KR102420229B1 - 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로 한 스캐폴드는 세포 생착능을 가지며, 닭, 소고기 또는 돼지고기와 유사한 구조를 가져 배양육 제조용도로 활용될 수 있다.

Description

바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드 및 이의 제조 방법{scaffold including bio-cellulose for manufacturing cultured meat and preparation method thereof}
본 발명은 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
바이오 셀룰로오스(bio-cellulose)는 미생물 배양을 통해 만들어지며 대표적으로 리조비움 속(Rhizobium sp.), 아그로박터 속(Agrobacter sp.), 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.), 및 아세토박터 속(Acetobacter sp.)의 미생물이 과일을 이용한 배양액에서 균체 배양을 통해 생산하는 것으로 알려져 있다. 생산된 바이오 셀룰로오스는 화상처리제 같은 의약품이나 마스크팩 같은 화장품용으로 사용되고 있으며, 최근에 이르러서는 포장 용기에 이용되는 등 이용 분야가 점점 넓어지고 있다. 바이오 셀룰로오스의 생산 효율이 가장 높은 균주로는 아세토박터 속 균주가 있으며, 아세토박터 균주를 정치배양의 방법으로 배양하는 경우, 배양액 상에 반투명 막의 형태로 바이오 셀룰로오스가 생성된다. 아세토박터 속 균주가 생산하는, 바이오 셀룰로오스는 글루코오스가 산소를 매개로 β-1, 4 결합을 한 형태로 90% 이상 수분을 함유할 수 있으며, 3차원 망상 구조를 이룬다. 또한, 인체 내에서 분해되어 밖으로 배출되며, 인체에 무해한 것으로 알려져 있어 새로운 분야로의 연구가 활발히 진행 중이다.
세포 외 기질(ECM; Extracellular matrix)은 세포와 세포 사이에 위치하여 여러 세포들의 공간을 채우는 기질으로, 대부분 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져, 동물 조직의 구조적 지지와 형태의 유지 그리고 외부의 충격으로부터 보호되도록 물리적인 골격을 제공한다. 근육조직도 마찬가지로 근육세포들 사이에 세포 외 기질이 채워져 있어 근육조직의 형태와 구조를 유지하게 되며 나아가 물리적 특성을 갖는데 매우 중요한 역할을 하게 된다.
오랜시간 동안 과학자들은 페트리 디쉬를 이용한 2차원 세포 배양법을 활용하여 다양한 연구를 수행해 왔다. 하지만, 2차원 세포 배양법으로 세포를 배양할 경우 실제 조직과는 다른 환경이 조성되는 문제가 있다. 3차원 세포 배양법으로 세포를 배양하기 위한 방법들이 연구되고 있으며 특히, 실제 조직과 유사하고 세포 부착이 가능한 세포 외 기질의 구조를 갖는 세포 부착 스캐폴드에 대한 중요성이 대두되고 있다. 생체 내 환경과 유사한 조직을 만들기 위한 스캐폴드는 조직공학 기술을 통하여 다양한 분야에 이용되고 있으며, 최근에는 세포를 배양하여 제조되는 배양육 분야에 까지 활용되고 있다.
배양육 제조에 이용할 수 있는 3차원 세포 배양 스캐폴드는 생체 적합성, 생체 안정성, 생체 기능성, 인체 무해성 등의 조건을 갖추어야 하며, 스캐폴드가 갖는 물리적 특성과 구조가 실제 고기의 구조와 유사해야 한다. 또한, 동물 보호 및 동물 복지를 고려할 때 비동물성 원료로 제작한 배양육용 스캐폴드에 대한 필요성이 대두되고 있다. 한편, 식물 유래 셀룰로오스는 많은 연구가 진행이 되어 다양한 분야에 이용되고 있으며, 최근 이를 이용하여 세포 부착 또는 배양이 가능한 스캐폴드에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 식물 유래 셀룰로오스는 식물 조직 자체를 이용하기 때문에 스캐폴드 내부 구조를 조절하기 어려우며, 탈세포화 공정이 매우 복잡하여 배양육 제조용 스캐폴드로 사용하기에 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 식물 유래 셀룰로오스가 아닌 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로 배양육 제조를 위한 스캐폴드를 제조하기 위하여 노력한 결과, 식물성 배양액을 이용하여 제조된 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로 배양육 제조용 스캐폴드를 생산할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
한국 공개특허 제 10-2021-0034733 호 (공개일자:2021.03.31)
본 발명자들은 미생물 유래 바이오 셀룰로오스가 배양육 제조용 스캐폴드로 활용될 수 있는지 연구한 결과, 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로 한 스캐폴드에서 세포 부착능을 확인하고, 고기 유사 구조를 가져 세포 외 기질과 같은 역할을 함으로써 배양육 제조용 스캐폴드로 적합함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배양육 제조용 스캐폴드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조 방법으로 제조된 배양육 제조용 스캐폴드에 비-인간 동물 유래 세포를 배양하여 제조되는 배양육을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드를 제공한다.
