CN110114356B

CN110114356B - 具有对中枢神经系统和血管系统的活性的苯并二氮卓衍生物

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Publication number: CN110114356B
Application number: CN201780041572.6A
Authority: CN
Inventors: Y·努奈兹菲古莱多; M·沃恩格古拉; L·A·弗恩塞卡弗恩塞卡; B·B·加里多萨莱兹; J·拉密莱兹桑契兹; G·L·帕尔多安德莱尤; Y·维尔德希亚雷耶斯; E·奥乔亚罗德里格兹; P·G·巴尔扎加费尔南德斯; N·冈萨雷斯阿方索; R·德尔加多埃尔南德斯; A·S·帕德龙雅奎斯
Original assignee: Universidad de la Habana; Centro de Investigacion y Desarrollo de Medicamentos CIDEM
Current assignee: Universidad de la Habana; Centro de Investigacion y Desarrollo de Medicamentos CIDEM
Priority date: 2016-05-04
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: CL2018003113A1; CN110114356A; BR112018072588B1; NZ748959A; ZA201808162B; CA3023105A1; SI3470414T1; AU2017259748A1; EP3470414B1; KR20210025137A; WO2017190713A1; US20190270738A1; CA3023105C; EA201892461A1; SG11201809845TA; CU20160058A7; US11098039B2; JP2019519600A; AR108369A1; KR102428383B1

Abstract

本发明涉及式(III)的化合物、其衍生物和包含其的药物组合物，用于治疗中枢神经系统和血管系统疾病，特别是具有认知衰退的神经变性病症、与氧化应激相关的疾病、与线粒体功能障碍相关的疾病、帕金森病和神经性疼痛，以及与老化相关的病理学过程。

Description

具有对中枢神经系统和血管系统的活性的苯并二氮卓衍生物

发明领域

本发明涉及神经变性疾病或与认知衰退、与不希望的氧化相关的疾病或与老化相关的病理学过程的预防和/或治疗。

神经变性是许多神经系统疾病和病症例如痴呆、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和神经性疼痛(NP)的共同主题。这些疾病是破坏性的并且其处理是昂贵的，而目前的治疗是不充分的。这些与年龄相关的疾病的发生率由于正在发生的人口统计学变化而迅速增加的事实增加了该问题的急迫性。

世界人口的逐渐老化必然导致神经变性疾病和老年痴呆增加的不希望结果。在全世界，估计4680万人忍受痴呆。估计该数字每20年增加至几乎两倍；2030年7470万和2050年1亿3150万。痴呆还具有巨大的经济影响。今天，痴呆的估计的全世界花费为8180亿USD，并且在2018年将是万亿美元的疾病，对患者和其亲属和照顾者的生活质量都具有巨大的影响(Alzheimer's Disease International.World Alzheimer Report 2015.London:Alzheimer's Disease International；2015)。

在所有这些中，AD是最普遍的，具有大约3千5百万患病的人并且估计其发病率在即将到来的三十年内将显著增加，与人口的平均年龄的增加同时地(Reitz,C；Brayne,C；Mayeux,R.Epidemiology of Alzheimer disease.Nat.Rev.Neurol.,2011,7,137-152)(Reitz,C；Mayeux,R.Alzheimer disease:Epidemiology,diagnostic criteria,riskfactors and biomarkers.Biochem.Pharmacol.,2014,88,640-651)。

AD是脑的神经变性病症，其导致缓慢进展的记忆和认知功能缺失，经常伴随有行为的改变，例如进攻和抑郁(Querfurth,H.W.；LaFerla,F.M.Alzheimer'sdisease.N.Engl.J.Med.,2010,362,329-344)。在其最后阶段，患者处于卧床、失禁并且依赖于照顾和守护，这对家庭是非常昂贵的。死亡发生于，作为平均值，诊断之后9年(CitrónM.(2004).Strategies for disease modification in Alzheimer's disease.Nat RevNeurosci.5(9):677-85)。患有该疾病的人数巨大并且需要不断的照顾和其他服务，严重地影响了医疗、货币和人力资源(Suh Y.H.和Checler F.(2002).Amyloid precursorprotein,presenilins,and alpha-15synuclein:molecular pathogenesis andpharmacological applications in Alzheimer's disease.Pharmacol Rev.54(3):469-525)。因此，这构成了增长的医学担忧。

AD是以可归因于联合皮质区的参与的与吞咽困难(其中具有谈话和谈话理解力衰退的语言病症)、运动障碍(在不存在运动衰退下协调和完成某些运动和有意的姿势的失能)和失认症(识别物体、人、声音、形状或颜色的无能)联合的记忆缺失为特征的皮质性原型痴呆(Crook R.等人.(1998).A variant of Alzheimer's disease with spasticparaparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9of presenilin 1.NatMed.4(4):452-5)(Houlden H.,Baker M.,等人.(2000).Variant Alzheimer's diseasewith spastic 5paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1mutationsthat lead to exceptionally high amyloid-beta concentrations.Ann Neurol.48(5):806-8)(Kwok J.B.,Taddei K.,等人.(1997)Two novel presenilin-1mutations inearly-onset Azheimer's disease pedigrees and preliminary evidence forassociation of presenilin-1mutations with anovel phenotype.Neuroreport.8(6):1537-42)(Verkkoniemi A.,Kalimo H.,等人.(2001).Variant Alzheimer disease withspastic paraparesis:neuropathological phenotype.J Neuropathol Exp Neurol.60(5):483-92)。

虽然该疾病是多因素的和异质的，但是它具有一些共同特征，即胆碱能神经元的大量丧失、神经原纤维缠结和β-淀粉样蛋白聚集体的沉积(Huang,Y.；Mucke,L.AlzheimerMechanisms and Therapeutic Strategies.Cell,2012,148,1204-1222)。

AD的化学病理学显示与PD的许多相似性：氧化应激、线粒体复合物I活性的降低、脂质过氧化的增加。这些相似性还包括疾病的渐进性质、濒死神经元周围的反应性小神经胶质细胞的增殖、氧化应激和炎症过程。

尽管有药物工业所进行的巨大投资，但只有对于AD的很少的，事实上没有任何有效的治疗。

目前遵循了不同的策略以便获得用于治疗疾病的新药物，既然已看到目前批准的药物对患者提供很少的益处。这些药物暂时延缓了(一年，在最好的情况下)疾病的一些症状但不阻止其发展。

虽然开始AD仅与胆碱能不足相关，但已证实其他神经递质例如多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和谷氨酸在AD中减少或失调。目前，在AD的发病学中研究最多的神经递质系统为胆碱能和谷氨酸能(Palmer,AM；Gershon,S.Is the neuronal basis of Alzheimer'sdisease cholinergic or glutamatergic？FASEB J 1990,4,2745-52)。

AD目前的治疗选择基于用药物例如多奈哌齐、加兰他敏或利凡斯的明抑制乙酰胆碱酯酶，或基于美金刚拮抗谷氨酸，NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体的能力。由于这些药物的很少的成功，已展开了新的研究路线(Bartus,RT,Dean,RL 3rd；Beer,B；Lippa,AS Thecholinergic hypothesis of geriatric memory disfunction.Science 1982,217,408-14)(Terry,A.V.Jr.；Buccafusco,J.J.The cholinergic hypothesis of age andAlzheimer's disease-related cognitive déficits:recent challenges and theirimplications for novel drug development.J.Pharmacol.Exp.Ther.,2003,306,821-827)(van Marum,R.J.Current and future therapy in Alzheimer'sdisease.Fundam.Clin.Pharmacol.,2008,22,265-274)。

根据AD的胆碱能假设，中枢神经系统(CNS)中胆碱能功能的丧失明显地贡献于与AD相关的认知功能障碍(Bartus,R.；Dean,R.；Beer,B.；Lippa,A.The cholinergichypothesis of geriatric memory dysfunction.Science,1982,217,408-414)。此外，尽管胆碱能耗竭、淀粉样蛋白生成和Tau磷酸化之间的关系是复杂的，但看起来胆碱能减少可以增加β-淀粉样蛋白的产生并可以诱导Tau蛋白的磷酸化。另一方面，AD的谷氨酸假设提出了与谷氨酸相关的兴奋性毒性机制涉及导致变性和细胞死亡的NMDA受体(Bleich S,RomerK,Wiltfang J,Komhuber J.Glutamate and the glutamate receptor system:a targetfor drug action.Int J Geriatr Psychiatry 2003,18,S33-40)。通过NMDA受体的突触刺激对于学习和记忆的功能是重要的，但是过量的谷氨酸可以引起兴奋性毒性和神经变性(Michaels RL,Rothman SM Glutamate neurotoxicity in vitro:antagonistpharmacology and intracelular calcium concentrations.J Neurosci 1990 10,283-92)。在该背景下，治疗策略应当对两个系统都施加障碍，通过组合能够改善胆碱能神经张力的AChE酶抑制剂与能够对抗由谷氨酸诱导的神经变性的NMDA受体拮抗剂。然而，该治疗组合具有一些缺点。除了面对分开的两种药物的施用外，这意味着对于患有AD的老年患者和照顾他们的人的额外的问题，各自药物的不同代谢动力学可以影响不同的药物效应动力学。在实践中，诊所将面对具有两种不同的ADME(施用、分布、代谢、排泄)曲线的组合疗法的施行。

