KR102397088B1 - 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 칩에 고정된 캡처 프로브가 특정 식중독균의 타겟 DNA와 선택적으로 결합하고, 타겟 DNA에서 TdT 반응이 유도되어 신호증폭을 위한 금속체가 형성되므로, 식중독균의 존재 유무를 정확하게 검출할 수 있는 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법에 대한 것이다.

Description

다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법{Method for simultaneous detection of foodborne pathogens using chip for multiplex detection}
본 발명은 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 칩에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열을 포함하며, 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 3' 말단을 블록킹한 식중독균용 캡처 프로브 각각을 칩의 다른 영역에 고정하여 다중검출용 칩을 준비하는 칩준비단계와; 상기 칩에 고정된 캡처 프로브에 측정 대상 타겟 DNA를 분포시켜 캡처 프로브와 타켓 DNA를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 캡처 프로브와 결합한 타켓 DNA의 3' 말단에서 TdT 반응이 일어나도록 하는 효소반응단계와; 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계;를 포함하는 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법에 대한 것이다.
식중독균은 급성위장염증상을 일으키는 세균을 말하는데, 식품 안에서 증식할 때 독소를 생성하여 식중독을 야기하기나, 생균의 형태로 섭취되어 그 증식이 식중독을 야기한다. 대표적인 식중독균인 대장균 O157:H7이 인체용혈성 요독증 증후군을 야기하는 등 식중독균에 오염된 식품을 섭취하는 경우 인체에 큰 피해가 발생하므로, 하기 특허문헌처럼 식중독균 존재 및 양을 검출하기 위한 장치 및 방법이 널리 개발되고 있다.
<특허문헌>
한국공개특허 제10-2020-0078219호(2020. 07. 01. 공개) "식중독균 검출장치 및 이를 이용한 식중독균 검출방법"
하지만, 종래의 식중독균을 검출하는 방법은 고가의 장비를 필요로 하고, 빠르고 간편하게 식중독균의 존재 유무를 확인할 수 없었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 칩에 고정된 캡처 프로브가 특정 식중독균의 타겟 DNA와 선택적으로 결합하고, 타겟 DNA에서 TdT 반응이 유도되어 신호증폭을 위한 금속체가 형성되므로, 식중독균의 존재 유무를 정확하게 검출할 수 있는 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법은 특정 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 칩에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열을 포함하며, 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 3' 말단을 블록킹한 식중독균용 캡처 프로브를 칩에 고정하는 칩준비단계와; 상기 칩에 고정된 캡처 프로브에 측정 대상 타겟 DNA를 분포시켜 캡처 프로브와 타켓 DNA를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 캡처 프로브와 결합한 타켓 DNA의 3' 말단에서 TdT 반응이 일어나도록 하는 효소반응단계와; 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법은, 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 식중독균의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법에 있어서 상기 캡처 프로브의 3' 말단에 인산 또는 비오틴을 처리하여, 3' 말단을 블로킹할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법에 있어서 상기 금속체형성단계에서는 상기 효소반응단계 후 구리 이온과 아스코베이트를 포함하는 용액을 칩에 주입하여, 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 구리 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법에 있어서 상기 금속체형성단계에서는 상기 효소반응단계 후 복수 개의 아데닌이 연이어지는 DNA에 금 나노입자가 결합한 금 나노입자 DNA를 칩에 주입하여 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민에 금 나노입자 DNA의 아데닌이 결합하도록 하고, 은 이온과 환원제를 포함하는 용액을 칩에 추가로 주입하여 금 나노입자 표면에서 은 클러스터가 형성되도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법에 있어서 상기 칩은 COC(cyclic olefin copolymer) 칩이 사용되며, 상기 캡처 프로브는 대장균을 검출하기 위해 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식중독균 검출 방법에 있어서 상기 대장균의 타겟 DNA는 서열번호 12의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예와 하기에 설명할 구성과 결합, 사용관계에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 칩에 고정된 캡처 프로브가 특정 식중독균의 타겟 DNA와 선택적으로 결합하고, 타겟 DNA에서 TdT 반응이 유도되어 신호증폭을 위한 금속체가 형성되므로, 식중독균의 존재 유무를 정확하게 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 식중독균을 검출하는 원리를 설명하기 위한 참고도.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따라 식중독균을 검출하는 원리를 설명하기 위한 참고도.