본 발명에서 상기 용어 “배양육”은 클린육(clean meat) 또는 세포 기반 육(cell-based meat) 또는 재배육(cultivated meat)이라고도 하며, 인간 또는 비-인간 동물이 먹기에 적합하거나 식용가능한 것을 의미한다.
상기 스캐폴드는 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로 한 스캐폴드로, 고기의 구조와 유사하며 세포 부착능을 갖는 배양육 제조용 스캐폴드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미생물은 아세토박터 속(Acetobacter sp.), 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.), 리조비움 속(Rhizobium sp.) 및 아그로박터 속(Agrobacter sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고, 바람직하게는 생산 수율이 좋은 아세토박터 속(Acetobacter sp.) 또는 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미생물 유래 바이오 셀룰로오스는 동물성 펩톤, 박테리아 펩톤 또는 식물성 펩톤을 포함하는 액체 배지에서 생성될 수 있다.
상기 동물성 펩톤은 미트(meat) 및/또는 카제인(casein)일 수 있다.
상기 박테리아 펩톤은 박토 펩톤(Bacto peptone) 일 수 있다.
상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤 (papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고, 바람직하게는 대두 펩톤일 수 있다.
상기 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리 또는 고압처리에 의해 분해시킨 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미생물 유래 바이오 셀룰로오스는 글루코오스, 프룩토오스 또는 이들의 조합을 탄소원으로 포함하는 액체 배지에서 생성될 수 있다.
미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 생산하는 균주들은 생장하는 동안 통상 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 당 밀(molasses), 프룩토오스(fructose), 만니톨(mannitol) 및 글리세롤(glycerol) 등을 탄소원으로 사용하고, 감즙 및 감식초, 사과즙, 포도즙, 맥주폐액 및 코코넛 부산물 등을 보조 탄소원으로 사용하며, 카제인(casein), 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract) 등을 질소원으로 사용하지만, 균주에 따라 최적의 탄소원과 보조 탄소원, 질소원이 각각 다르다.
다양한 종류의 탄소원과 보조 탄소원 그리고 질소원 중 최적의 것을 선택하여 적정 농도의 배양조건을 확립하는 것은 비용적 측면에서 중요할 뿐만 아니라 영양분의 부족으로 인한 수율 저하 억제, 과도한 탄소원의 소비로 촉 발되는 부산물의 축적 저해 등을 통해 수율 향상 효과를 낼 수 있기 때문에 중요하다.
본 발명에서도 박테리아 셀룰로오스의 생성능이 확인된 Gluconacetobacter Xylinus subsp. Xylinus (KCCM 41431) 균주를 이용하여 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 생성할 때, 배양육 제조용 스캐폴드로서의 물리적 특성을 갖도록 글루코오스 및 프룩토오스의 단독 또는 혼합비 등의 최적의 탄소원에 대한 배양 조건을 연구하여 본 발명의 배양육 제조용 스캐폴드를 설계하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다: (a) 펩톤을 포함하는 액체 배지에 미생물을 투입하고 28 내지 32℃에서 정치배양하여 바이오 셀룰로오스를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득한 바이오 셀룰로오스를 증류수로 세척하고 염기성 용액에서 끓인 후 증류수로 세척하여 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 단계 (a)의 액체 배지는 글루코오스, 프룩토오스 또는 이들의 조합을 탄소원으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 단계 (b)의 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 동결건조하여 동결건조 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 미생물은 아세토박터 속(Acetobacter sp.), 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.), 리조비움 속(Rhizobium sp.) 및 아그로박터 속(Agrobacter sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 펩톤은 동물성 펩톤, 박테리아 펩톤 또는 식물성 펩톤일 수 있다.