对两种药物治疗的组合的备选和革新的方法为可以作用于多个药物靶标的药物，即所谓的多靶标药物(MTD)。

用单一化合物同时作用于两种或多种蛋白质的策略可以提供优良的治疗效果(Cavalli A,Bolognesi ML,Minarini A,Rosini M,Tumiatti V,Recanatini M,Melchiorre C.Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerativediseases J Med Chem 2008,51,347-72)(Zimmerman GR,Lehar J,Keith CT.Multi-target therapeutics；when the whole is greater than the sum of the parts.DrugDiscov Today 2007,12,34-42)(Morphy R,Ranlovic,Z.Fragments,network biology anddesigning múltiple ligands.Drug Discov Today 2007,12,156-60)。这可以用由使用MTD对“混合物”或多组分药物所提供的潜在益处的数目来解释。MTD相对于“混合物”的优点可以汇总如下：1)减少临床发展中的不确定性，既然预测单一化合物的药物代谢动力学比用”混合物”的简单得多，克服了不同的生物可利用性、药物代谢动力学和代谢的问题；2)药物效应动力学中的安全性；3)归因于抑制多个治疗靶标的协同效应的增加的效力；4)增加的安全性，通过减小消耗药物混合物的副作用(降低的归因于药物-药物相互作用的风险)；这对于药物的代谢是特别重要的，其中不同药物对相同的代谢酶的竞争影响其毒性。

另一个重要的优点为具有改善的执行可能性的简化的治疗方案，这对AD的老年患者和其照顾者是特别重要的(Small,G,Dubois B Areview of compliance to treatmentin Alzheimer's disease:potential benefits of a transdermal patch.Curr Med ResOpin 2007,23,2705-13)。关于这一点，一个重要方面是AD患者对包括可以是很经常地相联系的高血压、血管疾病和糖尿病的宽范围的医学状态(同病)是敏感的。因此，近年已认识到与老年人群中的多药疗法相关的问题是关键的。这些问题首先在于药物的相互作用，其由于慢性疾病的共同存在和器官功能的失败在该人群中更经常地出现。不可以假定本身是安全的两种药物，相组合时也是安全的，特别是在老年人群的情况下。此外，同时施用的药物数应当尽可能地少，鉴于高龄对于药物学治疗是不可预测的危险因素(Turnheim,K.Whendrug therapy gets oíd:pharmacokinetics and pharmacodynamics in theelderly.Exp.Geront.2006,38,843-853)。鉴于MTD强烈地有利于组合疗法，关于多药疗法、同病、改变的药物效应动力学敏感性和在老年人的药物代谢动力学中的改变之间的复杂性而言，MTD的临床使用还可以简化治疗方案(Youdim,M.B.,和Buccafusco,JJ(2005)CNSTargets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's andParkinson's diseases J.Neural Transm 112,519-537)。遵循处方药物方案对于有效的治疗是基本的。不遵循是一个普遍的问题，但是这对于AD患者和其照顾者是一个挑战(Small,G,Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease:potential benefits of atransdermal patch.Curr Med Res Opin 2007,23,2705-13)。用可以作用于多个靶标的药物的简化治疗方案可以增加对治疗的坚持。所有上面所提到的优点对于药物混合物是不可用的。

对于多靶标的配体1策略是用于发展用于治疗复杂的神经系统疾病的新候选者的革新方法，特别是鉴于神经变性疾病中所涉及的基本过程本质上是多因素的事实(CavalliA,Bolognesi ML,Minarini A,Rosini M,Tumiatti V,Recanatini M,MelchiorreC.Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases JMedChem 2008,51,347-72)。这样的策略基于唯一的多功能化合物可以作用于在参与AD和其他神经变性疾病的神经变性过程中协作的多个靶标的观念，并因此可以阻止相互作用的致病途径之间不希望的代偿。而MTD可以是对使用药物组合的备选实践。既然大多数神经变性机制由许多神经元所共享，那么这样的MTD也可以用作对于其他疾病的药物治疗。

缺血性中风的全球负担是出血性中风的大约4倍多。目前的证据表明25-30％的缺血性中风的幸存者发展了立即的或延迟的血管性认知衰退，或血管性痴呆。中风损伤后的痴呆可以包括所有类型的认知病症。由于中风发生后的死亡风险已降低，因此具有大脑困境和认知衰退的中风幸存者的人数已增加(R.N.Kalaria,等人.,Stroke injury,cognitive impairment and vascular dementia,Biochim.Biophys.Acta(2016),http:// dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。

中风后发展的痴呆被认为是定义了由中风引起的损伤后发生的所有类型痴呆(不依赖于是否包括血管的、神经变性的或其混合的过程)的临床实体。这涉及具有大和小脉管疾病以及神经变性病理学状况的可变组合的复杂病因学(R.N.Kalaria,等人.,Strokeinjury,cognitive impairment and vascular dementia,Biochim.Biophys.Acta(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。

从所拥有的缺血性损伤级联的知识，我们知道它由一系列是高度异质的(R.Brouns,P.P.De Deyn,The complexity of neurobiological processes in acuteischemic stroke,Clin.Neurol.Neurosurg.111(2009)483-495)并在最初的血流灌注不足事件后从数分钟至数天和数周演变的复杂事件组成。主要事件包括归因于血流的中断的能量失败、兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、血脑屏障功能障碍、微血管损伤、止血激活、与炎症和免疫应答相关的损伤和在神经元、神经胶质细胞和内皮细胞水平的细胞死亡。微血管损伤和血脑屏障的破坏，其可以在几天后发生，导致血管性水肿并且还可以引起出血。同时，组织可以经历一系列复杂的修复和重塑应答，其包括血管发生以限制损伤并改善后果。这些事件在老化的大脑中被截断了，以至于脑实质不可逆地受到损害，这对认知功能障碍做出了贡献(R.N.Kalaria,等人.,Stroke injury,cognitive impairment and vasculardementia,Biochim.Biophys.Acta(2016),http://dx.doi.org/10.1016/ j.bbadis.2016.01.015)。

实验研究暗示缺血性损伤后的细胞死亡可高度归因于坏死。然而，最近的发展指出神经元死亡明显地通过凋亡以及通过混合机制而发生(R.N.Kalaria,等人.,Strokeinjury,cognitive impairment and vascular dementia,Biochim.Biophys.Acta(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。

神经炎症和免疫抑制也与中风、老化和感染相关联。这可能地具有对中风后认知功能的损伤效应(B.W.McColl,S.M.Allan,N.J.Rothwell,Systemic inflammation andstroke:aetiology,pathology and targets for therapy,Biochem.Soc.Trans.35(2007)1163-1165)(C.Meisel,A.Meisel,Suppressing immunosuppression after stroke,N.Engl.J.Med.365(2011)2134-2136)(W.Swardfager,D.A.Winer,N.Herrmann,S.Winer,K.L.Lanctot,lnterleukin-17in post-stroke neurodegeneration,Neurosci.Biobehav.Rev.37(2013)436-447)。

帕金森病(PD)是神经变性疾病，具有运动功能障碍的症状：动作缓慢、僵硬、静息震颤和平衡改变。随着疾病的进展，许多患者发展了非运动性症状，包括焦虑、抑郁、便秘和痴呆。这些特征归因于纹状体多巴胺含量的大量减少和黑质致密部中多巴胺能神经元的丧失(Gauthier,1982)。

PD的临床体征在多巴胺能神经元死亡超过70-80％的数目后和超过50-60％的纹状体神经末梢丧失时出现(Agid,1991)。

PD发展机制的研究已指示，黑质致密部中多巴胺神经元的丧失与线粒体复合体I的不足相关(Jenner 1998)。

虽然有减轻帕金森症状的药物，但是这些药物的长期使用在阻止PD的进展中是无效的并且与使人虚弱的副作用相联系。因此，发展延迟甚至阻止变性进展的神经保护性疗法是非常令人感兴趣的。

不幸的是，神经保护疗性法的发展受阻于变性神经疾病例如PD的发病学的有限知识。对PD中神经元变性负责的病因学和发病学仍处于未知中。一些证据线索支持小神经胶质细胞的活化和炎症过程参与导致神经元逐步变性的事件级联的理论(Kreutzgber,GW,1996Trends Neurosci,19:312-318)。活化的小神经胶质细胞存在于PD患者的黑质中处于变性的神经元的附近La(McGeer,PL等人,1988,Neurology,38:1285-1291)。

PD的经典治疗过程是施用多巴胺激动剂例如左旋多巴(L-DOPA)和卡比多巴。具有代替多巴胺或抑制其降解的具有明确目的的其他药物试剂，例如儿茶酚-O-甲基转移酶的抑制剂和金刚烷胺是经常开处方的药物(N.L.Diaz,C.H.Waters,Expert Rev Neurother9,1781(2009年12月1日)。在此类药物制剂通常改善患者的症状的同时，它们不总是随时间有效的和/或耐受的，运动障碍是一个副作用(A.H.Schapira等人.,European Journal ofNeurology 16,1090(2009))。并发症的另一问题是日常治疗可以是一个负担和对药物治疗的坚持减少的事实。因此目前强调新的药物释放系统，其能够通过安放微型泵(例如，空肠内的、皮下的)和通过皮肤贴剂的透皮释放来提供多巴胺激动剂的连续输注(A.H.Schapira等人.,European Journal of Neurology 16,1090(2009))。然而，即使随着此类药物和其释放系统的演变，一些PD患者还是没有接受到足够的减轻(N.L.Diaz,C.H.Waters,ExpertRev Neurother 9,1781(2009年12月1日)。