도 3은 식중독균의 타겟 DNA를 나타내는 도표.
도 4 및 5는 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 칩에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인하기 위한 형광 이미지.
도 6은 캡처 프로브가 COC 칩에 고정되는지를 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 7은 COC 칩 표면에 고정된 DNA의 3' 말단에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 8은 COC 칩 표면에 고정된 DNA의 3' 말단에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 확인하기 위한 Chemi-doc 및 Smartphone 이미지.
도 9는 3' 말단을 blocking함에 의해 TdT 반응이 억제됨을 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 10은 3' 말단을 blocking함에 의해 구리 나노입자의 합성이 억제됨을 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 11은 대장균의 검출을 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 12는 대장균의 검출을 확인하기 위한 Chemi-doc 및 Smartphone 이미지.
이하에서는 본 발명에 따른 다중검출용 칩을 이용한 식중독균 동시 검출 방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 동시 검출 방법을 도 1 내지 12를 참조하여 설명하면, 상기 식중독균 동시 검출 방법은, 특정 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 칩에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열을 포함하며, 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 3' 말단을 블록킹한 식중독균용 캡처 프로브 각각을 칩의 다른 영역에 고정하여 다중검출용 칩을 준비하는 칩준비단계와; 상기 칩에 고정된 캡처 프로브에 측정 대상 타겟 DNA를 분포시켜 캡처 프로브와 타켓 DNA를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 캡처 프로브와 결합한 타켓 DNA의 3' 말단에서 TdT 반응이 일어나도록 하는 효소반응단계와; 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계와; 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 식중독균의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 포함한다.
상기 칩준비단계는 특정 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 칩에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열을 포함하며, 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 3' 말단을 블록킹한 식중독균용 캡처 프로브 각각을 칩의 다른 영역에 고정하여 다중검출용 칩을 준비하는 단계이다. 상기 링커 역할을 하는 염기서열이 예컨대 C(10)T(10)로 이루어지고 3' 말단 부위에 위치하는 경우, 상기 캡처 프로브를 고분자(예컨대, COC 등) 칩에 분포시키고 UV 조사를 하면, 상기 C(10)T(10)가 고분자 칩 표면에 고정되어 캡처 프로브의 3' 말단 부분이 고분자 칩에 고정되어 상기 캡처 프로브를 칩에 고정할 수 있게 된다. 또한, DNA의 3' 말단은 OH로 되어 있어서 거기에서부터 TdT 반응이 유도되므로, 측정되는 신호 강도를 크게 하기 위해 캡처 프로브와 부분적으로 결합한 타겟 DNA의 3' 말단에서만 TdT 반응이 유도되도록, 상기 캡처 프로브는 3' 말단을 블록킹하여 캡처 프로브의 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 하며, 예컨대 프로브의 3' 말단에 phosphate 또는 biotin 등을 처리하여 3' 말단을 블로킹할 수 있다. 각 캡쳐 프로브는 각기 다른 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 상이한 염기서열을 가지므로, 각 캡처 프로브를 칩의 다른 영역(well)에 고정시킨 후, 이후 식중독균 동시 검출 방법의 각 단계를 진행하여 복수의 식중독균을 동시 검출할 수 있다.
상기 혼성화단계는 상기 칩에 고정된 캡처 프로브에 측정 대상 타겟 DNA를 분포시켜 캡처 프로브와 타켓 DNA를 부분적 결합시키는 단계이다. 상기 캡처 프로브 각각은 특정 식중독균의 타겟 DNA의 일부분과 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 포함하므로, 상기 혼성화단계에서는 특정 캡처 프로브와 특정 타겟 DNA가 부분적으로 상보적 결합하여 혼성화되게 된다. 즉, 본 발명에서는 특정하게 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 열처리하여 각 식중독균에 대한 single strand의 타겟 DNA를 얻고, 상기 PCR로 증폭된 타겟 DNA와 선택적으로 결합하도록 상기 캡처 프로브가 설계되게 된다. 본 발명에서는 하나의 칩에서 여러 식중독균에 대한 유전자를 동시 검출하므로, 각 타겟 DNA의 길이가 104 내지 109bp로 매우 비슷한 길이를 가지도록 설계되게 된다.