상기 동물성 펩톤은 미트 및/또는 카제인일 수 있다.
상기 박테리아 펩톤은 박토 펩톤일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤 (papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조 방법에서, 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리 또는 고압처리에 의해 분해시킨 산물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 방법으로 제조된 배양육 제조용 스캐폴드에 비-인간 동물 유래 세포를 배양하여 제조되는 배양육을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비-인간 동물 유래 세포는 근줄기세포, 근육 세포 및 이의 전구세포(progenitor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 근줄기세포는 위성 세포(satellite cell) 또는 근아세포(myoblast), 예를 들어, 근아세포일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube), 예를 들어, 근세포일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 전구세포는 복수 계통으로 분화된 세포를 생성시킬 수 있는 세포, 예컨대, 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 간질 세포, 주피세포, 평활근 세포 및 내피 세포를 지칭한다. 전구세포는 이들이 전형적으로 광범위한 자기 복제 능력을 갖지 않는다는 점에서 줄기 세포와는 상이하다.
상기 비-인간 동물 유래 세포는 지방 세포(fat cell 또는 adipocyte) 및/또는 이의 전구 세포, 간질 세포(결합 조직) 및/또는 이의 전구 세포, 또는 내피 세포(혈관) 및/또는 이의 전구 세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비-인간 동물은 소, 양, 돼지, 가금류, 갑각류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명은 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 기반으로한 스캐폴드서, 세포 부착능을 가지며, 닭, 소고기 또는 돼지고기와 유사한 구조를 가질 수 있는 배양육 제조용 스캐폴드를 제공한다.
도 1은 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 글루코오스를 포함하는 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 형태 또는 하이드로겔을 동결건조하여 제조된 동결건조 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 나타낸 것이다.
도 2는 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 글루코오스 또는 프룩토오스를 포함하는 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 동결건조하여 이의 단면을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 글루코오스 또는 프룩토오스를 포함하는 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에서의 근줄기세포의 부착성을 형광현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 탄소원을 포함하되, 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 달리하여 포함된 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 동결건조하여 단면을 SEM으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 탄소원을 포함하되, 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 달리하여 포함된 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에서의 근줄기세포의 부착성을 형광현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
실시예
실시예 1: 미생물 유래 바이오 셀룰로오스 스캐폴드 제조
바이오 셀룰로오스 스캐폴드 제조를 위해 본 발명의 글루콘아세토박터 속 균주로 글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스(Gluconacetobacter Xylinus subsp. Xylinus) 균주(기탁번호 : KCCM 41431)를 생균 형태로 (사)한국미생물보존센터로부터 분양받아 사용하였다. -80℃에서 보관중인 상기 균주를 글루콘아세토박터 고체 배지(0.5% 효모 추출물(yeast extract), 0.5% 대두 펩톤, 2% 글루코오스, 0.27% 인산이나트륨(disodium phosphate), 0.15% 구연산(citric acid) 및 2% 한천(agar) 포함)에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 고체 배지에서 배양된 본 발명의 글루콘아세토박터 속 균주를 글루콘아세토박터 액체 배지(0.5% 효모 추출물(yeast extract), 0.5% 대두 펩톤, 2% 글루코오스, 0.27% 인산이나트륨(disodium phosphate) 및 0.15% 구연산(citric acid) 포함)에 접종하여 72시간 이상 정치 배양하여 바이오 셀룰로오스를 수득하였다. 수득한 바이오 셀룰로오스를 하이드로겔화하기 위하여, 바이오 셀룰로오스에 포함되어 있는 배지를 증류수로 세척하고, 남아있는 미생물을 제거하기 위하여 0.1 M NaOH 용액에서 1시간 끓인 후, NaOH 용액을 제거하기 위하여 증류수로 3회 세척한 후 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 30% 에탄올에 보관하였다. 보관중인 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 증류수로 세척한 후, 고압증기멸균을 통해 멸균하였다. 멸균된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 PBS로 3번 세척하여 상기 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드와 이를 동결건조한 동결건조 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하였다(도 1). 상기와 동일한 조건으로 대두 펩톤 대신 미트(meat) 펩톤을 사용하여 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하였다.