线粒体病的实验模型通常涉及参与电子运输链中所涉及的酶的抑制(1)。此外已报道许多神经变性疾病与线粒体功能异常相联系(2-5)。已在AD、PD、亨廷顿病和LouGehring并中检测到线粒体呼吸链中的复合物I、II和IV的缺乏(6-9)。

一些证据线索暗示PD是一种涉及自由基的疾病并且线粒体功能异常导致能量产生的失败(10-11)。增加的氧化损伤、多巴胺的耗竭、蛋白质的硝化、铁的积累、蛋白质的聚集和凋亡是PD的特征(12-14)。

许多流行病学研究显示慢性疼痛具有高度普遍性，对个体的健康、健康服务机构和社会具有严重的影响(Torrance N,Smith BH.Bennett MI,Lee AJ.The epidemiologyof chronic pain of predominantly neuropathic origin.Results from a generalpopulation survey.J Pain2006；7:281-289)(Treede RD,Jensen TS,Campbell JN,Cruccu G,Dostrovsky JO,Griffin JW,Hansson P,Hughes R,Nurmikko T,SerraJ.Redefinition of neuropathic pain and a grading system for clinical use:consensus statement on clinical and research diagnostic criteria.Neurology2008；70:1630-1635)。特别地，估计具有神经性成分的慢性疼痛影响到大约7-8％的普通人群并且对于治疗其的可用疗法还不令人满意(Torrance N,Smith BH.Bennett MI,LeeAJ.The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathicorigin.Results from a general population survey.J Pain 2006；7:281-289)(vanHecke O,Austin SK,Khan RA,Smith BH,Torrance N.Neuropathic pain in the generalpopulation:a systematic review of epidemiological studies.Pain

155:654-62)(Bennett MI,Rayment C,Hjermstad M,Aass N,Caraceni A,Kaasa S.Prevalence andaetiology of neuropathic pain in cáncer patients:A systematic review.Pain2012；153:359-365)。NP被认为是一种神经变性症状，因此考虑神经保护作为用于预防其开始、控制其进展甚至恢复导致慢性疼痛的这些症状的建立的神经损伤的一种策略是合乎逻辑的(Bordet T和Pruss RM.Targeting neuroprotection as an alternative approachto preventing and treating neuropathic pain.Neurotherapeutics 2009；6:648-662)。神经保护包括在病理学应激(创伤、毒性、缺血性或代谢性事件)的背景下维持神经元存活和其功能的方法。因此目前，大多数周围神经病和中枢NP(疼痛性糖尿病神经病、由HIV和由抗逆转录病毒疗法引起的远端感觉性多发性神经病、由化学疗法诱导的周围神经病、疱疹后神经痛、多发性硬化症中的疼痛和中风后疼痛等)的治疗在朝着这个前景(Bordet T和Pruss RM.Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventingand treating neuropathic pain.Neurotherapeutics 2009；6:648-662)(Flatters SJL,Bennett GJ.Studies of peripheral sensory nerves in paclitaxel-induced painfulperipheral neuropathy:Evidence for mitochondrial dysfunction.Pain 2006；122:245-257)(Jaggi AS,Singh N.Mechanisms in cancer-chemotherapeutic drugs-inducedperipheral neuropathy.Toxicology 2012；291:1-9)。特别地，已聚焦于谷氨酸能功能异常、硝基-氧化性应激、线粒体功能异常、凋亡、营养因子、神经炎症和由神经变性诱导的未损伤纤维中的改变(Bordet T和Pruss RM.Targeting neuroprotection as analternative approach to preventing and treating neuropathicpain.Neurotherapeutics 2009；6:648-662)(DeLeo JA,Sorkin LS,Watkins LR,editors.Immune and glial regulation of pain.Seattle:IASP Press；2007)(Park ES,Gao X,Chung JM,Chung K.Levéis of mitochondrial reactive oxygen speciesincrease in rat neuropathic spinal dorsal horn neurons.Neuroscience Letters2006；391:108-111)。在基于依赖于ATP的神经病中电子运输链参与而发展用于疼痛的新型疗法中已暗示了生物学近似(Joseph EK,Levine JD.Mitochondrial electrón transponin models of neuropathic and inflammatory pain.Pain 2006；121:105-114)(JosephEK,Levine JD.MúltipleΡKΟε-dependent mechanisms mediating mechanicalhyperalgesia.Pain 2010；150:17-21)。还已报道了在诱导机械疼痛过敏中神经生长因子的(NFG)线粒体依赖性(Chu C,Levine E,Gear RW,Bogen O,Levine JD.Mitochondrialdependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia.Pain 2011；152:1832-1837)。

根据这些想法，已提出了将参与当神经纤维的连续性被打断时发生的瓦氏变性(WD)的多种免疫调节剂作为用于NP的药物治疗的新靶标(Debovy P.Walleriandegeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration andneuropathic pain induction.Annals of Anatomy 2011；193:267-275)(Lingor P,KochJC,Tónges L,Bahr M.Axonal degeneration as a therapeutic target in theCNS.Cell Tissue Res 2012；349:289-311)。此外，也认识到神经损伤后神经免疫激活、小神经胶质细胞-神经元信号传导和氧化应激在加强神经传递中的作用(Berger JV,KnaepenL,Janssen SPM,Jaken RJP,Marcus MAE,Joosten EAJ,Deumens R.Cellular andmolecular insights into neuropathy-induced pain hypersensitivity formechanism-based treatment approaches.Brain Research Reviews2011；67:282-310)(De Leo J.A,Tawfik VL,La Croix-Fralish ML.The tetrapartite synapse:Path toCNS sensitization and chronic pain.Pain 2006；122:17-21)(Austin PJ,Moalem-Taylor G.The neuro-immune balance in neuropathic pain:Involvement ofinflammatory immune cells,immune-like glial cells and cytokines Journal ofNeuroimmunology 2010；229:26-50)(Salvemini D,Little JW,Doyle T,NeumannWL.Roles of reactive oxygen and nitrogen species in pain.Free RadicalBiology&Medicine 2011；51:951-966)。因此，用于NP的治疗的旨在神经保护和特别是神经炎症以的革新策略目前处于研究-发展中(Bordet T和Pruss RM.Targetingneuroprotection as an alternative approach to preventing and treatingneuropathic pain.Neurotherapeutics 2009；6:648-662)(Stavniichuk R,Drel VR,Shevalye H,Maksimchyk Y,Kuchmerovska TM,Nadler JL,Obrosova IG.Baicaleinalleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation.Experimental Neurology 201 1；203:106-113)。

老化和神经学和精神病学病症引起神经细胞的损伤和死亡。在常见和突出的神经系统损伤之中，包括神经元变性、缺血、炎症、免疫应答、创伤和癌症等。作为这些的结果，神经细胞可以在数分钟或数小时内死亡或在激活神经变性的受损伤状态下从该最初的损伤状态下存活下来，最终同样以细胞死亡结束。

PD、AD和其他神经变性疾病中的神经变性看起来是多因素的，以至于包括炎症、谷氨酸能神经毒性、铁和一氧化氮的增加、内源性抗氧化剂的耗尽、减少的营养因子表达、泛素蛋白酶体系统的功能异常和促凋亡蛋白的表达的一系列复杂毒性反应导致神经元的死亡。

鉴于神经系统对使基本的运动能力和敏感性成为可能的重要性，存在找到用于保护神经系统的治疗武器的兴趣。

神经保护旨在神经系统、其细胞、结构和功能的保护、恢复、治愈或再生(Vajda等人2002,J Clin Neurosci 9:4-8)，神经保护的目标是预防或最小化神经系统中的原发损伤的效应，或预防或最小化引起轴突、神经元、突触和树突的内源性或外源性有害过程的后果。

神经保护是用于保护免于作为慢性神经变性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病)的结果的CNS的神经元损伤或变性的机制和策略。神经保护的目标是限制对CNS的损伤后的神经元功能异常/死亡和试图保持脑中细胞相互作用的可能的最大完整性，从而导致不受扰乱的神经功能。

神经保护的概念适用于慢性脑疾病以及急性神经状态，鉴于损伤CNS的一些基本机制在这些状态中是相似的。神经变性病症包括AD、PD、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症。神经保护被认识是治疗这些状态中使用的药物作用机制。

存在宽范围的可用的或处于研究中的神经保护试剂并且有些试剂可以潜在地被用于多于一种疾病，鉴于神经组织损伤的许多机制是相似的。将具有神经保护效应的试剂归类为下列类别：自由基清除剂、抗兴奋性毒性试剂、凋亡(程序性细胞死亡)抑制剂、抗炎症试剂、神经营养因子、金属铁螯合剂、离子通道调节剂和基因治疗。