상기 효소반응단계는 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 캡처 프로브와 결합한 타켓 DNA의 3' 말단에서 TdT 반응이 일어나도록 하는 단계로, 상기 캡처 프로브의 3' 말단은 블로킹되었음으로, 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 반응시키면 타겟 DNA의 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되어 복수의 티민(poly(T))이 연이어 형성되게 된다.
상기 금속체형성단계는 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 티민을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 단계로, 예컨대 도 1에 도시된 바와 같이, Cu2+와 ascorbate를 칩에 주입하면 poly(T)를 주형으로 한 구리 나노입자가 형성되게 된다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 금속체형성단계는 도 2에 도시된 바와 같이, TdT 효소반응단계 후 복수 개의 A가 연이어지는 DNA에 금 나노입자가 결합한 금 나노입자 DNA(AuNP-poly(A))를 추가로 공급하여, 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 티민에 금 나노입자 DNA의 아데닌이 결합하도록 하고, 은 이온과 환원제를 추가로 공급하여, 금 나노입자 표면에서 Ag cluster가 형성되게 된다.
상기 검출단계는 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 식중독균의 존재 및 그 양을 검출하는 단계로, 검사하고자 하는 시료에 식중독균이 존재하는 경우 PCR 생성물에 특정 타겟 DNA가 존재하여, 상기 타겟 DNA는 캡처 프로브와 결합하게 되어 결과적으로 금속체가 형성되고, 이후 빛을 조사하면 금속체가 구리나노입자인 경우 발광하는 형광을 측정하고, 금속체가 금/은 클러스터인 경우 흡수되는 빛을 측정하여, 기 설정된 타겟 DNA의 농도와 형광(또는 흡광도) 값 간의 비례적 상관관계를 고려하여, 식중독균의 존재 및 그 양을 검출할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 캡처 프로브(Capture probe)의 준비
1. 대장균용 캡처 프로브 준비
대장균(E. coli 0157:H7)의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열[GTATTTTCGGTTTTC(서열번호:1)]과, UV 조사를 통해 COC(Cyclic olefin copolymer) 칩에 고정화되어 링커 역할하는 염기서열(이하, '링커 염기서열'이라 함)[CCCCCCCCCCTTTTTTTTTT(서열번호:2)]을 포함하며, 3' 말단을 PO4(Phosphate)로 블록킹한 대장균용 캡처 프로브[5'-GTATTTTCGGTTTTCTCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3'(서열번호 3)]를 준비하였다.
2. 살모넬라균용 캡처 프로브 준비
대장균 대신 살모넬라균(Salmonella enterica Typhimurium)의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열[TATCGTCCAAAAGG(서열번호:4)]을 가지는 것을 제외하고 실시예 1의 1의 캡처 프로브와 동일하게 제조된 살모넬라균용 캡처 프로브[5'-TATCGTCCAAAAGGTCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3'(서열번호 5)]를 준비하였다.
3. 리스테리아균용 캡처 프로브 준비
대장균 대신에 리스테리아균(L. monocytogenes)의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열[AAAGCTTATTCATGG(서열번호:6)]을 가지는 것을 제외하고 실시예 1의 1의 캡처 프로브와 동일하게 제조된 리스테리아균용 캡처 프로브[5'-AAAGCTTATTCATGGTCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3'(서열번호 7)]를 준비하였다.
4. 바실러스균용 캡처 프로브 준비
대장균 대신에 바실러스균(B. Cereus)의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열[TTCTACGTACACAG(서열번호:8)]을 가지는 것을 제외하고 실시예 1의 1의 캡처 프로브와 동일하게 제조된 바실러스균용 캡처 프로브[5'-TTCTACGTACACAGTCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3'(서열번호 9)]를 준비하였다.
5. 황색포도상구균용 대한 캡처 프로브 준비
대장균 대신에 황색포도상구균(S. aureus)의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열[ACATTAATTTAACCGT(서열번호:10)]을 가지는 것을 제외하고 실시예 1의 1의 캡처 프로브와 동일하게 제조된 황색포도상구균용 캡처 프로브[5'-ACATTAATTTAACCGTTCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3'(서열번호 11)]를 준비하였다.