실시예 2: 탄소원의 종류에 따른 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 비교
2-1. 탄소원의 종류에 따른 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면 분석
상기 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 탄소원을 포함하되, 상기 탄소원으로 글루코오스 또는 프룩토오스를 달리 포함하는 액체 배지에서 제조된 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면을 관찰하기 위하여 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 -80℃에서 24시간 동안 선 동결 후 48시간 동결건조하였다. 동결건조된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드는 20 mA에서 60초 동안 백금 코팅 1회 하였으며, 코팅된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면을 SEM을 통하여 관찰하였다(도 2).
그 결과, 미트(meat) 펩톤 그리고 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면은 단단한 층으로 이루어진 고기의 결과 유사한 형태를 띄고 있으며, 세밀한 층을 여러 겹으로 이루고 있어 매우 질기고 단단한 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 대두 펩톤과 글루코오스를 이용하여 생산한 바이오 셀룰로오스는 미트 펩톤과 글루코오스를 이용하여 생산한 바이오 셀룰로오스와 마찬가지로 동일한 구조의 바이오 셀룰로오스를 생산한다는 것을 확인하였다. 이에 비해 프룩토오스를 탄소원으로 사용하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면은 세밀하지 않은 스폰지와 유사한 구조로 인해 단단한 층을 형성하지 않아, 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에 비해 상대적으로 질기지 않으며 단단하지 않다는 것을 확인하였다.
상기 바이오 셀룰로오스 스캐폴드 모두 고기의 결과 유사한 형태의 구조를 갖고 있어서, 근육세포를 본 발명의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에 부착할 경우 고기의 구조와 유사한 배양육을 제조할 수 있음을 예측하였다.
2-2. 탄소원의 종류에 따른 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 세포 부착성 분석
상기 탄소원의 종류를 글루코오스 또는 프룩토오스로 달리하여 제조된 미생물 유래 바이오 셀룰로오스를 근육세포 배양 스캐폴드로 사용하기에 적합한지 확인하기 위하여, 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에 근줄기세포를 씨딩(seeding)하였다. 상기 근줄기세포는 비-인간 동물 유래 세포로서 닭, 돼지 또는 소 근조직으로부터 primary cell culture를 통해 직접 분리된 근줄기세포이다. 근줄기세포가 상기 스캐폴드에 잘 부착될 수 있도록 3시간 배양 후 추가적으로 배양 배지를 투입하였다. 24시간 추가 배양한 후 살아있는 세포는 녹색으로 염색되고 죽은 세포는 붉은색으로 염색되는 특성을 가진 LIVE & DEAD ASSAY(Thermofisher L3223) 시약을 사용하여 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에 근줄기세포가 부착되어 살아있는지를 형광현미경으로 확인하였다(도 3).
그 결과, 글루코오스 또는 프룩토오스를 탄소원으로 사용하여 생산된 바이오 셀룰로오스와 미트 펩톤을 이용하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드 모두 근줄기세포가 부착되어 배양되고 있음을 녹색으로 염색된 세포로 확인할 수 있었으며, 90% 이상의 세포들이 생착되는 결과를 확인하였다. 또한, 위의 결과들을 통하여 미트 펩톤을 대두 펩톤으로 대신하더라도 생산되는 바이오 셀룰로오스의 세포 부착능은 변함이 없다는 것을 확인하였다.