已显示氧自由基与蛋白质变性、酶失活和DNA损伤相联系，导致细胞膜的脂质过氧化和最终神经变性疾病中的细胞死亡。

在动物模型和在人上进行的研究显示由脑代谢产生的氧化剂种类之间的平衡缺失并且抗氧化剂保护机制产生所谓的氧化应激，当这些防御系统降低了其效率和不堪重负时。该氧化应激随年龄增加并且是AD的发病学的首要原因之一(Neurobiol.Aging 2007,28,1009-1014)，可能地与神经元线粒体的功能异常相联系。同样，知道具有抗氧化特性的试剂能够防止由淀粉样肽诱导的凋亡，以及皮质神经元培养物中Ca²⁺内环境稳定的改变(Life Sci.2000,66,1879-1892).66,1879-1892)。因此，存在对乙酰胆碱酯酶(AChE)或丁酰胆碱酯酶(BuChE)抑制剂，和具有针对毒性袭击例如氧化自由基的神经保护能力的化合物的大的需要，所述化合物在治疗神经变性疾病例如AD、PD或亨廷顿病中具有大的医学重要性。

一般而言，治疗策略经常基于所提出的损伤的单一因子的调节。虽然可以观察到这些治疗在非常有限的动物模型中是有益的，但不太可能的是在涉及遗传上多样的人群中更可变严重程度的损伤的更复杂人病症中显示有效(Faden和Stoica 2007.；Arch Neurol64:794-800)。在很大程度上，鉴于推测的神经元死亡机制例如氧化应激、线粒体功能异常、蛋白质聚集、凋亡和炎症(Youdim,M.B.和Buccafusco,JJ(2005)CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinson's diseasesJ.Neural Transm 112,519-537)是既复杂又多变的，因此希望具有对多重机制损伤的多潜在效应的单一化合物。

发明内容

以其化学结构描述于古巴专利文献CU23879中的化合物(3-乙氧基羰基-2-甲基-4-(2-硝基苯基)-4,11-二氢-1H-吡啶并[2,3-b][1,5]苯并二氮

)(JM-20)可以具有对心血管、脑血管和其他与中枢神经系统相关的疾病的效应。

令人惊奇地，研究者们已发现化合物JM-20对CNS具有明显的治疗效应，优选地用于疾病例如不同类型的痴呆、帕金森病和疼痛的治疗。

因此，本发明的本质基于使用JM-20和其化学衍生物以优选地用于治疗疾病例如不同类型的痴呆、帕金森病和疼痛。

JM-20是苯并二氮

的衍生物并且已广泛报道苯并二氮

诱导痴呆(Huber-Geismann,F,1994)(Rosenberg,P.B.2015)，(Shash,D.,T.Kurth,等人.2015)(Zhong,G.,Y.Wang,等人.2015)),然而，出乎意料地，JM-20改善不同类型的痴呆。

尽管文献中已报道了JM20的潜在用途，但是其作为神经变性疾病例如痴呆、PD和NP的治疗药物的潜力尚未确立。

附图说明

图1显示获得化合物IIa和IIb的方案。

图2显示从化合物IIa获得化合物III的方案。

图3显示从化合物IIb获得化合物III的方案。

图4显示JM20的异构体形式。

图5显示获得化合物III及其卤代水合物的方案。

图6显示从JM-20(IIIc)获得富马酸盐。

图7显示从JM-20(IIId)获得磷酸盐。

图8显示从JM-20(IIIf)获得硫酸盐。

图9显示JM-20对短期和长期空间记忆的效应，特别是在获取和巩固的过程中。

图10显示在完成短期记忆研究之后，JM-20对用东莨菪碱处理的大鼠中脑组织的线粒体功能异常的效应。

图11显示在完成长期记忆研究后，JM-20对用东莨菪碱治疗的大鼠脑组织的线粒体功能异常的效应。

图12显示JM-20对由铝诱导的不同类型的记忆缺失的效应。

图13显示JM-20对由β-淀粉样蛋白的肽25-35寡聚体诱导的细胞生活力的损伤的效应。

图14显示JM-20恢复由β-淀粉样蛋白的肽25-35寡聚体诱导的记忆缺失。

图15显示JM-20对由大鼠颈总动脉的暂时闭塞所诱导的认知衰退的效应。

图16显示JM-20对处理7天后雄性Wistar大鼠中由6-OHDA诱导的损伤的神经保护效应。

图17A显示JM-20对在大鼠爪跖面上注射5％福尔马林后的舔/咬行为的效应。

图17B显示JM-20对在大鼠爪跖面上注射5％福尔马林后的舔/咬行为的效应的时间过程。

图18显示用氟马西尼预处理对JM-20对5％福尔马林试验的II期的抗超伤害性感受效应的影响。

图19显示JM-20对手术后14天CCI大鼠同侧爪上的机械性异常疼痛的效应。

图20显示通过测量对Von Frey电子刺激的缩爪反应所测定的JM-20对CCI大鼠同侧爪上的机械性超伤害性感受强度的效应。

图21显示通过修改经典的Randal Selito或SH Ferreira测验的JM-20(20mg/Kg,10mL/Kg,口服)或载体(CMC,0.05％)对爪的恒定压力的机械性超伤害性感受强度的效应。

图22显示在CCI后第7天开始的以重复剂量的JM-20的处理对由手术后14天通过CCI诱导的组织学改变(瓦氏变性)的效应。

图23显示JM-20对作为氧化亚氮浓度的指示物的硝酸盐脊髓浓度的效应。

图24A和B显示JM-20对大鼠中由角叉菜胶(500μg/腔)诱导的腹膜炎症反应的效应。A.白细胞滚动和B.其对肠系膜中的血管内皮的粘附。

图24C和D显示JM-20对大鼠中由角叉菜胶(500μg/腔)诱导的腹膜炎症反应的效应。C.白细胞朝腹膜腔的迁移和D.血管渗透性

图24E JM-20对角叉菜胶注射后腹水中肿瘤坏死因子(TNFα)的浓度的效应。

发明详述

作为本发明的另外的方面，可以将通式III的化合物(JM 20)、其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上经测试的前药与至少一种化学上惰性的、非毒性的辅助剂、稀释剂和/或载体(以下认作包含于所提出的药物组合物中的赋形剂)相混合地施用。

所述药物组合物考虑任何液体的、固体的或半固体的组合物，可以将它们通过口腔、口咽、舌下、肠胃外途径，例如肌内、静脉内、真皮内或皮下、局部、透皮、气管、支气管、鼻、肺、直肠途径或其他合适的施用途径，进行施用

所描述的药物组合物包含用于每种配制剂的合适的赋形剂。所述配制剂通过现有技术中收集的方法常规地制备。所述赋形剂根据按照施用途径的选择药物形式进行选择。

可以以药学上可接受的剂型包含用于将其向人施用的通式III的化合物(JM20)、其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、前药，其中包括但不限于这些呈现形式：片剂(包括舌下的，包衣的或可咀嚼的),硬或软胶囊(包括微胶囊、纳米颗粒和小丸剂)、溶液(口服滴剂、糖浆剂)、肠胃外溶液、透皮贴剂、植入物或其他延迟系统、软膏剂(霜剂和凝胶剂)、鼻喷雾剂、粘膜贴附剂、栓剂、悬浮液、待重构或待添加于食物中的粉剂，在本发明中所包含的其他剂型之中。

使用现有技术中已知的技术方法，可以与赋形剂例如液体、固体或半固体的辅助物质、天然或合成来源的有机和无机性质的化合物相混合地，以适合于其施用的剂型来配制JM 20、其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、前药。其中包括：填充固体、稀释剂、凝集剂、溶剂、乳化剂、润滑剂、崩解剂、爽滑剂、调味剂、着色剂、色素、聚合物、增甜剂、增塑剂、吸收增强剂、渗透增强剂、表面活性剂、辅助表面活性剂，向活性化合物或其生理学上可接受的盐提供物理、化学和/或生物学稳定性的特化油和/或缓冲系统。

一些在配制包含通式III的化合物或其衍生物的剂型中使用，而不限于其他辅助物质的使用的赋形剂为：淀粉、乳糖、纤维素和其衍生物、蔗糖、山梨醇、甘露醇和其他糖类，滑石粉、胶体二氧化硅、碳酸盐、氧化镁、磷酸钙、二氧化钛、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、明胶、乳蛋白、柠檬酸盐、酒石酸盐、海藻酸盐、葡聚糖、乙基纤维素、环糊精、硅弹性体、聚山梨酯、支链淀粉、对羟基苯甲酸酯、动物油和植物油、丙二醇、无菌水、单醇或多羟基醇例如甘油、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠、月桂醇硫酸酯钠、甘油和聚乙二醇蜡等。

包含通式III的化合物、其盐、对映体形式和氧化还原衍生物的固体口服剂型，例如片剂、微颗粒、纳米颗粒、小丸剂、用于重构的粉剂或胶囊，根据本发明，可以是立即释放的或修饰释放的。

根据本发明，一种选择药物形式为片剂，其包含通式III的化合物JM20、其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、前药作为活性药物成分，以与微晶纤维素、玉米淀粉、交聚维酮的混合物来制备，添加聚乙烯吡咯烷酮和月桂醇硫酸酯钠的溶液以形成颗粒，将其在流化床中以完全的过程进行干燥并与硬脂酸镁和滑石粉相混合，随后使用旋转打孔系统加工药片以制备其，最后用羟丙基纤维素、聚乙二醇4000、二氧化钛和着色剂的悬浮液包衣药片。