<실시예 2> 식중독균의 타겟 DNA(PCR product) 준비
도 3에 기재된 염기서열을 가지는 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균, 바실러스균, 황색포도상구균에 대한 타겟 DNA(PCR product)를 준비하였다. 도 3에서 빨간색으로 표시된 부분은 PCR시 forward & reverse primer와 결합하는 부분이며, 밑줄친 부부은 capture probe와 결합하는 부분이다.
<실시예 3> 캡처 프로브의 고정화 확인
1. 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 칩에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인
(1) 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 칩에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인하기 위하여, 용매효과확인용 DNA[5'-(cy3)-TCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-3'(서열번호 17)]을 준비하였다.
(2) COC 칩 친수화를 위해 COC 칩을 O2 Plasma처리하고(20W (power), 10 (time), 20 sccm (flow rate)), 농도가 0.5uM이 되도록 상기 용매효과확인용 DNA를 용매 A(150 mM sodium phosphate buffer with 0.01% tween 20 (pH 8.5)), 용매 B(1x micro spotting solution plus (Array it)), 특정 비율로 용매 A와 B가 혼합된 혼합용매 각각에 녹이고, pin을 이용한 contact 방식의 microarrayer를 이용하여 DNA를 COC 칩에 spotting 한 후 상온에서 10분 건조하였다. 이후, UV 처리를 수행하고(파장대 254nm, 처리시간 30분 (by XL-1000 UV cross linker)), 세척한 후(0.1x SC buffer with 0.01% SDS (pH 7)로 10min with shaking & DW rinsing), 형광 이미지를 얻어 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
(3) 도 4 및 5를 보면, 용매 A 또는 B를 단독으로 사용하여 용매효과확인용 DNA를 스팟팅 했을 경우 DNA가 스팟의 가장자리 또는 중심부에 몰려서 균일도가 낮가 스팟 사이즈가 너무 작아지는 등 고정화 효율이 좋이 않은데 반해, 용매 A와 B를 섞어서 사용했을 경우 DNA가 스팟 내에 고르게 분포되었고 스팟의 사이즈도 일정함을 확인하였으며, 특히 용매 A와 B를 1:1로 섞은 용매를 사용했을 때 고정화 효율이 가장 좋았다. 이후, 실험에서는 캡처 프로브의 용매로 용매 A와 B를 1:1로 섞은 용매를 사용하였다.
2. 캡처 프로브가 COC 칩에 고정되는지 확인
(1) 상기 용매효과확인용 DNA의 3' 말단을 PO4(Phosphate)로 블록킹한 칩 고정 확인용 캡처 프로브[5'-(cy3)-TCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-(phosphate)-3']를 준비하였다.
(2) COC 칩(COC bottom well plate)에 농도별 칩 고정 확인용 캡처 프로브 20ul 씩 넣고 건조하고, 자외선 조사를 실시하여 고정하고, 세척하고 건조한 후 cy3의 형광값을 측정(excitation 530nm, emission 575nm)하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
(3) 도 6을 보면, 칩 고정 확인용 캡처 프로브(Capture Probe)의 농도가 증가할수록 형광값이 커짐을 알 수 있어, 링커 염기서열을 가지는 캡처 프로브가 COC 칩에 잘 고정됨을 알 수 있다.
<실시예 4> COC 칩 표면에 고정된 DNA의 3' 말단에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 확인
1. COC 칩 표면에 고정된 DNA의 3' 말단에서 poly(T)가 생성되고 Thymine을 template로 하여 CuNP가 합성됨을 확인하기 위한 구리 나노입자 합성 확인용 캡처 프로브[5'-TTTTTTTTTTCCCCCCCCCCTAATCATGAGTCCAAGAGC-3'(서열번호:18)]을 준비하였다.