2-3. 탄소원의 혼합비율에 따른 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면 분석
글루코오스 또는 프룩토오스를 탄소원으로 이용하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 구조가 실제 고기와 차이가 있을 것으로 예상되어, 세밀한 구조를 갖는 바이오 셀룰로오스를 생산케 하는 글루코오스와 상대적으로 느슨한 구조를 갖는 바이오 셀룰로오스를 생산케 하는 프룩토오스의 혼합비율을 조절하여 실제 고기와 유사한 형태의 물리적 특성을 갖는 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 설계하였다.
상기 아세토박터 액체 배지 100 중량부에 대하여 2 중량부의 탄소원을 포함하되, 상기 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(글루코오스: 프룩토오스= 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 조절하여 제조된 아세토박터 액체 배지에 본 발명의 아세토박터 속 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 이상 정치배양하여 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하여 각각의 스캐폴드 단면을 SEM을 통하여 관찰하였다(도 4).
그 결과, 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율을 달리하여 생산된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 단면 분석을 통해, 글루코오스의 포함량이 많아질수록 바이오 셀룰로오스의 층이 여러 겹으로 명확하게 형성됨을 확인하였으며, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(글루코오스: 프룩토오스= 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 조절하여 제조된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드 모두 고기의 근육조직과 유사한 형태이지만 내부를 구성하는 구조의 세밀 정도는 모두 다르다는 것을 확인하였다.
2-4. 탄소원의 혼합비율에 따른 바이오 셀룰로오스 스캐폴드의 세포 부착성 분석
상기 실시예 2-3에서 기재된 동일한 방법으로, 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(글루코오스: 프룩토오스= 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 조절하여 제조된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에 근줄기세포를 씨딩(seeding)하여 상기 스캐폴드에 잘 부착될 수 있도록 3시간 배양 후 추가적으로 배양 배지를 투입하였다. 24시간 추가 배양한 후, LIVE & DEAD ASSAY(Thermofisher L3223) 시약을 사용하여 상기 바이오 셀룰로오스 스캐폴드에서의 근줄기세포 생착능을 형광현미경으로 분석하였다(도 5).
그 결과, 탄소원으로 글루코오스와 프룩토오스의 혼합비율(글루코오스: 프룩토오스= 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5)을 조절하여 제조된 바이오 셀룰로오스 스캐폴드 모두 세포 부착능을 갖는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.) 유래 바이오 셀룰로오스를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드로서,
    상기 바이오 셀룰로오스는 글루코오스 및 프룩토오스를 포함하는 액체 배지에서 생성되고, 글루코오스 함량이 증가될수록 세밀한 구조를 가지며 프룩토오스 함량이 증가될수록 느슨한 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 셀룰로오스는 식물성 펩톤을 포함하는 액체 배지에서 생성되는 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤 (papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리 또는 고압처리에 의해 분해시킨 산물인 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양육 제조용 스캐폴드는 하이드로겔(hydrogel) 형태 또는 동결건조(freezing dry) 형태인 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드.
  8. 다음의 단계를 포함하는 배양육 제조용 스캐폴드의 제조 방법:
    (a) 펩톤을 포함하는 액체 배지에 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.)을 투입하고 28 내지 32℃에서 정치배양하여 바이오 셀룰로오스를 수득하는 단계로서,
    상기 액체 배지는 글루코오스 및 프룩토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득한 바이오 셀룰로오스를 증류수로 세척하고 염기성 용액에서 끓인 후 증류수로 세척하여 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하는 단계로서, 글루코오스 함량이 증가될수록 세밀한 구조를 가지며 프룩토오스 함량이 증가될수록 느슨한 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하는 단계.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 하이드로겔 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 동결건조하여 동결건조 형태의 바이오 셀룰로오스 스캐폴드를 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 제8항에 있어서,
    상기 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤 (papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드의 제조 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리 또는 고압처리에 의해 분해시킨 산물인 것을 특징으로 하는 배양육 제조용 스캐폴드의 제조 방법.
  14. 제8항의 방법으로 제조된 배양육 제조용 스캐폴드에 비-인간 동물 유래 세포를 배양하여 제조되는 배양육.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 비-인간 동물 유래 세포는 근줄기세포, 근육 세포 및 이의 전구세포(progenitor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 배양육.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 비-인간 동물은 소, 양, 돼지, 가금류, 갑각류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배양육.
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