通过包衣药片，取得考究的完成形式并避免了令人不快的口味，这通过味道掩蔽剂例如甲基丙烯酸、乙基纤维素、甲基羟基丙基纤维素的共聚物和其他聚合物来取得。所述片剂既可以通过上面所说明的湿法制粒方法，也可以通过使用用于直接压缩的赋形剂的直接压缩方法和在片剂获得阶段中的递减步骤，只要以低的剂量进行工作。

所述片剂可以是修饰释放的或可以在微颗粒、纳米颗粒或基质系统中包含通式III的化合物或其衍生物，使用赋形剂例如：聚氧化乙烯、羟丙基甲基纤维素2910、硬脂酸镁、氯化钠、红氧化铁、醋酸纤维素、聚乙二醇3350和欧巴代。

所述药物组合物，根据本发明可以包含药学上可接受的聚合物，可渗透的、生物可降解的或不溶于水的，用于控制其释放曲线，由此可以获得修饰释放的剂型(立即的、延迟的或受控的)。这些聚合物可以用于药片、微颗粒、胶囊的包衣、纳米颗粒的获得，作为小丸剂、颗粒或与本发明中提到的任何其他剂型中包含的其余赋形剂的混合物中的释放基质。

对于口服施用，其他合适的药物组合物为硬胶囊、软胶囊和药物粉剂，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、对映体形式和其生理学上可接受的氧化-还原衍生物以明胶或纤维素硬胶囊的形式配分剂量，例如在其内部包含活性药物成分与例如对于片剂所描述的以固体形式通常使用的赋形剂的混合物，该混合物可以通过干燥途径、湿法制粒、挤出、丸粒化、微胶囊化或通过microtabs剂量配分获得。对于软明胶胶囊的剂量配分，使用常规加工方法并且可以通过混合通式III的化合物或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、前药与植物油、脂肪或适合于其配制的其他类似载体来制备。

在药物粉剂的情况下，这可以通过简单地混合通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药与填充剂、悬浮试剂、增甜剂、调味剂和防腐剂来加工。虽然在粉剂的加工中本发明也使用在100 ℃-150 ℃的入口温度和50 ℃-90 ℃之间的出口温度下的雾化干燥方法，使用赋形剂例如葡聚糖、聚乙二醇4000和月桂醇硫酸酯钠等以随着将其以溶液适当地掺入生物，或添加至食物例如果汁而改善活性药物成分的溶解度。

对于直肠施用，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药以栓剂、泡沫剂或以微型灌肠剂的直肠溶液的形式配分剂量，其可以包含活性化合物与中性固体脂肪基(Witepsol 45)或适合于其配制的其他类似载体的混合物，也可以使用山梨醇单油酸酯、聚山梨酯20、乳化蜡、无水胶体二氧化硅、焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、磷酸钠、聚乙二醇300、甘油、水、丙烷、异丁烷和正丁烷。

对于液体口服施用，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药以糖浆、酏剂、浓缩滴剂和悬浮液的形式配制，其含有药物上可接受的载体例如乙醇、水、甘油、丙二醇和/或聚乙二醇，尤其是羧甲基纤维素和其他增稠试剂的混合物，它可以包含着色剂、调味剂、增甜剂(蔗糖、天冬甜二肽、环己氨磺酸盐、甜菊苷)、防腐剂(对羟基苯甲酸酯、苯甲酸盐)。这些液体剂型可以在其使用之前用合适的溶剂重构以粉剂的药物组合物开始来制备。

对于肠胃外施用，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药作为可注射溶液进行配制。这些溶液可以包含稳定、防腐成分和/或缓冲液成分。在本发明中，活性药物成分在用于注射的96％乙醇溶液、苄醇、丙二醇、苯甲酸、苯甲酸钠、氢氧化钠、水中，也可以使用其他赋形剂例如聚乙二醇400、柠檬酸钠和柠檬酸。包含通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药的用于肠胃外施用的溶液也可以通过在使用之前用合适的溶剂重构干燥的(冻干的)药物组合物来制备，包括使用辅助物质例如：甘露醇、聚山梨酯80、氯化钠等。

对于通过皮下途径的施用，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药以植入物的形式配分剂量，通过使用硅酮弹性体和无水胶体二氧化硅作为辅助物质，虽然对于小丸剂的制作，可以使用其他药物用途的聚合物。

对于通过透皮途径的施用，可以将通式III的化合物(JM20)或其盐、水合物、晶体形式、对映体、异构体、代谢物、生理学上可接受的前药以贴剂的形式进行配制，在这种情况下，活性药物成分被包含在支持物中，其在可取下的片层的内面上含有丙烯酸共聚物、乙醇、轻质液体石蜡、棕榈酸异丙酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、乙烯醋酸乙烯酯的溶液和的一层硅酮(具有在12.75cm²的表面积上15mg/天的标称释放速率)。

实施例

合成中间体，5-甲酰基-1,4-二氢吡啶衍生物的获得

化合物II在干燥的二甲基甲酰胺下通过三氯氧磷或三溴氧磷从I的转化开始获得，随后将其混合物以3至9倍的比例添加至在二氯甲烷或氯仿中的I的溶液并在20-60℃之间的温度下搅拌15-20小时(图1)。

使得到的产物经历碱性水解，随后用氯仿或二氯甲烷抽提，通过洗涤和干燥进行纯化。

化合物I通过以唯一步骤的多组分反应来获得，其中在作为溶剂的乙酸中混合等摩尔量的2-硝基苯甲醛、麦氏酸、乙酰乙酸乙酯和乙酸铵，并且经历回流反应7-10小时。在该时间后，将混合物倒在水上并将得到的沉淀通过乙醇重结晶进行纯化。

化合物III的获得

使前面获得的化合物IIa和IIb与邻苯二胺在无水乙醇中反应以获得化合物III(JM-20),其可以通过形成不同的盐而制备，取决于所采用的反应条件。

从IIa开始获得化合物III

为了获得化合物III(JM-20),从化合物IIa的乙醇溶液开始并添加等摩尔量的在作为溶剂的无水乙醇中的邻苯二胺，同时进行搅拌。向反应混合物添加等摩尔量或更多的(1-2当量)的三乙胺(图2，方法A)，保持搅拌，或通过受控滴落物添加足够量(1-1.5当量)的氢氧化钠溶液，并继续搅拌反应混合物(图2，方法B)。

从IIb开始获得化合物III

为了获得化合物III(JM-20),从化合物IIb的乙醇溶液开始并添加等摩尔量的在作为溶剂的无水乙醇中的邻苯二胺，同时进行搅拌。向反应混合物添加等摩尔量或更多的(1-2当量)的三乙胺(图3，方法A)，保持搅拌，或通过受控滴落物添加足够量(1-1.5当量)的氢氧化钠溶液，并继续搅拌反应混合物(图3，方法B)。

化合物JM20具有异构体，其结构显示于图4中。

水合卤化物型盐形式的化合物III的获得

III的水合氯化物或水合溴化物(JM20的水合卤化物)的相应盐分别从IIa或IIb开始使用或不使用催化剂来获得。当以合适的催化量(5-25％摩尔)添加相应的水合物时，催化过程发生，其降低了反应时间并稍微提高了反应产量(图5)。JM20的水合氯化物(IIIa)从IIa开始适当地获得，并且当添加合适量的HCl时，反应的催化作用发生。化合物JM20还可以从IIb开始以水合溴化物(IIIb)的形式获得(图5)，特征是，溴是比氯更好的离去基团，促进了分子内亲核取代反应，导致快速的反应并有效地获得以水合溴化物形式的JM20。

富马酸盐形式的化合物III的获得

JM-20的富马酸盐(IIIc)从III的水合氯化物或水合溴化物开始通过向IIIa或IIIb的溶液添加富马酸单钠来获得，同时磁力搅拌2-5小时(图6)，并随后通过添加合适量的乙醇使其沉淀。

将相应于富马酸盐IIIc的沉淀进行过滤并适当地洗涤，进行纯化并随后放在具有受控温度和在减压下的干燥器中。

磷酸盐形式的化合物III的获得

JM20的磷酸盐(IIId)可以通过与前面的实施例相似的过程，从IIa或IIb开始获得，通过在反应开始时添加等摩尔量的磷酸，或通过向在乙醇中的IIIa或IIIb的溶液添加磷酸，同时进行搅拌(图7)。

硫酸盐形式的化合物III的获得

JM20的硫酸盐(IIIf)从IIa或IIb开始或从IIIa或IIIb的水合卤化物开始来获得，如在图8中所显示的。

片剂形式配制剂的获得

120.00mg的每片包含：

成分	量	功能
			JM 20	40.00mg	活性成分
玉米淀粉	23.00mg	崩解剂
			聚乙烯吡咯烷酮K-25	4.00mg	凝集素
乳糖单水合物	50.50mg	填充剂
			硬脂酸镁	1.50mg	润滑剂
胶体二氧化硅	1.00mg	润滑剂
			乙醇*，C级	12.00μl	溶剂
去离子水*	12.00μl	溶剂