2. COC 칩에 농도별 구리 나노입자 합성 확인용 캡처 프로브 50ul 씩 넣고 건조(RT 16h, dry oven 30min), 고정(UV-fix 30min), 세척(SSC washing 10min 및 DW washing 3회) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하여, COC 칩에 구리 나노입자 합성 확인용 캡처 프로브를 고정하였다. 이후, 표 1에 기재된 조성을 가지는 TdT 반응 용액을 COC 칩에 넣고, TdT 반응을 2시간 실시하고, final 농도 4mM Na-ascorbate 및 200uM CuSO4를 포함하는 구리 나노입자 합성 용액을 TdT 반응 결과물과 혼합한 후 dark condition에서 5min 동안 반응시켜 구리 나노입자를 합성한 후, 형광값을 측정(excitation 350nm, emission 500~700nm)하여 그 결과를 도 7에 나타내었고, Chemi-doc 및 Smartphone으로 촬영하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
Reagents Volume(uL) Final concentration
(5x) buffer 10 1x
(100mM) dTTP 2 4mM
(20U/uL) TdT 2 40unit
DW 36
Total 50
3. 도 7 및 도 8을 보면, 구리 나노입자 합성 확인용 캡처 프로브(Capture Probe)의 농도가 증가할수록, 형광 세기가 커짐을 알 수 있어, COC 칩 표면에 고정된 DNA의 3' 말단에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 알 수 있다.
<실시예 5> 3' 말단을 blocking함에 의해 TdT 반응이 억제됨을 확인
1. DNA의 3' 말단을 biotin으로 블로킹함에 의해 TdT 반응이 억제됨을 확인
(1) Normal DNA[5'-AGCTCTGTGGCG-3'(서열번호:19)]와, Normal DNA의 3' 말단에 biotin을 달은 Biotin DNA를 준비하였다.
(2) 하기의 표 2에 기재된 조성으로 Noraml DNA(또는 Biotin DNA)와 TdT 반응 용액을 혼합하여 TdT 반응을 2.5시간 실시하고, 10X SYBR green Ⅱ로 염색한 후 형광값을 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, TdT 반응 결과물, final 농도 4mM Na-ascorbate 및 200uM CuSO4를 포함하는 구리 나노입자 합성 용액을 혼합한 후 dark condition에서 5min 동안 반응시켜 구리 나노입자를 합성하고, 형광값을 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
Reagents Volume(uL) Final concentration
(5x) buffer 10 1x
(100mM) dTTP 2 4mM
(1uM) Normal DNA(or Biotin DNA) 25 0.5uM
(20U/uL) TdT 2 40unit
DW 11
Total 50
(3) 도 10을 보면, Biotin DNA를 이용한 경우 Normal DNA를 이용한 경우보다 형광값이 작음을 확인할 수 있어 DNA의 3' 말단을 Biotin으로 블로킹하는 경우 TdT 반응이 억제됨을 알 수 있고, 도 9를 보면, Biotin DNA를 이용한 경우 Normal DNA를 이용한 경우보다 형광값이 작음을 확인할 수 있어 thymine의 생성이 억제되는 경우 구리 나노입자의 합성이 저해됨을 알 수 있다.
2. DNA의 3' 말단을 phosphate로 블로킹함에 의해 TdT 반응이 억제됨을 확인
Biotin DNA 대신에 Normal DNA의 3' 말단에 phosphate를 달은 phosphate DNA를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5의 1과 동일하게 실험하였다. 그 결과 phosphate DNA를 이용한 경우 Normal DNA를 이용한 경우보다 형광값이 작음을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 식중독균의 검출
1. 대장균의 검출
(1) DW에 녹여진 20uM의 대장균용 캡처 프로브 20ul를 COC 칩에 넣고 건조(RT 16h, dry oven 30min), 고정(UV-fix 30min), 세척(SSC washing 10min 및 DW washing 3회) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하여, COC 칩에 대장균용 캡처 프로브를 고정하였다. 90% perfectHyb Plus Hybridization Buffer에 녹여진 대장균의 타겟 DNA 20ul를 농도별(0, 1 and 5uM)로 넣고, 40℃에서 2시간 혼성화시키고, 세척(SSC washing 10min 및 DW washing 4회) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하였다. 이후, 표 1에 기재된 조성을 가지는 TdT 반응 용액을 COC 칩에 넣고, TdT 반응을 2시간 실시하고, final 농도 4mM Na-ascorbate 및 200uM CuSO4를 포함하는 구리 나노입자 합성 용액을 TdT 반응 결과물과 혼합한 후 dark condition에서 5min 동안 반응시켜 구리 나노입자를 합성한 후, 형광값을 측정(excitation 350nm, emission 500~700nm)하여 그 결과를 도 11에 나타내었고, Chemi-doc 및 Smartphone으로 촬영하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
(2) 도 11 및 12를 보면, 대장균의 타겟 DNA의 농도가 증가할수록, 형광 세기가 커짐을 확인할 수 있어, 대장균의 존재 및 양을 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Method for simultaneous detection of foodborne pathogens using chip for multiplex detection <130> PDAHJ-20144 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for binding E. coli <400> 1 gtattttcgg ttttc 15 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for immobilization on the chip <400> 2 cccccccccc tttttttttt 20 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for E. coli <400> 3 gtattttcgg ttttctcatg accccccccc cttttttttt t 41 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for binding S. enteria