 mg/kg, 10 mL/kg, p.o.) o el vehículo (CMC, 0.05 %) sobre la alodinia mecánica en la pata ipsilateral de las ratas CCI 14 días después de la cirugía, determinada midiendo la respuesta de retirada de la pata con estimulación de filamentos de von Frey. Los datos se presentan como la media ± e Em del 50 % del umbral de respuesta, n = 7 por grupo. Letras diferentes representan diferencias significativas entre los grupos (ANOVA para una ruta seguida por Bonferronni's a posteriori).

La figura 20 muestra los efectos de JM-20 (20/kg, 10 mL/kg, p.o.) o vehículo (CMC, 0.5 %) sobre la intensidad de la hipernocicepción mecánica de las patas ipsilaterales de ratas CCI determinadas midiendo la respuesta de retirada de la pata cuando se estimula con electrónica von Frey. Los datos se presentan como la media ± EEM de la diferencia de umbral (A) para la abstinencia en gramos calculada sobre la base de restar la media de las tres mediciones de diferentes intervalos de tiempo de la media de las tres mediciones de tiempo 0, n = 7 por grupo **p<0.01 representa diferencias significativas con respecto al grupo de control tratado con el vehículo, #p <0.05 representa diferencias significativas con respecto al grupo simulado CCI (ANOVA para una ruta seguida por Bonferronni's a posteriori).

La figura 21 muestra los efectos de JM-20 (20mg/Kg, 10mL/Kg, p.o.) o vehículo (CMC, 0.05 %) sobre la hipernocicepción mecánica a presión constante en las patas mediante una modificación a la prueba clásica Randal Selito o SH Ferreira. Los datos se presentan como la media ± EEM de la diferencia (A) del tiempo de reacción calculado restando la medición de los diferentes intervalos de tiempo de la medición del tiempo 0, n = 7 por grupo *p<0.05 representa diferencias significativas con respecto a la grupo de control tratado con el vehículo, ## p<0.01 representa diferencias significativas con respecto al grupo simulado CCI (ANOVA para una ruta seguida por Bonferronni's a posteriori).

La figura 22 muestra los efectos del tratamiento con JM-20 (20 mg/kg, p.o.) a dosis repetidas durante 7 días a partir del día 7 post-CCI sobre los cambios histológicos inducidos por CCI (degeneración walleriana) a los 14 días después de la cirugía. A, B y C muestran la sección longitudinal del nervio ciático 5 mm distal a la lesión en ratas CCI Simulado, CCI tratadas con JM-20 y tratadas con vehículo respectivamente (coloración H/E). Se puede observar el aumento de la celularidad en los animales CCI relativamente en comparación con los animales operados de forma simulada como resultado de la proliferación de células de Schawann y la infiltración de macrófagos y la pérdida de una alineación ordenada de los axones asociados a sus vainas de mielina en comparación con las CCI simuladas. La flecha indica una de las muchas cámaras de digestión de las células de Schawann que contienen un ovoide de mielina (masa ovalada rojiza). D, E, F muestran secciones de los mismos animales pero están coloreadas con la técnica luxol fast blue (LFB), una técnica específica para la tintura de mielina. B y E: reducción de la desorganización de las fibras nerviosas inducida por CCI y aumento del número de células y degradación de las vainas de mielina en animales tratados con JM-20, particularmente este último efecto especificado en E.

La figura 23 muestra los efectos de JM-20 (20 mg/kg, 10 mL/kg, p.o.) o vehículo (CMC, 0.05 %) sobre las concentraciones espinales de nitratos como indicador de las concentraciones de óxido nítrico. Los datos I presentados como la media ± EEM, n=7 por grupo, *** p<0.001 representa diferencias significativas con respecto al grupo de control tratado con el vehículo, ### p <0.001 representa diferencias significativas con respecto al grupo simulado CCI (ANOVA para una ruta seguida por Bonferronni's a posteriori).

Peritonitis inducida por carragenina

Posteriormente se diseñan diferentes experimentos en el modelo de peritonitis inducida por CA en roedores con el fin de explorar la posible actividad antiinflamatoria de JM-20 en estas condiciones.

Los resultados se muestran en las figuras 24A-E.

La figura 24 muestra los efectos de JM-20 (20 mg/kg, 10 mL/kg, p.o.) o vehículo (CMC, 0.05 %) sobre la respuesta inflamatoria peritoneal inducida por carragenina (500 pg/cavidad) en ratas. A. El enrollamiento de leucocitos y B su adhesión al endotelio vascular en el mesenterio se determinó mediante microscopio intravital 4 horas después de la inducción de la inflamación. C. Se determinó la migración de leucocitos hacia la cavidad peritoneal y D. la permeabilidad vascular (pg/mL) 4 horas después de la CA. E. Efectos sobre las concentraciones del factor de necrosis tumoral (TNFa) en el líquido peritoneal 4 horas después de la inyección de carragenina. Los datos se presentan como la media ± EEM, n = 6 por grupo, *p<0.05, **p<0.01 representa diferencias significativas con respecto al grupo de control tratado con el vehículo,, ### p <0.001, ## p <0.01 representa diferencias significativas con respecto al control con suero fisiológico intraperitoneal (ANOVA para una vía seguida de Newman-Keuls o Bonferronni's a posteriori en cada caso respectivo).

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula III

, sus sales, hidratos, formas cristalinas o enantiómeros para su uso en un método de tratamiento de la demencia, la enfermedad de Parkinson o el dolor.

2. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que la demencia es la enfermedad de Alzheimer o la demencia vascular.

3. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que el dolor es un dolor neuropático.