*在干燥过程中蒸发。

技术过程简述：

1.通过20目筛选活性成分、淀粉和乳糖。

2.按照式中所确定的量称取配制剂的所有成分。

3.为了制备凝集素溶液，将水和C级乙醇的混合物倒入具有蒸汽夹套的金属容器中，添加聚乙烯吡咯烷酮并搅拌直至完全溶解。

4.加载具有活性成分、玉米淀粉和乳糖(内相的成分)的混合物。混合15分钟。

5.通过使用蠕动泵缓慢地添加凝集素溶液，如果需要，通过使用水和C级乙醇(1:1)来达到所要求的湿度。以低速通过碾磨机碾磨颗粒。

6.在流化床中使颗粒干燥。在10分钟后，取代表性颗粒样品，脱颗粒并测试其残留湿度；所述湿度值应当在0.8至1.2％之间。

7.混合干燥的颗粒与润滑剂10分钟。

8.通过使用6.4mm直径(1/4PBR)的平的、斜面的和开槽的冲模在高速旋转机上压缩混合物，以获得具有下列参数的片剂：

质量:120.0mg±10％

高度:2.6±0.10mm

硬度:4.0±1KgF

易碎性:小于1％

口服滴剂形式配制剂的获得

每ml(20滴)包含：

技术过程简述：

1.在制备产品的时刻测量纯化水的pH和电导率。

2.将丙二醇倒入反应器中。

3.在具有合适容量的辅助不锈钢容器中将糖精钠溶解入纯化水中。

4.掺入Kollidon 25，一点一点地分散，并搅拌不少于30分钟的时间直至完全的分散。

5.搅拌并给制剂加热，保持40-50℃之间的温度30分钟。

6.将活性成分以小份额掺入前一个步骤的结果中，保持不断的搅拌30分钟的时间。

7.撤除加热并等待制剂获得室温：30±2℃，

8.在具有合适容量的玻璃或不锈钢辅助容器中溶解在C级乙醇中的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，不断搅拌直至完全的溶解。

9.在前一步的结果中添加可溶液体草莓调味剂并搅拌直至完全的均质化。

10.将前一步的结果缓慢地掺入反应罐中，伴随剧烈和不断的搅拌。

11.在具有合适容量的玻璃或不锈钢容器中在纯化水中溶解柠檬酸和无水柠檬酸钠，每次添加后搅拌直至其完全的溶解。

12.将前一步的结果缓慢掺入反应罐中，伴随剧烈和不断的搅拌。

13.在具有合适容量的玻璃或不锈钢容器中在纯化水中溶解丽春红，搅拌直至其完全的溶解并掺入制剂。

14.用水补齐预定的体积。搅拌以使其均匀。

15.测试pH是否保持在4.0-6.0的区间。

16.进行最终过滤，测试有机器官感觉特性。

17.将最终制剂装入具有15.0±1.0mL的溶液的x 15mL琥珀色玻璃品中，适当地遮挡，通过使用用于油类产物的具有减滴器的盖子。

可注射配制剂的获得

JM 20的每个球(2mL)包含：

1.检查反应器在灭菌后是完全干燥的，如果不是，用无水乙醇冲洗。

2.制备1N盐酸溶液用于调节pH。

3.向反应器添加一部分Cremofor ELP和无水乙醇。以420rpm混合。

4.称取活性成分并向包含它的烧杯添加无水乙醇部分，用玻璃搅拌器分散并添加至反应器，重复该操作直至扫除所有活性成分并用尽所有无水乙醇。

5.在反应器中以420rpm保持搅拌60分钟直至取得活性成分的完全溶解。

6.加入其余的Cremofor ELP，用无水乙醇扫除剩余部分，在420rpm下搅拌10分钟。

7.测定溶液的pH并用1N盐酸溶液调节至5.0-6.0之间。

8.通过添加无水乙醇完成溶液的体积。以420rpm搅拌5分钟。

9.取10mL的溶液并运送至实验室以用于控制过程(评价和pH)。

10.检查填充和氮化系统的正确装配。

11.用无水乙醇进行Sartobran P MidiCaps过滤器，(0.45+0.2μm)的孔隙度的完整性试验。

12.结束过程控制时，通过使用氮气(0.7-1.0巴)给反应器加压以推动溶液通过0.45μm+0.2μm孔隙度的Sartobran P过滤器盒。进行球形物的充填和封闭，制备2.2mL溶液的剂量。

痴呆模型中的记忆力研究

试剂

所有试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。足量供应JM-20以用于由哈瓦那大学化学系有机合成实验室所提出的研究。

对于不同的研究，将JM-20悬浮在0.05％羧甲基纤维素(CMC)中并通过口服途径进行施用。将溴化东莨菪碱溶解在0.9％盐水溶液中，通过腹膜内途径施用(1mg/kg，4mL/Kg体重)。将氯化铝溶解在实验受试者的普通饮用水中，并以长期的形式在一个月期间以500mg/Kg体重的剂量通过口服途径施用，同时进行行为研究。使β-淀粉样蛋白的肽(25-35)寡聚化并按照其制造商的标准增溶，并按5uL中100皮摩尔通过脑室内途径施用于右脑半球中。

动物实验。伦理学考虑。

在相应于东莨菪碱和铝的模型的体内实验中使用Wistar大鼠(雄性，230-260g)，而在对应于β-淀粉样蛋白的模型中使用OF-1小鼠(雄性,25-30g)。所有这些动物来自实验室动物生产国家中心(CENPALAB,马亚贝盖，古巴)，并在其到达后适应实验室条件7天。将它们保持在12小时的白天和黑夜交替循环、受控的温度(22±2℃)、45-55％的相对湿度下并随意供应水和食物。所有行为研究在09:00和17:00之间，在受控的光照条件和噪音水平下进行。本研究中所报告的所有用动物的步骤都按照实验室动物照管国际委员会批准的标准和按照为实验动物建立的国家条例进行。

实验设计

实验方案1:JM-20对由东莨菪碱诱导的记忆缺失的效应的评价

研究了三个剂量的JM-20(2、4和8mg/kg)对由急性腹膜内施用东莨菪碱所影响的短期和长期记忆的获取和巩固过程的保护效应。为此在四个独立试验中在影响短期和长期的记忆的获取和巩固过程之前施用JM-20。

在每个试验中，形成6个随机选择的受试者实验组(n＝10,每组):健康对照组(CMC和盐水)；JM-20组-未受损害(JM-20，8mg/kg)；东莨菪碱组(CMC和东莨菪碱1mg/kg)；JM-20-东莨菪碱组(JM-20，2mg/kg和东莨菪碱1mg/kg)、(JM-20，4mg/kg和东莨菪碱1mg/kg)和(JM-20，8mg/kg和东莨菪碱1mg/kg)。

对记忆的效应通过使用适合于独立于短期和长期记忆的获取和巩固过程的研究的实验设计的新物体认知测验和具有强制改变的Y迷宫测验来评价。

在行为研究的最后，以脑组织为基础进行不同的离体研究。研究了JM-20对于以下的效应：氧化应激的各种标志物、线粒体功能性、乙酰胆碱酯酶AChE活性的水平和记忆和学习过程紧密涉及的脑区中的神经元和轴突生活力的组织学参数。

实验方案2:JM-20对由氯化铝诱导的记忆缺失的效应的评价

研究了JM-20的两个剂量(2和8mg/kg)对由急性腹膜内施用氯化铝所影响的不同记忆类型的保护效应。为此从氯化铝(500mg/kg)施用开始后15天开始直至行为研究结束施用JM-20。评价了JM-20和氯化铝对三种记忆类型的效应：通过Morris水迷宫测验和T迷宫的空间记忆和通过新物体认知测验的新颖性认知记忆和通过被动回避测验的情感联想记忆。

形成5个随机选择的受试者实验组(n＝10,每组):健康对照组(CMC和水)；JM-20组-未受损害(JM-20，8mg/kg，和水)；铝组(CMC和氯化铝500mg/kg)；JM-20组-铝(JM-20，2mg/kg和铝500mg/kg)和(JM-20，8mg/kg和铝500mg/kg)。

在行为研究的最后，从脑组织开始进行不同的离体研究。研究了JM-20对于以下的效应：氧化应激的各种标志物、线粒体功能性、乙酰胆碱酯酶AChE活性的水平。

实验方案3:JM-20对由β-淀粉样蛋白的肽25-35的寡聚物诱导的损伤的效应的评价

首先，评价JM-20对经历了1μM浓度的β-淀粉样蛋白的肽25-35的寡聚物的PC12细胞系的细胞生活力的效应。在该体外实验中，评价了在二甲基亚砜(DMSO)中增溶的三个浓度的JM-20(3.125、6.25和12.5μM)的效应。形成6个实验组：未经处理的对照组(NT)；载体组(DMSO)；β-淀粉样蛋白组(Αβ，1μΜ)；JM-20-β-淀粉样蛋白组(JM-20，3.125+Αβ，1μΜ)、(JM-20，6.25+Αβ，1μΜ)和(JM-20，12.5+Αβ，1μΜ)。

然后，在OF-1小鼠上进行体内研究。评价了通过口服途径以10和30mg/kg体重的剂量，在脑室内施用Αβ(100皮摩尔)10天后7天，JM-20对所施用的β-淀粉样蛋白的寡聚物所诱导的记忆丧失的效应。形成5个实验组：健康对照组(假)；未受损伤的JM-20组(假+JM-20，30mg/kg)；β-淀粉样蛋白组(Αβ，100pmol+CMC)；JM-20-β-淀粉样蛋白组(JM-20，10mg/kg+Αβ100pmol)和(JM-2030mg/kg+Αβ100pmol)。