Typhimurium <400> 4 tatcgtccaa aagg 14 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for S. enteria Typhimurium <400> 5 tatcgtccaa aaggtcatga cccccccccc tttttttttt 40 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for binding L. monocytogenes <400> 6 aaagcttatt catgg 15 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for L. monocytogenes <400> 7 aaagcttatt catggtcatg accccccccc cttttttttt t 41 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for binding B. Cereus <400> 8 ttctacgtac acag 14 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for B. Cereus <400> 9 ttctacgtac acagtcatga cccccccccc tttttttttt 40 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of capture probe for binding S. aureus <400> 10 acattaattt aaccgt 16 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for S. aureus <400> 11 acattaattt aaccgttcat gacccccccc cctttttttt tt 42 <210> 12 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr product of E. coli 0157 <400> 12 gttaaacacc acgacaggtc tttatgatct gaaaaccgaa aataccttgt taactaccga 60 tgctgcattc gataaattag ggaatggcga taaagtcaca gttggcgg 108 <210> 13 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr product of S. enterica Typhimurium <400> 13 gcaacggcct gtatcatcaa aaacaaaccc ttttggacga tatctcacgc aaaaattacc 60 ttggcttatt tttgaccatg ttatgccttc tctaaagtaa tactca 106 <210> 14 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr product of L. monocytogenes <400> 14 caatcaaatg tagttggtcc gttaccaccc catgaataag cttttccaag gtgtttttga 60 gcttcagcaa taatagcact tgcacttgaa ttgctgttat tgttggaag 109 <210> 15 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr product of B. Cereus <400> 15 catttaaatc gctcaaaaca accgattcat gaagagcctg tgtacgtaga aggttcaaaa 60 gatggtattc aggttgaggt ttctcttcaa tataacgaag gata 104 <210> 16 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr product of S. aureus <400> 16 cctgcgacat taattaaagc gattgatggt gatacggtta aattaatgta caaaggtcaa 60 ccaatgacat tcagactatt attggttgat acacctgaaa caaagcatc 109 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA for confirming immobilization of capture probe <400> 17 tcatgacccc cccccctttt tttttt 26 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA for confirming poly T generation <400> 18 tttttttttt cccccccccc taatcatgag tccaagagc 39 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA for confirming of suppression of TdT reaction <400> 19 agctctgtgg cg 12

Claims (7)

  1. DNA로 이루어지며, 특정 식중독균의 타겟 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 칩에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열을 포함하며, 3' 말단에서 TdT 반응이 유도되지 않도록 3' 말단을 블록킹한 식중독균용 캡처 프로브를 칩에 고정하는 칩준비단계와; 상기 칩에 고정된 캡처 프로브에 측정 대상 타겟 DNA를 분포시켜 캡처 프로브와 타켓 DNA를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 혼성화단계 후 TdT 반응용액을 추가로 첨가하여 캡처 프로브와 결합한 타켓 DNA에서 TdT 반응이 일어나도록 하는 효소반응단계와; 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계와; 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 식중독균의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 포함하며,
    상기 금속체형성단계에서는 상기 효소반응단계를 통해 타겟 DNA에 형성된 복수의 티민을 템플레이트로 하여 구리 나노입자를 형성하고,
    상기 검출단계에서는 구리 나노입자에서 발광하는 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 캡처 프로브의 3' 말단에 인산 또는 비오틴을 처리하여, 3' 말단을 블로킹할 수 있는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 칩은 COC 칩이 사용되며, 상기 캡처 프로브는 대장균을 검출하기 위해 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 대장균의 타겟 DNA는 서열번호 12의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
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