行为研究

Y迷宫。自发改变。

JM-20对空间记忆的效应通过强迫改变的Y迷宫测验来评价(20)。迷宫由从中心平台开始的以120°角的三个臂(55x 20x 20cm)的塑料构成。测验在两段时间内进行。在学习的第一阶段，进行训练，其中将每只大鼠放在中央平台上并允许其自由地探索迷宫的两个臂(A和C)10分钟，而第三个臂(B)保持关闭。认为进入每个臂就是进入了臂的任何一个内的四个末端。视频记录进入臂10分钟的顺序以用于其后续分析。评价阶段在于允许大鼠自由探索Y迷宫的所有臂5分钟，包括之前被关闭的。录制进入臂5分钟的顺序以用于其后续分析。在该测验中，评价进入新臂(B)的次数，其中进入该臂的百分比与所研究的动物的较好记忆成正比。正确进入B的百分比从所有可能的改变所实现的改变的比例开始来计算，如下面的等式所显示的：正确的进入％＝(进入B的次数)/(进入三个臂的总次数)x 100。在每次测验后，用40％的乙醇溶液清洁迷宫以减少嗅觉踪迹的存在。

物体的识别

JM-20对新物体识别记忆的效应通过物体识别测验来评价。该试验在连续的两天内在敞箱内进行。第一天进行动物住所适应，让它们探索盒子3分钟，以2个时间段。次日，进行通过每个5分钟持续时间的两个阶段的训练和学习评价，在后面分别称为训练阶段(E)和测验阶段(P)。在阶段E中，给大鼠展现两个相同的物体，所谓的熟悉物体(F)。30分钟后，P阶段开始并将大鼠暴露于：熟悉物体F和新物体(N)。录制测验以分析物体的探索，由每只动物对每个物体进行的探索的时间来定义。物体F和N之间的区别指数计算为：ID＝(N-F)/(N+F)。

Morris水迷宫

Morris水迷宫测验在圆形箱(1.52m的直径，0.60m的深度)内按照具有某些修改的由Vorhees和Williams(21)所描述的来进行。进行每天4个时间段的5天训练，和第六天的学习评价。在所有训练时间段期间，动物应当学习定位固定于不变位置中的淹没平台。在整个实验期间，放置几个外部线索并保持在固定位置。在每次训练中，将动物放在水中，面对箱壁，在四个出口位置之一上，直至它们在1分钟的最大时间内找到平台。在评价日，撤除平台。定量训练试验中的逃离潜伏期(动物在找到平台中耽搁的时间)、动物在学习的评价试验期间在平台的象限中经过的时间和直至找到平台位置所覆盖的距离。

被动回避

被动回避测验基于具有某些修改的由Kohara等(22)所描述的方法学来进行。使用了被动回避设备(UGO Basile)，其由两个室组成，一个有照明的(30x 30x 30cm)，一个黑暗的(10x 20x 12cm),由环形形状的进入门相连接。黑暗室配备有电路。

测试在连续的两天内以两个阶段进行。第一天，将每只大鼠放置在有照明的室中10秒钟，然后打开两室之间的门并让大鼠自由地探索90秒的最大时间。一旦大鼠进入黑暗室，就关闭门并且大鼠接受1mA的电脉冲5秒钟。次日，在300秒的最大时间内测量进入黑暗室的潜伏期。

线粒体功能性的研究

脑线粒体的分离

通过差速离心分离线粒体。通过断头法处死动物并立即取出脑，在4℃下在50mL的包含蔗糖75mmol/L、EGTA 1mmol//L、甘露醇225mmol/L、BSA 0.1％和HEPES-KOH 10mmol/L的分离缓冲液，pH 7.2中切割，并在Potter-Elvehjen中匀浆化。将所获得的悬浮液在2000g下离心3分钟，并将得到的上清液在12000g下离心8分钟。将沉淀重悬在10mL还包含20uL的10％毛地黄皂苷的分离缓冲液中并在12000g下离心10分钟。将线粒体沉淀悬浮于没有EGTA的分离缓冲液中，在12000g下离心10分钟，弃去上清液并用没有EGTA的分离缓冲液温和地洗涤。最后，将线粒体沉淀重悬在250μL没有EGTA的分离缓冲液中。使用微量Lowry法以测定蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白作为标准对照物(Mirándola等人.,2010)。

在KCl(130mmol/L)、MgCl₂(1mmol/L)和HEPES-KOH、磷酸(2mmol/L),pH 7.4的培养基中培养线粒体。用5mmol/L琥珀酸钾和2.5μmol/L鱼藤酮激活线粒体(1mg蛋白质/mL)。

线粒体膜的电位

线粒体膜的电位通过使用番红O(10μΜ)作为荧光标记物在POLARstar Omega荧光分光光度仪(德国)中在495/586nm(激发/发射)下以荧光分光光度法进行测定。

线粒体肿胀

线粒体肿胀通过在200μmol/L的Ca²⁺存在下，培养于标准培养基中的线粒体的悬浮液在540nm下的表观吸光度的减少并使用POLARstar Omega(德国)分光光度仪来监测。

活性氧种类的产生

活性氧种类(ROS)通过使用1μΜAmplex红(Molecular Probes,OR,Eugene)作为荧光标记物和1UI/ml的辣根过氧化物酶在563/587nm(激发/发射)下以荧光分光光度法进行测定。

用于酶和氧化还原状态测定法的脑组织的制备

用断头法处死大鼠，取出其脑并快速进行解剖以分开两个区，海马和两个脑半球的前额皮质(23)。将这些区以1:10(重量:体积)的比例在磷酸钠缓冲液(0.1mM,pH 7.4:NaCl 0.13M,KCl 0.0027M,KH₂PO₄ 136.04M,Na₂HPO₄ 0.0016M)中进行匀浆化，并在Eppendorf离心机(德国,5424R)中以6 000g离心20分钟。将脑结构匀浆物的等份保存在-80℃直至其使用。用Lowry法(24)在POLARstar Omega荧光分光光度仪(德国)上测定蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白作为参考物。

乙酰胆碱酯酶(AChE)活性

所提取的海马和前额皮质的匀浆物中的酶AChE的活性通过具有轻微修改的(26)由Ellman所描述的方法(25)以分光光度法进行测量。试验在96孔板中进行，每孔最终体积200μL。反应介质包含140μL的Ellman试剂、50μL的匀浆物和10μL的20mM碘化乙酰胆碱(AcSCh)溶液，并在37℃下孵育1分钟。在POLARstar Omega(德国)荧光分光光度仪上在405nm下以1分钟的间隔读取吸光度20分钟。计算酶活性，并表示为每mg蛋白质一分钟内所水解的(AcSCh)的μmol。

氧化还原状态和氧化损伤参数的研究

过氧化物歧化酶(SOD)活性

酶SOD的活性通过使用焦棓酸氧化方法(27)来测定。反应混合物由2.8mL的Tris0.2M-HCl 0.2M(pH 8.2)溶液、0.05mL EDTA60mM、0.1mL的匀浆物和0.05mL的焦棓酸7.37mM溶液组成。在POLARstar Omega(德国)荧光分光光度仪上在420nm下读取吸光度1分钟。将结果表示为每mg蛋白质的酶活性单位，考虑1个酶活性单位为一分钟内催化1μmol底物的转化的酶量。

过氧化氢酶(CAT)活性

酶CAT的活性从过氧化氢(H₂O₂)的分解开始测定(28)。反应混合物由0.9mL的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、0.1mL的脑组织匀浆物和0.5mL的H₂O₂(50mM)组成。在POLARstar Omega(德国)荧光分光光度仪上在240nm下读取吸光度10和70秒。将结果表示为每分钟每mg蛋白质所分解的H₂O₂的μmol。

还原型谷胱甘肽(GSH)的水平

GSH的水平按照具有某些修改的由Ellman所描述的方法(29)来估计。在比色皿中添加0.375mL的磷酸盐缓冲液(50mM,pH 8.0)、0.1mL的匀浆物和0.025mL的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)/丙酮溶液(0.6mM)。在POLARstar Omega(德国)荧光分光光度仪上在412nm下读取吸光度。使用所形成的发色团的摩尔消光系数(1.36x 10⁴(mol/L)^～1cm^-1)来计算结果。将结果表示为每mg蛋白质的GSH的nmol数。

脂质过氧化水平

脂质过氧化水平通过检测从与硫代巴比妥酸的反应(30)所形成的丙二酰二醛(MDA)来进行定量。反应介质由350μL的三氯乙酸：硫代巴比妥酸：氯化氢、100μL的脑组织匀浆物和50μL的二叔丁基羟基甲苯(BHT)形成。将混合物在TALBOYS振动搅拌器(USA)中均匀化并在Grant OLS200恒温水浴(USA)中在100℃下放置5分钟。然后在Eppendorf离心机(Alemania,5424R)中以3 000rpm离心10分钟。作为脑组织中脂质过氧化的产物而形成的MDA与硫代巴比妥酸反应并产生有色化合物，将其在POLARstar Omega(德国)荧光分光光度仪上在535nm下以分光光度法进行测定。考虑所形成的有色化合物的摩尔消光系数(1.56x10⁵M^-1cm^-1)并根据下列等式来计算MDA的浓度：

C＝O.D.x 10⁴nM

1.56

其中C为待测定的MDA的浓度，O.D.为所检测的吸光度。将结果表示为每mg蛋白质的MDA的纳摩尔数。

组织学研究

由东莨菪碱的急性腹膜内施用所引起的损伤的组织学评价在海马和前额皮质区进行。使用具有脑解剖学描述的Paxinos和Watson图谱(31)以鉴定各个脑区，并进行处理以用于4μm厚度的冠状切面的苏木精和伊红(HE)染色，总是取每个区的头三个切片。在Leica光学显微镜(Microsystems,德国)上观察两个脑半球。在CA1、CA2、CA3区和海马齿状回上观察到神经元损伤，并且认为萎缩、核固缩、暗细胞质着色或神经元缺乏是神经元变性的标志。此外，计算轴突损伤，特别是基于部分或完全脱髓鞘的轴突的出现，以及轴突萎缩，并表示为对于每个所研究的区的每个玻片上存在的所有轴突的百分比。为了进行前额皮质水平上组织损伤的分析，计数每个脑半球的三个固定区域中受影响的神经元和轴突的平均数，并表示为相对于每个区全体的受损伤神经元/轴突的百分比。

统计学分析

对于所获得的结果的统计学处理和分析，使用程序GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.,美国)。将数据表示为平均值±SEM(平均值标准误差)，并检验其正态性和同方差性。进行简单归类方差分析(ANOVA)，接着是多重比较图基检验以在不同的实验组之间进行比较。p<0.05的值被认为是统计学上显著的。

结果呈现于图9-14中。

血管性痴呆

作为血管性痴呆的模型，使动物(雄性瑞士白化病小鼠)经历颈总动脉的暂时性闭塞20分钟并通过Morris水迷宫试验来评价认知衰退。

结果呈现于图15中。

通过6-羟基多巴胺的注射的黑质致密部单侧损伤

材料与方法

实验动物

使用来自古巴哈瓦那市国家实验室动物生产中心(CENPALAB)的、在实验开始时具有200至250克重量的Wistar成年雄性大鼠。将动物保持在医学研究和发展中心(CIDEM),在23℃(22±2℃)的平均温度下在透明塑料盒中，具有随意的食物和水供应和12小时的白天和黑夜周期。

伦理学考虑

在该研究中，遵守在用于实验动物伦理学的法规中所建立的准则。保证动物的遗传真实性，这通过在认可的繁育中心获得动物来取得。该程序避免了使用遗传上受污染的动物。用于研究的遗传质量的重要性，从生物学的观点看，在于任何实验的结果在其中重复该实验的任何其他地方是可重现的，并且从伦理学的观点看，保证使用最小数目的动物。

在研究期间，将动物处于最佳住宿条件下。保持在23℃的温度下，这在热带(22±2℃)中建立的折中范围中。温度的控制是重要的，如果考虑到高温引起动物中的应激和高于38℃的温度可以引起其死亡。它们被暴露其下的白天和黑夜周期为12小时，因为光周期性以直接或间接的方式控制昼夜节奏、生物化学和激素节奏。

化合物的施用

在诱导损伤24小时后并且每日以三个不同的剂量，10、20和40mg/Kg施用JM-20 7天。用插管在胃内以0.05％在羧甲基纤维素(CMC)中制备化合物。具有5个实验组：组I(载体/具有抗坏血酸的盐水，n＝6)、组II(用6-OHDA损伤的动物，n＝8)、组III(用6-OHDA损伤和用10mg/Kg JM-20辅助治疗的动物，n＝8)、组IV(用6-OHDA损伤和用20mg/Kg JM-20辅助治疗的动物,n＝8)和组V(6-OHDA损伤和用40mg/Kg JM-20辅助治疗的动物，n＝8)。在第7天，结束所有的行为研究。

数据处理

统计学分析用GraphPadPrism 5.01.2007版软件包进行。结果指示相对于未经处理的细胞对照而言生活力的百分比的平均值±SEM。在所有情况下进行方差分析(OneWayANOVA)，接着是Dunet检验(GraphPadPrism 5)，以测定相对于实验中使用的对照而言具有p<0.05(^*)、p<0.01(^**)和p<0.001(^***)显著性水平的显著性差异。为了相对于各种对照和相互之间比较实验中所获得的所有值，以p<0.05(^*)、p<0.01(^**)和p<0.001(^***)显著性水平进行图基检验(GraphPadPrism 5)。

在大鼠上设计的实验模型中的损伤方法

通过在大鼠中注射6-羟基多巴胺的黑质致密部单侧损伤

为了进行纹状体(右脑半球)的单侧多巴胺能去神经，用水合氯醛麻醉大鼠[0.4g/kg重量，腹膜内，Merck(Darmstadt,德国)]，并放在为脑功能区定位手术所设计的框架中(Stoelting Instruments,美国)，其中在右边的黑质致密部内注射神经毒素6-OHDA-HBr(8μg/3μL的盐水溶液，其还包含0.2mg/ml的抗坏血酸作为抗氧化剂)(Pavón Fuentes,Nancy(2007)Efecto de la inactivación de los receptores dopaminérgicos D2 y de lamanipulación del núcleo subtalámico sobre la conducta motora en modelos dehemiparkinsonismo en roedores.Doctor en Ciencias de una Especialidad,Universidad de Ciencias Médicas de La Habana)。按照Paxinos和Watson图谱[Paxinos,G.and Watson,C,The rat brain in stereotaxic coordenates.第二版，theAcademic Press.New York,1986]取前卤作为参考点计算坐标,并参考表1。

表1.相对于前卤的以mm表示的脑功能区定位坐标(DV为例外，其参考硬脑膜表面)。

一旦在对的位置，就用汉密尔顿注射器(3μL)以1μL/分钟的速度缓慢注射神经毒素，结束注射后原位保持5分钟。

IV.行为测试

A.圆柱体测试

在该测验中，将大鼠放在具有20cm直径和30cm高度的透明的丙烯酸圆柱体内，其不允许动物达到边缘。圆柱体形状有利于用前肢垂直探索壁的天生行为，当将大鼠置于它们不认识的地方中时(Chan,H.,Paur,H.,Vernon,A.C.,Zabarsky,V.,Datla,K.P.,Croucher,M.J.,Dexter,D.T.,2010.Neuroprotection and functional recoveryassociated with decreased microglial activation following selectiveactivation of mGluR2/3receptors in a rodent model of Parkinson'sdisease.ParkinsonsDis.pii,190450)。放置动物后，定量动物用两只前爪(右爪和左爪)所进行的触碰的数量，直至动物在接受壁上总共20次的触碰。

用6-OHDA单侧损伤的动物倾向于使用损伤时的对侧爪，在我们的情况下，左爪。通过下面的公式定量每只动物所呈现的不对称性的％(Roof RL,Schielke GP,Ren X,HallED(2001)A comparison of long-term functional outcome after 2middle cerebralartery occlusion models in rats.Stroke 32:2648-2657)。

(％同侧触碰)-(％对侧触碰)＝(％非对称性)

探索活动

为了评价动物的垂直探索活动，使用探索活动测试，将动物放在具有41x 41x 33(h)cm的尺寸的清亮plexiglas玻璃小室内(UGO BASILE,MultipleActivityCage目录编号：47420。数据输出用52050-04数据获取软件包(

based)管理。将小室支持在配备有四个垂直钢筋的黑色plexiglas做的稳固基座上，具有钢凹槽以为了水平/垂直检测系统处于正确固定中。传感器是能够以形状或垂直探索来记录动物运动的IR光发射系统。在计算机上监测数据。将动物放在盒子的中央，以便它们探索它。将盒子放在与研究者和环境噪音隔离的住所，此外具有少的照明，5分钟的时间段。当盒子传感器的光被打断时，研究者取得动物垂直探索盒壁的次数(Cools,A.R.,R.Brachten,D.Heeren,A.Willemen,和B.Ellenbroek,1990.Search after neurobiological profile of individual-specificfeatures of Wistar rats.Brain Res.Bull.24:49-69)。

结果呈现于图16中。

紧张性疼痛

我们研究了在大鼠的紧张性疼痛模型(5％福尔马林试验)(Dubuisson D,DennisSG.The formalin test:a quantitative study of the analgesic effects ofmorphine,meperidine and brain-stem stimulation in rats and cats.Pain 1977；4:161-174)中JM-20(10、20、40mg/Kg,口服)对与疼痛相关的行为的影响。

结果呈现于图17A、17B和18中。

神经性疼痛

研究了JM-20对坐骨神经慢性收缩模型(CCI)(Bennett MI,Rayment C,HjermstadM,Aass N,Caraceni A,Kaasa S.Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cáncer patients:A systematic review.Pain 2012；153:359-365)，一种NP模型的效应。

结果呈现于图19-23。

由角叉菜胶诱导的腹膜炎

随后我们在啮齿动物中由CA诱导的腹膜炎模型上设计了不同的实验，以探索在这些状态下JM-20的可能的抗炎活性。

结果显示于图24A-E中。

Claims

1.式III的化合物在制备用于治疗帕金森病、疼痛或不同类型的痴呆的药物中的用途

2.根据权利要求1的用途，其中所述疼痛为神经性疼痛。

3.根据权利要求1的用途，其中所述痴呆为阿尔茨海默病。

4.根据权利要求1的用途，其中所述痴呆为血管性痴呆。